Rapport Scientifique Seine-Aval 3

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1 Rapport Scientifique Seine-Aval 3 Séminaire Seine-Aval 2008 Fiches de synthèse des propositions SA4 THEME 3 : TABLEAU DE BORD ET INDICATEURS OPERATIONNELS PUCES A ADN CHEZ MYTILUS EDULIS Danger J-M. C. Lévêque C. Dégremont GIP Seine-Aval 12 Avenue Aristide Briand Rouen tel : fax :

2 1 Résumé L objectif de la proposition de recherche était d isoler des produits de gènes différentiellement régulés par un mélange de xénobiotiques regroupant 4 classes principales de contaminants. Cette partie du projet constitue une des étapes nécessaire à la construction de puces à ADN les plus exhaustives possibles permettant un suivi environnemental des populations de moules bleues qui sont largement utilisées comme espèce sentinelle dans les programmes de biosurveillance. Ces clones complètent le panel de gènes qui avait précédemment été isolé et «imprimé» sur des puces à ADN après exposition à l atrazine. Les banques construites au cours de cette phase 2004 du programme Seine-Aval sont au nombre de 8. Elles visent à dégager des gènes régulés positivement ou négativement par les xénobiotiques tout en prenant en compte les paramètres de tidalité. En effet, les moules sont soumises à une alternance d immersion/émersion qui constitue un stress supplémentaire à celui engendré par la contamination anthropique. Les banques comprennent près de 1300 gènes qui vont enrichir les 1175 clones qui avaient été déjà obtenus chez la moule bleue (voir rapports antérieurs). L ensemble de ces clones peut donc être déposé sur des puces à ADN. L utilisation des puces à ADN qui est fondée sur la comparaison deux à deux de signaux d hybridation d acides nucléiques marqués, requiert une normalisation stricte de ces signaux. Cette normalisation est généralement calculée à partir de gènes qui ne présentent pas de régulation différentielle. Des banques non soustraites sont également construites afin de répondre à cet aspect technique de normalisation. Un total de 800 clones aléatoirement sélectionnés est suffisant pour permettre une normalisation statistiquement satisfaisante. L étape de test des puces à ADN et d établissement d empreintes spécifiques de classes de contaminants fait l objet de la suite de ce travail proposé et accepté pour l année par le programme Seine-Aval. 2 Rappel des objectifs Le travail proposé visait à mettre en œuvre la méthodologie de comparaison des transcriptomes par construction de banques soustractives afin d isoler et d identifier chez la moule bleue des acteurs moléculaires impliqués dans les processus de détoxication et de lutte contre le stress spécifique à l exposition aux contaminants chimiques. L établissement d une collection de clones constitue l étape préalable à la fabrication de puces à ADN dédiées au diagnostic environnemental présentant un nombre suffisant de gènes analysés. 3 Résultats 3.1 Animaux Les moules, Mytilus edulis, sont prélevées à Yport. Leur taille est d environ 4 cm. Les animaux sont ensuite transférés dans des bacs pour une période de dépuration d une semaine. L eau de mer, fournie en flux continu, est prélevée au niveau de la côte près de Saint-Adrien au nord du Havre. Elle est filtrée à 50 µm et épurée sur des filtres à charbon actif. La température de l eau de mer est de 10 C en moyenne. Pendant cette période et lors de l exposition au mélange de contaminants, les animaux sont nourris par un flux continu pendant 2 heures par jour d algues mises en culture (grâce à l aimable collaboration de l association Aquacaux). Deux grandes classes d animaux sont soumises ou non à un régime de marées (6 heures basse mer, 6 heures haute mer). Chaque classe comprend 3 groupes de moules ; les individus témoins, les moules exposées à un mélange de contaminants et les individus exposés à du DMSO (qui est utilisé comme diluant des contaminants). Le mélange

