UNIVERSITE MOHAMED V FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE DE RABAT

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1 UNIVERSITE MOHAMED V FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE DE RABAT ANNEE : 2008 THESE N 84 Production de l insuline humanisée A partir des graines de carthame Génétiquement modifié THESE Présentée et soutenue publiquement le.. PAR Melle Kaoutar SKIREDJ Née le 27 Mai, 1984 à Fès Pour l obtention du Doctorat en Pharmacie Mots clés : Insuline Diabète Carthame - OGM. Jury Mr A. ETTAIB Professeur de Zootechnie Mr L. El GUESSABI Professeur de Pharmacognosie Mr H. BENZIANE Professeur agrégé de Pharmacie clinique Mr A. ZAHIDI Professeur agrégé de Chimie thérapeutique Président Rapporteur Juges

2 بسم هللا الرحمان الرحيم «سبحانك ال علم لنا إال ما علمتنا إنك أنت العليم الحكيم» صدق هللا العظيم سورة البقرة: اآلية: 13 b

3 RABAT UNIVERSITE MOHAMMED V- SOUISSI FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE - DOYENS HONORAIRES : Docteur Abdelmalek FARAJ Professeur Abdellatif BERBICH Professeur Bachir LAZRAK Professeur Taieb CHKILI Professeur Mohamed Tahar ALAOUI Professeur Abdelmajid BELMAHI ADMINISTRATION : Doyen Professeur Najia HAJJAJ Vice Doyen chargé des Affaires Académiques et Estudiantines Professeur Mohammed JIDDANE Vice Doyen chargé de la Recherche et de la Coopération Professeur Naima LAHBABI-AMRANI Vice Doyen chargé des Affaires Spécifiques à la Pharmacie Professeur Yahia CHERRAH Secrétaire Général : Monsieur Mohammed BENABDELLAH PROFESSEURS : Décembre Pr. TOUNSI Abdelkader Pathologie Chirurgicale Février, Septembre, Décembre Pr. ARCHANE My Idriss* Pathologie Médicale 3. Pr. BENOMAR Mohammed Cardiologie 4. Pr. CHAOUI Abdellatif Gynécologie Obstétrique 5. Pr. CHKILI Taieb Neuropsychiatrie c

4 Janvier et Décembre Pr. HASSAR Mohamed Pharmacologie Clinique Février Pr. AGOUMI Abdelaziz Parasitologie 8. Pr. BENKIRANE ép. AGOUMI Najia Hématologie 9. Pr. EL BIED ép. IMANI Farida Radiologie Février Mars et Novembre Pr. ARHARBI Mohamed Cardiologie 11. Pr. SLAOUI Abdelmalek Anesthésie Réanimation Mars Pr. LAMDOUAR ép. BOUAZZAOUI Naima Pédiatrie Mars, Avril et Septembre Pr. EL KHAMLICHI Abdeslam Neurochirurgie 14. Pr. MESBAHI Redouane Cardiologie Mai et Octobre Pr. BENOMAR Said* Anatomie Pathologique 16. Pr. BOUZOUBAA Abdelmajid Cardiologie 17. Pr. EL MANOUAR Mohamed Traumatologie-Orthopédie 18. Pr. HAMMANI Ahmed* Cardiologie 19. Pr. MAAZOUZI Ahmed Wajih Chirurgie Cardio-Vasculaire 20. Pr. SBIHI Ahmed Anesthésie Réanimation 21. Pr. TAOBANE Hamid* Chirurgie Thoracique Mai et Novembre Pr. ABROUQ Ali* Oto-Rhino-Laryngologie 23. Pr. BENOMAR M hammed Chirurgie-Cardio-Vasculaire 24. Pr. BENSOUDA Mohamed Anatomie d

5 25. Pr. BENOSMAN Abdellatif Chirurgie Thoracique 26. Pr. CHBICHEB Abdelkrim Biophysique 27. Pr. JIDAL Bouchaib* Chirurgie Maxillo-faciale 28. Pr. LAHBABI ép. AMRANI Naïma Physiologie Novembre Pr. ALAOUI TAHIRI Kébir* Pneumo-phtisiologie 30. Pr. BALAFREJ Amina Pédiatrie 31. Pr. BELLAKHDAR Fouad Neurochirurgie 32. Pr. HAJJAJ ép. HASSOUNI Najia Rhumatologie 33. Pr. SRAIRI Jamal-Eddine Cardiologie Décembre Pr. BOUCETTA Mohamed* Neurochirurgie 35. Pr. EL OUEDDARI Brahim El Khalil Radiothérapie 36. Pr. MAAOUNI Abdelaziz Médecine Interne 37. Pr. MAAZOUZI Ahmed Wajdi Anesthésie -Réanimation 38. Pr. NAJI M Barek * Immuno-Hématologie 39. Pr. SETTAF Abdellatif Chirurgie Novembre et Décembre Pr. BENJELLOUN Halima Cardiologie 41. Pr. BENSAID Younes Pathologie Chirurgicale 42. Pr. EL ALAOUI Faris Moulay El Mostafa Neurologie 43. Pr. IHRAI Hssain * Stomatologie et Chirurgie Maxillo-Faciale 44. Pr. IRAQI Ghali Pneumo-phtisiologie 45. Pr. KZADRI Mohamed Oto-Rhino-laryngologie Janvier, Février et Décembre Pr. AJANA Ali Radiologie 47. Pr. AMMAR Fanid Pathologie Chirurgicale 48. Pr. CHAHED OUAZZANI Gastro-Entérologie 49. Pr. EL FASSY FIHRI Mohamed Taoufiq Pneumo-phtisiologie 50. Pr. EL HAITEM Naïma Cardiologie e

6 51. Pr. EL MANSOURI Abdellah* Chimie-Toxicologie Expertise 52. Pr. EL YAACOUBI Moradh Traumatologie Orthopédie 53. Pr. ESSAID EL FEYDI Abdellah Gastro-Entérologie 54. Pr. LACHKAR Hassan Médecine Interne 55. Pr. OHAYON Victor* Médecine Interne 56. Pr. YAHYAOUI Mohamed Neurologie Décembre Pr. BENHMAMOUCH Mohamed Najib Chirurgie Pédiatrique 58. Pr. DAFIRI Rachida Radiologie 59. Pr. FAIK Mohamed Urologie 60. Pr. FIKRI BEN BRAHIM Noureddine Médecine Préventive, Santé Publique et Hygiène 61. Pr. HERMAS Mohamed Traumatologie Orthopédie 62. Pr. TOULOUNE Farida* Médecine Interne Décembre 1989 Janvier et Novembre Pr. ABIR ép. KHALIL Saadia Cardiologie 64. Pr. ACHOUR Ahmed* Chirurgicale 65. Pr. ADNAOUI Mohamed Médecine Interne 66. Pr. AOUNI Mohamed Médecine Interne 67. Pr. AZENDOUR BENACEUR* Oto-Rhino-Laryngologie 68. Pr. BENAMEUR Mohamed* Radiologie 69. Pr. BOUKILI MAKHOUKHI Abdelali Cardiologie 70. Pr. CHAD Bouziane Pathologie Chirurgicale 71. Pr. CHKOFF Rachid Pathologie Chirurgicale 72. Pr. FARCHADO Fouzia Pédiatrique 73. Pr. HACHIM Mohammed* Médecine-Interne 74. Pr. HACHIMI Mohamed Urologie 75. Pr. KHARBACH Aîcha Gynécologie -Obstétrique 76. Pr. MANSOURI Fatima Anatomie-Pathologique 77. Pr. OUAZZANI Taïbi Mohamed Réda Neurologie 78. Pr. SEDRATI Omar* Dermatologie 79. Pr. TAZI Saoud Anas Anesthésie Réanimation 80. Pr. TERHZAZ Abdellah* Ophtalmologie f

7 Février Avril Juillet et Décembre Pr. AL HAMANY Zaîtounia Anatomie-Pathologique 82. Pr. ATMANI Mohamed* Anesthésie Réanimation 83. Pr. AZZOUZI Abderrahim Anesthésie Réanimation 84. Pr. BAYAHIA ép. HASSAM Rabéa Néphrologie 85. Pr. BELKOUCHI Abdelkader Chirurgie Générale 86. Pr. BENABDELLAH Chahrazad Hématologie 87. Pr. BENCHEKROUN BELABBES Abdelatif Chirurgie Générale 88. Pr. BENSOUDA Yahia Pharmacie galénique 89. Pr. BERRAHO Amina Ophtalmologie 90. Pr. BEZZAD Rachid Gynécologie Obstétrique 91. Pr. CHABRAOUI Layachi Biochimie et Chimie 92. Pr. CHANA El Houssaine* Ophtalmologie 93. Pr. CHERRAH Yahia Pharmacologie 94. Pr. CHOKAIRI Omar Histologie Embryologie 95. Pr. FAJRI Ahmed* Psychiatrie 96. Pr. JANATI Idrissi Mohamed* Chirurgie Générale 97. Pr. KHATTAB Mohamed Pédiatrie 98. Pr. NEJMI Maati Anesthésie-Réanimation 99. Pr. OUAALINE Mohammed* Médecine Préventive, Santé Publique et Hygiène 100. Pr. SOULAYMANI Pharmacologie 101. Pr. TAOUFIK Jamal Chimie thérapeutique Décembre Pr. AHALLAT Mohamed Chirurgie Générale 103. Pr. BENOUDA Amina Microbiologie 104. Pr. BENSOUDA Adil Anesthésie Réanimation 105. Pr. BOUJIDA Mohamed Najib Radiologie 106. Pr. CHAHED OUAZZANI Laaziza Gastro-Entérologie 107. Pr. CHAKIR Noureddine Radiologie 108. Pr. CHRAIBI Chafiq Gynécologie Obstetrique 109. Pr. DAOUDI Rajae Ophtalmologie 110. Pr. DEHAYNI Mohamed* Gynécologie Obstétrique 111. Pr. EL HADDOURY Mohamed Anesthésie Réanimation 112. Pr. EL OUAHABI Abdessamad Neurochirurgie g

8 113. Pr. FELLAT Rokaya Cardiologie 114. Pr. GHAFIR Driss* Médecine Interne 115. Pr. JIDDANE Mohamed Anatomie 116. Pr. OUAZZANI TAIBI Med Charaf Eddine Gynécologie Obstétrique 117. Pr. TAGHY Ahmed Chirurgie Générale 118. Pr. ZOUHDI Mimoun Microbiologie Mars Pr. AGNAOU Lahcen Ophtalmologie 120. Pr. AL BAROUDI Saad Chirurgie Générale 121. Pr. ARJI Moha* Anesthésie Réanimation 122. Pr. BENCHERIFA Fatiha Ophtalmologie 123. Pr. BENJAAFAR Noureddine Radiothérapie 124. Pr. BENJELLOUN Samir Chirurgie Générale 125. Pr. BENRAIS Nozha Biophysique 126. Pr. BOUNASSE Mohammed* Pédiatrie 127. Pr. CAOUI Malika Biophysique 128. Pr. CHRAIBI Abdelmjid Endocrinologie et Maladies Métabolique 129. Pr. EL AMRANI ép. AHALLAT Sabah Gynécologie Obstétrique 130. Pr. EL AOUAD Rajae Immunologie 131. Pr. EL BARDOUNI Ahmed Traumato Orthopédie 132. Pr. EL HASSANI My Rachid Radiologie 133. Pr. EL IDRISSI LAMGHARI Abdennaceur Médecine Interne 134. Pr. EL KIRAT Abdelmajid* Chirurgie Cardio- Vasculaire 135. Pr. ERROUGANI Abdelkader Chirurgie Générale 136. Pr. ESSAKALI Malika Immunologie 137. Pr. ETTAYEBI Fouad Chirurgie Pédiatrique 138. Pr. HADRI Larbi* Médecine Interne 139. Pr. HDA Ali* Médecine Interne 140. Pr. HASSAM Badredine Dermatologie 141. Pr. IFRINE Lahssan Chirurgie Générale 142. Pr. JELTHI Ahmed Anatomie Pathologique 143. Pr. MAHFOUD Mustapha Traumatologie Orthopédie 144. Pr. MOUDENE Ahmed* Traumatologie Orthopédie 145. Pr. MOSSEDDAQ Rachid* Neurologie h

9 146. Pr. OULBACHA Said Chirurgie Générale 147. Pr. RHRAB Brahim Gynécologie Obstétrique 148. Pr. SENOUCI ép. BELKHADIR Karima Dermatologie 149. Pr. SLAOUI Anas Chirurgie Cardio-vasculaire Mars Pr. ABBAR Mohamed* Urologie 151. Pr. ABDELHAK M barek Chirurgie - Pédiatrique 152. Pr. BELAIDI Halima Neurologie 153. Pr. BARHMI Rida Slimane Gynécologie Obstétrique 154. Pr. BENTAHILA Abdelali Pédiatrie 155. Pr. BENYAHIA Mohammed Ali Gynécologie -Obstétrique 156. Pr. BERRADA Mohamed Saleh Traumatologie -Orthopédie 157. Pr. CHAMI Ilham Radiologie 158. Pr. CHERKAOUI Lalla Ouafae Ophtalmologie 159. Pr. EL ABBADI Najia Neurochirurgie 160. Pr. HANINE Ahmed* Radiologie 161. Pr. JALIL Abdelouahed Chirurgie Générale 162. Pr. LAKHDAR Amina Gynécologie Obstétrique 163. Pr. MOUANE Nezha Pédiatrie Mars Pr. ABOUQUAL Redouane Réanimation Médicale 165. Pr. AMRAOUI Mohamed Chirurgie Générale 166. Pr. BAIDADA Abdelaziz Gynécologie Obstétrique 167. Pr. BARGACH Samir Gynécologie Obstétrique 168. Pr. BELLAHNECH Zakaria Urologie 169. Pr. BEDDOUCHE Amoqrane* Urologie 170. Pr. BENAZZOUZ Mustapha Gastro-Entérologie 171. Pr. CHAARI Jilali* Médecine Interne 172. Pr. DIMOU M'barek* Anesthésie Réanimation 173. Pr. DRISSI KAMILI Mohammed Nordine* Anesthésie Réanimation 174. Pr. EL MESNAOUI Abbes Chirurgie Générale 175. Pr. ESSAKALI HOUSSYNI Leila Oto-Rhino-Laryngologie 176. Pr. FERHATI Driss Gynécologie Obstétrique i

10 177. Pr. HASSOUNI Fadil Médecine Préventive, Santé Publique et Hygiène 178. Pr. HDA Abdelhamid* Cardiologie 179. Pr. IBEN ATTYA ANDALOUSSI Ahmed Urologie 180. Pr. IBRAHIMY Wafaa Ophtalmologie 182. Pr. BENOMAR ALI Neurologie 183. Pr. BOUGTAB Abdesslam Chirurgie Générale 184. Pr. ER RIHANI Hassan Oncologie Médicale 185. Pr. EZZAITOUNI Fatima Néphrologie 186. Pr. KABBAJ Najat Radiologie 187. Pr. LAZRAK Khalid (M) Traumatologie Orthopédie 188. Pr. OUTIFA Mohamed* Gynécologie Obstétrique Décembre Pr. AMIL Touriya* Radiologie 190. Pr. BELKACEM Rachid Chirurgie Pédiatrie 191. Pr. BELMAHI Amin Chirurgie réparatrice et plastique 192. Pr. BOULANOUAR Abdelkrim Ophtalmologie 193. Pr. EL ALAMI EL FARICHA EL Hassan Chirurgie Générale 194. Pr. EL MELLOUKI Ouafae* Parasitologie 195. Pr. GAMRA Lamiae Anatomie Pathologique 196. Pr. GAOUZI Ahmed Pédiatrie 197. Pr. MAHFOUDI M barek* Radiologie 198. Pr. MOHAMMADINE EL Hamid Chirurgie Générale 199. Pr. MOHAMMADI Mohamed Médecine Interne 200. Pr. MOULINE Soumaya Pneumo-phtisiologie 201. Pr. OUADGHIRI Mohamed Traumatologie Orthopédie 202. Pr. OUZEDDOUN Naima Néphrologie 203. Pr. ZBIR EL Mehdi* Cardiologie Novembre Pr. ALAMI Mohamed Hassan Gynécologie Obstétrique 205. Pr. BEN AMAR Abdesselem Chirurgie Générale 206. Pr. BEN SLIMANE Lounis Urologie 207. Pr. BIROUK Nazha Neurologie 208. Pr. BOULAICH Mohamed O.RL. j

11 209. Pr. CHAOUIR Souad* Radiologie 210. Pr. DERRAZ Said Neurochirurgie 211. Pr. ERREIMI Naima Pédiatrie 212. Pr. FELLAT Nadia Cardiologie 213. Pr. GUEDDARI Fatima Zohra Radiologie 214. Pr. HAIMEUR Charki* Anesthésie Réanimation 215. Pr. KADDOURI Noureddine Chirurgie Pédiatrique 216. Pr. KANOUNI NAWAL Physiologie 217. Pr. KOUTANI Abdellatif Urologie 218. Pr. LAHLOU Mohamed Khalid Chirurgie Générale 219. Pr. MAHRAOUI CHAFIQ Pédiatrie 220. Pr. NAZZI M barek* Cardiologie 221. Pr. OUAHABI Hamid* Neurologie 222. Pr. SAFI Lahcen* Anesthésie Réanimation 223. Pr. TAOUFIQ Jallal Psychiatrie 224. Pr. YOUSFI MALKI Mounia Gynécologie Obstétrique Novembre Pr. BENKIRANE Majid* Hématologie 226. Pr. KHATOURI Ali* Cardiologie 227. Pr. LABRAIMI Ahmed* Anatomie Pathologique Novembre Pr. AFIFI RAJAA Gastro - Entérologie 229. Pr. AIT BENASSER MOULAY Ali* Pneumo-phtisiologie 230. Pr. ALOUANE Mohammed* Oto- Rhino- Laryngologie 231. Pr. LACHKAR Azouz Urologie 232. Pr. LAHLOU Abdou Traumatologie Orthopédie 233. Pr. MAFTAH Mohamed* Neurochirurgie 234. Pr. MAHASSINI Najat Anatomie Pathologique 235. Pr. MDAGHRI ALAOUI Asmae Pédiatrie 236. Pr. MANSOURI Abdelaziz* Neurochirurgie 237. Pr. NASSIH Mohamed* Stomatologie Et Chirurgie Maxillo Faciale 238. Pr. RIMANI Mouna Anatomie Pathologique k

12 239. Pr. ROUIMI Abdelhadi Neurologie Janvier Pr. ABID Ahmed* Pneumo-phtisiologie 241. Pr. AIT OUMAR Hassan Pédiatrie 242. Pr. BENCHERIF My Zahid Ophtalmologie 243. Pr. BENJELLOUN Dakhama Badr.Sououd Pédiatrie 244. Pr. BOURKADI Jamal-Eddine Pneumo-phtisiologie 245. Pr. CHAOUI Zineb Ophtalmologie 246. Pr. CHARIF CHEFCHAOUNI Al Montacer Chirurgie Générale 247. Pr. ECHARRAB El Mahjoub Chirurgie Générale 248. Pr. EL FTOUH Mustapha Pneumo-phtisiologie 249. Pr. EL MOSTARCHID Brahim* Neurochirurgie 250. Pr. EL OTMANYAzzedine Chirurgie Générale 251. Pr. GHANNAM Rachid Cardiologie 252. Pr. HAMMANI Lahcen Radiologie 253. Pr. ISMAILI Mohamed Hatim Anesthésie-Réanimation 254. Pr. ISMAILI Hassane* Traumatologie Orthopédie 255. Pr. KRAMI Hayat Ennoufouss Gastro-Entérologie 256. Pr. MAHMOUDI Abdelkrim* Anesthésie-Réanimation 257. Pr. TACHINANTE Rajae Anesthésie-Réanimation 258. Pr. TAZI MEZALEK Zoubida Médecine Interne Novembre Pr. AIDI Saadia Neurologie 260. Pr. AIT OURHROUIL Mohamed Dermatologie 261. Pr. AJANA Fatima Zohra Gastro-Entérologie 262. Pr. BENAMR Said Chirurgie Générale 263. Pr. BENCHEKROUN Nabiha Ophtalmologie 264. Pr. BOUSSELMANE Nabile* Traumatologie Orthopédie 265. Pr. BOUTALEB Najib* Neurologie 266. Pr. CHERTI Mohammed Cardiologie 267. Pr. ECH-CHERIF EL KETTANI Selma Anesthésie-Réanimation 268. Pr. EL HASSANI Amine Pédiatrie 269. Pr. EL IDGHIRI Hassan Oto-Rhino-Laryngologie l

