Master M1 de Biologie Cellulaire Physiologie et Pathophysiologie, 2004-2005 Université Denis Diderot Paris VII Cyrille Vernet Implication des récepteurs de la sérotonine 5-HT 2A dans la réponse à un inhibiteur sélectif de la recapture de la sérotonine : le Citalopram. Etude sur la souris mutante qui n exprime pas ce récepteur. Responsable de stage Docteur Joëlle Adrien. UMR 677 (INSERM/UPMC) Neuropsychoparmacologie CHU Pitié-Salpêtrière 91 boulevard de l Hôpital 75013 Paris
Remerciements : Je remercie le docteur Michel Hamon de m avoir accepté comme stagiaire dans le laboratoire ainsi que le docteur Joëlle Adrien qui m a encadré pendant ces 4 mois. Je remercie également toute l équipe du laboratoire qui a su m apporter des réponses quand j en avais besoin. 2
Sommaire : Remerciements :...2 Sommaire :... 3 Abréviations :... 4 Matériels et méthodes :...7 Animaux :...7 Principe de mesure des états de vigilance :...7 Implantation des électrodes :... 8 Enregistrement polygraphique :...11 Traitement pharmacologique :... 11 Analyse des données et statistiques :... 12 Résultats :... 13 Effet du Citalopram chez les souris sauvages :...13 Effet du Citalopram chez les souris 5-HT2A -/- :...14 Discussion et perspectives :...16 Bibliographie:...18 3
Abréviations : 5-HT: sérotonine (5-hydroxy-tryptamine) 5-HT 1A : récepteur 1A de la sérotonine ISRS : inhibiteur sélectif de la recapture de sérotonine SP: Sommeil paradoxal SL: Sommeil lent (S1 + S2) ST : Sommeil total (S1 + S2 + SP) EEG : électroencéphalogramme EMG : électromyogramme EOG : électrooculogramme IP: intra peritoneal SC : sous cutané 4
Introduction : Les inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine (ISRS) sont les médicaments les plus fréquemment prescrits pour les troubles dépressifs. Les ISRS ont également une action sur le sommeil et l éveil. Chez plusieurs espèces notamment chez le rat (Maudhuit et al, 1994 ; Ursin, 2002), le hamster (Gao et al, 1992), et aussi chez l homme (Hendrickse et al, 1994), ils produisent initialement une réduction du sommeil paradoxal (SP), souvent associée à une augmentation de l éveil, et secondairement une augmentation du sommeil lent (SL) (Maudhuit et al, 1994; Ursin, 2002). Ces effets seraient dus à l augmentation des taux de sérotonine (5-HT) dans l espace extracellulaire du fait de l inhibition de la recapture de ce neurotransmetteur. Ainsi, une fois libérée par les terminaisons, la 5-HT irait activer les récepteurs sérotoninergiques (Hamon, 1990) et moduler les états de vigilance à partir de structures centrales bien identifiées (Pace- Schott et Hobson, 2001). Ces dernières, situées dans le tronc cérébral, sont porteuses de divers sous-types de récepteurs sérotoninergiques notamment ceux de types 5-HT 1A, 5-HT 1B et 5-HT 2A. En effet, on sait que l activation directe de ces récepteurs par l injection d agonistes induit une diminution du SP et une augmentation de l éveil (Tissier et al, 1993; Boutrel et al, 1999, 2002). Au contraire leur blocage facilite l expression du SP (Boutrel et al, 1999, 2002) et du SL (Dugovic et al, 1989, Popa et al, 2005). Ainsi l effet des ISRS sur le sommeil pourrait s exercer par l intermédiaire de l activation de ces récepteurs. De fait, ceci a été montré dans le cas des récepteurs 5-HT 1A et 5-HT 1B (Monaca et al, 2001). En effet l action d un ISRS, le Citalopram, sur le SP est fortement diminuée chez des souris mutantes qui n expriment les récepteurs 5-HT 1A, ainsi que chez des souris sauvages après blocage de ces récepteurs. En revanche l action du Citalopram sur le sommeil n est que faiblement réduite chez les souris mutantes qui n expriment pas les récepteurs 5-HT 1B, ou chez les sauvages après blocage de ces derniers. Par ailleurs, on sait que les récepteurs 5-HT 2 sont également impliqués dans la régulation du sommeil. Ces récepteurs sont distribués largement dans le système nerveux central (Leysen, 2004). Leur activation entraîne une inhibition du SL et du SP tandis que leur blocage augmente le sommeil lent chez l homme (Idzikowski et al, 1991) et chez le rat (Dugovic et al, 1989). De plus l association d antagonistes des récepteurs 5-HT 2 à des 5
