PRINCIPES DE BASES DE L ANALYSE DES CHROMOSOMES HUMAINS II. Outils
CONTEXTE CLINIQUE Jonction entre chromosomique et moléculaire Dr G. Lefort
II. TECHNIQUE 1) Le caryotype conventionnel en bandes
Nécessite l obtention de cellules qui se divisent et que l on va bloquer en mitoses afin d obtenir les chromosomes à un stade de condensation maximum que l on pourra observer au microscope optique Inhibiteur de polymérisation Des microtubules : Colcemid (Molecular biology of the cell, Alberts)
Traitement des cellules Choc hypotonique : KCL 0,075M 37 Fixation : Méthanol/Acide Acétique
TEHNIQUE DU CARYOTYPE SANGUIN 1 Mise en culture 72H Milieu de culture + cellules en division : * Cellules sanguines (lymphocytes + mitogène : Phytohématoglutinine) 2 Colchicine : poison du fuseau mitotique. Bloque les cellules en mitoses 3 culot cellulaire Choc hypotonique et fixations 4 Etalement sur lame de verre 5 Tampon phosphate 85 + Giemsa (bandes R) Ou Traitement par la trypsine (bandes G) Observation au microscope Technique de bandes
Métaphase non classée au microscope
Les chromosomes en bandes Bandes R Dénaturation thermique Bandes G Digestion à la trypsine Idéogramme ISCN 2013
TECHNIQUE DES LIQUIDES AMNIOTIQUES Laboratoire de cytogénétique CHU de MONTPELLIER M PONSET M-C GUERIN
MISE EN CULTURE SUR LABTEK Réception du LA ( réparti dans 2 tubes coniques). Centrifuger le liquide 5 minutes à 1000 tours/minute. Aspirer le surnageant en laissant 0,5 ml au dessus du culot cellulaire. 4 Labtek 1 flacon
SORTIE DES LAMES Surveiller les lames au microscope inversé dès le 5 ème jour. Évaluer les critères de maturation de la culture cellulaire : Richesse de la lame, aspect et taille des clones, indice mitotique. Clone jeune Clone beau Ébauche
RESULTATS Réalisation du caryotype complet : 12 à 25 clones (à partir de 2 à 3 lames) Résultats fiables sur liquides clairs et hémorragiques Possibilité de réaliser la FISH directement sur LABTEK
II. TECHNIQUE 2) L hybridation in situ fluorescente ou FISH
Hybridation in situ fluorescente FISH : Fluorescent in situ hybridization La FISH permet la visualisation d une séquence d ADN (la sonde) marquée par un fluorochrome, in situ après hybridation sur les chromosomes (la cible). L hybridation de la sonde et de la cible est possible en raison de la propriété de la double hélice d ADN de se dénaturer, et de se renaturer en hybridant les séquences complémentaires et de former un duplex sonde cible. La FISH permet l analyse des chromosomes en mitose et en interphase (noyaux interphasiques) et ne dépend pas de l obtention de bandes.
TECHNIQUE D HYBRIDATION IN SITU FLUORESCENTE Préparation des lames. Etalement des noyaux et chromosomes double brins Traitement à la pepsine Fixation à la formaldéhyde Dénaturation de l ADN par la formamide 70% 72 ADN simple brin Préparation de la sonde V V V V V V La sonde est en solution dans une solution d hybridation Contenant de la formamide et est dénaturée à 75 16
TECHNIQUE D HYBRIDATION IN SITU FLUORESCENTE Hybridation de la sonde simple brin sur l ADN de la lame Observation au microscope à fluorescence
Types de Sondes pour la FISH Sondes spécifiques des régions centromèriques qui vont s hybrider sur des séquences répétées en tandem sur plusieurs centaines de kb Enumération des chromosomes. Sondes spécifiques des régions subtélomèriques Diagnostic de translocation cryptique Sondes séquences uniques spécifiques de loci : Sondes commerciales pour les Syndromes microdélétionnels connus BACs (ou autres vecteurs Phage, YACs) marqués dans le laboratoire pour vérification des anomalies de CGH array Sondes de peinture chromosomique obtenues à partir de l amplification par DOP PCR de l ADN d un chromosomes entier obtenu à partir d hybride somatique ou par cytométrie de flux.
Sondes spécifiques des régions centromèriques qui vont s hybrider sur des séquences répétées en tandem sur plusieurs centaines de kb. Intérêt pour l énumération des chromosomes. Sondes centromèriques : Spécifique pour tous les chromosomes sauf 13 et 21 et 14 et 22. La FISH centromèrique est utilisée pour la caractérisation des anomalies de nombre.
Sonde séquence unique : Sont utilisées pour le diagnostic de délétion cryptique (syndromes microdélétionnels)
Sondes de «peinture chromosomique» (whole chromosome painting : WCPs) obtenues à partir de l amplification par DOP PCR de l ADN d un chromosomes entier obtenu à partir d hybride somatique ou par cytométrie de flux. utilisées pour la caractérisation des anomalies de structure.