13 270. Pr. EL KHADER Khalid Urologie 271. Pr. EL MAGHRAOUI Abdellah* Rhumatologie 272. Pr. GHARBI Mohamed El Hassan Endocrinologie et Maladies Métaboliques 273. Pr. HSSAIDA Rachid* Anesthésie-Réanimation 274. Pr. MANSOURI Aziz Radiothérapie 275. Pr. OUZZANI CHAHDI Bahia Ophtalmologie 276. Pr. RZIN Abdelkader* Stomatologie et Chirurgie Maxillo-faciale 277. Pr. SEFIANI Abdelaziz Génétique 278. Pr. ZEGGWAGH Amine Ali Réanimation Médicale PROFESSEURS AGREGES : Décembre Pr. ABABOU Adil Anesthésie-Réanimation 280. Pr. AOUAD Aicha Cardiologie 281. Pr. BALKHI Hicham* Anesthésie-Réanimation 282. Pr. BELMEKKI Mohammed Ophtalmologie 283. Pr. BENABDELJLIL Maria Neurologie 284. Pr. BENAMAR Loubna Néphrologie 285. Pr. BENAMOR Jouda Pneumo-phtisiologie 286. Pr. BENELBARHDADI Imane Gastro-Entérologie 287. Pr. BENNANI Rajae Cardiologie 288. Pr. BENOUACHANE Thami Pédiatrie 289. Pr. BENYOUSSEF Khalil Dermatologie 290. Pr. BERRADA Rachid Gynécologie Obstétrique 291. Pr. BEZZA Ahmed* Rhumatologie 292. Pr. BOUCHIKHI IDRISSI Med Larbi Anatomie 293. Pr. BOUHOUCH Rachida Cardiologie 294. Pr. BOUMDIN El Hassane* Radiologie 295. Pr. CHAT Latifa Radiologie 296. Pr. CHELLAOUI Mounia Radiologie 297. Pr. DAALI Mustapha* Chirurgie Générale 298. Pr. DRISSI Sidi Mourad* Radiologie 299. Pr. EL HAJOUI Ghziel Samira Gynécologie Obstétrique 300. Pr. EL HIJRI Ahmed Anesthésie-Réanimation 301. Pr. EL MAAQILI Moulay Rachid Neuro-Chirurgie m

14 302. Pr. EL MADHI Tarik Chirurgie-Pédiatrique 303. Pr. EL MOUSSAIF Hamid Ophtalmologie 304. Pr. EL OUNANI Mohamed Chirurgie Générale 305. Pr. EL QUESSAR Abdeljlil Radiologie 306. Pr. ETTAIR Said Pédiatrie 307. Pr. GAZZAZ Miloudi* Neuro-Chirurgie 308. Pr. GOURINDA Hassan Chirurgie-Pédiatnique 309. Pr. HRORA Abdelmalek Chirurgie Générale 310. Pr. KABBAJ Saad Anesthésie-Réanimation 311. Pr. KABIRI EL Hassane* Chirurgie Thoracique 312. Pr. LAMRANI Moulay Omar Traumatologie Orthopédie 313. Pr. LEKEHAL Brahim Chirurgie Vasculaire Périphérique 314. Pr. MAHASSIN Fattouma* Médecine Interne 315. Pr. MEDARHRI Jalil Chirurgie Générale 316. Pr. MIKDAME Mohammed* Hématologie Clinique 317. Pr. MOHSINE Raouf Chirurgie Générale 318. Pr. NABIL Samira Gynécologie Obstétrique 319. Pr. NOUINI Yassine Urologie 320. Pr. OUALIM Zouhir* Néphrologie 321. Pr. SABBAH Farid Chirurgie Générale 322. Pr. SEFIANI Yasser Chirurgie Vasculaire Périphérique 323. Pr. TAOUFIQ BENCHEKROUN Soumia Pédiatrie 324. Pr. TAZI MOUKHA Karim Urologie Décembre Pr. AL BOUZIDI Abderrahmane* Anatomie Pathologique 326. Pr. AMEUR Ahmed* Urologie 327. Pr. AMRI Rachida Cardiologie 328. Pr. AOURARH Aziz* Gastro-Entérologie 329. Pr. BAMOU Youssef * Biochimie-Chimie 330. Pr. BELGHITI Laila Gynécologie Obstétrique 331. Pr. BELMEJDOUB Ghizlene* Endocrinologie et Maladies Métaboliques 332. Pr. BENBOUAZZA Karima Rhumatologie 333. Pr. BENZEKRI Laila Dermatologie 334. Pr. BENZZOUBEIR Nadia* Gastro Enterologie n

15 335. Pr. BERADY Samy* Médecine Interne 336. Pr. BERNOUSSI Zakiya Anatomie Pathologique 337. Pr. BICHRA Mohamed Zakarya Psychiatrie 338. Pr. CHOHO Abdelkrim * Chirurgie Générale 339. Pr. CHKIRATE Bouchra Pédiatrie 340. Pr. EL ALAMI EL FELLOUS Sidi Zouhair Chirurgie Pédiatrique 341. Pr. EL ALJ Haj Ahmcd Urologie 342. Pr. EL BARNOUSSI Leila Gynécologie Obstétrique 343. Pr. EL HAOURI Mohamed * Dermatologie 344. Pr. EL MANSARI Omar* Chirurgie Générale 345. Pr. ES-SADEL Abdelhamid Chirurgie Générale 346. Pr. FILALI ADIB Abdelhai Gynécologie Obstétrique 347. Pr. HADDOUR Leila Cardiologie 348. Pr. HAJJI Zakia Ophtalmologie 349. Pr. IKEN Ali Urologie 350. Pr. ISMAEL Farid Traumatologie Orthopédie 351. Pr. JAAFAR Abdeloihab* Traumatologie Orthopédie 352. Pr. KRIOULE Yamina Pédiatrie 353. Pr. LAGHMARI Mina Ophtalmologie 354. Pr. MABROUK Hfid* Traumatologie Orthopédie 355. Pr. MOUSSAOUI RAHALI Driss* Gynécologie Obstétrique 356. Pr. MOUSTAGHFIR Abdelhamid* Cardiologie 357. Pr. MOUSTAINE My Rachid Traumatologie Orthopédie 358. Pr. NAITLHO Abdelhamid* Médecine Interne 359. Pr. OUJILAL Abdelilah Oto-Rhino-Laryngologie 360. Pr. RACHID Khalid * Traumatologie Orthopédie 361. Pr. RAISS Mohamed Chirurgie Générale 362. Pr. RGUIBI IDRISSI Sidi Mustapha* Pneumo-phtisiologie 363. Pr. RHOU Hakima Néphrologie 364. Pr. RKIOUAK Fouad* Endocrinologie et Maladies Métaboliques 365. Pr. SIAH Samir * Anesthésie Réanimation 366. Pr. THIMOU Amal Pédiatrie 367. Pr. ZENTAR Aziz* Chirurgie Générale 368. Pr. ZRARA Ibtisam* Anatomie Pathologique o

16 Janvier Pr. ABDELLAH El Hassan Ophtalmologie 370. Pr. AMRANI Mariam Anatomie Pathologique 371. Pr. BENBOUZID Mohammed Anas Oto-Rhino-Laryngologie 372. Pr. BENKIRANE Ahmed* Gastro-Entérologie 373. Pr. BENRAMDANE Larbi* Chimie Analytique 374. Pr. BOUGHALEM Mohamed* Anesthésie Réanimation 375. Pr. BOULAADAS Malik Stomatologie et Chirurgie Maxillo-faciale 376. Pr. BOURAZZA Ahmed* Neurologie 377. Pr. CHERRADI Nadia Anatomie Pathologique 378. Pr. EL FENNI Jamal* Radiologie 379. Pr. EL HANCHI Zaki Gynécologie Obstétrique 380. Pr. EL KHORASSANI Mohamed Pédiatrie 381. Pr. EL YOUNASSI Badreddine* Cardiologie 382. Pr. HACHI Hafid Chirurgie Générale 383. Pr. JABOUIRIK Fatima Pédiatrie 384. Pr. KARMANE Abdelouahed Ophtalmologie 385. Pr. KHABOUZE Samira Gynécologie Obstétrique 386. Pr. KHARMAZ Mohamed Traumatologie Orthopédie 387. Pr. LEZREK Mohammed* Urologie 388. Pr. MOUGHIL Said Chirurgie Cardio-Vasculaire 389. Pr. NAOUMI Asmae* Ophtalmologie 390. Pr. SAADI Nozha Gynécologie Obstétrique 391. Pr. SASSENOU Ismail* Gastro-Entérologie 392. Pr. TARIB Abdelilah* Pharmacie Clinique 393. Pr. TIJAMI Fouad Chirurgie Générale 394. Pr. ZARZUR Jamila Cardiologie Janvier Pr. ABBASSI Abdelah Chirurgie Réparatrice et Plastique 396. Pr. AL KANDRY Sif Eddine* Chirurgie Générale 397. Pr. ALAOUI Ahmed Essaid Microbiologie 398. Pr. ALLALI fadoua Rhumatologie 399. Pr. AMAR Yamama Néphrologie p

17 400. Pr. AMAZOUZI Abdellah Ophtalmologie 401. Pr. AZIZ Noureddine* Radiologie 402. Pr. BAHIRI Rachid Rhumatologie 403. Pr. BARAKAT Amina Pédiatrie 404. Pr. BENHALIMA Hanane Stomatologie et Chirurgie Maxillo Faciale 405. Pr. BENHARBIT Mohamed Ophtalmologie 406. Pr. BENYASS Aatif Cardiologie 407. Pr. BERNOUSSI Abdelghani Ophtalmologie 408. Pr. BOUKALATA Salwa Radiologie 409. Pr. CHARIF CHEFCHAOUNI Mohamed Ophtalmologie 410. Pr. DOUDOUH Abderrahim* Biophysique 411. Pr. EL HAMZAOUI Sakina Microbiologie 412. Pr. HAJJI Leila Cardiologie 413. Pr. HESSISSEN Leila Pédiatrie 414. Pr. JIDAL Mohamed* Radiologie 415. Pr. KARIM Abdelouahed Ophtalmologie 416. Pr. KENDOUSSI Mohamed* Cardiologie 417. Pr. LAAROUSSI Mohamed Chirurgie Cardio Vasculaire 418. Pr. LYACOUBI Mohammed Parasitologie 419. Pr. NIAMANE Radouane* Rgumatologie 420. Pr. RAGALA Abdelhak Gynécologie Obstétrique 421. Pr. REGRAGUI Asmaa Anatomie Pathologique 422. Pr. SBIHI Souad Histo Embryologie Cytogénétique 423. Pr. TNACHERI OUAZZANI Btissam Ophtalmologie 424. Pr. ZERAIDI Najia Gynécologie Obstétrique Avril Pr. ACHEMLAL Lahsen* Rhumatologie 426. Pr. AFIFI Yasser Dermatologie 427. Pr. AKJOUJ Said* Radiologie 428. Pr. BELGNAOUI Fatima Zahra Dermatologie 429. Pr. BELMEKKI Abdelkader* Hematologie 430. Pr. BENCHEIKH Razika O.R.L 431. Pr. BIYI Abdelhamid* Biophysique 432. Pr. BOUHAFS Mohamed El Amine Chirurgie Pédiatrique q

18 433. Pr. BOULAHYA Abdellatif* Chirurgie Cardio-Vasculaire 434. Pr. CHEIKHAOUI Younes Chirurgie Cardio-Vasculaire 435. Pr. CHENGUETI ANSARI Anas Gynécologie Obstétrique 436. Pr. DOGHMI Nawal Cardiologie 437. Pr. ESSAMRI Wafaa Gastro-Entérologie 438. Pr. FELLAT Ibtissam Cardiologie 439. Pr. FAROUDY Mamoun Anesthésie Réanimation 440. Pr. GHADOUANE Mohammed* Urologie 441. Pr. HARMOUCHE Hicham Médecine Interne 442. Pr. HNAFI Sidi Mohamed* Anesthésie Réanimation 443. Pr. IDRISS LAHLOU Amine Microbiologie 444. Pr. JROUNDI Laila Radiologie 445. Pr. KARMOUNI Tariq Urologie 446. Pr. KILI Amina Pédiatrie 447. Pr. KISRA Hassan Psychiatrie 448. Pr. KISRA Mounir Chirurgie Pédiatrique 449. Pr. KHARCHAFI Aziz* Médecine Interne 450. Pr. LMIMOUNI Badreddine* Parasitologie 451. Pr. MANSOURI Hamid* Radiothérapie 452. Pr. NAZIH Naoual O.R.L 453. Pr. OUANASS Abderrazzak Psychiatrie 454. Pr. SAFI Soumaya* Endocrinologie 455. Pr. SEKKAT Fatima Zahra Psychiatrie 456. Pr. SEFIANI Sana Anatomie Pathologique 457. Pr. SOUALHI Mouna Pneumo-Phtisiologie 458. Pr. ZAHRAOUI Rachida Pneumo-Phtisiologie ENSEIGNANTS SCIENTIFIQUES PROFESSEURS 1. Pr. ALAMI OUHABI Naima Biochimie 2. Pr. ALAOUI KATIM Pharmacologie 3. Pr. ALAOUI SLIMANI Lalla Naïma Histologie Embryologie 4. Pr. ANSAR M'hammed Chimie Organique et Pharmacie Chimique 5. Pr. BOUKLOUZE Abdelaziz Applications Pharmaceutiques 6. Pr. BOURJOUANE Mohamed Microbiologie r

19 7. Pr. DRAOUI Mustapha Chimie Analytique 8. Pr. EL GUESSABI Lahcen Pharmacognosie 9. Pr. ETTAIB Abdelkader Zootechnie 10. Pr. FAOUZI Moulay El Abbes Pharmacologie 11. Pr. HMAMOUCHI Mohamed Chimie Organique 12. Pr. REDHA Ahlam Biochimie 13. Pr. TELLAL Saida* Biochimie 14. Pr. TOUATI Driss Pharmacognosie 15. Pr. ZELLOU Amina Chimie Organique * Enseignants Militaires s

20 DEDICACE Je dédie ce modeste travail à : Mes très chers parents et grands parents, source d amour et de compréhension inépuisable. Aucune dédicace ne saurait exprimer mon grand amour, mon estime, ma vive gratitude, mon intime attachement et ma profonde affection envers eux. Que Dieu leur accorde longue vie. Mes frères Abdallah et Abderrahman, en témoignage de leur solide fraternité. Que Dieu leur accorde succès et bonheur. Ma belle sœur et cousine Lalla Hajar et sa petite famille. Tous les membres de ma famille et des familles proches : Skiredj, Ammor, Zemmouri, Khaoulani, Jabrane, Benjelloun, Tlemssani, Debbarh, Fassi Fihri et Tssouli. Toutes mes amies et collègues. Tous les professeurs et corps administratif de la faculté de médecine et de pharmacie de Rabat t

21 Remerciements Mes sincères remerciements s adressent tout d abord au Professeur El Guessabi Lahcen, pour la confiance qu il m a accordée, son soutien, ses critiques constructives et ses conseils qui m ont permis d évoluer dans la présente recherche. Je tiens à le remercier aussi pour le temps qu il a consacré à ma thèse afin de la garnir de rigueur. Je remercie aussi le Professeur Abdelkader Ettaïb, pour avoir accepté de présider ce jury. Qu il trouve ici ma profonde reconnaissance. J adresse toute ma gratitude à tous les membres de jury pour le soin avec lequel ils ont lu mon rapport et l intérêt qu ils ont porté à mon travail ; je tiens à les remercier pour avoir accepté de juger cette thèse. Je tiens aussi à remercier sincèrement tous les professeurs qui ont contribué à ma formation, pour leurs conseils pertinents, soutiens, moral et scientifique et pour leur disponibilité. J exprime aussi mes vifs remerciements aux chercheurs de l entreprise pharmaceutique canadienne SemBioSys pour leur documentation et la permission qu ils m ont accordée à utiliser les photos de leurs publications. Qu ils trouvent ici le témoignage de ma reconnaissance. Je remercie également tous ceux qui m ont guidée et aidée de près ou de loin à élaborer ce modeste travail. u

22 Liste des figures Intitulé Page Fig. 1- Graines de Carthame 6 Fig. 2- a- Fleurs sèches de Carthame ; 2-b- portrait de Carthame 8 Fig. 3- Culture de Carthame 9 Fig. 4 : Glycosylation de l anticorps Guy s Fig. 5 : Biosynthèse, transport et maturation des protéines dans la cellule végétale 51 Fig. 6- Structure chimique de l insuline 64 Fig. 7- Le pancréas 71 Fig. 8- Section d une graine de Carthame. Localisation des protéines 121 Fig. 9- Structure d un corps lipidique d une graine de Carthame 121 Fig. 10 a et b- Introduction du gêne d oléosine fusionné avec le gène d intérêt 122 Fig. 11- Carte d un système biologique de stratosome 123 Fig. 12- Technologie d extraction d un corps lipidique d une graine de Carthame 123 Fig. 13- Représentation schématique de l insuline humaine 124 Fig. 14- Détermination chromatographique des protéines d une graine de Carthame 124 Fig. 15- Test de tolérance de l insuline 125 Fig. 16- Analyse spectrale de masse de l insuline d origine végétale 126 v

23 Table des matières Intitulés Page Introduction et problématique 1 But et objectifs de la recherche 3 Méthodologie 4 Chapitre I Le carthame (Safran bâtard) : 1-1- Plante Fleur Graine Principales espèces botaniques connues Historique Propriétés médicinales et alimentaires Culture Culture au Maroc Carthame génétiquement modifié pour produire la pro insuline humaine. 10 Conclusion 12 Chapitre II : L agriculture moléculaire, une nouvelle orientation en confrontation à la 13 mondialisation : 2-1- Introduction 2-2- Les 3 générations de l agriculture moléculaire végétale Historique de la production pharmaceutique à partir d OGM Réglementation de l agriculture moléculaire Les avantages de la moléculture Les plantes, nouveaux vaccins comestibles Rentabilité de l agriculture moléculaire Conclusion 23 Conclusion 26 Chapitre III : Les risques soulevés par la moléculture Introduction Les voies d introduction des biomolécules dans l environnement ainsi que dans 28 l alimentation humaine et animale 3-3- Risques pour la santé humaine et animale Les consommateurs face à 33 l agriculture moléculaire végétale Conclusion 35 w

24 Chapitre IV : Particularités des protéines à usage pharmaceutique dans les plantes transgéniques Introduction La machinerie de glycosylation Retouches protéolytiques Caractère immunogène des glycanes des «planticorps» Humanisation des glycoprotéines recombinantes d origine végétale Rétention 47 de la protéine recombinante dans le réticulum endoplasmique 4-7- Conclusion et perspectives 49 Chapitre V : Ingénierie moléculaire et étapes de production des oléosines modifiées 50 pour la production de l insuline humanisée Introduction Voies d amélioration de la synthèse des protéines La transcription Les étapes post- transcriptionnelles La traduction Étapes post-traductionnelles Technologie de l extraction de la protéine d intérêt 60 Conclusion 61 Chapitre VI : L Insuline Introduction La pro insuline et la maturation de 62 l insuline 6-3- Structure biochimique de l insuline et son historique Normes et pratique d utilisation de l insuline par le diabétique Impact de l insuline sur le métabolisme cellulaire Conclusion 68 Chapitre VII : Généralités sur le diabète. Impact d une alimentation raisonnée Introduction Généralités Diabète, problèmes de l insulino- résistance, maladies cardio-vasculaires secondaires, 73 rôle d une alimentation équilibrée Rappels. 82 x

25 Lutte contre l insulino résistance Une alimentation raisonnée Recommandations alimentaires Un sport adapté Conclusion 93 Chapitre VIII : Synthèse et discussion 94 Conclusion générale 102 Résumés (français, anglais, arabe) 104 Références bibliographiques 107 Annexes 1 : Correspondances avec Sembiosys 116 Annexes 2 : Illustrations 121 Serments 127 y