3 de contaminant est composé de benzo-[a]-pyrène (0,5 µg.ml -1 ), phénanthrène (5 µg.ml -1 ), PCB-153 (0,5 µg.ml -1 ), nonylphénol (5 µg.ml -1 ) et carbamazépine (30 µg.ml -1 ) dilués dans du DMSO. Il est distribué dans les différents bacs par l intermédiaire d une pompe péristaltique afin d obtenir les concentrations finales précisées. Chaque groupe d animaux (témoin, témoin DMSO, exposés) comporte cent individus. Les mesures chimiques précises des concentrations en contaminants et en DMSO seront effectuées ultérieurement par le LPTC de l Université de Bordeaux. La période d exposition est de 14 jours, à l issue de laquelle les animaux sont rapidement disséqués (branchies et manteaux). Les tissus, pris individuellement pour chaque animal, sont aussitôt congelés dans de l azote liquide. Une coquille des bivalves est systématiquement conservée afin de déterminer la taille moyenne des individus qui est de 3,9 ± 0,3 cm, ce qui correspond à des animaux de 4 ans environ). La mortalité durant le maintien des animaux en conditions de laboratoire s est élevée au total de 6 individus répartis de façon aléatoire dans l ensemble des groupes. 3.2 Détermination du sexe Le mélange de contaminant contenant des composés susceptibles d avoir un effet perturbateur endocrinien et/ou oestrogéno-mimétique, les sexes des individus doivent être déterminés. Pour cela, il est fait appel à une stratégie par PCR fondée sur l analyse du polymorphisme lié au sexe du gène mitochondrial codant pour la sous-unité 3 de la cytochrome c oxydase. En effet, chez Mytilus edulis, les individus mâles possèdent dans leurs gonades des mitochondries d origine paternelle tandis que chez les femelles, ces organites ont une origine exclusivement maternelle. Les ARN totaux sont extraits du manteau à l aide de TRI Reagent (Sigma). Ces ARN comprennent les ARN ribosomaux, messagers ainsi que les ARN de transfert et l ensemble des ARN mitochondriaux. Ces derniers sont sélectivement rétrotranscrits à l aide du KIT RobusT-II (Finnzyme) à partir du mélange des 4 amorces de PCR dont les séquences sont données ci-après. La PCR est conduite dans le même tube. Deux couples d amorces sont utilisés pour amplifier des fragments de gènes «mâles» (MmtDNAfor : TGGAGTCGCTTTATTTATTTTATCTGA, MmtDNArev: ATACTACA- AACCACAGCCTCACTCATA) et «femelles» (FmtDNAfor : TATGTACCAG- GTCCAAGTCCGTG, FmtDNArev : CACATACACTAAGCACCACAATG). Cette réaction PCR permet de générer des fragments d amplification de 530 et de 753 pb respectivement pour les individus mâles et femelles. Les amplifications PCR sont effectuées dans des plaques 96 puits à l aide de thermocycleurs Biorad et/ou Hybaid. Aucune anomalie des rapports de sexe n est notée dans les différentes échantillons de moules. 3.3 Construction de banques soustractives Extraction et purification des ARNm Les tissus branchiaux provenant de 50 individus mâles sont rassemblés. Les ARN totaux sont extraits à l aide de TRI Reagent (Sigma) suivant le protocole décrit par le fabricant du réactif. Les ARN totaux sont contrôlés par électrophorèse sur gel d agarose à 1,5% dans du tampon TAE en présence de SDS à 0,1%. La quantité d ARN totaux et le spectre UV sont déterminés à l aide d un spectrophotomètre à barrettes (Nanodrop) sur un aliquot de 1 µl. Les rapports de DO260nm/280nm obtenus sont supérieurs à 1,9. Les ARN messagers sont ensuite purifiés sur des particules paramagnétiques à l aide du Kit PolyATtract mrna Isolation Systems Promega. Brièvement, les ARN sont mis en présence d oligod(t) biotinylés dans un tampon d hybridation composé de 5 x SCC. Seuls les ARNm s hybrident et sont piégés à l aide de particules paramagnétiques liées à l avidine. La qualité des messagers et leur pureté est

