Mécanismes de réparation des dommages de l'adn

Mécanismes de réparation des dommages de l'adn Eric Quéméneur CEA Marcoule DSV / ibeb / SBTN Visiatome - 12 juillet 2007 Objectifs de cet exposé - Rappels de quelques notions de base avant l'intervention de JC Artus - Introduire les concepts d'instabilité du génome, les mécanismes de maintien de son intégrité et les bases moléculaires de la cancérogenèse - Situer les enjeux de la recherche en radiobiologie Plan de cette courte présentation - Dommages de l'adn - rappels des bases structurales - faire la part des choses (dommages radio-induits vs autres) - conséquences fonctionnelles (du dommage au cancer) - Repérer, identifier le dommage - exemple de MutS (mismatch) - exemple de γ-h2ax (DSB foci) - Réparer - réversion directe par la photolyase - les grandes voies (BER, NER, MR, HR, NHEJ) - maladies génétiques - Coordonner l'intervention - articulation Réparation/Cycle celllulaire ("checkpoints") - Perspectives et enjeux 1

Introduction On estime que l'adn d'une cellule humaine moyenne subit plusieurs dizaines de milliers de lésions par cellule et par jour, dans des conditions habituelles d'activité métabolique et d'exposition aux facteurs environnementaux. L'exposition aux rayonnements ionisants n'est qu'un facteur de risque supplémentaire parmi d'autres. Ces lésions sont globalement néfastes (cancer, vieillissement, etc.) mais la mutagenèse est également un moteur de l'évolution. Un ensemble très efficace de processus biochimiques identifie, signale et corrige les dommages de l'adn et contribue ainsi à maintenir l'intégrité du génome cellulaire. Cette machinerie de "réparation de l'adn" est toujours active, réactive, finement contrôlée par la cellule et est reliée à plusieurs mécanismes connexes. Mais cette machinerie n'est pas infaillible! la défaillance accroissant le risque cancérogène les facteurs de variabilité sont nombreux : fond génétique individuel, âge, types cellulaires, types de lésions, facteurs environnementaux, etc. 1- Les dommages à l'adn 2

Rappels sur la structure de la Chromatine et de l'adn La particule coeur (core particle): 146 paires de bases + un octamère d histones 2[H2A, H2B] 2 et [H3,H4] 4 3

Structure de l'adn Rappel sur la structure des protéines 4

Brochure Environnement-Energie-Santé (2 nde edition, Juin 1997) SFEN Languedoc-Roussillon Dommages endogènes à l'adn induits par la vie cellulaire Source type de lésion Ruptures simples Température corporelle Site apuriniques (37 C) Sites apyrimidiques Déamination Dommages des bases (total) Thymine glycol Thymidine glycol Radicaux libres 5-hydroxométhyluracile 8-hydroxométhylguanosine Ruptures simples, doubles, pontages Métabolismes divers Adduits glucose N7-méthylG N3-méthylA O6-méthyl G Pontages ADN/ADN et ADN/protéines Evaluation du nombre de lésions induites par cellule et par jour 20 000-40 000 10 000 500 100-300 10 000 270 70 620 168? 3 4 000 600 10-3? 5

Dommages à l'adn induits par des agents génotoxiques connus Source Type de lésions Nombre d'adduits induits/cellules Bain de soleil (1 heure) dimères de thymine 60 000 à 80 000 Tabagisme (20 cigarettes/jour) Travailleurs de fours à charbon (selon les auteurs et le nombre de jours) Travailleurs de fonderie Bruit de fond des radiations naturelles (2,4 à 40mSv/an) Adduits sur l'adn (hydrocarbures polycycliques) BPDE benzo (α)pyryène diol époxyde BPDE benzo (α)pyryène diol époxyde Ruptures simple brin 100 à 200 400 à 70 000 300 à 6 500 2/an (DNA-DNA et DNA-RNA cross links) Modification des sucres ND 800-1000 Sites alcali-labiles ND 200-300 Pontages DNA-Protéines ND 150 6

Effets biologiques des rayonnements ionisants Les différentes échelles de temps Clefs CEA N 48 Source : Santé, radioactivité et rayonnements ionisants (2003) Brochure du Comité d'information des Professions de Santé 7

Différents types de mutations Mutations ponctuelles (inversion de bases) Mutations intra et interchromosomiques Décalage de cadre de lecture Comment les mutations causent-elles un cancer? La prolifération cellulaire est contrôlée finement par la balance entre 2 classes de protéines : - les suppresseurs de tumeurs (ex. p53, RB1, BRCA1 ) - les (proto)oncogènes (ex. ras, myc, wnt ) Bloque cycle cellulaire Inducteur apoptose Réponse Signaux externes Maintien intégrité génome Réparation dommages ADN TS PO Stimulation croissance et division cellulaire Une mutation qui : - inactive un TS fournit un avantage sélectif décisif à la - active un PO cellule concernée tumorogenèse Système de réparation des mutations de l'adn = protection contre la cancer 8