26 Introduction et problématique Actuellement, environ 150 millions de personnes dans le monde sont atteintes de diabète de type 1 et ont besoin d injection d insuline. Des experts estiment que le nombre de personnes concernées doublera dans les 25 prochaines années (M. Lang & A. Baum, 2005). Des scientifiques testent actuellement de nouvelles méthodes moins pénibles que les piqûres, à l aide desquelles les patients pourraient avaler l insuline ou la faire pénétrer par les muqueuses du nez ou des poumons (Guevara CA., 2007 ; Morishita M. et al, 2007). Etant donné qu une telle absorption est moins efficace, des doses cinq à dix fois supérieures seraient indispensables. Compte tenu de ce fait, la demande en insuline augmentera considérablement dans les prochaines années (M. Lang & A. Baum, 2005). De même, la technologie actuelle de production de l insuline humaine qui utilise des microorganismes (cultures de bactéries et de levures dans des bioréacteurs) n est plus adaptée à cette forte demande en insuline à cause du coût élevé de sa production. Une alternative possible, nettement plus économique, serait la production d insuline à base de plantes (Nykiforuk CL, 2006). Afin de pouvoir déterminer si la nouvelle méthode est techniquement et commercialement rentable, des chercheurs canadiens ont effectué des essais en laboratoire sur une mauvaise herbe particulière, l arabette ou plante d Arabidopsis (Nykiforuk CL, 2006). Les scientifiques de z

27 l entreprise canadienne (SemBioSys, 2005) ont travaillé de la manière suivante : Ils ont identifié une protéine autour des corps lipidiques présents dans les graines d arabidopsis et de carthame : l oléosine. Ils ont lié un gène hybride (codant pour l insuline humaine) au génome de ces plantes, menant à la production d une protéine composée d oléosine et d insuline. Cette protéine s accumule autour des corps lipidiques dans les graines et peut être recueillie après centrifugation et traitement à la trypsine, une enzyme qui sert à séparer l insuline humaine de l oléosine. Après une dernière étape de purification, les chercheurs ont finalement réussi à extraire de l insuline humaine biologiquement active. Grâce à sa petite taille et à son maniement simple, l arabidopsis se prête parfaitement aux expériences en laboratoire. En revanche, elle ne serait pas appropriée à une production de produits pharmaceutiques en grande quantité. C est pourquoi les chercheurs de SemBioSys ont testé avec succès le carthame des teinturiers (Carthamus tinctorius). Ces plantes permettent une culture à grande échelle et sont une source abondante de corps lipidiques, et par conséquent, d insuline humaine (Nykiforuk CL, 2006). aa

28 La méthode de production de l insuline humaine à l aide des plantes de carthame est actuellement optimisée. Des essais cliniques ont été conduits sur trois années et ont prouvé la réussite du choix de cette plante pour la production de l insuline et la facilité de sa purification. La méthode traditionnelle qui se sert de microorganismes génétiquement modifiés s avère plus coûteuse de 40 à 60 % que celle du carthame. En visant l'objectif d avoir un rapport «quantité d insuline/ quantité de protéines totales de la graine» de un pourcent, le rendement de production pourrait être de deux kilos d'insuline par hectare de Carthame, ce qui représente une quantité suffisante pour assurer le traitement de 2500 patients pendant un an. Les chercheurs pensent être capables de répondre aux besoins mondiaux dès 2010, en exploitant moins de 8000 hectares de plants de carthame (M. Lang & A. Baum, 2005 ; J. Guth et al, 2006). Ce mode de production de médicaments ou d intermédiaires pharmaceutiques dans les plantes est connu sous le nom de pharming ou de moléculture. Il a depuis longtemps séduit les industriels de la pharmacie et des biotechnologies. En effet, plusieurs classes de médicaments peuvent être produites dans des plantes et sont en cours de développement : vaccins (cholera, hépatite B), enzymes (lipase), anticorps (traitement du cancer, du paludisme), hormones (insuline, hormone de croissance), protéines de structure (collagène), etc. Le «pharming» porte en germe la promesse de médicaments moins chers, pouvant être produits dans des pays en développement, là où ils sont le plus nécessaires. Certaines molécules ont vu ainsi leurs coûts de production diminués d un facteur de 10 à 100. Un autre avantage très important pour les industriels réside dans le fait que la quantité de bb

29 protéines produites peut être facilement modulée avec des investissements limités dans les moyens de production (Moschini, G. et al, 1999). De plus, les plantes permettent la production de certaines protéines complexes qui ne sont actuellement pas synthétisées de façon fonctionnelle dans des microorganismes (levures, bactéries, champignons ). But et objectifs de la recherche Le but de cette recherche est de faire le point sur le fort potentiel de production de l insuline par les graines de carthame génétiquement modifié. Les objectifs spécifiques et les chapitres du présent travail bibliographique sont les suivants : 1. Le carthame génétiquement modifié, plante prometteuse dans la production d insuline : Fiche technique, historique, utilisations médicinales et culture. 2. Les cultures moléculaires, les modifications génétiques, les anticorps et l éthique dans l utilisation des OGM. 3. La technologie de l oléosine pour la production de l insuline. 4. Analyse bibliographique sur la pro insuline, l insuline et les produits analogues : Aspects biochimiques et physiologiques. 5. Analyse bibliographique sur le diabète et impact du sport et d une alimentation à base végétale, particulièrement de fruits et de légumes sur la maladie. cc

30 Méthodologie Le présent travail est bibliographique. Il épuise ses sources de références principalement des sites web de l Internet, des articles de recherche et des thèses des mémorisants de la Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat. Une correspondance particulière a été établie avec les chercheurs de la société canadienne SemBioSys. En communicant par , différentes explications et éclaircissements ont été apportés à ce rapport. Une autorisation particulière a été reçue de leur part (annexe 1) afin d inclure dans le présent document les photos de leur découverte (annexe 2). dd

31 Chapitre I Le carthame (Safran Bâtard) 1.1- La plante : Le carthame est une plante annuelle, de la famille des Astéracées (composées). Elle est légèrement épineuse, apparentée au cardon et mesure 0,60 à 1,50 m de hauteur. Elle est originaire des zones chaudes et sèches (Zone méditerranéenne, Mexique, Australie, Iran, Inde, Chine, etc ). La plante est buissonneuse, ornée de fleurs nombreuses de couleur jaunes, oranges et rouges. Ces fleurs sont tubuleuses et groupées en capitules solitaires en haut des rameaux. Chaque capitule, comme pour les autres cardons, comprend de nombreuses fleurs, chacune pouvant produire potentiellement une seule graine. Chaque capitule, contenant une centaine de fleurs, peut produire de 20 à 100 graines de forme semblable à celle des petites graines de riz. La graine est composée d'une masse entourée d'une coque fibreuse épaisse, difficile à enlever. Les farines de carthame sont produites à partir de graines non décortiquées La fleur est le plus souvent jaune foncé, mais, selon le génotype, elle peut être rouge orangé, rouge, jaune citron ou même blanche. Le carthame est généralement une plante autogame. Pendant la phase de maturité, les plantes se dessèchent complètement et les graines peuvent être récoltées sans problème à la fin du mois d Août. Le fruit du carthame est un akène, dont le poids de mille grains est d environ 30 grammes (30 mg/graine). ee

32 1.3- Les graines sont de la grosseur d un gros grain d orge, de couleur blanche, brunâtre ou blanc, rayée de gris, de brun ou de noir. Elles contiennent environ 17% de protéine brute et 35% de matière grasse brute, dont 70% d acide linoléique et 20% d acide oléique ; le reste sous forme d acide palmitique (5%) et d autres acides gras. La graine de carthame s appelle «Cardy». Elle est aussi appelée «Graine de Perroquet, Safran Bâtard, Safran des Prés, Safran des teinturiers». En Anglais, la plante est appelée «Safflower, Saffron Thistle, False Saffron» (Wikipedia, the free encyclopedia, 2007). Fig. 1 : Graines de Carthame 1.4- Principales espèces botaniques connues : Carthamus arborescens L. (carthame arborescent), plante du sud de l'espagne et du nord-ouest de l'afrique. Carthamus boissieri Halácsy, plante des îles grecques. Carthamus dentatus, plante des Balkans et de la Turquie. Carthamus lanatus L. (carthame laineux), présent dans tout le bassin méditerranéen. Carthamus tenuis, plante de la méditerranée orientale. ff

33 1.5- Historique : Le carthame est connu depuis la plus haute Antiquité. Les Égyptiens l utilisaient comme colorant allant du jaune au rouge extrait de ses fleurs pour l imprégnation des bandelettes entourant les momies car on lui attribuait une action contre les moisissures. Il est utilisé également en Inde dans la cuisine pour colorer les aliments en jaune (à la place du vrai safran). Les fleurs de carthame contiennent de la carthamine (C14 H16 O7), un colorant de type flavonoïde. Au XIXe siècle on a abandonné ses propriétés colorantes à l avènement des colorants synthétiques (aniline) et on le cultive désormais davantage pour extraire de ses graines une huile très appréciée. Actuellement, il est cultivé comme plante génétiquement modifiée (PGM) afin de produire de l insuline humaine Propriétés médicinales et alimentaires : Les fleurs de carthame sont utilisées contre les douleurs musculaires. L huile de carthame est considérée comme un anticoagulant qui fait circuler le sang et disperse les amas de cholestérol. La richesse en acide gras oléique le rend nécessaire dans des cas d artériosclérose, maladies cardiovasculaires, arthrite, rhumatismes. Les graines contiennent de l'acide linoléique (70%) et de l'acide oléique (20%) ; ce dernier, avec la même teneur élevée en vitamine E (310 ppm), est responsable de la bonne réputation d'huile de carthame parmi les nutritionnistes. L huile de carthame peut être consommée directement ou entrer dans la fabrication de corps gras (margarine). Les graines sont aussi utilisées directement pour la gg

34 nourriture des oiseaux et entrent dans la composition d aliments pour le bétail (Quillet & Larousse, Encyclopédies 2007). Fig 2. a- Fleurs sèches de Carthame carthame Fig 2.b- Portrait du 1.7- Culture : Le carthame est une culture qui s'adapte à des sols peu fertiles, à différents climats et il a besoin de peu d'eau. La culture ressemble à celle du cardon vulgaire. La plante supporte bien les gelées au début de son développement et également bien la sécheresse une fois arrivée à maturité. La plante commence à croître en hauteur en Mai, puis les pousses latérales se développent. Les plantes sont très résistantes à la verse grâce à leurs racines pivotantes. Les feuilles sont plus ou moins épineuses selon le génotype de la plante. La floraison commence environ à la mi-juillet et la pousse principale fleurit avant les pousses latérales. Dans la réalisation de l objectif d une forte production du carthame, les itinéraires techniques sont relativement assez bien connus, mais sont encore mal maîtrisés pour élaborer une qualité donnée dans la graine, telle que sa richesse en protéines. En effet, la composition des graines en protéines varie selon les conditions environnementales (température, eau...), les conduites culturales (régime hydrique, apport azoté, date de hh

35 semis ) et aussi selon les génotypes. Tout stress de sécheresse et de déficit hydrique agit en faveur d une augmentation du taux des protéines dans la graine. La connaissance des caractéristiques génomiques, biochimiques et agrophysiologiques liées à la qualité de la graine, doit permettre de progresser dans l identification des meilleures combinaisons génotypes environnement - pratiques culturales pour la production d une qualité recherchée (Roche J. & Bouniols A., 2005). Fig. 3 : Culture de Carthame 1.8- Culture au Maroc : Le carthame, généralement limité à moins de ha, est presque abandonné par les agriculteurs marocains à cause des problèmes de faible rendement, de difficulté d'écoulement de la production et de sa faible valorisation. Les rendements réalisés sont de moins de 6 qx/ha de graines pour cette culture conduite en bour ; c est le rendement le plus faible de toutes les oléagineuses (Bamouh et al, 2001). La culture n est pas réalisée en irriguée à cause de sa faible rentabilité. L'incitation à la culture du carthame au niveau des zones arides (Oujda, Guerssif) et semi-arides (Taounate, Saïs, Haouz) pour une utilisation pharmaceutique valoriserait ces régions et pourrait contribuer à l amélioration du revenu du producteur. Le carthame détient aussi ii

36 l attention des chercheurs. En effet, à l INRA, dans le cadre du programme de développement variétal, une collection de plus de 200 variétés de différentes origines est présente à Meknès et les travaux de caractérisation de ces variétés sont en cours de réalisation (Bamouh et al, 2001) Le Carthame génétiquement modifié pour produire la pro insuline humaine: La société canadienne SemBioSys, découvrant la possibilité de produire de l insuline humaine à partir de graines de Carthame (Carthamus tinctorius) transgénique (portant le code secret de la société A), a voulu être à l abri des critiques des environnementalistes et a présenté à l organisme officiel américain USDA-APHIS une demande d évaluation des effets néfastes de cette plante «Carthame génétiquement modifié» sur l environnement. Certains avis des scientifiques ont été pour cette découverte, qualifiée d extraordinaire, pouvant bouleverser le monde, en mettant à la disposition des diabétiques une insuline qui coûte la moitié de son prix actuel. Les arguments avancés présument que la pro insuline humaine est très rapidement dégradée pour qu'elle perde de son activité une fois ingérée par les animaux du milieu. D autres avis contre, présument que l inhalation de la pro insuline contenue dans les débris des graines dispersées au champ de culture constitue l une des options possibles pour la thérapie humaine (Ruhlman et al, 2007). jj

37 Les chercheurs de SembioSys écartent la possibilité que les débris inhalés et la poussière du carthame transgénique puissent être actifs, mais ils ne fournissent aucune preuve expérimentale à l'appui de cette conclusion. Ils supposent aussi que des animaux sauvages ne seraient pas affectés par l'insuline humaine. Or, contrairement à cet avis, les lapins comptent parmi les animaux utilisés lors de la découverte de l'insuline et ils continuent à être employés comme animaux d'expérience dans des études courantes sur l'action de cette hormone protéique (Guevara, 2007). En outre, les oiseaux (Remage-Healey & Romero, 2001) et les serpents (Sidorkiewicz E & Skoczylas R., 1974) répondent également à l'insuline humaine. Il est probablement prudent de dire que toutes les espèces menacées et les êtres humains peuvent être des victimes potentielles de la dissémination de plantes vivrières génétiquement modifiées pour produire l'insuline humaine. Le rapport des chercheurs de SembioSys note que les plantes à graines, entourant la parcelle de terrain de carthame transgénique des essais, fourniront «une source de nourriture libre et ouverte» plus attrayante pour les oiseaux et les mammifères que le carthame transgénique. Or, d après certains environnementalistes d avis contre les OGM, la bande de jachère autour de la parcelle de terrain d'essai est peu susceptible de décourager des animaux mobiles tels que les lapins qui s alimentent la nuit pour éviter les prédateurs. De même, des protéines fusionnées de pro insuline et de toxine cholérique ont aussi été produites dans des plantes de laitue et de tabac (Ruhlman et al, 2007); lorsque des préparations de ces kk

38 plantes transgéniques en poudre sont administrées à des souris diabétiques, la tolérance orale à l'insuline est produite, par conséquent, la pro insuline est restée active. ll

39 Conclusion : Le rapport de l organisme officiel américain USDA-APHIS a donc présenté différents arguments contrastés, en faveur et en défaveur de la production de l insuline humaine par le carthame génétiquement modifié, mais l avis favorable l a emporté et la société canadienne SembioSys a été autorisée à effectuer cette production. Par ailleurs, la culture de Carthame est prometteuse ; elle pourrait, lorsqu elle est génétiquement modifiée, valoriser le terrain et les intrants pour une utilisation pharmaceutique. Cependant, le risque de la modification génétique est réel, mais il doit être suivi et contrôlé afin de le surmonter. mm

40 Chapitre II : L agriculture moléculaire Une nouvelle orientation en confrontation à la mondialisation 2-1- Introduction : Confrontée à la mondialisation des marchés, l agriculture et les secteurs industriels qui lui sont associés doivent renforcer leur compétitivité et assumer les nouvelles exigences du marché en terme de qualité, modes de production, diversification et transformation. D une part, les consommateurs des produits non alimentaires, notamment pharmaceutiques, recherchent des produits peu coûteux et respectant l environnement. D autre part, les industriels de la transformation de la matière agricole exigent des produits de composition stable et à forte valeur ajoutée. Les agriculteurs, quant à eux, demandent des produits rentables, permettant de valoriser les intrants et leur assurant un revenu conséquent. Ainsi, il ne suffit plus d améliorer la productivité, il apparaît nécessaire d ouvrir la voie à de nouveaux débouchés de la production agricole en répondant aux exigences de la qualité et des cahiers des charges. Les progrès génétiques et des pratiques culturales respectueuses de l environnement permettent de progresser dans cette voie. Ainsi, ces préoccupations environnementales et économiques poussent le monde agricole vers un mode de production efficace dans l obtention du produit ciblé et de la qualité désirée; les organismes de Recherche et de Développement accompagnent cette démarche. Dans le secteur des oléagineuses, malgré une demande croissante en huiles végétales au niveau mondial, la filière du carthame produisant nn

41 uniquement de l huile s est fragilisée, notamment par la concurrence d autres cultures oléagineuses, comme le colza. Toutefois, une meilleure valorisation des produits et co-produits de la récolte et une diversification des utilisations permettrait à la culture de rester compétitive vis-à-vis des autres espèces oléagineuses. Un atout de la graine du carthame est sa grande diversité de composition en acides gras et en protéines. Ceci conduit à des utilisations variées aussi bien en nutrition humaine que dans l utilisation non alimentaire. Dans le secteur non alimentaire, principalement le secteur pharmaceutique, les graines du Carthame conduisent à la production de l insuline, hormone de plus en plus demandée dans le monde pour résoudre le problème du diabète. Par ailleurs, le tourteau de carthame est utilisé pour l alimentation animale Les 3 générations de l agriculture moléculaire végétale (moléculture ou pharming) : L agriculture moléculaire végétale ou moléculture ou pharming désignent la production de composés pharmaceutiques ou industriels par des végétaux génétiquement manipulés. Cette production est passée par trois phases : Une première génération a manipulé les plantes pour qu elles résistent aux insectes et aux maladies. La deuxième génération a modifié les végétaux pour qu ils puissent offrir des caractéristiques agronomiques améliorées (résistance des oo

42 plantes à la sécheresse et au froid) et nutritionnelles précises (production d un maïs riche en lysine, par exemple). Pour la troisième génération, les scientifiques continuent à s intéresser à la production de biomolécules utiles sur les plans pharmaceutique et industriel. Cette production est économe et devient de plus en plus généralisée. En effet, aujourd hui, environ 57 % des 150 médicaments les plus connus contiennent au moins un composé actif majeur originalement extrait d une plante (Grifo, 1997). Les chercheurs ont donc identifié, avec le temps, plusieurs protéines humaines ainsi que les gènes qui codent leur production. Les protéines forment la défense du corps humain contre les maladies. Ces protéines sont habituellement synthétisées dans des bactéries modifiées, des cellules de mammifères et d insectes, des levures et, plus récemment, dans des plantes modifiées génétiquement. La technique consiste à transférer un gène spécifique dans les cellules des végétaux. La production de composés pharmaceutiques par les plantes (moléculture), représente la troisième génération des biotechnologies en agriculture. Plusieurs substances peuvent être obtenues des plantes génétiquement modifiées destinées à l agriculture moléculaire végétale : Produits primaires : Anticorps, fragments d anticorps, enzymes (industrielles, thérapeutiques, diagnostiques, cosmétiques), protéines structurales, antigènes (vaccins), agents thérapeutiques, médicaments, inhibiteurs enzymatiques. pp