4 estimée par spectrophotométrie UV (Nanodrop) avant de procéder à la construction de banques soustractives Rétranscription Les ARNm (2,0 µg au total) sont soumis à une digestion à la DNase I afin d éliminer toute contamination d ADN génomique. Ils sont ensuite de nouveau purifiés par extraction au phénol-chloroforme-alcool isoamylique avant d être rétrotranscrits. La rétrotranscription est réalisée à l aide de la SuperscriptIII (Life Sciences Technologies) en utilisant une amorce dégénérée de séquence TTTTGTACAAGCTT 30 N 1 N. La réaction est conduite pendant 1h30 à 42 C Synthèse du second brin d ADN La synthèse du second brin d ADNc est assurée par un cocktail enzymatique composé ADN polymérase I (fragment de Klenow), RNase H d ADN ligase d E. coli. La réaction est ensuite complétée par l ajout d ADN polymérase de T4. La réaction est ensuite arrêtée et une extraction au phénol chloroforme est effectuée Digestion par RsaI Les ADNc sont soumis à une digestion complète par RsaI. Cette digestion est contrôlée par électrophorèse sur gel d agarose. Cette digestion constitue l étape finale pour la fabrication des échantillons qualifiés de «driver» qui seront ensuite utilisés comme soustracteurs lors des hybridations Ligation des adaptateurs Les fragments de digestion RsaI subissent parallèlement deux ligations avec deux adaptateurs différents partiellement bicaténaires (adaptateurs 1 et 2R) en présence de T4 ADN ligase. Les ADNc munis d adaptateurs constituent les «testers» c'est-à-dire les espèces nucléiques qui subissent la soustraction Hybridations Une première série d hybridations est réalisée entre, d une part, les «testers» munis d adaptateurs 1 et les «drivers» et, d autre part, les «testers» munis d adaptateurs 2R et les «drivers». Ces hybridations sont effectuées pendant 8 heures à 68 C. Une seconde hybridation est ensuite réalisée en mélangeant les deux échantillons avec un excès de «driver». Les espèces différentiellement exprimées issues de la soustraction «tester» «driver» sont ensuite amplifiées par PCR suppressive PCR suppressive Les ADNc munis d adaptateurs subissent ensuite un «fill in» afin de remplir les extrémités dépassantes. Une première PCR de 27 cycles est effectuée à l aide d une amorce unique (CTAATACGACTCACTATAGGGC) complémentaire d une portion des adaptateurs 1 et 2R. Ensuite une seconde amplification de 12 cycles est ensuite conduite en utilisant comme matrice une dilution au 1/10 de la première PCR et comme amorces les oligonucléotides (TCGAGCGGCCGCCCG-GGCAGGT et AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT). Les produits de chaque PCR sont déposés sur gel d agarose à 2% pour analyse par électrophorèse.

5 3.3.8 Ligation dans le vecteur pgem-t Les produits issus de la seconde PCR sont introduits par TA-cloning dans le vecteur pgem-t à l aide de T4 DNA ligase Transformation dans les bactéries de la souche Xl1-Blue Les cellules XL1-Blue électro-compétentes sont préparées selon la méthode usuelle. La transformation bactérienne des produits de ligation est effectuée par électroporation (GenePulser, Biorad). Les clones bactériens sont cultivés sur Petri LB additionnés d ampicilline, d Xgal et d IPTG Mise en culture des clones bactériens Chaque colonie est prélevée et cultivée individuellement dans LB ampicilline. Des stocks glycérol des clones bactériens sont systématiquement réalisés Amplification par PCR des inserts Pour chaque clone, une amplification par PCR de l insert est effectuée à l aide des amorces T7 et Sp6 qui s hybrident de part et d autre du «polylinker» de pgem-t. La taille moyenne des inserts obtenus est de 550 bp. 3.4 Analyse des banques Un total de 8 banques soustractives a été construit suivant le schéma suivant : Ces banques comprennent un nombre total de 1293 clones qui doivent maintenant être analysés sur des puces à ADN. La suite du projet est prévue dans le cadre du programme Seine-Aval III pour l année