antidépresseurs diminue l insomnie chez les patients déprimés (Thase, 2000). Le récepteur de sous-type 5-HT 2A serait plus spécifiquement impliqué dans ces actions. Il se pourrait donc que les récepteurs 5-HT 2A, comme les récepteurs 5-HT 1A, joue un rôle dans l action des ISRS sur le sommeil. C est pour tenter de répondre à cette question que nous avons analysé l effet du Citalopram (Monaca et al, 2001) sur les cycles veille-sommeil chez la souris mutante qui n exprime pas le récepteur 5-HT 2A ainsi que chez la souris sauvage de la même lignée. 6
Matériels et méthodes : Animaux : Nous avons travaillé avec des souris de la lignée 129/sv «sauvages» et mutantes issues d hétérozygotes après 7 «back-crosses». Les animaux sont placés dans les conditions standards de laboratoire : cycle de 12-12h lumière-obscurité (allumage à 7h00), température maintenue à 24 C, eau et nourriture à volonté. Cette étude a été effectuée sur des souris mâles. En effet les femelles présentent des variations de leurs états de vigilance en fonction du cycle ovarien et cela augmente l'hétérogénéité des groupes. Ces souris avaient un âge compris entre 2 et 5 mois (jeunes adultes) au moment des enregistrements, puisque l on sait que le sommeil varie en fonction de l âge. Principe de mesure des états de vigilance : L étude des états de vigilance est réalisée au moyen d enregistrements polygraphiques (logiciel d acquisition Somnologica), qui permettent, pour chaque souris, de suivre en parallèle au cours du temps : - l activité corticale globale à l aide de l électroencéphalogramme (EEG) - l activité musculaire de la nuque à l aide de l électromyogramme (EMG) - l activité oculaire à l aide de l électrooculogramme (EOG) La combinaison de ces trois activités caractérise l état de vigilance de l animal à chaque instant. 7
Implantation des électrodes : Préparation des électrodes: L enregistrement polygraphique du sommeil est réalisé à partir de six électrodes implantées à demeure chez chaque souris : 2 électrodes musculaires (EMG), 2 oculaires (EOG) et 2 corticales (EEG). La première étape à consiste à fabriquer les électrodes. On coupe 6 morceaux de fil de nickel chrome émaillé (150 μm de diamètre) de 2 cm de longueur. On effectue un décapage sur l extrémité de chaque fil qui sera soudée aux plots du connecteur. Pour cela on plonge l extrémité (2 à 3 mm) dans un bain de décapant 15 minutes. Ceci a pour effet de ronger l'isolant. Ensuite on prépare l autre l'extrémité des 6 électrodes (voir figure 1): on décape chaque extrémité. L EEG est torsadée et aplatie à son extrémité afin de ne pas endommager le cortex lors de l insertion. L EOG est recourbée pour ne pas blesser l œil et l EMG est biseautée pour mieux pénétrer le muscle. Les deux électrodes corticales sont soudées sur un connecteur à 6 broches alors que les 4 autres devront être soudés après implantation sur la souris. La soudure est effectuée en position 5 et 6 du connecteur (les positions 1 et 2 sont pour les EMG et les 3 et 4 pour les EOG). EOG EEG EMG Parties dénudées Figure 1 : Schéma de la préparation des différentes électrodes. 8
Protocole chirurgical: Nettoyer les outils a l'éthanol 70% Préparer une cage individuelle post-opératoire. Anesthésier la souris avec du pentobarbital sodique (60 mg/ml dilué au tiers avec du sérum physiologique) à la dose de 70 mg/kg. On effectue une injection intra péritonéale (IP) de 0,1 ml par 25g de poids corporel. Si la souris n'est pas endormie après 10 minutes on peut réinjecter 0,03 ml par la même voie. Placer la souris dans l'appareil stéréotaxique en maintenant le crâne grâce aux barres d'oreilles. Placer la mâchoire supérieure sur la barre de gueule. Vérifier que le crâne ne bouge pas et que les barres sont serrées, tout en ménageant un espace inter-aural d environ 7 mm. Inciser la peau au dessus du crâne de manière sagittale, sur une longueur de 2 cm. Appliquer un anesthésique local (lidocaine) sur le crâne et sous la peau incisée. Gratter la surface du crâne et dégager les muscles de la nuque très délicatement après avoir désinseré les tendons, attachés à la crête arrière du crâne, qui maintenaient ces muscles. Nettoyer le crâne avec un coton imbibé d'acide citrique 10% et de chlorure ferrique 3% afin d assécher l os et de le rendre poreux de manière à faciliter la fixation du ciment sur le crâne (Limoge-Landais et al, 1994) Rincer toute la surface avec du sérum physiologique puis sécher à l'air comprimé. Percer 2 trous avec une fraise à l'endroit d'implantation des EEG : 2 mm à droite de la ligne médiane et 4 mm en arrière de la suture du bregma ; et l autre sur la ligne médiane 2 mm en arrière de la suture du lambda (voir photo 1). Préparer la résine monomère (Superbond) dans un bac refroidi; et recouvrir le crâne et les crêtes en faisant attention à ne pas boucher les trous que l'on vient de percer. Laisser sécher 5 minutes. bregma lambda Ligne médiane Photo 1 : Les différentes sutures du crâne de la souris. 9