43 Produits dérivés : Bioplastiques, vitamines, cofacteurs, métabolites secondaires (composés phénoliques, glucosinolates tannins, amidons, sucres, parfums, arômes, alcaloïdes), fibres. Actuellement, au moins 350 plantes génétiquement modifiées pour produire des composés pharmaceutiques sont en développement clinique au Canada et aux États-Unis (Lamoureux, 2002). Dans les documents bibliographiques, on dénombre environ 34 protéines synthétisées par les plantes : des anticorps (que l on appelle aussi «planticorps» dans le nouveau langage de la moléculture), des protéines sanguines comme l albumine ou l hémoglobine, des enzymes, des hormones comme l érythropoïétine, ainsi que des protéines immunogènes servant à vacciner, comme la glycoprotéine de la rage (Faye et al, 2001) Historique de la production pharmaceutique à partir d OGM : Dans les années 1970, les médicaments de nature protéique n étaient disponibles qu en très faible quantité. Depuis, les protéines pharmaceutiques et les enzymes industrielles sont principalement produites à partir de bactéries génétiquement modifiées. Les premiers composés pharmaceutiques «OGM» ont été l insuline et les interférents, produits à partir de la célèbre bactérie E.Coli. Cette bactérie a l avantage de se reproduire très rapidement à très faibles coûts en comparaison avec les cultures en fermentation. Néanmoins, les bactéries ne peuvent pas produire des molécules aussi complexes que peuvent le faire les levures et qq

44 les insectes. Actuellement, elles ne suffisent plus à la production de protéines recombinantes. Les premières expériences avec des plantes destinées à l agriculture moléculaire ont été réalisées avec du maïs et du tabac. Le maïs est utilisé parce qu il se cultive facilement et le tabac parce qu il se manipule facilement sur le plan génétique, produit de nombreuses graines et possède de larges feuilles générant une grande biomasse. D autres plantes sont aussi utilisées en moléculture, comme le riz, le carthame, le soja, la luzerne et la pomme de terre. Ce n est pas un hasard si ces plantes ont été choisies en premier pour des essais en agriculture moléculaire végétale et dans le domaine des biotechnologies. De plus, des recherches ont été faites sur leur pollinisation, leur génétique et la dormance de leurs semences. Ces informations deviennent cruciales lorsque vient le temps d établir le mouvement du pollen et la possibilité de transfert des gènes entre les plantes conventionnelles et celles issues du génie génétique. Toutes ces informations sont alors utilisées afin d isoler au maximum les essais en champ (Felsot, 2002). Actuellement, les médicaments issus d AMGM (Anticorps Monoclonaux provenant de plantes Génétiquement Modifiées) qui ont été approuvés et autorisés ont été principalement préparés à partir de cultures cellulaires. A titre indicatif, on peut citer les exemples suivants : Des souris de laboratoire OGM ont été modifiées génétiquement pour produire des anticorps humains. rr

45 Des anticorps monoclonaux humains ont déjà été produits à des niveaux relativement élevés à partir d oeufs de poulet. Des tabacs ont été transformés avec un vecteur viral pour produire des anticorps visant le lymphome non-hodgkinien. Des plantes OGM ont été transformées pour produire les anticorps utilisables en prophylaxie contre la rage et d'autres états pathogènes (Marie-France Huot, 2003) Réglementation de l agriculture moléculaire: Cette réglementation change d un pays développé à un autre, mais en général, les plantes destinées à la moléculture sont considérées comme toute autre plante transgénique et sont étudiées au cas par cas, selon leurs caractéristiques. Les demandes pour les essais en milieux confinés (serres, laboratoires) par les promoteurs, en France, par exemple, sont déposées auprès de la Commission du génie génétique (CGG) qui relève du ministère de la Recherche. Les demandes pour les essais en champ se font auprès de la Commission du génie biomoléculaire (CGB). Cette dernière a pour mission d évaluer les risques liés à la dissémination des OGM sur la santé publique et l environnement. La CGG et la CGB sont des instances consultatives sans pouvoir de décision. Ces commissions émettent un avis et le ministère dont elles dépendent octroie ou non un agrément ou une autorisation. Ainsi, la CGB, composée de membres nommés (scientifiques, environnementalistes, spécialistes de la santé, consommateurs) examine le dossier et présente un avis au ministère de l Agriculture, de l Alimentation, de la Pêche et des Affaires rurales ainsi ss

46 qu au ministère de l Écologie et du Développement, qui autorisent ou non l essai. Cet avis contient des recommandations sur les mesures de confinement (distance d isolement, rangs de bordures, etc.) à prendre par le ministère. La Commission base sa décision, entre autres, sur les caractéristiques de l implantation de l essai, sa localisation et le biotope concerné ainsi que sur les caractéristiques des séquences introduites et des plantes considérées. Enfin, le ministère de l Agriculture publie sa décision à travers les formulaires d information du public, mis sur son site Internet à l adresse suivante : En effet, la procédure d information du public est obligatoire pour toute dissémination volontaire de plantes transgéniques. Cependant, seule la liste des communes dans lesquelles sont réalisés les essais est diffusée sur Internet. Les références cadastrales ne sont pas révélées. L Agence du médicament humain (EMEA), s occupe de l évaluation des médicaments en général, dont ceux issus de plantes génétiquement modifiées. En effet, le promoteur doit enregistrer son médicament auprès de l EMEA. Le produit, comme tout médicament conventionnel, doit faire l objet d une panoplie de tests cliniques qui évaluent sa qualité, sa tolérance et son efficacité Les avantages de la moléculture : L agriculture moléculaire végétale est perçue comme étant une alternative viable à la production actuelle de molécules biopharmaceutiques. En effet, les coûts élevés limitent actuellement la production de médicaments par des méthodes tt

47 traditionnelles. Les systèmes de production traditionnels sont (Daniell et al, 2001) : Des cellules de mammifères modifiées à l aide de techniques de l ADN recombinant; l avantage est que l on produit des composés identiques aux produits d origine. Par contre, c est une production qui coûte très cher et l échelle de production est limitée. Des microorganismes (ex : bactéries) ; ces bactéries ont le désavantage de produire des composés qui varient grandement du produit d origine. Les cultures cellulaires et la fermentation bactérienne sont actuellement les technologies les plus utilisées pour la production de protéines thérapeutiques. Les antibiotiques sont souvent produits par des bactéries tandis que les anticorps monoclonaux et la majorité des vaccins sont produits par des cellules de mammifères. Dans les cellules animales, la dernière étape est la glycolysation, c est-à-dire l addition de sucres sur la protéine afin qu elle se plie d une façon spécifique. Cette façon de se plier va déterminer sa fonction et si elle est active ou non. Certaines protéines recombinantes n ont pas besoin d atteindre le stade de glycosylation (maturité) pour servir de «médicaments». Elles sont produites alors dans des fermenteurs de bactéries (Rappelons que les bactéries ne produisent pas toujours de protéine conforme à l originale ; la modification de la structure protéique a lieu lors de la glycosylation). Par contre, les autres protéines sont produites par des cellules de uu

48 mammifères qui donnent une copie conforme à la structure protéique originale. Depuis quelques années, on assiste à un plafonnement des thérapies à base de protéines (ex : utilisation de cellules d ovaire de hamster chinois) pour la production de médicaments. En effet, ces procédés sont coûteux et ne sont pas rentables pour certains médicaments. L industrie pharmaceutique a un besoin urgent de protéines pour mettre au point des médicaments sûrs et efficaces, mais fait face à une faible capacité de production. Des recherches sur des médicaments potentiels pourraient même être éventuellement abandonnées. La méthode traditionnelle de cultures de cellules pour la production de biomolécules nécessite beaucoup d énergie, d espace et d investissement. Bref, l industrie pharmaceutique ne répond pas adéquatement à la demande de médicaments à base de protéines (Felsot, 2002). Par exemple, la compagnie américaine Immunex, connaît des problèmes majeurs d approvisionnement pour son médicament Embrel. Ce dernier est utilisé contre l arthrite rhumatoïde. Actuellement, Embrel, est produit à partir de cellules. Sa production ne suffit plus et il devient de moins en moins accessible. C est aussi un médicament qui coûte très cher. Une solution serait cependant envisageable. En effet, Embrel pourrait être produit dans les plantes en de plus grandes quantités et à un prix moindre. Le cas d Immunex a incité de nombreuses compagnies et pays à entreprendre des recherches en moléculture (Lamoureux, 2002). Les deux principaux arguments avancés en faveur de l agriculture moléculaire pour la production de composés pharmaceutiques est la vv

49 diminution des coûts et la sécurité des produits (Larrick et al, 1998 ; Fisher R. & Emans N., 2000; Rogers, 2003). Les autres principaux avantages de la moléculture sont les suivants : Production de nouveaux composés pharmaceutiques pour le diagnostic et le traitement des maladies. Production économique puisqu elle n utilise pas de systèmes de fermentation et de bioréacteurs, contrairement aux productions conventionnelles (l investissement en capital est moindre). De plus, la production peut se faire à plus grande échelle. Les protéines sont produites dans des compartiments intra- cellulaires de la plante. Par conséquent, elles sont plus stables. Aussi, elles peuvent être directement exprimées dans certaines composantes de la plante, comme dans les chloroplastes par exemple. Production sécuritaire puisqu il n y a pas de transmission de toxines ou de pathogènes à l humain. En effet, la méthode traditionnelle d extraction à partir de tissus animaux peut représenter des dangers de contamination (virus, prions). Les plantes ont des cellules eucaryotes qui offrent l avantage d une maturation protéique qui ressemble davantage à celle qui se produit dans les cellules humaines. Les protéines se retrouvent quasi prêtes à l usage. Avec les bactéries, on fabrique des protéines peu complexes. Avec les plantes, on peut synthétiser des glycoprotéines beaucoup plus complexes. En effet, les plantes surpassent la capacité de production des fermenteurs de cultures cellulaires pour les substances biopharmaceutiques. Par contre, il y a actuellement beaucoup de travail à faire sur les mécanismes de glycosylation (l ajout par des enzymes de sucres sur le squelette ww

50 d acides aminés des protéines). La glycosylation pose en effet d importantes difficultés : la biomolécule produite peut perdre son activité biologique ou se révéler immunogène pour l humain (Chevassusau-Louis, 2001). La moléculture, bien qu avantageuse pour la production de certains composés pharmaceutiques, ne pourra cependant pas être utilisée pour la production de tous les vaccins et toutes les protéines thérapeutiques. Dans certains cas, les biomolécules ne peuvent pas être synthétisées adéquatement dans les tissus végétaux Les plantes, nouveaux vaccins comestibles : Les plantes pourraient être de bons vaccins, car elles véhiculent beaucoup d antigènes à peu de frais. Elles pourraient, entre autres, servir de vaccins contre les hépatites, le traitement de la cirrhose, le traitement de la muciviscidose et les maladies hépathiques, la thérapie contre le VIH, la maladie de Gaucher et le traitement de l hypertension. Selon certains scientifiques, les vaccins comestibles semblent avantageux pour plusieurs raisons. D abord, contrairement aux vaccins traditionnels qui consistent à injecter dans le corps humain une bactérie ou un virus atténué, les vaccins comestibles consistent à administrer directement des antigènes qui poussent le système immunitaire à produire des anticorps pour défendre l organisme. Par conséquent, ils entraîneraient moins d effets secondaires. Ensuite, les vaccins comestibles n ont pas besoin de la chaîne du froid, soit toutes les mesures prises pour conserver les virus et les bactéries atténuées. Cet avantage pourrait profiter aux pays en développement. En effet, des études tentent actuellement d iophyliser (sécher) les xx

51 biomolécules d intérêt pour les administrer sous forme de capsules et non sous forme d aliments frais (des tomates et des bananes modifiées que l on mangerait pour obtenir l effet désiré, par exemple). On tente actuellement de développer des vaccins contre les maladies de vibrio cholera et E.Coli. Ces deux maladies sont répandues dans plusieurs pays en développement et font, chaque année, plusieurs victimes. Mais des recherches restent à faire pour mettre au point la technique des vaccins comestibles (Mason H.S. & Arntzen, C.J., 1995). Plusieurs enjeux restent à préciser avant que ces vaccins ne puissent faire leur apparition sur le marché. Il faudra, d abord, mettre en place une infrastructure rigoureuse pour leur distribution et leur administration à la population, afin qu ils soient efficaces et sécuritaires (Fisher R. & N. Emans, 2000). Au Canada, l Institut national des sciences agrobiologiques (NIAS), en collaboration avec la firme Japan Paper Industries et l Institut de recherche Sanwa Kagaku viennent de mettre au point une nouvelle variété de riz contenant un taux élevé d une hormone (GLP-1), aidant le pancréas à produire de l insuline. Ce riz pourrait servir de traitement pour les personnes diabétiques Rentabilité de l agriculture moléculaire : Un des principaux arguments en faveur de la production de médicaments à partir de plantes manipulées génétiquement est la diminution des coûts. En effet, la moléculture permet d utiliser des plantes comme plate-forme de production, au lieu de systèmes de fermentation coûteux. La moléculture permet aussi de varier l échelle de la production. On estime que le marché yy

52 des biopharmaceutiques atteindra près de 140 billions US Dollars d ici 2020 (Wired, 2002). Actuellement, il semble que les rendements de la moléculture sont plutôt faibles. La rentabilité commerciale des cultures nécessite que la protéine, produite par la plante, représente au minimum 1 % des protéines produites par d autres procédés. Un document de synthèse décrit des taux encore plus bas, de dix à mille fois inférieurs à ce 1 % (Daniell et al, 2001). Une des solutions à ce problème est de faire produire des protéines par les chloroplastes de la plante. En effet, les copies d un transgène peuvent se multiplier et atteindre un taux de dix mille copies par cellule si on modifie génétiquement ces organites. Il est donc possible d augmenter la production de la protéine voulue. Cependant, on ne maîtrise pas encore très bien l utilisation des chloroplastes chez toutes les plantes servant d usine, notamment chez les plantes de grandes cultures, les plus utilisées par l agriculture moléculaire végétale. Certains scientifiques prétendent que la moléculture ne sera pas rentable pour plusieurs raisons. Premièrement, il sera trop dispendieux de purifier les biomolécules des plantes. Ensuite, des sommes énormes devront être investies afin d empêcher la pollinisation croisée. Enfin, il faudra ajouter les coûts de responsabilité en cas de contamination des cultures conventionnelles. De façon générale, en incluant les coûts reliés aux problèmes posés par la moléculture comme le rendement et l isolation des cultures, l agriculture moléculaire végétale semble présenter des coûts de production avantageux. Selon une étude de marché réalisée par la firme Planet Biotechnologies, la production d un gramme purifié zz

53 d immunoglobuline A (IgA) par une plante transgénique reviendrait à 50 $ US comparativement à 1000 $ US avec les cultures cellulaires actuelles et à 100 $ US avec les animaux transgéniques (Chevassus-au-Louis, 2001). Ce faible coût s explique, entre autres, par le fait que la moléculture ne nécessite pas ou peu de gros équipements comme les fermenteurs, utilisés avec les méthodes traditionnelles. L extraction des biomolécules de la plante représenterait environ 80 % du coût de la production d une protéine recombinante. Cette étape ne coûterait pas moins cher qu avec les méthodes traditionnelles, mais ne coûterait pas plus cher non plus. Les industriels de la biotechnologie semblent penser que les consommateurs auront accès à une plus grande variété de produits qui coûtent moins cher avec la moléculture qu avec les méthodes traditionnelles. Mais le manque de données rend toute généralisation sur la rentabilité commerciale de la moléculture difficile à faire. Chaque application est différente. Plusieurs variables doivent être évaluées. En effet, il peut y avoir des variations au plan des pratiques agronomiques, de l efficacité de l expression des gènes, des normes d isolation nécessaires, des tests sur la santé et sur l environnement du composé et de la plante et de la facilité avec laquelle le produit peut être extrait et purifié. Enfin, il faut considérer la possibilité que l on puisse obtenir des sous-produits de la moléculture qui seraient utiles, comme de l huile ou de la nourriture, et leur valeur sur le marché. (College of agriculture, 2002). Par exemple, le tabac est différent du soya ou du maïs. En effet, le tabac a la possibilité de produire une grande quantité de feuilles vertes par hectare. Donc, le tabac est l usine la plus rentable pour les composés pharmaceutiques pouvant être synthétisés dans les feuilles. aaa

54 Dans le cas où les biomolécules doivent être produites dans les graines, le maïs et le soya représentent de meilleurs supports, parce que les graines de tabac sont extrêmement petites et se prêtent moins bien à la production de composés pharmaceutiques. Les graines de carthame sont aussi très petites, soit akènes par gramme de semence, mais leur richesse en protéines est à l origine de leur rentabilité étudiée par la société SembioSys. Chaque culture possède une génétique particulière, des caractéristiques uniques et des méthodes de production différentes. Conclusion : Toutes ces caractéristiques rendent le calcul des coûts de production assez complexe. Ce sont les considérations pratiques et économiques qui détermineront le choix de la protéine et de la culture dans laquelle elle sera produite. En effet, on devra tenir compte du rendement, de la qualité des feuilles et des graines, des conditions d entreposage, de la question de production confinée ou non, des coûts de production, de la stratégie de purification, de la taille du marché, des enjeux et des préoccupations environnementales ainsi que de la perception de la population à l égard de cette production pharmaceutique particulière (Daniell et al, 2001). bbb

55 Chapitre III : Les risques soulevés Par la moléculture 3-1- Introduction : La moléculture semble présenter des avantages économiques pour la production de médicaments. Néanmoins, elle présente également des risques pour la santé humaine et l environnement. En effet, contrairement aux méthodes traditionnelles de fabrication des substances pharmaceutiques en laboratoire, l agriculture moléculaire peut se pratiquer dans les champs, avec toutes les conséquences que cela peut entraîner. L agriculture moléculaire est une technique relativement nouvelle. Très peu d information est encore connue sur les effets des produits biopharmaceutiques fabriqués à partir des plantes sur la santé humaine et l environnement. La majorité des recherches se font encore en laboratoire, avec quelques essais en champ sur de petites superficies. Les problèmes associés à la première génération d aliments transgéniques, comme le transfert de gènes entre espèces ou espèces apparentées, sont également soulevés en agriculture moléculaire (Le chèvre, 1997 ; Fisher R. et al, 2001 ; Huot, 2003). En effet, le flux de transgènes est un évènement à forte probabilité d'occurrence, même si chaque évènement transgénique nécessite d'être analysé au cas par cas du fait des différents transgènes développés, des plantes modifiées génétiquement et des environnements dans lesquels ces plantes sont introduites (Kirk, 2001; Le chèvre, 1997). Les risques liés au flux de transgènes concernent: ccc

56 - Le développement de nouvelles plantes adventices qui compliquerait le travail des agriculteurs. - Les effets sur la biodiversité agricole avec une perte des caractéristiques des plantes mises en culture, à cause des flux de gènes non désirés, ces derniers créant de l'hétérogénéité parmi les caractéristiques conservées. Les efforts effectués pour conserver la pureté des variétés pourraient être ruinés. Les effets négatifs sur la biodiversité sauvage sont réels : certaines plantes d une même variété risquent d'être remplacés par des PGM (plantes génétiquement modifiées), d où une perte éventuelle de biodiversité du pool de gènes disponibles dans la nature (Gilliam, 2002). Dans cette biodiversité sauvage doit également être considérée la biodiversité animale, qui pourrait être affectée par l'expression de composants végétaux qui ont une toxicité directe, une allergénicité ou des caractéristiques antinutritionnelles chez les herbivores (Kirk, 2001; Kamenetsky, 2003). La perte de sources alimentaires secondaires comme des insectes ou autres animaux peut également résulter en une perte de biodiversité animale. - Les risques pour la santé humaine et animale que posent les cultures de PGM utilisées pour produire des médicaments ou des produits chimiques (cas de production d un vaccin à partir d une PGM alors que l expression de ce vaccin n est pas encore évaluée sur la santé humaine). ddd

57 3-2- Les voies d introduction des biomolécules dans l environnement ainsi que dans l alimentation humaine et animale : Les possibilités d introduction des biomolécules dans notre environnement sont bien réelles. En effet, il existe plusieurs voies d introduction ou d entrées possibles (Kirk, 2001), notamment : L ingestion directe par la faune, comme les mammifères, les invertébrés et les oiseaux. Certaines molécules pourraient être bioactives au moment de la récolte des plantes qui les comportent. Ensuite, certaines biomolécules seront détruites par le processus de digestion, d autres non. Ces dernières pourraient donc éventuellement se retrouver dans la chaîne alimentaire. La décomposition des résidus de la moléculture dans le sol, la transpiration des racines et l infiltration dans l eau. Par contre, il est possible de cibler la partie de la plante où sera produite la biomolécule (targetting). Par exemple, il serait possible de ne pas produire de molécules dans les racines de la plante. Le mouvement du pollen. Les biomolécules peuvent aussi se retrouver dans l alimentation humaine ou animale par des mélanges accidentels des graines manipulées pour la production de médicaments et de graines destinées à l alimentation humaine. Le mélange peut survenir lors des étapes de manutention, au moment du transport, par exemple. La dispersion de grains provenant des camions représente un mécanisme de contamination plus fréquent que la contamination due à la dispersion du pollen. Le déplacement de la machinerie agricole d un champ à l autre est aussi une eee