6 3.5 Construction de banques d ADN Afin de disposer d un panel de clones dits contrôles sur les puces à ADN (projet , Seine-Aval III), des banques d ADNc non soustraites sont construites Extraction et purification des ARNm Les ARN totaux sont extraits à partir de 3 moules non exposées provenant d Yport suivant le protocole décrit plus haut. La méthode utilisée permet de sélectionner des messagers complets notamment à leur extrémité Traitement à la phosphotase alcaline Les ARN isolés sont soumis à une déphosphorylation par la phosphatase alcaline qui laisse les seuls ARN non munis d une coiffe (7MeGppp) avec des extrémités 5 non-phosphorylées. Les messagers complets étant protégés par cette coiffe de l action de la CIP Traitement à la pyrophosphatase Les ARN sont ensuite soumis à l action de la pyrophosphatase acide de tabac qui attaque les messagers munis d une coiffe et génère au niveau ceux-ci une extrémité 5 -phosphate Ligation d un oligo-ribonucléotide Un ARN oligonucléotide de séquence (CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGAC- UGAAGGAGUAGAAA) est ligasé aux extrémités 5 phosphate des ARN qui en sont encore pourvus (les ARNm complets) Transcription inverse La transcription inverse est conduite avec de la Superscript III en utilisant comme amorce l oligonucléotide de séquence GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACA- GTGT Amplification par PCR Les ADNc monocaténaires construits sont ensuite amplifiés par PCR en utilisant comme amorces des oligonucléotides complémentaires de l oligorna (CGACTGGAGCACGA) et l amorce de rétro-transcription (GCTGTCAACGATA). Les produits PCR sont contrôlés par électrophorèse sur gel d agarose Digestion par RsaI Une partie des produits PCR est digérée à l aide de l enzyme RsaI afin de générer des fragments de tailles comparables à celles des inserts obtenus lors de la construction de banques soustractives.

7 3.5.8 Ligation d adaptateurs L adaptateur 1 utilisé lors de la construction de banques soustractive est ligasé à l aide de la T4 DNA ligase sur les fragments RsaI PCR et clonage dans pgem-t Les produits de ligation obtenus à l étape précédente sont amplifiés par PCR à l aide de l amorce utilisée lors de la PCR suppressive. Les produits sont ensuite clonés dans le vecteur plasmidique pgem-t, puis la transformation est effectuée dans des bactéries Xl1-Blue électrocompétentes. L utilisation de cette procédure permet de générer une banque comprenant près de 800 clones qui sont prélèvés de façon aléatoire. Cela doit permettre de construire un segment «contrôle» sur les puces à ADN qui seront construite afin d aider à la normalisation des puces. 4 Conclusion Les banques soustractives construites doivent permettre de faire la distinction entre les effets des contaminants dans le contexte d une alternance des marées. Par ailleurs, les banques nonsoustraites fournissent un ensemble de clones contrôles nécessaires à la normalisation des puces à ADN. Il est désormais possible de passer à la seconde étape de la construction des puces à ADN qui est décrite dans le projet déposé et accepté pour l année du programme Seine-Aval. De façon parallèle et hors programme Seine-Aval, une démarche similaire est développée chez la moule zébrée Dreissena polymorpha. Les résultats obtenus chez les deux espèces de bivalves l une marine, l autre dulcicole, sont confrontés. 5 Publications sur le thème en Article : Masson R., Loup B., Bultelle F., Siah A., Leboulenger F et Danger J.M.. Identification of gene encoding DnaK-type molecular chaperone as potentially down regulated in blue mussels (Mytilus edulis) exposed to acute exposure to atrazine. Hydrobiologia. (Soumis). 5.2 Communications orales ou affichées Masson R., Bultelle F., Siah A., Loup B., Panchout M., Leboulenger F. et Danger J.M. Analyse différentielle des transcriptomes de bivalves bioindicateurs exposés à des contaminants organiques. 18ème Congrès de l ACFAS. Montréal, Canada, Mai Loup B., Marin M., Masson R., Manduzio H., Maillet G., Poret A., Siah A., Bultelle F., Le Foll F., Rocher B. et Danger J.M. Ecotoxicologie moléculaire chez les bivalves : transcriptomique, protéomique et signalisation ionique. 12 Journée de l IFRMP. Dieppe, France. Juin 2004.

8 Masson R., Bultelle F., Loup B., Panchout M., Siah A. and Danger J.M. (2004). Transcriptome analysis in bivalve species (Mytilus edulis and Dreissena polymorpha) as a tool to identify new biomarkers of exposure to xenobiotics. 38 ème Symposium de l Estuarine and Coastal Sciences Association (ECSA). Rouen, Septembre Danger J.M. Development of a genetically modified yeast and of DNA arrays as tools for environmental risk assessment. Symposium on Biotechnologies. Incheon, Corée. Décembre 2004.

9 Crédits photos : C. Dégremont, R. Hocdé, C. Lévêque, S. Moussard Pour tout renseignement, veuillez contacter la coordination scientifique : cdegremont@seine-aval.fr Le GIP Seine-Aval ne saurait être tenu responsable d'évènements pouvant résulter de l'utilisation et de l'interprétation des informations mises à disposition. Travaux co-financés par :