Désolvatation et ionisation de molécules biologiques par électronébullisation
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- Heloïse Crevier
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1 Désolvatation et ionisation de molécules biologiques par électronébullisation Guillaume van der Rest Equipe «Spectrométrie de masse analytique» DCMR Ecole Polytechnique Palaiseau Cedex
2 Plan Un peu d histoire Le mécanisme de l électrospray Electrospray vs nanospray Influence du solvant Interactions non-covalentes Guillaume van der Rest - Atelier Vapomolec 2
3 Un peu d histoire Dole(1970) : ES d une solution de polystyrène ions négatifs multichargés. Premier modèle de la formation d ions à partir de gouttelettes multichargées Iribarne et Thomson (1976) : Nébulisation pneumatique de solutions aqueuses salines. Deuxième modèle : évaporation des ions (IEM) Fenn / Aleksandrov (1984) : Couplage électrospray et spectrométrie de masse Fenn (1988) : Application aux macromolécules multichargées Wilm et Mann (1994) : mise au point du nanospray Guillaume van der Rest - Atelier Vapomolec 3
4 Prix Nobel de chimie 2002 John FENN Koichi TANAKA Electrospray MALDI Guillaume van der Rest - Atelier Vapomolec 4
5 Principe général de l électrospray MALI S. Gaskell, J. Mass. Spectrom. 1997, 32, 677. Guillaume van der Rest - Atelier Vapomolec 5
6 Mécanisme de l électrospray Trois étapes principales Production de gouttelettes multichargées Fission des gouttelettes en mini-gouttelettes Formation d ions en phase gazeuse Guillaume van der Rest - Atelier Vapomolec 6
7 1 Production de gouttelettes multichargées 1 1 Migration des ions positifs à la surface Formation du cône de Taylor par déstabilisation de la surface Guillaume van der Rest - Atelier Vapomolec 7
8 Cône de Taylor en formation R. Cole, J. Mass Spectrom. 2000, 35, 763. Guillaume van der Rest - Atelier Vapomolec 8
9 2 Fission des gouttelettes 2 2 Réduction de la taille des gouttelettes par évaporation Fission de la gouttelette par explosions coulombiennes lorsqu elle atteint la limite de Rayleigh Guillaume van der Rest - Atelier Vapomolec 9
10 3 Formation d ions en phase gazeuse Deux théories Charged Residue Model (Dole) : formation de petites gouttelettes ne contenant qu un seul ion M. Dole et al. J. Chem. Phys. 1968, 49, Ion Evaporation Model (Iribarne & Thomson) : ions éjectés de la surface de la gouttelette multichargée J.V. Iribarne, B.A. Thomson, J. Chem. Phys. 1976, 64, MALI Guillaume van der Rest - Atelier Vapomolec 10
11 Réactions d oxydo-réduction Kebarle et Tang, Anal. Chem, 1993, 65, 972A. Réactions d oxydoréduction dans le capillaire 2 B - B e - 4 H 2 O O H e - Formation de cations radicaux Guillaume van der Rest - Atelier Vapomolec 11
12 Les sources nanospray Utilisation d aiguilles remplies de 1-4 µl de solution Pas de gaz de nébulisation, température et tensions plus faibles Débit de qq nl/min MALI diamètre de 1-4 µm picture from Guillaume van der Rest - Atelier Vapomolec 12
13 Electrospray vs nanospray En nanospray, les gouttelettes initiales sont très petites : Très bonne efficacité d ionisation Formation des ions en phase gazeuse très rapide Moins sensible à la présence de sels Influence du diamètre de l orifice de l aiguille Nano-ESI mass spectra of an equimolar mixture (c = 10-5 mol/l) of neurotensin and maltoheptaose Aiguille non cassée Aiguille cassée Guillaume van der Rest - Atelier Vapomolec 13
14 Exemple de spectre ESI de la myoglobine (16951 Da) C= 10 pmol/µl Débit : 10 µl/min Solvant : H 2 O/AcN/AF 0.2% hème m/z Guillaume van der Rest - Atelier Vapomolec 14
15 Applications à des biomolécules: presque universelle Macromolécules biologiques : peptides, protéines, ADN, ARN, oligosaccharides Usuellement en présence d acide (mode positif) ou de base (mode négatif) Formation d ions multichargés (gamme de m/z réduite) Solvant dénaturant : déplie la structure en solution des molécules, d où une faible influence de la structure en solution. Autres molécules constituantes du vivant : Efficace pour la plupart des molécules polaires, susceptibles d être dans un état protoné (ou cationisé) en solution. Difficulté pour la désolvatation de composés peu polaires (lipides et autres composants hydrophobes) Guillaume van der Rest - Atelier Vapomolec 15