58 source de dispersion. Il est très difficile de tout nettoyer et de tout séparer lorsque la production se fait en plein champ : la récolte laisse toujours des résidus et des grains dans le champ. Ainsi, il est illusoire de penser que des producteurs agricoles, aussi perfectionnés soient-ils dans leur traçabilité, pourraient éventuellement faire de la moléculture pour une compagnie de biotechnologie, sans risque de contamination La persistance des produits de la moléculture dans le sol : Selon certains scientifiques, la plupart des biomolécules auraient une demi- vie très courte dans le sol à cause d une activité bactérienne. À l opposé, selon d autres scientifiques, ces produits auraient une assez bonne stabilité dans le sol (Freese, 2002). Par contre, il est intéressant de mentionner que certaines plantes, comme les racines de tabac, ne survivent pas à l hiver. Cette culture est donc une usine sécuritaire pour la production de biomolécules. Actuellement, on exige que tous les résidus de la moléculture soient détruits par incinération. On n envisage donc pas d utiliser la biomasse comme aliment pour le bétail ou à d autres fins. La fermentation des résidus en éthanol (biocarburant) pourrait être un compromis. Mais, cette technique de production d énergie peut aussi contribuer à l effet de serre. Finalement, il semble que les décisions concernant l emploi des résidus de la moléculture dépendront de la nature du matériel utilisé et du risque qu il présente Le mouvement du pollen : La répartition du matériel génétique par l intermédiaire du pollen soulève de nombreuses craintes. Les scientifiques tentent de développer des mécanismes d isolement des fff

59 plantes pour empêcher la dispersion du pollen et la contamination croisée. Différentes techniques d isolation des cultures ont été mises au point afin de limiter la dispersion du matériel génétique (Clinton, 2005) Techniques d isolation des cultures : a- La production en milieux confinés : Les cultures destinées à la moléculture peuvent être produites dans des milieux confinés, comme dans des serres (serres protégées comportant des caractéristiques spéciales limitant le pollen, les insectes, les rongeurs, etc.), des mines ou des grottes. D ailleurs, la production en grotte est une avenue intéressante qui commence à se développer au Canada et aux États-Unis. Ensuite, les cultures peuvent être isolées dans des tunnels de plastique. Toutes ces techniques ne peuvent cependant pas garantir à 100 % que le matériel génétique ne se répandra pas. En effet, ces installations ne sont pas à l abri des tornades, des feux et des inondations. De plus, même en conditions confinées complètes, il peut y avoir des problèmes de contamination à des étapes ultérieures de la production, par exemple lors du transport. D ailleurs, aucune technique ne peut garantir un risque zéro. En plus, un milieu confiné signifie une charge de plus par rapport au plein champ, le coût de production serait donc automatiquement augmenté. b- L isolation génétique : L isolation génétique consiste à faire en sorte que le pollen reste sur le site de production par des techniques comme la stérilisation mâle, la récolte de la production avant la floraison et le développement du pollen, et l insertion des gènes dans les chloroplastes (ciblage ; targetting). En effet, le pollen ne contient pas de chloroplaste, ggg

60 ce qui diminue les risques de contamination. Jusqu'à présent, cette technique a fonctionné seulement avec le tabac et les pommes de terre. (Moller, 2003). La technique d activation de promoteurs (inductibles) peut aussi être utilisée. Les promoteurs sont des éléments génétiques qui contrôlent l expression de gènes auxquels ils sont associés. Ces promoteurs peuvent être activés par le froid, la chaleur, la longueur de la journée, un produit chimique, etc. On peut donc activer le gène à notre guise. Enfin, on peut utiliser la technologie communément appelée «Terminator» (gènes terminateurs), qui consiste à empêcher la germination de semences par des manipulations génétiques. c- Les distances d isolation des cultures : Les distances entre les cultures destinées à l agriculture moléculaire et les cultures traditionnelles font aussi partie des mécanismes d isolement. Il faut noter que les connaissances scientifiques de la pollinisation sur de longues distances sont peu avancées (Moller, 2003). Actuellement, au Canada, les distances entre les cultures de colza conventionnel et transgénique sont de 175 m pour la production de semences et de 100 m pour la production alimentaire ou d huile (Newsletter, 2001). Les possibilités de transfert de gènes seront considérablement plus grandes pour les plantations commerciales à grande échelle de cultures génétiquement modifiées que pour les petites parcelles d essai. Par conséquent, il faut faire preuve de prudence lorsque des généralisations sont établies à propos des distances de dispersion du pollen des plantations commerciales fondées sur des études hhh

61 expérimentales réalisées à l aide de petites parcelles d essai. (Société royale du Canada, 2001). Il est cependant difficile de prévoir la dispersion du pollen par le vent ou les abeilles et, par conséquent, le transfert de gènes et les problèmes de contamination croisée. En général, la gestion des plantes transgéniques et celles qui sont destinées à l agriculture moléculaire, devra tenir compte des risques d une dissémination éventuelle des transgènes dans les espèces cultivées et sauvages apparentées (Le chèvre, 1997). Ces risques existent dans les populations naturelles quand : L espèce cultivée est à reproduction allogame, c est-à-dire que le pollen provient d une plante voisine. Le pollen et/ou les graines peuvent être transportés sur des distances importantes. La même espèce ou des espèces voisines spontanées sont présentes dans les zones de culture et fleurissent à la même période. Il serait donc possible de réduire les risques en utilisant des plantes qui ne répondent pas à ces critères Les impacts de la moléculture sur les organismes non visés : Les organismes non visés sont définis comme des organismes présents dans l environnement mais qui sont les victimes accidentelles du produit. Ces organismes sont parfois difficiles à identifier, donc à étudier. Les impacts de l agriculture moléculaire sur les organismes non visés, comme iii

62 les insectes et les microorganismes du sol, ne sont pas encore très bien connus Risques pour la santé humaine et animale : Actuellement, il n y a aucun résidu de la moléculture dans la nourriture des êtres humains et des animaux. Les résidus sont détruits par incinération. Certains chercheurs affirment même que seules les plantes qui ne sont pas destinées à l alimentation humaine ou animale devraient servir à la moléculture et elles devraient être cultivées en milieu confiné strict (Mc Calla, 2001, Rogers, 2003, Miele, 1997) Les consommateurs face à l agriculture moléculaire végétale : L agriculture moléculaire végétale attire de plus en plus l attention des médias et suscite des craintes et des questions chez le public. En effet, la moléculture utilise des plantes génétiquement modifiées, et la polémique sur les OGM est bien connue de tous actuellement. Les produits de l agriculture moléculaire diffèrent parce qu ils ne sont pas destinés à l alimentation humaine ou animale, mais développés pour produire une plus grande variété de médicaments à des coûts moins élevés. Cet argument ne satisfait pas tout le monde, surtout pas ceux qui s opposent aux techniques du génie génétique utilisées pour manipuler les organismes vivants Conclusion : Comme toute nouvelle technologie, l agriculture moléculaire présente des avantages et des risques. Est-ce que les avantages de la moléculture surpassent actuellement les risques? Certains jjj

63 affirment que oui, d autant plus que des vies pourraient être sauvées. D autres n y croient pas du tout et prétendent que les risques de contaminer la chaîne agroalimentaire et l environnement sont trop grands. Est-ce que le public est prêt à courir certains risques pour profiter des avantages de l agriculture moléculaire végétale? Il semble qu actuellement, les consommateurs manquent d information pour pouvoir bien évaluer la situation. La perspective d avoir accès à une plus vaste gamme de médicaments à moindre coût séduit beaucoup de personnes, mais pas à n importe quel prix. Les consommateurs ne veulent surtout pas que des traces de biomolécules pharmaceutiques se retrouvent dans leurs aliments. Ils veulent être certains que les gouvernements prennent des mesures de sécurité maximales afin d éviter une telle contamination. À cet effet, l idée de cultiver des plantes destinées à la moléculture en plein champ et sur de grandes superficies ne les rassure pas du tout. L option de la production confinée leur semble plus adéquate. Par ailleurs, les produits de l agriculture moléculaire ne sont pas destinés à l alimentation humaine. Comme des médicaments traditionnels, ces produits seront emballés, prescrits, vendus et administrés. L agriculture moléculaire végétale en plein champ ou en milieu confiné nécessitera la mise en place de solides systèmes de traçabilité et une préservation rigoureuse de l identité des plantes et des produits, du champ au médicament. Il faudra aussi, à travers ces systèmes, établir de bonnes pratiques agricoles ainsi que des modes opératoires normalisés (manutention, transport, récolte). Enfin, les organismes de réglementation kkk

64 devront nécessairement auditer la production de ces substances biopharmaceutiques. L industrie de l agriculture moléculaire et le gouvernement ont donc de nombreux défis à relever. Ils doivent, entre autres, s assurer de l innocuité des cultures pour la santé humaine et animale, de la sécurité des travailleurs et de la minimisation des impacts négatifs de la moléculture sur l environnement. De plus, ils devront présenter cette nouvelle façon de produire des médicaments à la population, être à l écoute de ses craintes et pouvoir répondre à ses questions. La mise en place d une réglementation claire, transparente et basée sur la science ainsi que d un système de surveillance solide, sont essentiels. Enfin, l agriculture moléculaire semble là pour rester et elle va se développer. Cependant, il est crucial que ce développement ne se fasse pas au détriment de la santé des humains, des animaux et de l environnement. L industrie doit maintenant prouver à la population que l agriculture moléculaire végétale comporte des avantages pour la production de médicaments et que les risques sont rigoureusement contrôlés. Chapitre IV : Particularités des protéines A usage pharmaceutique dans les plantes transgéniques 4-1- Introduction et généralités : Le génie génétique et la transgenèse sont deux sciences appartenant à la biotechnologie moderne. La première regroupe l ensemble des outils et des techniques de la biologie moléculaire permettant, de manière contrôlée, l'étude de la modification lll

65 des gènes (isolement, clonage, séquençage, découpage) dans un but de recherche fondamentale ou appliquée. La deuxième est une technique servant à introduire un gène étranger (transgène) dans le génome d'un organisme (hybridation de gênes), en vue d'obtenir un organisme génétiquement modifié pour un usage donné (Faye et al, 2001 ; Kusnadi et al, 1997). La transgenèse est donc une application du génie génétique. Les OGM sont des produits issus de la biotechnologie moderne, et plus précisément à la fois du génie génétique et de la transgenèse. Ils regroupent : Les Organismes vivants modifiés (OVM), possédant une combinaison de matériel génétique inédite suite à des processus qui ne se produisent pas naturellement (semences, végétaux, animaux), et les produits génétiquement modifiés prêts à la consommation qui ne sont plus vivants et qui ne disposent plus de leur capacité à se reproduire (farine de blé génétiquement modifié, par exemple). Par ailleurs, afin de pouvoir couvrir la demande croissante des protéines thérapeutiques à l échelle mondiale et qui n est pas suivie, en parallèle, d une croissance de même rythme de leur production (Cramer et al, 1999), il ne suffit plus d utiliser les méthodes technologiques traditionnelles des bactéries ou des levures, puisqu il y a toujours des limites pour une production à grande échelle de protéines complexes. C est la moléculture qui offre à l industrie pharmaceutique des alternatives aux systèmes de production actuels au faible coût (Faye et al, mmm

66 2001). Le passage de la recherche en laboratoire aux essais cliniques puis à la production industrielle a été couronné par un contexte industriel favorable suite à la protection de la propriété intellectuelle par des brevets. En effet, le brevetage des inventions biotechnologiques a contribué à l essor industriel dans ce secteur. Les inventions protégées par les brevets empêchent les tiers de fabriquer, utiliser ou vendre l invention pendant une durée de 20 ans. Ainsi, l inventeur est stimulé à innover, car il peut bénéficier du fruit de ses recherches. Les inventions brevetées doivent être nouvelles, impliquer une activité inventive et être susceptibles d application industrielle. Mais la délivrance d un brevet peut être refusée par le gouvernement si ce dernier peut induire des risques plus ou moins directs sur la santé humaine ou sur l environnement. En outre, le brevetage du vivant engendre des problèmes à plusieurs niveaux : monopole des multinationales et problèmes d éthique sur la nature vivante des inventions biotechnologiques. En moléculture, l «usine de production» des protéines recombinantes à grande échelle est la plante qui est disponible et qui ne coûte pas cher, alors que les bioréacteurs nécessaires dans la production «relativement traditionnelle» coûtent cher (économies d'échelle) (Theisen, 1997; Van Der Logt, 1998), et la méthode de multiplication in-vitro qu ils utilisent nécessite une haute technologie et un investissement élevé (Richter et al, 2000 ; Buch, 1998 ; Goddjin & Pen, 1995). En agriculture moléculaire aussi, deux groupes de systèmes végétaux sont utilisés : le feuillage et la graine. Chacun d eux présente des avantages et nnn

67 des inconvénients sans convenir à l expression de toutes les protéines visées. Les feuilles (tabac, luzerne...) ont un métabolisme actif et complexe qui offre beaucoup de possibilités, mais elles ont aussi une activité protéasique importante qui limite l accumulation de certaines protéines (Staub et al, 2000). Les graines (maïs, colza, carthame, soja et riz) présentent l avantage d avoir un contenu en eau moins élevé et offrent donc un milieu d accumulation plus stable. En revanche, elles ne sont pas adaptées à la synthèse de certaines protéines complexes, et la nécessité d atteindre la floraison peut représenter un danger accru de dispersion du transgène par le pollen (Boothe et al, 1997). Toutefois, la molécule recombinante doit être extraite et purifiée à partir de l ensemble des protéines endogènes de l organisme. Pour chaque système végétal faisant l objet de développement commercial (feuilles ou graines), l enjeu de la récupération de la molécule recombinante est au centre même de la rentabilisation du procédé. En effet, La purification d une protéine recombinante compte pour plus de 80 % de ses coûts de production. Cette purification est effectuée par des méthodes traditionnelles de chromatographie ou d électrophorèse. Ce sont les phases initiales d extraction et de purification qui posent problème dans la plupart des cas, en particulier en raison de la protéolyse rapide qui a lieu dès l homogénéisation des tissus (Faye et al, 2001). ooo

68 Chez certaines le Carthame, par exemple, la protéine recombinante (insuline) est fusionnée à une autre protéine (oléosine), de la graine. Pour séparer l oléosine de l insuline, les chercheurs ont mis au point un système simple de centrifugation. Parmi les protéines thérapeutiques les plus connues, on peut citer l albumine, protéine sanguine, produite dans la pomme de terre pour le contrôle du volume sanguin (Sijmons et al, 1990) ; l hémoglobine, substitut sanguin, produit dans les feuilles du tabac (Dieryck et al, 1997)... Les plantes offrent donc un fort potentiel pour la production en masse de protéines recombinantes d intérêt thérapeutique (Arakawa et al, 1998). Cependant, sous leur forme brute, elles ne sont pas encore idéales (comme c est le cas de certaines bactéries) pour la production de ces protéines parce qu elles produisent des molécules dont la glycosylation n est pas toujours compatible avec une application thérapeutique chez l homme. La modification de la capacité de glycosylation des plantes en vue de l adapter à un usage thérapeutique, fait l objet de nombreux travaux de recherche et d inventions géniales et originales (Lerouge et al, 1998 ; Gomord et al, 1997 ; Navazio et al, 1996) La machinerie de glycosylation : La cellule végétale est capable de réaliser la glycosylation des protéines, ce qui lui donne un avantage sur les bactéries et les levures. La glycosylation débute dans le réticulum endoplasmique par l association au polypeptide, en cours de synthèse, d un oligosaccharide (appelé N-glycane) qui se fixe sur un acide aminé, ppp

69 l asparagine, en un ou plusieurs points de la chaîne protéique. La protéine devient alors une glycoprotéine. Cet oligosaccharide subit ensuite de nombreuses modifications sous l action de glycosidases et de glycosyl-transférases. Cet équipement enzymatique, impliqué dans les phases finales de la maturation golgienne des N-glycanes, est spécifique du système cellulaire. Une cellule végétale ne possède donc pas le même équipement enzymatique que la cellule de mammifère par exemple, ce qui explique la différence existant entre les N-glycanes des glycoprotéines de mammifères et ceux des glycoprotéines de plantes (Von Schaewen et al, 1993 ; Strasser et al, 1999 ; Wenderoth I & Von Schaewen, 2000). Le N-glycane "végétal" possède des xyloses et un fucose (attaché en -3) alors que le N-glycane "mammalien" possède de l acide sialique. Ces différences structurales sont à l origine du principal obstacle à l utilisation thérapeutique des protéines recombinées issues de cellules végétales : elles pourraient induire la production d anticorps et, à l extrême, une réponse allergique chez les personnes auxquelles on les administre. Il semble en effet que l injection d une glycoprotéine végétale à un mammifère soit toujours suivie de la production d anticorps dirigés contre les résidus fucose et xylose des N-glycanes. Afin d éviter ces problèmes d immunologie et d allergie, deux grandes stratégies sont actuellement envisagées : d une part l arrêt précoce du processus de glycosylation avant que n apparaissent des traits spécifiques qqq

70 aux végétaux (xylose associé au fucose), d autre part l "humanisation" de la plante de manière à lui faire produire des glycanes de type mammalien En ce qui concerne la première stratégie, il semble que les particularités structurales qui distinguent les glycanes végétaux de leurs homologues mammaliens ne soient introduites que tardivement lors de la maturation de la protéine. On peut donc envisager : 1. De stopper le processus de glycosylation juste avant ces étapes finales qui se déroulent dans l appareil de Golgi. 2. De maintenir les protéines dans le réticulum endoplasmique. Pour cela, il faut fusionner au transgène une séquence codant pour un peptide (de type HDEL ou KDEL) qui s insèrerait à l extrémité C- terminale de la protéine synthétisée et qui provoquerait (par reconnaissance avec un récepteur membranaire du réticulum endoplasmique) le confinement (rétention) de la protéine dans le réticulum endoplasmique. 3. Une autre solution pourrait être de bloquer certaines enzymes-clef de la glycosylation avec des alcaloïdes inhibiteurs de glucosidase tel que la castanospermine. 4. Enfin, on peut envisager de prendre, comme systèmes de production, des plantes déficientes, par suite de mutations, en enzymes responsables de la maturation "végétale" des N-glycanes La seconde stratégie est plus ambitieuse ; il faudrait complémenter l appareil de Golgi des cellules végétales avec des glycosyl-transférases de mammifère en utilisant les techniques de rrr

71 transgenèse. Ce transfert de gène permettrait par exemple d exprimer une sialyl-transférase (catalysant l addition d acide sialique sur le N-glycane) dans l appareil de Golgi. Cependant, certains problèmes subsistent car il n est pas évident qu une enzyme d origine mammalienne soit active dans une cellule végétale et qu elle le soit au bon moment et au bon endroit. Toutefois, il a été démontré que des signaux peptidiques permettant l acheminement et la rétention de glycosyl-transférases dans l appareil de Golgi d une cellule de mammifère semblent être les mêmes chez les végétaux. Il suffirait donc de cloner le gène d origine mammalienne et l intégrer dans le génome de la cellule végétale pour qu il soit normalement exprimé dans l appareil de Golgi. De nombreuses glycosyl- transférases végétales, et plus particulièrement la β1,2 xylosyl-transférase et l α 1,3 fucosylt-ransférase, peuvent être clonées et le développement de nouvelles stratégies d inhibition de ces enzymes, comme la recombinaison homologue, pourrait permettre la production de protéines d intérêt thérapeutique non immunogènes chez les plantes. Malgré les problèmes posés par les N-glycanes, la glycosylation reste un processus obligatoire auquel doivent être soumises les protéines recombinées. Elle est responsable du haut degré de conformité existant entre la protéine "sauvage" et la protéine recombinée puisqu elle apporte à la protéine des modifications d un point de vue structure, stabilité, activité, solubilité. Cela est particulièrement important pour les protéines destinées à un usage médical. Lorsqu il s agit de protéines à usage sss