Une fois le crâne sec, placer une électrode corticale dans l un des trous et la maintenir verticalement (au dessus de la dure mère). Déposer du ciment acrylique à sa base. Laisser sécher. Photo 2 : Mise en place du connecteur soudé aux électrodes corticales. Faire de même avec la deuxième EEG. Placer ensuite tour à tour les 2 EOG en position sous-cutanée au niveau des bords interne et externe de l orbite droite, puis les 2 EMG dans les muscles de la nuque. Déposer une goutte de ciment sur chaque fil d électrode au niveau de son contact avec la plaque de ciment, afin de maintenir le fil en place. Laisser sécher. Souder les 4 électrodes aux embouts du connecteur dans leur position respective en évitant tout contact entre elles. Pour cela appliquer de l'acide phosphorique sur l'électrode afin de décaper le métal et ainsi faciliter la soudure. Recouvrir le crâne de ciment jusqu'à la base du connecteur tout en maintenant ce dernier en position verticale. Laisser sécher le tout. Suturer la peau : un point en avant du connecteur et le reste des points à l'arrière. Libérer la souris et la placer dans sa cage en position latérale pour éviter tout étouffement et maintenir une température de 37-38 C. Au réveil disposer de l eau et de la nourriture «ad libitum» dans la cage. La souris aura 10 jours de récupération post-opératoire, puis sera habituée aux conditions expérimentales. Photo 3 et 4 : Souris en phase de récupération après la mise en place du connecteur 10
Enregistrement polygraphique : Pour l habituation aux conditions d enregistrement, les cages des souris sont placées dans un box spécial pendant 2 jours. On relie le connecteur implanté au système d enregistrement, grâce à un câble qui, via un collecteur tournant (permettant une liberté de mouvement), transmettra les signaux électriques à un système d enregistrement EMBLA. Les enregistrements sont effectués de 10h à 18h, c'est-à-dire pendant 8 heures après l injection des composés. Photo 5 : Habituation de la souris aux conditions expérimentales. Cage en plexiglas et animal relié au câble d enregistrement. Traitement pharmacologique : Le Citalopram (Lundbeck, Copenhague, DK), est administré par voie IP, aux doses de 1, 5 et 10 mg/kg dissous dans 0,1 ml de sérum physiologique. Pour recueillir les données de base on effectue des injections IP de sérum physiologique de même volume. 11
Analyse des données et statistiques : Pour chaque souris on obtient 3 tracés correspondant aux EMG, EOG et EEG. On élimine les parasites par l utilisation de filtres. On filtre les hautes fréquences : supérieures où égales à 50 Hz (50 Hz correspondant au courant alternatif qui alimente les appareils), et les basses fréquences selon le tracé : pour l EEG, qui comprend des fréquences comprises entre 0,5 et 5 Hz, on filtrera les fréquences inférieures à 0,1Hz. Pour L EOG on filtrera les fréquences inférieures à 5 Hz et pour l EMG : inférieures à 7 Hz. Les différents stades de vigilance sont caractérisés par une combinaison spécifique des signaux EMG, EOG, EEG (Tobler et al, 1997; Lena et al, 2004). Nous distinguons 4 états de vigilance: Eveil caractérisé par une activité cérébrale intense (EEG désynchronisé de haute fréquence : 7-40 Hz et de faible amplitude : 300 μv), activité musculaire importante (EMG de forte amplitude) et quelques mouvements oculaires. SL1 : sommeil lent caractérisé par des ondes cérébrales plus lentes (EEG de plus faible fréquence et qui monte en amplitude 450 μv), EOG et EMG très peu actifs. SL2 : sommeil lent profond, EEG de très faible fréquence et de haute amplitude : 600 μv, EOG et EMG sans tonus. SP : EEG désynchronisé de haute fréquence et faible amplitude : 300 μv ; très régulier avec des ondes thêta caractéristiques (7-10 Hz); proche de celui de l éveil mais aucun tonus musculaire n est détecté, toutefois on a des saccades oculaires sur l EOG. Les enregistrements polygraphiques sont dépouillés manuellement, par tranches de 15 secondes. Pour chacune d elles nous déterminons, en fonction des 3 voies d enregistrement, s il s agit d éveil, SL1, SL2 ou de SP. Analyse statistique : on réalise une ANOVA à deux facteurs (dose de Citalopram et génotype) suivie d un test t de Student. Le seuil de significativité est déterminé à 5%. 12