Du dommage de l'adn au cancer : un processus probabiliste Complex adaptative systems at various levels Risk per humam stem cell per 1 mgy* Ratio of the probabilities for radiation induced lethal cancer and the corresponding DSB is ~10-11 ~10-12 Ionizing Radiation ~ 10 20 cells at risk Organism Tissues Cells Molecules Atoms ~10-14 malignant transformation with fatal outcome? ~10-4 chromosoma aberr. ~10-2 DNA DSB ~2 DNA alterations ~150 ROS MAIS, SURTOUT, LA CELLULE DISPOSE D'UN SYSTEME TRES EFFICACE * DE REPARATION DE SON ADN!! 2- Repérer les dommages 9

Mismatch recognition by MutS Obmolova et al. (2000) Nature 407, 703-710 Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA Mécanisme de la réparation de mésappariement le "contrôle qualité" post-replicationnel 10

La réparation de l ADN a lieu dans le contexte de la chromatine, les histones jouent également des rôles clefs dans la détection des dommages Modifications post-traductionnelles des queues des histones 11

12

3- Réparer les dommages 13

Les dommages à l'adn : mécanismes de réparation Figure from : Hoeijmakers (2001) Nature 411, 366-374. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer Mécanisme de la réparation par excision de base (BER), une tâche de fond pour lutter contre les dommages induits par le métabolisme 14

Structure des composants de la voie BER on sait presque tout!? Mécanismes d'excision de nucléotide ( NER) et de réparation couplée à la transcription - Un système global de surveillance très versatile Le "reparosome", un complexe stable préformé Gervais et al. (2004) Nature Struct Mol Biol 11, 616-622 (2004) TFIIH contains a PH domain involved in DNA nucleotide excision repair TFIIH (460 kda) = 9 sous-unités 2 entités structurales et fonctionnelles - core : p34, p44, p52, p62, XPB helicase - complexe CAK (CDK-activating kinase) : Cdk7, cyclin H, MAT1 XPD helicase pontant les deux Schulz et al. (2000) Cell 102, 599 607 Molecular Structure of Human TFIIH 15

Réparation des cassures double-brin (EJ pathway) synapsis microhomology alignment transphosphorylation P P unwinding P ligation P P Ku86/Ku70 DNA-PK cs Ligase IV XRCC4 Walker et al. (2001) Nature 412, 607-614 Structure of the Ku heterodimer bound to DNA and its implications for double-strand break repair 16

Junop et al. (2000) EMBO J. 19, 22, 5962 Crystal structure of the Xrcc4 DNA repair protein and implications for end joining Sibanda et al. (2001) Nature Structural Biology 8, 1015-1019 Crystal structure of an Xrcc4 DNA ligase IV complex Evolution of the structural knowledge on DNA repair systems Database (july 10, 2007) = 44578 entries Query for "DNA repair" = 778 entries Sorting for non redondant structures = 494 (<30% ident) 17

Hoeijmakers (2001) Nature 411, 366-374. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer XP Patient Cockayne patient AT patient 18

DNA damage response and human disease Ataxia telangiectasia Nijmegen breakage syndrome Li-Fraumeni syndrome Immune deficiency syndromes (inc. SCID) Sensor Signaling Mediator / Regulator Effector NHR / HR Fanconi anemia Familial breast and ovary cancer Bloom's and Werner's syndromes Sporadic tumors 4- Coordonner l'intervention moléculaire 19

Les différentes options de la cellule face aux dommages de l'adn Les "checkpoints" du cycle cellulaire 20

21

Analyse du mécanisme de relocalisation intra-cellulaire de p53 Cartographie fonctionnelle de la protéine Contrôle Stress Contrôle Stress Un outil génétique d'analyse de la relocalisation de p53 Etude des stress synergiques Etude de mutants Godon et al. (2005) Oncogene 24, 6459-6464. Quantitation of p53 nuclear relocation in response to stress using a yeast functional assay: effects of irradiation and modulation by heavy metal ions. 22

Perspectives - Enjeux des recherches en radiobiologie Continuer à identifier et caractériser les éléments clés du maintien de l'intégrité du génome Comprendre comment : - ils échappent au contrôle cellulaire - ils peuvent se maintenir pendant des années - ils peuvent se transmettre Bases moléculaires de la variabilité individuelle et de la susceptibilité au cancer Faibles doses et synergies avec autres stress cellulaires/facteurs environnementaux 23