72 industriel, des différences de composition (par rapport au type "sauvage") et donc une glycolysation imparfaite sont tolérées à condition que les protéines produites possèdent les mêmes caractéristiques fonctionnelles Les «nouvelles» glycosyl-transférases : A côté de ces approches par inactivation des glycosyl-transférases, une autre possibilité prometteuse pour humaniser les N-glycanes végétaux est l expression de «nouvelles» glycosyl-transférases qui vont compléter et/ou inactiver, par compétition, la machinerie endogène de maturation des N-glycanes de la cellule végétale. Plusieurs glycosyl-transférases de mammifères sont exprimées avec succès dans l appareil de Golgi de la cellule végétale telle que la GNT I humaine (Von Schaewen et al, 1993) ou l α(2,6)- sialyltransférase du rat (Wee et al, 1998). Cependant, il a été montré que ces deux glycosyl-transférases recombinantes sont adressées de façon correcte dans l appareil de Golgi quand elles sont produites dans le système endomembranaire de sécrétion de la cellule végétale. Dans le cadre de ces stratégies de complémentation, plusieurs laboratoires ont émis l hypothèse selon laquelle l expression d une β(1,4)-galactosyltransférase (GalT) animale dans des compartiments précoces de l appareil de Golgi végétal pourrait permettre une humanisation partielle des glycanes végétaux et éventuellement prévenir l association de β(1,2)- xylose et d α(1,3)-fucose qui a lieu plus tardivement dans l appareil de Golgi médian et dans le compartiment trans-golgien (Fitchette-Laine et al, 1994). ttt

73 En accord avec cette hypothèse, Palacpac et al, 1998, ont montré que la GalT humaine, exprimée dans des cellules de tabac en culture, transfère des résidus galactose sur les résidus N-acétylglucosamine terminaux des N-glycanes végétaux. Plus récemment, une immunoglobuline a été produite dans des plantes de tabac exprimant la GalT humaine. L expression de cette enzyme humaine dans les plantes de tabac a conduit à la production d un planticorps dont 30 % des N-glycanes présentent des séquences N-acétyllactosamine terminales identiques à celles associées aux N-glycanes d anticorps produits dans des cellules de mammifère (Bakker et al, 2001). D autres modifications chimiques interviennent également après la synthèse protéique. L acétylation, qui affecte 80% des protéines et qui correspond au transfert d un groupe acétyl au groupe aminé N-terminal, semble être un facteur déterminant pour la durée de vie des protéines. L acylation par un acide gras permet l insertion de la protéine dans la bicouche lipidique membranaire. La phosphorylation concerne les résidus internes et est une substitution du groupe hydroxyle des sérine, thréonine et tyrosine par un groupe phosphoryle. Cette réaction, facilement réversible, est catalysée par des protéines kinases et des protéines phosphatases. Elle sert à ajuster l activité de nombreuses protéines Retouches protéolytiques : La protéine synthétisée reste en première étape liée au signal qui a déclanché sa formation ; elle est inactive en cet effet. On dit qu elle n est pas mature. Sa maturation nécessite le clivage du polypeptide signal, en présence de protéases uuu

74 appropriées (maturation protéolytique). Il est évident et primordial de produire des protéines recombinées dans des cellules végétales ou dans des plantes en général, capables d assurer une bonne maturation des protéines afin d obtenir une forme active. L ingénierie génétique peut parvenir à introduire des séquences responsables de synthèse des enzymes impliquées dans la maturation. Cette maturation protéolytique est un processus courant d activation ou d inactivation des protéines. Pour quelques protéines de sécrétion comme l hormone de croissance, l amputation de la séquence signal est la seule scission protéolytique connue : elle transforme d un coup le polypeptide en la forme active, mature, de la protéine. Pour d autres protéines, elles sont d abord synthétisées sous forme de proprotéines, inactives, ce qui leur confère une durée de vie relativement longue. La conversion de la proprotéine en protéine mature s effectuera généralement dans des vésicules de sécrétion (pour les protéines membranaires et de sécrétion) et consistera en un clivage endoprotéolytique. Lorsque les protéines ne sont pas correctement clivées, il y a une accumulation de protéines inactives dans les cellules, d où l importance de cette étape Caractère immunogène des glycanes des «planticorps» (c est-àdire anticorps produits chez les plantes) : L utilisation en thérapie, chez l homme ou chez l animal, de glycoprotéines recombinantes d origine végétale est encore très limitée. Cabanes- Macheteau M. et al, 1999, a étudié la N-glycosylation d un vvv

75 anticorps monoclonal, Guy s 13, spécifique d une adhésine de Streptococcus mutans, une bactérie responsable de la carie dentaire. Il a comparé les caractéristiques de cet anticorps sous deux conditions de production (figure 4) : Dans un système mammifère (souris), et Dans des plantes de tabac. Le chercheur a trouvé les résultats suivants : Chez le mammifère, l IgG1 est glycosylée sur deux sites de N- glycosylation par des structures oligosaccharidiques (N-glycanes) qui présentent un résidu α (1,6)-fucose et environ 10% d acide sialique terminal. Dans des plantes de tabac, le planticorps Guy s 13 est également glycosylé sur les mêmes sites de N-glycosylation, mais les N- glycanes présentent un résidu β(1-2)-xylose associé au résidu l α(1,3)-fucose. Lorsque la glycoprotéine d origine végétale est injectée à certains mammifères et en particulier à l homme, ce résidu β(1-2)-xylose confère au glycane une forte immunogénicité (Fitchette-Laine et al, 1994). Cela sous-entend une auto- destruction de la protéine chez l organisme humain et la limite de son utilisation en thérapie chez l homme (Faye et al, 2001). Les N-glycanes complexes d origine végétale participent aussi à l allergénicité de très nombreux allergènes glycosylés d origine végétale (Garcia-Casado et al, 1996). www

76 Figure 4 : Glycosylation de l anticorps Guy s 13 (lgg1) 4-5- Humanisation des glycoprotéines recombinantes d origine végétale : L «humanisation de la protéine recombinante d origine végétale» consiste en une modification de la glycosylation afin de produire, dans les plantes, une protéine recombinante «copie conforme» à celle des mammifères (sans résidu immunogène β(1-2)-xylose). La glycosylation n est différente entre mammifères et plantes que pendant les dernières étapes de maturation de la protéine. La modification de la machinerie de glycosylation durant sa dernière étape de maturation est donc un moyen utilisé pour humaniser les glycoprotéines recombinantes. De nombreux chercheurs travaillent dans ce domaine, non seulement chez xxx

77 les plantes mais aussi chez les levures, dans les cellules de mammifères ou d insectes utilisées pour la production de protéines recombinantes (Wee et al, 1998; Von Schaewen et al, 1993 ; Tackaberry et al, 1999; Fitchette-Laine et al, 1994). La plupart des stratégies étudiées afin d humaniser les N-glycanes chez ces différents organismes concernent : L inhibition de glycosyl-transférases résidentes de l appareil de Golgi (pour empêcher le transfert des résidus de sucres immunogènes et leur association avec les résidus spécifiques des protéines recombinantes), Ou bien l expression de «nouvelles» glycosyl-transférases dans ce compartiment. (Palacpac et al, 1998) Rétention de la protéine recombinante dans le réticulum endoplasmique : Les protéines naturelles résidentes du réticulum endoplasmique portent des glycanes de structure oligo-mannosidique, commune aux plantes (de type β(1,2)-xylosylés et α(1,3)-fucosylés) et aux mammifères (de type α(1,3)-fucosylés), très probablement non immunogènes (Lerouge et al, 1998). Cette caractéristique permettrait d éviter l association de glycanes immunogènes (β(1,2)-xylosylés) aux glycoprotéines recombinantes d origine végétale. La stratégie consiste à stocker la glycoprotéine recombinante dans le réticulum endoplasmique (RE). Ce stockage, présentant l avantage d une grande stabilité de la protéine dans la cellule végétale, est possible puisque l ajout à l extrémité carboxy-terminale de la protéine recombinante d un tétrapeptide de séquence KDEL ou HDEL permet sa rétention dans le RE des cellules yyy

78 végétales (Gomord et al, 1997). Selon la séquence HDEL ou KDEL, le recyclage de la protéine (du RE vers l AG puis vers le RE) peut avoir lieu ou bien à un stade tardif (après maturation dans l AG, c est-à-dire après glycosylation et attachement de résidus de sucre immunogène β(1,2)- xylosylés) (Von Schaewen et al, 1993) ou bien à un stade précoce, avant l association β(1,2)-xylosylés et α(1,3)-fucosylés (Fitchette-Laine et al, 1994). Par conséquent, et à cause du résidu β(1,2)-xylosylé, l expression chez les plantes, d une glycoprotéine recombinante fusionnée avec une extension HDEL ne peut pas être retenue comme une approche utilisable pour obtenir une glycosylation compatible avec une utilisation thérapeutique chez les mammifères (immunogénicité du résidu β(1,2)- xylosylés). Lorsque les protéines recombinantes sont fusionnées avec la séquence KDEL, leur recyclage est plus efficace, c est-à-dire beaucoup plus précoce au niveau golgien que lors d une fusion avec le signal HDEL. C est seulement dans les compartiments tardifs de l appareil de Golgi que la maturation des N-glycanes diffère chez les plantes et chez les mammifères, en particulier avec l ajout de β(1,2)-xylose et d α(1,3)- fucose à de très nombreux N-glycanes végétaux (Lerouge et al, 1998). C est ainsi que pour utiliser pleinement l énorme potentiel du système végétal en vue de produire des protéines à usage thérapeutique, et pour obtenir des N-glycanes humanisés sur les glycoprotéines recombinantes d origine végétale, il est nécessaire de bloquer les maturations typiques de leur glycosylation Conclusion et perspectives : L utilisation des plantes pour la production de protéines d intérêt thérapeutique est donc possible grâce zzz

79 aux travaux d humanisation de la N-glycosylation dans les plantes transgéniques. L efficacité des stratégies de complémentation visant la production de glycanes non immunogènes dans les cellules végétales a aussi augmenté grâce aux travaux de recherche sur la précision de localisation de la GalT humaine au niveau golgien et sur son niveau d expression. De tels glycanes présentant des séquences N- acétyllactosamine terminales sont d excellents supports pour obtenir des copies parfaites des glycanes de mammifères après transfert de l acide sialique terminal. Ces acides sialiques, absents des N-glycanes de plantes, sont importants, en particulier pour la demi-vie de la majorité des glycoprotéines circulantes de mammifères. L obtention de N-glycanes sialylés chez les plantes, en adaptant la machinerie de maturation des N- glycanes végétaux, nécessiterait le transfert d au moins cinq gènes hétérologues différents codant pour des enzymes impliquées dans la biosynthèse de l acide sialique dans le cytosol et son transport dans l appareil de Golgi. Les enzymes manquantes de cette voie métabolique devraient non seulement être exprimées de façon stable mais aussi être adressées de façon correcte et enfin être actives dans la cellule végétale. Pour ces différentes raisons, la production de glycoprotéines recombinantes sialylées chez les plantes représente un défi dans le domaine des biotechnologies végétales. aaaa

80 Chapitre V : Ingénierie moléculaire Et étapes de production des oléosines modifiées Pour la production de l insuline humanisée 5-1- Introduction : Les étapes de synthèse de l oléosine génétiquement modifiée dans les graines de Carthame ne diffèrent pas de celles de la synthèse des protéines dans la cellule végétale (Fig. 5). Cependant, des manipulations génétiques, souvent compliquées, sont nécessaires afin de conduire à bien la synthèse de la molécule d intérêt (insuline). (Commentaire de la figure 5 : La biosynthèse de la majorité des protéines végétales débute dans le cytosol. Des signaux spécifiques peuvent adresser une partie de cette population protéique vers le noyau, la mitochondrie ou le chloroplaste. La protéine peut présenter un peptide signal ; son élongation s arrête dans le cytosol pour reprendre une fois transférée vers le réticulum endoplasmique (RE) où les étapes de maturation ont lieu : clivage du peptide signal, glycosylation et formation de ponts disulfures. Les protéines solubles qui présentent à leur extrémité carboxy-terminale des signaux de rétention dans le RE (H/KDEL) vont s accumuler dans ce compartiment. Une partie de cette population protéique dite résidente du RE échappe au RE et est recyclée vers ce compartiment en passant par l appareil de Golgi (AG). Les protéines qui ne portent pas de signal de rétention dans le RE seront transportées par l intermédiaire de vésicules jusqu à l AG où ont lieu les principales étapes de la maturation des glycanes. Les protéines qui comportent des signaux de rétention dans l AG ou la vacuole seront adressées vers leur destination. Celles qui ne comportent pas de signaux seront transférées vers le milieu extacellulaire). bbbb

81 Figure 5 : Biosynthèse, transport et maturation des protéines Dans la cellule végétale 5-2- Voies d'amélioration de la synthèse des protéines : Afin de pouvoir introduire l ADN recombinant dans la cellule végétale on utilise un vecteur plasmidien. Cet ADN recombinant est constitué alors d ADN provenant du vecteur et d ADN codant pour la protéine recombinée. Un contrôle minutieux doit porter essentiellement sur les points suivants : cccc

82 La qualité et la quantité de cet ADN incorporé dans le génome de la plante- hôte sont importantes à considérer afin d optimaliser le taux de protéine recombinée à produire. Le gène d intérêt ne doit pas subir d inactivation au sein des génomes dans lesquels il a été intégré. En effet, sur la plante Arabidopsis, l intégration de plusieurs copies d un gène au même locus augmentent la probabilité que le transgène soit inactivé (Nykiforuk, 2006). Ce phénomène est une cis-inactivation. On parle de trans-inactivation quand, par exemple, deux copies de gène recombiné sont intégrées à des endroits différents dans le génome. Il peut y avoir, dans certains cas une interaction allélique qui débouche sur une inactivation des gènes intégrés. Une corrélation entre l inactivation des gènes et la méthylation de l ADN a particulièrement été démontrée pour les transgènes (Buch, 1998 ; Kusnadi et al, 1997). Souvent la plante réagit, après l introduction du gène d intérêt, par ce qu on appelle «phénomène de co-suppression», généralement dû à une régulation développementale ou à des facteurs environnementaux. Dans la plupart des cas, la co-suppression implique une dégradation post-transcriptionnelle de l ARN selon différents mécanismes; le plus fréquemment rencontré est celui basé sur la formation de duplex d ARN qui est l appariement de deux brins d ARN complémentaires. Ceux-ci sont synthétisés par deux gènes, un gène codant pour une séquence antisens de la séquence codée par l autre gène (Barrett & Abergel. 2000). dddd

83 Afin d éviter ces inactivations qui touchent les transgènes, plusieurs solutions peuvent être envisagées : 1. Sélectionner des cellules qui n ont intégré qu une seule copie d ADN recombiné, 2. Développer des méthodes qui permettent d intégrer une seule copie d ADN recombiné ou encore sélectionner des cellules végétales avec une activité de méthylation assez faible. 3. Sélectionner des plantes ou cellules qui ont une expression forte et constante de la molécule recombinée. 4. Une solution pratique actuellement utilisée pour faciliter la lecture du gène recombiné consiste à le flanquer de séquences SARs (scaffold associated regions). Ces séquences maintiennent des domaines particuliers de chromosome dans une conformation propre à faciliter la transcription ou la réplication. 5. Les SARs sont des sites de fixation pour la topoisomérase II, une enzyme démêlant les enchevêtrements de l ADN qui tendent à se former lorsque les longs brins parentaux se détordent pour permettre la synthèse des brins- fils (Markley, 2006) La transcription : Les étapes à suivre pour augmenter la production de la protéine ciblée sont les suivantes : eeee

84 Augmenter la production d ARNm qui code pour la transcription du gène introduit. Agir sur de nombreux facteurs impliqués dans la régulation de la transcription, en particulier sur les protéines interagissant avec l ADN génomique. Le caractère distinctif entre ces protéines, facteurs de transcription, est le motif structural qu elles possèdent toutes et qui leur permet de venir se fixer sur l ADN génomique. On parle de protéines à motif hélice- boucle- hélice, protéines portant une agrafe à leucine, protéines en doigt de gant coordonné au zinc, etc. Différents gènes codant pour ces facteurs cellulaires ont également été découverts. Ce sont des proto-oncogènes tels que le MYC ou le MYB (Lewin, 1999). Beaucoup de protéines synthétisées pourraient être des enzymes qui trouveraient des substrats adéquats dans les plantes. Une régulation par rétroaction risque d avoir lieu dans la plante, risquant de détourner les protéines néosynthétisées vers des sites non souhaités (rôle primordial joué par les promoteurs dans la transcription). Une des solutions pour éviter cette régulation négative de la production serait de stocker les protéines produites dans un compartiment cellulaire où leurs substrats ne sont pas présents (Berg & Singer. 1993). La transcription est un mécanisme complexe qui, lorsqu il sera parfaitement maîtrisé, permettra d envisager le concept de production "inductible". En effet, en jouant sur l induction de la ffff

85 transcription via les facteurs de transcription et les promoteurs, il serait possible d obtenir une plante qui produit la protéine recombinée uniquement durant une courte période avant la récolte. Cela permettrait d éviter que la synthèse de la protéine n interfère en permanence avec la physiologie de la plante Les étapes post- transcriptionnelles : Une fois la synthèse d ARNm est initiée, les manipulations biotechnologiques et génétiques sont les suivantes : Coiffage : Une coiffe est ajoutée à ce préarnm en croissance. Il s agit de l addition de 7-méthylguanylate à l extrémité 5 de l ARNm en cours de synthèse. Cela se fait via une liaison 5-5. Une des fonctions de cette coiffe est de protéger l ARNm contre la dégradation opérée par les ARNases. Polyadénylation : Après le coiffage, il faut faire une polyadénylation : une queue poly-a de 200 résidus environ est ajoutée à son extrémité 3 par la poly-a polymérase. Cette queue a plusieurs fonctions pour l ARNm : elle le protège des actions des ARNases, elle augmente sa stabilité dans le cytoplasme et elle est nécessaire à une traduction réussie sur les ribosomes. La coiffe et la queue poly-a sont également requises pour passer au travers de la membrane nucléaire. Epissage : L étape qui suit ces deux réactions (coiffage et polyadénylation) est l épissage. Il consiste en l excision des introns présents dans l ARNm, ce qui le rend "lisible". Ces introns gggg

86 augmentent la stabilité de l ARN. Cette stabilité permet d envisager une meilleure production de la protéine recombinée. Les ARNm possèdent également des séquences qui fonctionnent comme des éléments déstabilisants spécifiques. L ARE est une de ces séquences. Elle est constituée d un pentanucléotide AUUUA répété plusieurs fois et entraînant la désadénylation de l ARNm, ce qui contribue à sa déstabilisation. La suppression des séquences déstabilisantes permettrait d obtenir des ARNm plus stables. Toutes les propriétés vues font que le coiffage, la polyadénylation et l épissage sont des étapes-clef dans la stabilisation et la "lisibilité" de l ARNm. Il conviendra donc de s assurer que les enzymes impliqués dans ces réactions ne soient pas présentes en quantité limitante. L ingénierie génétique aura aussi pour but d éviter la présence de certaines séquences déstabilisantes dans les gènes intégrés (Kahn, 1997) La traduction : Les principaux éléments sont les suivants : La coiffe 5 de l ARNm semble être le premier signal reconnu par l élément ribosomial qui déclanche l amorçage du processus de traduction. L élément ribosomial se fixe au niveau de cette coiffe, il glisse le long de l ARNm jusqu à la rencontre d un codon AUG qui est le codon d amorçage. hhhh