Résultats : Effet du Citalopram chez les souris sauvages : Chez les souris sauvages, le blocage du transporteur de la sérotonine par le Citalopram induit une diminution significative des taux de SP, qui dure 4 heures post-injection (figure 2). Cet effet est dose dépendant (figure 3) et est significatif pour la dose de 10 mg/kg jusqu à 4h après le traitement. (3,5 ± 0,2 min par rapport à 14,6 ± 1,0 min pour le sérum physiologique). Après cette diminution initiale du taux de SP il y a un retour progressif aux valeurs de bases. Taux de SP (min) 12 Sauvages 5-HT 2A -/- 10 8 6 4 2 0 0 1 5 Dose de Citalopram (mg/kg IP) 10 Figure 3 : Effet du Citalopram sur le taux de SP pendant les 2 premières heures post-injection chez les souris 5-HT 2A -/- et les «sauvages». Les taux de SP sont exprimés en minutes (moyennes ± erreurs standard pour 3 à 6 souris) 13
La réduction de SP par le Citalopram est accompagnée d une augmentation de la latence du SP (80,2 ± 13,9 et 191,5 ± 16,0 min pour 5 et 10 mg/kg respectivement contre 37,9 ± 2,6 min pour le sérum physiologique ; non représenté) et d une diminution significative du nombre d épisodes de SP (durant les 2 premières heures pour 5 et 10 mg/kg et aussi durant les 2 heures suivantes pour 10 mg/kg) sans modifications significatives de leur durée moyenne (figure 4). Le Citalopram n induit aucune modification des taux de sommeil total (figure 5), toutefois on observe durant les 4 premières heures une augmentation significative du S1 à la dose de 10 mg/kg, compensée par une diminution du S2 (figure 6). Taux de ST (min) 10 10 9 9 8 8 7 7 6 6 5 Sauvages 5-HT 2A -/- ST 0-2 2-4 4-6 Temps post- Taux de ST (min) 105 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 Dose de Citalopram # * 0 mg/kg 1 mg/kg 5 mg/kg 10 mg/kg 0-2 h 2-4 h 4-6 h * Temps post-injection Figure 5 : Taux de sommeil durant les 6 premières heures après l injection de Citalopram (0-10 mg/kg) chez les souris 5-HT 2A -/- et «sauvages». Les taux, exprimés en minutes (moyennes ± erreurs standard pour 3 à 6 souris) sont évalués par tranches de 2 heures. * P 0,05 résultats significativement différents entre les 2 souches de souris. # P 0,05 résultats significativement différents en comparaison du sérum physiologique * * Effet du Citalopram chez les souris 5-HT 2A -/- : Chez les souris 5-HT 2A -/- le Citalopram produit, comme chez les «sauvages», une diminution dose-dépendante des taux de SP durant les 4 premières heures (figure 2 et 3). Cet effet est significativement moins important que celui observé chez les souris sauvages durant la deuxième tranche horaire (pour la dose de 10 mg/kg : 4,88 ± 0,1 min versus 3,5 ± 0,2 min). On observe une même latence du SP que celle des souris sauvages mais un plus petit nombre d épisodes de SP (figure 4). 14
Chez les souris mutantes il y a une baisse significative du S2 pendant les 2 premières heures à la dose de 10 mg/kg compensée par une augmentation du S1 (figure 6). Le Citalopram induit, chez ces souris une augmentation dose-dépendante de l éveil durant la deuxième plage horaire (figure 2). En revanche, on observe pendant la troisième plage horaire une augmentation dose dépendante du temps de sommeil qui n apparaît pas chez les souris sauvages (figure 5). Sauvages 5-HT 2A -/- Taux de S1 (min) 60 50 40 30 20 10 0 # # Taux de S1 (min) 60 50 40 30 20 10 0 Dose de Citalopram # 0 mg/kg 1 mg/kg 5 mg/kg 10 mg/kg * 0-2 h 2-4 h Temps post-injection 0-2 h 2-4 h Temps post-injection Taux de S2 (min) 70 60 50 40 30 20 10 0 # # Taux de S2 (min) 70 60 50 40 30 20 10 0 # 0-2 h 2-4 h Temps post-injection 0-2 h 2-4 h Temps post-injection Figure 6 : Taux de sommeil lent léger (S1) et profond (S2) durant les 4 premières heures après l injection de Citalopram (0-10 mg/kg) chez les souris 5-HT 2A -/- et «sauvages». Les taux, exprimés en minutes (moyennes ± erreurs standard pour 3 à 6 souris) sont évalués par tranches de 2 heures. * P 0,05 résultats significativement différents entre les 2 souches de souris. # P 0,05 résultats significativement différents en comparaison du sérum physiologique 15