16 Etude d interactions non covalentes Possibilité, dans certaines conditions expérimentales, d observer des édifices liés de manières non covalentes Protéine/protéine Protéine/ligand Protéine/ARN Applications Détermination de stoechiométries Détermination de constantes d association Screening de ligands! Le passage en phase gazeuse peut conduire à des modifications structurales importantes! Guillaume van der Rest - Atelier Vapomolec 16
17 Les conditions expérimentales Choix du tampon Sels volatils compatibles avec la conservation de la structure (acétate d ammonium, bicarbonate d ammonium ) Éliminer sels non volatils, détergents Pression à l interface, voltage et température dans la source Pour améliorer la désolvatation douce du complexe et son transfert en phase gazeuse Attention à préserver les interactions faibles Guillaume van der Rest - Atelier Vapomolec 17
18 Exemple d un complexe protéine ligands : la créatine kinase Apollo ESI source ESI ICR cell 2x10-6 mbar 10-3 mbar 0.1 mbar 1 mbar hexapole CapExit heated glass capillary Guillaume van der Rest - Atelier Vapomolec 18
19 Conditions expérimentales : effet de la tension de désolvatation Dimer 19+ Monomer CapExit 250 V 300 V 7+ * 19+ M exp = Da M theo = Da * adducts m/z * 400 V L interaction non covalente est conservée par l électronébullisation à condition de travailler à un faible potentiel d extraction des ions m/z Guillaume van der Rest - Atelier Vapomolec 19
20 Assemblage compétitif de la créatine kinase avec deux ligands, ATP et ADP 19+ CK * * * 20 µm CK + 40 µm ADP + 40 µm ATP ADP ATP * adducts * * * 20 µm CK + 20 µm ADP + 60 µm ATP m/z Guillaume van der Rest - Atelier Vapomolec 20
21 Effet du tampon sur les états de charge AB AA TEAB TEAA TEAF m/z Créatine kinase 4 µm dans différents tampons (AB = bicarbonate d ammonium; AA = acétate d ammonium; TEAB = bicarbonate de triéthylammonium; TEAA = acétate de tréthylammonium; TEAF = formiate de triéthylammonium), ph 8. Guillaume van der Rest - Atelier Vapomolec 21
22 T E A B T E A A T E A F Effet du tampon sur les constantes d association AB TEAB TEAA 0 2 AA TEAF m/z m/z Créatine kinase 4 µm + ADP 16 µm dans différents tampons (AB = bicarbonate d ammonium; AA = acétate d ammonium; TEAB = bicarbonate de triéthylammonium; TEAA = acétate de tréthylammonium; TEAF = formiate de triéthylammonium), ph 8. Quelle est la «vraie» association en solution? Guillaume van der Rest - Atelier Vapomolec 22
23 Approche en conditions natives Avantages : Taille des systèmes étudiés : permet de monter à des systèmes de très grandes tailles, tant qu ils survivent à la désolvatation (virus entier par exemple) Accès direct aux stoechiométries Mesure de constantes d association en solution. Limites : Attention à la question de la représentativité lors du passage en phase gazeuse. Choix des tampons. Hétérogénéité des systèmes de grande taille : intrinsèque à l échantillon induite par la présence d adduits de solvant ou sels Guillaume van der Rest - Atelier Vapomolec 23
24 Conclusion Avantages Méthode quasi-universelle Technique d ionisation douce (interactions non-covalentes) Technique très sensible Couplage en routine avec HPLC Analyse de composés de très haut poids moléculaire Inconvénients Sensible à la présence de sels Réponse affectée par la présence de contaminants Guillaume van der Rest - Atelier Vapomolec 24
25 Bibliographie et sites web S. Gaskell, J. Mass. Spectrom. 1997, 32, 677. R. Cole, J. Mass Spectrom. 2000, 35, 763. Kebarle and Tang, Anal. Chem. 1993, 65, 972A-986A Guillaume van der Rest - Atelier Vapomolec 25
K W = [H 3 O + ] [OH - ] = 10-14 = K a K b à 25 C. [H 3 O + ] = [OH - ] = 10-7 M Solution neutre. [H 3 O + ] > [OH - ] Solution acide
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