87 La séquence de Kozak, découverte par Marilyn Kozak, correspond à la séquence de nucléotide ACCAUGG- qui précède le codon AUG. Il semble que la coiffe 5 et la séquence de Kozak augmentent la fréquence d amorçage. Il est donc possible d intégrer une séquence de Kozak dans l ADN recombinant, ce qui a pour effet d augmenter le taux d initiation de la traduction et par la même occasion la production de protéine recombinée. Souvent, on intègre également des promoteurs (de gène) d origine virale car ils s avèrent être des facteurs augmentant le taux de traduction (Chambond, 1985 ; Clausen, 2000). Les principaux facteurs limitants pouvant subvenir sont les suivants : 1. Un manque d ARNt compatible avec les séquences de l ARNm. Il suffit alors de modifier le gène recombinant de sorte que l ARNm, pour lequel il code, comporte des codons qui trouvent suffisamment de ARNt correspondants dans la cellule- hôte. Le gène modifié code alors pour une protéine qui est identique à celle de départ puisque les codons remplacés le sont par des "synonymes". 2. Les acides aminés peuvent également être un facteur limitant pour la traduction. Lorsque l on désire produire une protéine particulièrement riche en un acide aminé, il est parfois recommandé de modifier les voies de biosynthèse de cet acide aminé lorsque celui-ci n est pas présent naturellement iiii

88 en quantité suffisante dans la cellule- hôte (Cramer et al, 1999) Étapes post-traductionnelles : Ces étapes sont cruciales pour la qualité des protéines recombinées. Si différentes étapes sont mal réalisées, on obtient des protéines non-conformes, ce qui les rend inutilisables dans le domaine médical et parfois dans le domaine industriel. Le ciblage : Les principaux éléments de base sont les suivants : 1. Les protéines synthétisées doivent être localisées dans des organites bien connus de la cellule. 2. Il faut donc conditionner leur localisation par des séquences «programmées». Cette technique offre comme avantage de séquestrer les protéines afin d éviter leur dégradation par des protéases cytoplasmiques ou leur interaction indésirable avec le métabolisme cellulaire. 3. Les biotechnologies actuelles permettent aussi de diriger les protéines recombinées synthétisées vers des organites déterminés (mitochondrie, chloroplaste, etc.) en leur associant une séquence spécifique de ciblage. 4. Après leur localisation et stockage, la séquence (de tête) doit être clivée. Si elle ne l est pas, cela peut affecter la qualité de la protéine produite. 5. Il faut également que la protéine synthétisée soit au préalable envoyée vers le réticulum endoplasmique afin d y subir la glycosylation (dont l importance est connue) et la formation de jjjj

89 ponts disulfure qui contribuent à la structure secondaire de la protéine. Le réticulum endoplasmique est donc souvent un passage obligé pour la protéine. Elle y rentre de manière cotraductionnelle, le ribosome, en train de synthétiser la protéine, s associant au niveau du réticulum endoplasmique rugueux. 6. Les rares protéines ne nécessitant pas un passage par le réticulum endoplasmique subissent une reconnaissance posttraductionnelle par les membranes des organites qui les stockent. Reploiement et assemblage : Le réticulum endoplasmique contient plusieurs chaperons moléculaires (de nature protéique) qui aident les protéines néoformées à s assembler, se replier de la manière la plus stable, ne pas se dégrader et s organiser pour être transportées. Ces processus de reploiement sont consommateurs d ATP. Le reploiement est une étape-clef dans l activation des protéines recombinées et dans leur degré de conformité. L expression simultanée de tous les gènes exprimant les différentes sous- unités de la protéine néoformée est nécessaire à son assemblage. La dégradation protéique : Dans les cellules animales, il y a deux voies de dégradation : une dans des vacuoles digestives spécialisées appelées lysosomes et l autre dans le cytosol. Les protéines destinées à être dégradées dans les lysosomes semblent kkkk

90 posséder un message les y envoyant. Les lysosomes sont également capables de digérer des organites de la cellule. La vacuole des cellules végétales est riche en protéases et est l équivalent végétal des lysosomes, mais jusqu à présent il n est pas démontré que les vacuoles végétales digèrent des organites ou participent à la dégradation des protéines cytosoliques, excepté durant la sénescence. La voie non lysosomiale de dégradation protéique, observée dans les cellules eucaryotes, implique que la protéine soit au préalable liée par covalence à un polypeptide de 76 acides aminés appelé ubiquitine. L ubiquitinisation d une protéine se fait sur des sites spécifiques et implique l intervention de trois enzymes (E1, E2, E3). Une fois marquée, la protéine peut être reconnue par un complexe protéolytique appelé 26S protéosome. Il existe plusieurs possibilités pour éviter la dégradation des protéines recombinées : 1. Exprimer la protéine recombinée dans les graines où les taux d inhibiteurs de protéase sont élevés et donc susceptibles d atténuer la dégradation protéique. 2. Élaborer des protéines restant dans le réticulum endoplasmique loin d un contact avec des protéases. 3. Synthétiser des protéines ne possédant pas de sites spécifiques de reconnaissance par les protéases (site d ubiquitinisation par exemple). Cette dernière solution impose certaines restrictions sur les protéines recombinées et pourrait donc poser des problèmes de conformité. llll

91 4. Sélectionner des cellules possédant une faible activité protéolytique ce qui réduirait le taux de dégradation pour toutes les protéines synthétisées Technologie de l extraction de la protéine d intérêt : Une fois le gène d intérêt est introduit dans le génome de la plante (transgenèse) et devient fonctionnel (bien intégré), plus la plante grandit, plus la fusion de l'oleosine/proteine d intérêt (insuline), naturellement visée est capturée sur les corps lipidiques dans la graine. Plus la production des graines augmente, plus celle de l oléosine/insuline, liée aux membranes des particules lipidiques contenues dans ces graines augmente aussi. Pour l extraction, se basant sur le principe que l'huile est plus légère que l'eau, la graine récoltée est moulue dans un tampon aqueux et les particules lipidiques sont purifiés des impuretés à travers une série de centrifugations simples et de processus de lavage à froid. Ces particules sont munies de leurs membranes protéiques qu il faut dissocier des lipides. Ce sont ces membranes qui contiennent l oléosine liée à l insuline. Afin de dissocier l oléosine de la protéine d intérêt (insuline), une enzyme et un produit chimique, reconnaissant bien le site de la fusion «oleosine/insuline» sont ajoutés aux particules lipidiques purifiées. Par une série de centrifugations, en phase aqueuse, à froid, on isole les protéines dissociées des lipides. Le secret professionnel empêche les scientifiques de divulguer le détail de cette information! mmmm

92 Conclusion : Glycosylation, acétylation, acylation et phosphorylation sont des étapes qui jouent un rôle important dans la synthèse des protéines conformes. Les enzymes qui catalysent ces modifications devront donc être présentes en quantité suffisante dans les cellules de production. Les protéines recombinées produites dans les cellules végétales doivent subir une maturation qui les rend actives. Elles doivent également être traitées de manière à éviter leur dégradation, en les exprimant dans un compartiment cellulaire loin des protéases ou en présence d inhibiteurs de ces protéases. Ces protéines doivent ensuite être extraites puis purifiées pour leur utilisation. nnnn

93 Chapitre VI : L Insuline 6-1- Introduction : Cette hormone pancréatique a été bien étudiée au Maroc (Ismaili Alaoui, 2005 ; El Jabiri, 2005 ; Sellam, 1999) et ailleurs (Kaaks, 2001 ; Giroud & Assan, 1988). Les insulines actuellement disponibles sur le marché sont dites humaines ; elles sont obtenues par recombinaison génétique ; elles sont ensuite hautement purifiées afin d être tolérantes sur le plan de l immunogénicité. L historique de l insuline est bien décrit dans la thèse 92 disponible à la Faculté de médecine et de pharmacie de Rabat (Ismaili Alaoui, 2005) ; il a donc été opportun d en extraire l essentiel dans le présent chapitre. Par ailleurs, l insuline est produite dans les cellules «Beta» qui constituent 75 % des îlots de Langerhans du pancréas. Les cellules «alfa» sécrètent le glucagon, les cellules «gamma» la somatostatine. L insuline est synthétisée sous forme d une chaîne polypeptidique unique : la pré -pro -insuline qui se transforme en pro insuline qui, ellemême, sous l influence de protéases appelées «furines» donne l insuline et le peptide C. Liée à deux atomes de Zinc, elle est stockées dans des granules sous forme d un polymère (hexamère, probablement) La pro- insuline et la maturation de l insuline : La pro-insuline humaine, produite dans les cellules végétales, présente les caractéristiques suivantes : Deux acides aminés sont éliminés pour sa stabilité chez les plantes, oooo

94 Onze acides aminés C terminaux supplémentaires, assurant la rétention de la protéine dans le réticulum endoplasmique. La séquence codant pour la pro- insuline est fusionnée avec le gène codant pour l oléosine de l espèce végétale Arabidopsis sp., ou Carthamus tinctorius, de manière à ce qu elle ne soit exprimée que dans les graines. L'expression du gène fusionné est commandée par les séquences d un promoteur et d un terminateur de la phaséoline du haricot commun. Le promoteur du haricot conduit la transcription de la pro- insuline synthétique de façon spécifique au niveau de la graine (Faye et al, 2001). Un marqueur de sélection est régulé par le promoteur et le terminateur de l'ubiquitine du persil ; ceci a fait l objet d une classification comme information commerciale confidentielle, bien que ce marqueur de sélection soit le plus communément utilisé comme marqueur de sélection chez les plantes, d une part, et qu il ait déjà été employé dans beaucoup d'expérimentations antérieures, d autre part. Cette pro- insuline est le précurseur de l'insuline, normalement élaborée dans les cellules bêta des îlots de Langerhans au niveau du pancréas humain (Ruhlman et al, 2007). La protéine est synthétisée dans le réticulum endoplasmique où elle est repliée et 2 groupes sulfhydriles (-SH) sont oxydés en une liaison (pont disulfure -S-S-). pppp

95 Elle est alors transportée vers l'appareil de Golgi où elle subie une dernière étape de glycosylation (liaison covalente d'oses aux protéines) ; elle est ensuite empaquetée dans les vésicules sécréteuses et transformée par une série de protéases en une insuline mature (Davidson, 2004). L'insuline mature possède 39 acides aminés en moins par rapport à la pro- insuline, dont 4 sont complètement enlevés et les 35 acides aminés restants (C-peptide) sont coupés au milieu de la molécule de pro-insuline. Les deux extrémités de segments (chaînes B et A) demeurent reliées par la liaison disulfure formées antérieurement. L'insuline humaine, produite dans les graines de l espèce des crucifères, Arabidopsis sp ou des astéracées (composées), Carthame est activée par exposition à la trypsine, une enzyme digestive (Nykiforuk et al, 2006) Structure biochimique de l insuline et son historique : L insuline présente la structure suivante (fig. 6) : qqqq

96 Fig. 6 : Structure biochimique de l insuline En 1922, Frederick Grant Banting et Charles H. Best injectent un extrait pancréatique - contenant de l insuline qu ils viennent de découvrir - à un jeune garçon de quatorze ans souffrant de diabète. C est un véritable succès, qui vaut le prix Nobel aux deux inventeurs et qui suscite immédiatement une importante demande. Hormone peptidique à deux chaînes d'acides aminés : une chaîne A de 21 acides aminés et une chaîne B de 30 acides aminés. Sécrétée par le pancréas (cellules ß des ilôts de Langerhans) au cours de la digestion, dès que le taux de glucose dans le sang (glycémie) dépasse M. Hormone hypoglycémiante : elle favorise le retour de la glycémie à la valeur basale de M. L'insuline active le mouvement des transporteurs de glucose dans les membranes plasmiques, ce qui favorise le transport actif du glucose vers le cytoplasme. L'insuline diminue les taux des messagers secondaires dans de nombreux tissus : AMPc et Ca ++, ce qui entraîne les effets suivants : o o o o activation de la glycogénogénèse inhibition de la glycogénolyse inhibition de la gluconéogénèse (action antagoniste de celle du glucagon et du cortisol) activation de la lipogénèse rrrr

97 o inhibition de la lipolyse 6-4- Normes et pratique d utilisation de l insuline par le diabétique : 1- Conditions de prélèvement : Le prélèvement de sang veineux (en général au pli du coude) doit être rapidement traité et congelé avant le dosage. Le tube de prélèvement peut contenir un anticoagulant. Plusieurs prélèvements dans différentes conditions peuvent être réalisés : à jeun, après un repas (post-prandial), après une épreuve d'hyperglycémie provoquée par voie orale (HPO, voir ce terme). 2- Intérêt du dosage : L'insuline est une hormone hypoglycémiante secrétée par le pancréas. Son dosage permet d'explorer une hypo- ou une hyper- sécrétion dans le cadre des diabètes, des insulinomes ou des hypoglycémies. Elle permet d'évaluer l'équilibre glycémique et d'évaluer la capacité sécrétrice du pancréas. La prise d'aliments entraîne immédiatement une sécrétion d'insuline. Les valeurs normales sont les suivantes : i. A jeun : pmol /l soit : 5-15 mu /l ii. Lors de l'hpo: variations au cours du temps ; globalement : < 800 pmol / l Variations pathologiques : Ces variations se présentent comme suit : 1. Diabète de type I : * Taux de base bas, avec glycémie élevée ; * N'augmente pas au cours de l'hpo. ssss

98 2. Diabète de type II : * Taux de base normal ou élevé ; * Augmente peu au cours de l'hpo. 3. Insulinome : * Taux normal ou peu élevé malgré une glycémie basse. * Augmente très fortement après injection de glucagon ou de tolbutamide. * Interférences dans le dosage Les insulines utilisées en traitement chez les diabétiques peuvent entraîner l'apparition d'autoanticorps anti-insuline qui sont susceptibles de perturber le dosage; il faut alors avoir recours au dosage de l'insuline libre ou du peptide C Impact de l insuline sur le métabolisme cellulaire : Le glycogène est la forme de réserve du glucose, présente majoritairement dans le muscle (les 3/4) et abondante aussi dans le foie. La mise en réserve du glucose et sa dégradation sont soumises à un contrôle hormonal très efficace et très complexe. Les hormones exerçant le contrôle sont l insuline (qui stimule la mise en réserve), l adrénaline et le glucagon (qui stimulent la dégradation). Le cerveau est le grand consommateur de glucose. Il ne consomme que du glucose dans les conditions d alimentation normale (les acides gras liés à l albumine ne passent pas à travers la barrière hématoencéphalique). Lors du jeûne, les corps cétoniques remplacent le glucose. tttt

99 Le muscle est le grand consommateur de molécules énergétiques. Il consomme : Principalement du glucose dans les conditions de contraction musculaire intense (issu des réserves de glycogène) et de la créatine phosphate («sprint sur 100m»). Du glucose et des acides gras lors d un effort physique prolongé («marathon»). Principalement des acides gras au repos. Il produit du lactate et de l alanine récupérés par le foie pour faire du glucose. Le foie est le grand distributeur de molécules énergétiques. Il fournit du glucose au reste de l organisme (glycogénolyse, néoglucogenèse), des acides gras aux tissus utilisateurs et des corps cétoniques lors du jeûne Conclusion : La maîtrise des connaissances sur la biochimie de l insuline et sur les mécanismes de son métabolisme dans l organisme humain est à l origine de la production de cette hormone d une manière commerciale, économe, en utilisant les plantes comme support biologique, génétiquement modifié. L insuline «humaine» d origine végétale se comporte exactement comme l insuline naturelle et constitue, par conséquent, un produit prometteur, aussi bien pour l industriel que pour le consommateur alourdi par le coût relativement élevé de l insuline «traditionnelle» disponible sur le marché. uuuu

100 Chapitre VII : Généralités sur le diabète Impact d une alimentation raisonnée et d un Sport adapté 7-1- Introduction : En médecine, diverses maladies portent le nom de diabète. Elles ont toutes en commun des urines abondantes (polyurie). Le mot «diabète» vient du grec ancien dia- baïno, qui signifie «passer au travers». Les médecins grecs avaient observé que les malades semblaient uriner aussitôt ce qu'ils venaient de boire, comme s'ils étaient «traversés par l'eau» sans pouvoir la retenir. Le sigle IGT désigne tous les types de diabète Généralités : A- La glycémie et les diabètes : Les diabètes sont des maladies générées par une glycémie anormalement élevée (supérieure à 1,26 g /L à jeun le matin). Cette anomalie est due à une insuffisance ou une mauvaise utilisation de l insuline. Sans traitement approprié, cette maladie peut être à l origine de graves complications. On distingue : Le diabète de type 1, autrefois appelé diabète du jeune ou diabète maigre ou encore DID (diabète insulinodépendant). Maladie apparaissant généralement chez l'enfant qui s'amaigrit rapidement. Il s'agit d'une maladie auto immune : Le pancréas est autodétruit par les propres lymphocytes de l'enfant. Ce diabète se solde par une chute de la production d'insuline et se traite donc par des autoinjections quotidiennes d'insuline. vvvv

101 Le diabète de type 2 est autrefois appelé diabète de l'âge mûr ou diabète gras ou encore DNID (diabète non insulinodépendant). C est une maladie apparaissant en général à l'âge mûr, vers ans. Elle est souvent corrélée à l'obésité ou au surpoids. Le pancréas produit toujours de l'insuline et les causes du diabète sont multiples : mauvaise réactivité des cellules à l'hormone, destruction trop rapide de l'insuline, mauvaise transformation en glycogène du glucose sanguin. Il se traite essentiellement par un régime drastique et des médicaments hypoglycémiants. Il touche un grand nombre de citoyens (Rouiller, 1999). B- Origine de la maladie : De nombreux cas de diabète seraient dus à des enzymes mutées. On citera la glucokinase, la glucose-6- phosphatase, la glycogène-synthétase, la glycogène- phosphorylase. Une enzyme est définie comme étant un catalyseur biologique de nature protéique accélérant considérablement les réactions biologiques. Leur déficience est à l'origine de nombreuses maladies. Le foie est un organe capital, notamment dans la régulation de la glycémie. Il contient une très grande variété d'enzymes et est capable d'innombrables transformations. Il stocke le glucose sous forme de glycogène (100 g) et de triglycérides (150 g). Il est capable d'un rapide déstockage. C'est le seul organe capable de fournir l'essentiel de glucose au milieu intérieur. Il peut même, si besoin est, en générer à partir d'acides aminés. Les maladies du foie peuvent donc être à l origine du diabète. wwww

102 Par ailleurs, le diabète peut se définir comme une perte de contrôle à la hausse de la glycémie (sucre dans le sang). Chez l'être humain, une hormone est responsable d'empêcher la glycémie de s'élever dans le sang. Cette hormone s'appelle l'insuline. Chez les patients souffrant de diabète, deux situations peuvent se produire: L'insuline est produite par le pancréas. Ce dernier peut diminuer ou arrêter la production de l'insuline. Dans ces situations, la glycémie augmente et la maladie du diabète apparaît. Dans d'autres situations, il s'agit d'une résistance à l'action de l'insuline au niveau cellulaire. L'insuline est nécessaire pour faire entrer le sucre dans les cellules. Cette résistance à l'action de l'insuline rend celle-ci moins efficace. Alors à ce moment, la glycémie monte et la maladie du diabète apparaît. C- Le pancréas (Fig. 7) Le sucre sanguin, soit le glucose, est une source principale d'énergie pour l'ensemble des cellules de l'organisme. Lorsqu'il augmente dans le sang, il devient moins disponible et cause ainsi une perte d'énergie globale pour l'ensemble des cellules. Les symptômes du diabète peuvent se présenter de différentes façons: fatigue, difficulté de concentration, vision embrouillée, soif intense, miction fréquente, faim insatiable, possibilité de xxxx

103 perte de poids, possibilité de faiblesse musculaire. Certains de ces symptômes ou l'ensemble de ces symptômes sont présents chez les patients qui souffrent de diabète au début de la maladie. Cependant, certains diabétiques présentent peu de symptômes. La maladie est alors dépistée lors d'un prélèvement sanguin. Il existe différents types de diabète (Wikipedia, the free encyclopedia, 2007): Diabète de type 1 (Diabète juvénile) : Le diabète de type 1 (10% des patients diabétiques) consiste en une perte de la production par des cellules particulières du pancréas (cellules Bêta ou cellules Langerhans) de l'hormone que l'on appelle l'insuline. L'âge du début peut varier de quelques mois de vie jusqu'à environ 35 ans. Les causes de cette perte de production d'insuline sont encore inexpliquées (virus, rejet, allergie). L'organisme du patient diabétique rejette par la formation d'anticorps, les cellules qui sont capables de produire l'insuline. Lors de cette perte de capacité de production d'insuline, le patient présente les symptômes classiques de diabète. Autrefois appelé diabète insulino- dépendant (DID ou encore diabète juvénile), ce diabète apparaît le plus souvent de manière brutale chez l'enfant ou chez le jeune adulte. Il se caractérise par : 1. Une glycémie (taux de sucre dans le sang) supérieur à 1,26 g/l à jeun ou 8,8 mmols (la valeur normale étant comprise entre 0,8 et 1,10 g/l, mais de 1,10 à 1,25 on parle d'intolérance au glucose), yyyy