Discussion et perspectives : Les données présentées ici, bien que préliminaires, confirment que le blocage du transporteur de la sérotonine par le Citalopram chez la souris, induit une inhibition du SP. De plus, nos résultats paraissent indiquer que cette inhibition ne s exerce que pour une faible partie par l intermédiaire des récepteurs 5-HT 2A. Chez la souris sauvage, la diminution de SP induite par le Citalopram est semblable à celle précédemment décrite chez la même souche de souris (Monaca et al, 2001), ainsi que chez d autres rongeurs (Maudhuit et al, 1994; Ursin, 2002) avec divers ISRS. L inhibition du SP induite par le Citalopram est la conséquence de l augmentation des taux de 5-HT dans l espace extracellulaire induite par blocage de la recapture de cette amine. Il a été montré précédemment au laboratoire que cette action était due à une activation des récepteurs de type 5-HT 1A, et dans une moindre mesure, des récepteurs de type 5-HT 1B (Monaca et al, 2001). Il restait à examiner le rôle des récepteurs 5-HT 2 dans cet effet. Ici, en utilisant des souris mutantes qui n expriment pas le récepteur 5-HT 2A, nous apportons des arguments en faveur d une implication très discrète de ces récepteurs dans cet effet inhibiteur du SP. En effet, avec la plus forte dose de Citalopram utilisée (10 mg/kg), les souris 5-HT 2A -/- tendent à présenter une moindre baisse des taux de SP que leurs témoins «sauvages». Cette différence ne serait pas due à une désensibilisation du transporteur lui-même puisque seulement de très faibles changements de ce dernier ont été observés chez ces mutants, notamment dans le tronc cérébral (Ase et al, 2001), qui est une zone clé pour la régulation du SP (Pace-Schott et Hobson, 2002). En revanche cette différence pourrait être attribuée, en plus de l absence d expression du récepteur 5-HT 2A, à une moindre sensibilité du récepteur 5-HT 2B. En effet, il a été montré, d une part que l activation de ce récepteur entraînait une diminution du SP, et d autre part que ce récepteur était désensibilisé chez le mutant 5-HT 2A -/- (Popa et al, 2005). 16
Pour l instant, nous ne sommes pas en mesure de répondre à cette question. Il sera nécessaire de combiner les traitements avec le Citalopram et le blocage pharmacologique non sélectif des récepteurs 5-HT 2 (par l injection préalable d un antagoniste, la ritansérine Dugovic et al. 1989), ou le blocage sélectif des divers sous-types de récepteurs 5-HT 2 (Popa et al, 2005), pour évaluer la part respective de ces récepteurs dans les effets observés. Quoi qu il en soit, il est intéressant de remarquer que les souris mutantes 5-HT 2A -/- présentent une tendance à l augmentation secondaire du temps de sommeil après le traitement avec 5 et 10 mg/kg de Citalopram (voir figure 4), alors que cet effet n est pas observé chez la souris sauvage. Ceci est à rapprocher du fait que les ligands antagonistes des récepteurs 5-HT 2 facilitent le sommeil lent profond chez l homme, et que les antidépresseurs possédant une action 5-HT 2 antagoniste ont une action hypnotique chez le patient déprimé insomniaque (Thase, 2000). Ainsi, l inactivation fonctionnelle des récepteurs 5-HT 2, et peut-être plus particulièrement 5-HT 2A (comme chez la souris 5-HT 2A -/-) semblerait représenter une configuration favorable à la restauration du sommeil en cas de traitement avec un ISRS. En conclusion, il sera nécessaire d une part de confirmer les données préliminaires obtenues sur les mutants 5-HT 2A -/-, et d autre part d effectuer de nombreuses expérimentations pharmacologiques complémentaires pour mieux comprendre le mode d action des antidépresseurs ISRS sur le sommeil. A terme, ces études pourraient permettre de proposer de meilleures prises en charge des patients déprimés présentant des insomnies sévères. 17
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