1ères rencontres d'oncologie Thoracique en Nouvelle-Aquitaine ADN circulant en ex-poitou-charentes L expérience de Poitiers Gaëlle TACHON 12 mai 2017 Laboratoire de Cancérologie Biologique Plateforme Hospitalière de Génétique Moléculaire des Cancers (INCa) Pr Karayan-Tapon Lucie
Prélèvement sanguin : plasma ADN Tumoral circulant PCR Digitale pour la recherche des mutations de l EGFr Sensibilité : 0.1% (screening de 3000 molécules = 10ng d ADN circulant) Au diagnostic [ADNc] > 10ng/µl [ADNc] < 10ng/µl Selon la quantité d ADN extrait A la Rechute Multiplex del exon 19 (12 génotypes) Exon 21 : p.l858r Exon 18: p.g719s Exon 20 : p.t790m Et la mutation activatrice si connue prélèvement tissulaire non réalisable bloc épuisé prélèvement tissulaire trop pauvre en cellules tumorales ADN extrait de la tumeur non amplifiable
Les choix technologiques de Poitiers Le Pré-analytique Appel du site préleveur et/ou du prescripteur au laboratoire Quantité de sang optimal à prélever : 15mL Sang du patient récupéré sur tube EDTA (conditionnement préféré) Acheminement dans les 3h au laboratoire de cancérologie biologique Ou Centrifugation du sang par un autre laboratoire dans un délai <3h post prélèvement isolation du plasma congélation à -20 C envoi à notre laboratoire à -20 C. Sang du patient récupéré sur tube Cell-Free DNA Collection Tubes (Roche) Tubes envoyés par le laboratoire aux sites préleveurs sur demande (si aucun accès à une centrifugeuse ) Acheminement au laboratoire de cancérologie biologique à température ambiante dans les 24h (possible envoi jusqu à 72h).
Les choix technologiques de Poitiers Analytique : Extraction choisie QIAamp DSP Circulating NA Kit (Qiagen) Avantages Technique simple. Coût modéré. Optimisée pour une extraction de 2.5mL de plasma. Extraction simultanée de plusieurs prélèvements possible. Contrôles d extractions positif et blancs réalisés en systématique. Dosage de l ADN
Les choix technologiques de Poitiers Analytique : la PCR digitale QX200 Droplet Digital PCR System (BIORAD) Technique allèle spécifique, quantitative, réputée très sensible Permettant la détection de mutation à 0.1-0.2%.
Les choix technologiques de Poitiers Technologie allèle spécifique Multiplexage possible Principe de la technologie Allèle non muté (Allèle X) Allèle muté WT (Allèle Y) C G Polymérase T A C Polymérase C G T A Fluorochrome bleu (VIC FAM 523-568) Fluorochrome vert (FAM HEX 450-533) Quencher
Les choix technologiques de Poitiers Amplification de l ADN Amplification de la fluorescence en fonction de l amorce fixée Lecture de la fluorescence gouttelette après gouttelette Traduction des résultats en graphe
L activité de Poitiers en quelques chiffres Recherche de mutations au niveau des exons 18, 19, 20 et 21 du gène EGFr : Séquence de référence NM_005228. Mutations recherchées si prise en charge au diagnostic: exon 19 :p.e746_a750del, p.l747_p753>s, p.l747_a750>p, p.l747_t751>p, p.e746_t751>i,p.l747_t751>q, p.e746_s752>d, p.l747_p753>q, p.l747_s752del, p.l747_e749del, p.l747_t751del, p.l747_t751>q exon 21 :p.l858r exon 18: p.g719s Mutations recherchées si prise en charge à la rechute: exon 20 : p.t790m +/- mutation activatrice initiale si quantité d ADN suffisant Exceptionnel et sur demande spécifique du clinicien : - Recherche de mutations au niveau des gènes KRAS ou BRAF. - Recherche de mutations EGFR au niveau du tissu tumoral, du LCR, épanchements
L activité de Poitiers en quelques chiffres Passage en routine en décembre 2015: Lettre au prescripteurs 2015: 3 analyses sur plasma 2016 : 102 analyses sur plasma + 4 analyses autres (liquide pleural, LCR ) 2017 (pour l instant) : 33 analyses sur plasma + 2 analyses autres Sur l année 2016 : prise en charge de 82 patients (106 analyses au total) 65 35 61 39
L activité de Poitiers en quelques chiffres Sur les années 2015-16-17 Dans le cadre du diagnostic 56 analyses/patient réalisées : 11% mutées Deux L858R et quatre délétions de l exon 19. Dans le cadre de la rechute 88 analyses réalisées : 31% mutées T790M. soit 61 patients : 44% mutées T790M. % d analyse à la rechute % de patients à la rechute 69 31 56 44
L activité de Poitiers en quelques chiffres
L activité de Poitiers en quelques chiffres Prise en charge des rechutes à Poitiers : Plusieurs prélèvements successifs en cas de négativité ++ 10 (16%) patients ont au moins eu 2 prélèvements analysés. 7 (11%) patients ont au moins eu 3 prélèvements analysés 1 (1.6%) patient a au moins eu 4 prélèvements analysés 18 patients ont eu des prélèvements successifs et 3/18 présentaient une mutation T790M au nième prélèvement
L activité de Poitiers en quelques chiffres
Bientôt Application de cette technologie: A la recherche de mutations de résistances ALK A la recherche de la mutation de résistance p.c797s (EGFR) Nombreuses autres perspectives possibles