MultiFish ou FISH 24 couleurs
II. TECHNIQUE 3) Caryotype moléculaire ou Analyse chromosomique sur puce à ADN (ACPA) ou Microréseaux d ADN génomique CGH array (Comparative Genomic Hybridization)
Microarray Il existe différents type de miroarray ou «chips» De nombreuses utilisations en biologie moléculaire : Étude des profils d expression DNA méthylation Splicing mirnas Interaction protéines-adn (Chromatin ImmunoPrecipitation ) Etude des single nucleotide polymorphism : SNP Etude des Copy Number Variation : CNV (CGH array : Comparative Genomic Hybridization)
CGH ARRAY Etudie les CNV : Copy Number Variants La CGH array détecte les déséquilibres génomiques appelés CNV Un CNV correspond à une variation quantitative du génome en comparaison avec un génome de référence diploïde d 1 KB à plusieurs mégabases. Les variations du nombre de copies correspondent à des délétions, des duplications, des insertions, des remaniements complexes.
CGH ARRAY Etudie les CNV : Copy Number Variants Les CNV sont présents chez tous les individus et sont une traduction de la diversité génétique. Certains CNV sont retrouvés fréquemment au sein d une population donnée (>1%) et correspondent à un polymorphisme (CNP)
Hybridation comparative Technique d hybridation qui permet d analyser les anomalies chromosomiques déséquilibrées (gain ou perte) Réalisée à partir de l ADN à étudier + ADN témoin microarray : sondes sur lame de verre des milliers d oligonucléotides représentant tout le génome ADN à tester COHYBRIDATION R = V normal R > V gain ADN témoin R< V perte Mesure du ratio des fluorescence
Detection CNV : CGH array 10, 9 MB délétion 60 gènes 7.2 MB duplication
CGH ARRAY Difficultés pour établir le caractère pathogène d un CNV différents critères sont à établir: Caractère de novo ou hérité des parents : FISH des parents Taille : un remaniement de grande taille (plusieurs megabases) a plus de chance de contenir des gènes sensibles au dosage génique Type : une délétion est généralement plus délètère qu une duplication Contenu en gènes : établir si les gènes contenus dans la région sont associés à des syndromes connus Bases de données : DGV, DECIPHER, Génome Data Base,OMIM Données de la littérature
CGH ARRAY Les CNV diagnostiqués par CGH array doivent être vérifiés par une autre technique quantitative : FISH, QPCR sur le patient et chez les parents 3/4 délétions 1/4 duplications La CGHarray a permis l identification de nouveaux syndromes de microdélétions ou microduplications récurrentes la CGH array détecte en moyenne 10 à 20% d anomalie chez les patients ayant un décalage des acquisitions +/- malformations Pour effectuer le conseil génétique il est nécessaire de déterminer le mécanisme de l anomalie chromosomique Transmission sur un mode déséquilibré d un dérivé d une translocation cryptique parentale Ségrégation méiotique d une insertion parentale équilibrée Remaniement récurrent généré par recombinaison homologue non allélique
CGH ARRAY CNV bénin ou polymorphisme VOUS : Variant Of Unknown Signification CNV pathogène Pour effectuer le conseil génétique il est nécessaire de déterminer le mécanisme de l anomalie chromosomique Transmission sur un mode déséquilibré d un dérivé d une translocation cryptique parentale Ségrégation méiotique d une insertion parentale équilibrée Remaniement récurrent généré par recombinaison homologue non allélique
Algorythme inteprétation CGH array David Miller and al AM J Human Genet 2010 86 749-764
II. TECHNIQUE 4) Séquençage Haut débit Next Generation Sequencing
NGS Permet le séquençage de millions de molécules d ADN simultanément après la préparation d une banque de fragments Les «reads» sont ensuite alignés sur un génome de référence Permet le diagnostic des anomalies moléculaires au niveau génique (mutations) mais aussi des anomalies chromosomiques : Délétion Duplication Inversion Insertion
Intérêts/limites du caryotype standard Analyse pangénomique Permet le diagnostic des anomalies équilibrées Faible résolution : 5MB pour 55O Bandes 10 MB pour 400 bandes Difficultés d analyse de certaines régions chromosomiques en raison de la non discrimination des bandes Nécessite l obtention de cellules en culture Long et laborieux
Intérêts/limites de la FISH Réalisée sur métaphases et/ou noyaux interphasiques Ne nécessite pas l obtention de cellules en culture Permet de compter des centaines de métaphases et noyaux à la recherche d une faible mosaïque Résolution permettant le diagnostic des syndromes microdélétionnels Permet de confirmer une anomalie suspectée sur le caryotype standard Permet l analyse pantélomèrique Etude ciblée Ne permet l analyse que d un nombre limité de régions chromosomiques pour un patient (2 ou 3 sondes)
Intérêts/limites du caryotype moléculaire Analyse pangénomique Résolution A partir de l ADN même en faible quantité Ne diagnostique pas les anomalies équilibrées Difficultés pour les anomalies en mosaïque Difficultés d interprétation des CNV (copie number variation)