104 2. Une acétonurie, parfois (présence d'acétone dans les urines, le seuil de passage de l' acétone dans les urines est une glycémie de 2,5 g/l) accompagnée d'une haleine de «pomme reinette» caractéristique et une présence de sucre dans les urines (glycosurie, le seuil du passage de sucre dans les urines est de 1,8 grammes) par une émission d'urine excessive (polyurie) entraînant une soif intense (polydipsie), appétit anormal augmenté (polyphagie). Il a aussi pour conséquence un amaigrissement malgré une prise de nourriture abondante. En cas d'hyperglycémie, l'insuline est produite en plus forte quantité, en cas d'hypoglycémie c'est le glucagon qui est sécrété en forte quantité. Situées dans le pancréas, leur destruction a pour conséquence une absence d'insuline dans le sang. Les diabétiques de type 1 doivent donc s'injecter de l'insuline plusieurs fois par jour tout au long de leur vie et manger de manière équilibrée. Cet équilibre glycémique étant précaire, traitement et alimentation varient au jour le jour en fonction des circonstances (activités, émotions, horaires, maladies, etc.). Le diabétique se doit donc d'être autonome dans sa gestion de la maladie. Diabète de type 2 (Diabète de l'adulte) : C est un diabète où la perte de contrôle à la hausse de la glycémie est souvent associée à de l'obésité avec une prédominance familiale. Ce diabète résulte du mélange d'une perte d'efficacité de l'insuline, et d'une baisse de sécrétion de l'insuline qui s'installe graduellement. Lorsque ce zzzz

105 phénomène se produit, les symptômes classiques de diabète apparaissent. Autrefois appelé diabète non insulinodépendant (DNID ou diabète de l'âge mûr), ce diabète survient classiquement chez l'adulte de plus de 40 ans présentant, dans 80 % des cas, une obésité ou du moins un excès pondéral. Il est quelquefois précédé du diabète de type 1. Au début de la maladie, la production d'insuline par le pancréas est normale (voire excessive). Mais, les cellules de l'organisme chargées de capter et d'utiliser le glucose deviennent insensibles à l'insuline, d'où une augmentation de la glycémie. Le diabète peut être qualifié de différents adjectifs selon les cas ; on distingue : Le diabète gestationnel : C est une hyperglycémie repérée pour la première fois pendant la grossesse. Les symptômes sont similaires à ceux du diabète de type 2. Il est le plus souvent diagnostiqué par dépistage prénatal plutôt que par ses symptômes. L intolérance au glucose et les troubles de la glycémie à jeun sont des stades intermédiaires entre l état normal et le diabète. Les sujets qui présentent l une ou l autre de ces altérations ont de fortes chances de faire un diabète de type 2, évolution qui n est cependant pas inévitable. Le diabète de type 3 (autres types): C est une maladie systémique qui apporte une destruction du pancréas. Cette pathologie peut être causée par des pancréatites chroniques, aaaaa

106 certaines réactions défavorables à des médicaments ou à un défaut familial typique de certains récepteurs responsables de l'efficacité de l'insuline. Il faut noter que le diabète de type 3 est beaucoup plus rare. Cas particulier du Diabète de type MODY (Maturity Onset type Diabetes of the Young) englobant plusieurs formes de diabètes héréditaires, le diabète gestationnel, et des diabètes secondaires à des maladies, notamment celles du pancréas. Cinq types de diabète MODY ont été mis en évidence, avec 5 gènes mutés : 1. MODY-1 : HNF-4 alpha (Hepatique Nucléaire Facteur) 2. MODY-2 : Glucokinase (Hexokinase hépatique) 3. MODY-3 : HNF-1 alpha 4. MODY-4 : IPF-1 (Insuline Promoteur Facteur) 5. MODY-5 : HNF-1 beta (forme rare) Exemples : Diabète insipide (néphrogénique, central,...), lié à un défaut de la réabsorbtion d'eau au niveau du rein (aquaporine), se manifestant par des urines abondantes non sucrées, Diabète rénal lié à un défaut de réabsorption du glucose par le rein, donnant une urine sucrée (glycosurie) sans anomalies de la glycémie. Diabète secondaire à une mutation de l'acide désoxyribonucléique mitochondrial, (associé à une surdité de perception et caractérisé par une hérédité maternelle) : syndrome de Ballinger-Wallace. bbbbb

107 Diabète lipoatrophique : Lipodystrophie congénitale de Berardinelli-Seip, caractérisé par la disparition du tissu adipeux, avec insulino-résistance majeure, hyperlipidémie et stéatose hépatique. Hémochromatose appelée également le diabète bronzé (ou Syndrome de Troisier-Hanot-Chauffard), diabète favorisé par un excès de fer dans les tissus. Le diabète, sans être véritablement classé dans les maladies émergentes est une maladie non contagieuse qui se développe de manière épidémique depuis quelques décennies, et dont la prévalence augmente fortement et rapidement dans tous les pays, ce qui laisse supposer qu'outre une composante génétique, cette maladie a un ou plusieurs facteurs environnementaux. Le diabète est une maladie qui touche de plus en plus de citoyens marocains. C est une maladie qui peut toucher l'individu à tout âge. Elle est devenue un problème préoccupant pour la santé publique et une lourde charge aussi bien pour l'individu que pour la société. La prévalence de cette maladie sur la population mondiale atteint actuellement 7% et pourrait facilement augmenter dans les 10 prochaines années à 10 % (Steiner, 2000). Concernant "la prise en charge du diabétique par la Caisse nationale des organismes de prévoyance sociale (Cnops) marocaine", on peut dire que le diabète est la première affection de longue durée prise en charge par cette institution ; le coût des soins du diabète s'établissent en moyenne à DH par an pour l'adulte et à DH par mois pour l'enfant. ccccc

108 L'OMS évoque "une véritable épidémie" avec un nombre de cas estimé passé de 30 millions en 1985 à 135 millions en 1995, 10 ans plus tard et 177 millions en 2000, puis 194 millions en L'OMS s'attend à un nombre de diabétiques d'environ 300 millions d'ici 2025 (330 millions diabétiques dans le monde selon la fédération mondiale du diabète). Quelque 2 millions d'adultes de plus de 30 ans au Maroc sont diabétiques et la plupart d'entre eux sont des Diabétiques Non- Insulino- Dépendants (DNID), le type de diabète le plus fréquent, selon les dernières statistiques du Ministère de la santé. Le diabète est un problème de santé publique et le nombre de malades continue de progresser au Maroc où cette maladie engendre encore des complications graves qui peuvent toucher les reins, les yeux, le coeur et plusieurs autres organes du corps humain. Une étude considérée comme très fiable du ministère de la Santé révèle que 8 % des Marocains souffrent du diabète (Soit 2 millions et demi de personnes pour une population de 30 millions d'habitants). Le même taux de maladie règne dans tout le Maghreb arabe. Il y a moins de diabétiques à la campagne qu'en ville et le Maroc en souffre moins qu en Afrique noire. Devant cette progression, le Maroc a défini la lutte contre le diabète comme une priorité. D- Pénurie : Pour le Maroc tout entier, il y a entre 120 et 130 endocrinologues seulement. Sur 100 consultations en endocrinologie, 80 sont en rapport direct avec le diabète, déclare le Professeur Hassan El ddddd

109 Ghomari, endocrinologue et diabétologue au CHU Averroès de Casablanca. Il faut donc considérer que l'insuline est un médicament à part entière, délivré sur ordonnance pour que les malades puissent l'acheter à un prix subventionné, comme les autres médicaments. Au Maroc, le flacon d'insuline coûte 120 DH alors qu'il est vendu pour l équivalent de 30 de nos dirhams en Tunisie. Le traitement se monte en moyenne à 400 DH par mois, avec les seringues. Pour le Pr El Ghomari: «Il vaut mieux subventionner l'insuline, ça coûte moins cher au ministère de la Santé que les soins que nécessite la prise en charge des diabétiques, mais il y a déjà eu un effort en ce sens, depuis un an, l'insuline échappe à la TVA». Selon notre spécialiste: «l'état engage un programme national de lutte contre le diabète en ouvrant des structures régionales». E- Diabète et jeûne : Avec le Ramadan, mois des sucreries, les diabétiques ne peuvent jeûner qu'en prenant des risques. En principe, les diabétiques ne devraient pas jeûner. Malgré cela, certains malades tiennent à le faire. Pour être autorisés à jeûner, leur diabète doit répondre à des critères rigoureux. Il est indispensable d'écouter son médecin. L unanimité est faite sur les critères interdisant de jeûner en cas de: Diabète insulino- traité. Diabète non Insulino- dépendant déséquilibré. Diabète avec complications dégénératives. Diabète et grossesse. Diabète gestationnel. Diabète et allaitement. eeeee

110 Diabète avéré du troisième âge. F- Prise en charge coûteuse : Le diabète a des conséquences lourdes, dont maladies cardiovasculaires, attaque cérébrale, neuropathies, insuffisance rénale, cécité, amputations... Ces conséquences aggravent l invalidité, la diminution de l espérance de vie et les coûts médicaux. Le diabète et ses complications ont d importantes conséquences économiques pour les malades, leur famille, les systèmes de santé et les pays. Un taux élevé de sucre sanguin (glycémie) en dehors d'une certaine norme provoque très rapidement des symptômes: Malaises hypoglycémique et hyperglycémique (acido-cétosiques). Apparition de mycoses parfois (notamment à l'entrecuisse). Les complications à long terme du diabète peuvent être séparées en complications des petits vaisseaux (microangiopathie) et complications des gros vaisseaux (macroangiopathie). Les maladies cardio-vasculaires dues à l'athérosclérose. On retrouve souvent de l'angine de poitrine, voire des infarctus du myocarde passant parfois inaperçus, des accidents vasculaires cérébraux comme des accidents ischémiques et de l'artériopathie oblitérante des membres inférieurs. Il est conseillé aux diabétiques de faire un électrocardiogramme une fois par an. Sur le plan cutanéo- muqueux, on note des difficultés de cicatrisation des plaies sous forme d'ulcères, ces derniers sont courants chez les diabétiques atteints d'artériopathie oblitérante des membres inférieurs. fffff

111 Sur le plan immunitaire, le milieu sucré profite à beaucoup d'agents infectieux telles les candidoses par une atteinte de l'immunité cellulaire. Les complications des petits vaisseaux touchent: 1. Les yeux par la rétinopathie diabétique ischémique (sans formation de néo-vaisseaux) ou hémorragique (avec formation de néo-vaisseaux) pouvant entraîner cécité, microanévrisme, œdème maculaire. Il est conseillé aux diabétiques de faire un fond d'œil une fois par an. 2. La neuropathie diabétique est un trouble de la sensibilité épicritique et profonde parfois accompagné de douleurs neuropathiques principalement au niveau des membres inférieurs, ces troubles de la sensibilité peuvent entraîner un retard de prise en charge de plaies du pied. 3. Le diabétique ne se rend pas compte qu'il a une blessure par l'absence de stimuli douloureux, il laisse évoluer une blessure pouvant entraîner une escarre, voire un authentique mal perforant plantaire. Les diabétiques testent annuellement leur sensibilité distale avec le test appelé mono filament. 4. La néphropathie diabétique pouvant évoluer jusqu'à l'insuffisance rénale. Différentes lésions peuvent atteindre le rein diabétique, surtout les néphropathies glomérulaires et les néphropathies vasculaires. ggggg

112 La mortalité par cette maladie est difficile à mesurer, notamment dans les pays pauvres. L'OMS estime que plus de 4 millions de personnes en mourraient par an dans le monde, ce qui correspond à 9 % environ de tous les morts. Les complications oculaires et cardiovasculaires de cette maladie qui surviennent souvent chez des gens jeunes ou encore en activité, ce qui pousse les services de santé et organismes de sécurité sociale à dépenser de plus en plus pour lutter contre le diabète dont les causes restent incomprises. Le nombre de cas continue néanmoins à augmenter. Le diabète est devenu la quatrième ou cinquième cause de mortalité dans la plupart des pays développés (Scheen et al, 1996). Il a d'abord surtout touché des pays riches ou développés, mais s'étend dans les pays pauvres ou nouvellement industrialisées. Pour la prévention contre le diabète, outre un dépistage permettant un traitement plus précoce, un régime alimentaire adapté, une augmentation de l'activité physique (entraînant une baisse de poids), avec une sensibilisation et un programme d'éducation continus peuvent fortement diminuer la prévalence du diabète. C'est ce qu'a notamment montré, selon l'oms, une expérience chinoise conduite sur six ans au sein d'une population sensible, qui a réduit de près des deux tiers l'apparition de cas de diabète. De telles mesures sont lourdes mais très rentables à long et moyen terme si appliquées à toute une population. Des conséquences secondaires positives concerneront de plus l obésité, les maladies cardiovasculaires et certains cancers d'origine socio- environnementale. Chez hhhhh

113 les patients ayant déjà développé un diabète, divers moyens existent d'en diminuer les impacts : - traiter précocement l hypertension artérielle et l hyperlipémie et contrôler la glycémie afin de réduire les complications et freiner l'évolution vers les formes graves de diabète. Détecter et traiter précocement la protéinurie pour limiter l'évolution vers l'insuffisance rénale. - prévenir l'ulcération des pieds et leur amputation par une éducation et des soins appropriés (source OMS). - dépister et traiter précocement les rétinopathies, ce qui éviterait nombre de cécités et diminuerait les coûts globaux (dont indirects et immatériels) du diabète. Une lutte plus efficace contre le tabagisme et l'alcoolisme qui aggravent les conséquences du diabète (hypertension et cardiopathies) est également recommandée par l'oms. La médecine scolaire et du travail peuvent y contribuer, mais manquent souvent encore de moyens, même dans les pays riches. En résumé, pour prévenir le diabète de type 2 et ses complications, il faut : Surveiller son poids. iiiii

114 Faire de l exercice physique : au moins 30 minutes d exercice régulier d intensité modérée presque tous les jours. Des efforts plus intenses sont parfois nécessaires pour éviter de prendre du poids. Un diagnostic précoce est possible au moyen de tests sanguins relativement bon marché. Le traitement du diabète consiste notamment à abaisser la glycémie et à réduire d autres facteurs de risque connus qui endommagent les vaisseaux sanguins. Le sevrage tabagique est également important pour éviter les complications. Les interventions à la fois économiques et faisables dans les pays en développement sont notamment les suivantes : 1. Correction modérée de la glycémie. Les malades souffrant du diabète de type 1 ont besoin d insuline ; les malades atteints du type 2 peuvent être soignés à l aide de médicaments par voie orale mais peuvent aussi avoir besoin d insuline ; 2. Contrôle de la tension artérielle ; 3. Soins des pieds. 4. Les autres interventions visant à réduire les coûts sont notamment : Le dépistage de la rétinopathie (qui entraîne la cécité) ; Le contrôle des lipides sanguins (pour réguler la cholestérolémie) ; jjjjj

115 Le dépistage des premiers signes d atteinte rénale due au diabète. Ces mesures doivent s accompagner d une bonne alimentation, d exercice physique régulier, du maintien d un poids normal et de l abstinence tabagique Diabète, problèmes de l insulino- résistance, maladies cardiovasculaires secondaires, rôle d une alimentation équilibrée : Rappels : L insuline est une hormone sécrétée par le pancréas et libérée dans le sang lorsqu on consomme des glucides (sucres, céréales, pommes de terre, etc.) et, dans une moindre mesure, lorsqu on mange des protéines et des graisses. Les glucides que nous avalons sont transformés en glucose. L insuline a pour rôle de conduire nos cellules à capter ce glucose sanguin pour les besoins d énergie de l organisme. Ainsi, notre taux de sucre sanguin, qu on appelle «glycémie», reste relativement stable. Lorsque les cellules musculaires (mais aussi celles du foie, du tissu adipeux, des parois vasculaires) ne répondent plus aux sollicitations de l insuline, on parle de résistance à l insuline (ou insulino- résistance). Le sucre sanguin a alors tendance à rester élevé, et le pancréas s épuise à produire toujours plus d insuline pour remédier à cette situation. La résistance à l insuline a des conséquences importantes sur l organisme. Elle entraîne à la longue un taux d insuline chroniquement kkkkk

116 élevé et un ensemble de dérèglements, qui comprend notamment de l obésité, un diabète ou pré-diabète, des problèmes cardiaques, de l hypertension, un «bon» cholestérol (HDL) trop bas, des triglycérides élevés Lutte contre l insulino- résistance: Cette lutte peut être réalisée en prenant en considération les résultats de la recherche et les informations suivantes : Le chrome (Cr) augmente l efficacité de l insuline (Il est le cofacteur de l insuline). Une déficience en Cr réduit la tolérance au glucose et augmente l incidence de diabète (Dewayne-Ashmead, 1989). Il y a prévention de l athérosclérose et inversion de son développement par le Cr qui jour un rôle clé sur le métabolisme lipidique (Moreau, 1989). Tous les sucres lents ne sont pas égaux! En effet, il y a deux types d amidon: l amylose et l amylopectine : L amylose ne se laisse pas facilement démanteler par les amylases. Les aliments riches en amylopectine ont un indice glycémique plus élevé que les aliments riches en amylose parce qu ils permettent aux enzymes digestives de libérer plus rapidement le glucose qu ils en renferment. Des études conduites dès 1993 à l université de Sydney par Suzy Brynes ont montré que les rats auxquels on donne un régime alimentaire riche en amylopectine deviennent résistants à l insuline. Cela est vrai quel que soit l âge auquel ce régime est lllll

117 introduit, et même le changement d alimentation au profit de l amylose n a pas permis de retrouver la santé des rats. Il y a un rôle protecteur de Mg vis à vis de l athérosclérose. Une corrélation inverse existe entre la cholestérolémie et la magnésiémie. Le Magnésium allonge le temps de coagulation. Après 7 jours d administration de Magnésium, des réductions de plus de 40 % de l adhésivité plaquettaire sont observées (Asmead et al, 1985). Dans une étude, l administration orale de Magnésium a permis une diminution de la douleur et de la durée des crises ainsi qu une augmentation de 25% de la capacité d effort sans apparition de crises. La magnésothérapie a aussi réduit la mortalité de 24% chez des patients hospitalisés pour une présomption d infarctus du myocarde, la fréquence de l insuffisance ventriculaire gauche a également été réduite de 25% (Leicester, 1992). Les «Sucres Fous» sont ceux qui conduisent à l insulinorésistance. Le sucré est associé au saccharose (sucre blanc), mais aujourd hui, le goût sucré est obtenu très souvent avec le Glucose (sirop de glucose), le Fructose libre et le Sirop de maïs ou HFCS (Hight fructose corn syrup). Leur consommation régulière, en grande quantité, n est pas innocente. En effet, sur un échantillon de femmes ayant un risque de 30 % de diabète, âgées de 55 à 69 ans et suivies pendant 6 ans, celles qui ont consommé le plus de glucose et de fructose ont vu leur risque de diabète augmenter de +30 % (K Meyer, 2000). De même, dans leurs essais sur des diabétiques, les chercheurs Sakai, 2002 ; Elliot, 2002; Cordain, mmmmm

118 2003 ont trouvé que le fructose pur ou sirop de maïs ou HFCS (à ne pas confondre avec celui des fruits), ne stimule pas la sécrétion d insuline mais provoque plutôt une élévation des graisses, une baisse de la leptine (hormone qui contrôle l appétit), une augmentation de la production de radicaux libres et un syndrome de résistance à l insuline. Chez les diabétiques, il y a une accélération des complications, rétinopathie et gangrène. Les céréales et autres glucides complexes sont risqués dans l alimentation des diabétiques. En effet, les chercheurs de Harvard conseillent d alléger la part des céréales et des féculents dans la ration calorique quotidienne. Ils recommandent de choisir des aliments complets, dont l index glycémique est bas. Ces aliments doivent être riches en fibres, et aussi peu raffinés que possible. Les pommes de terre ne sont pas souhaitables, car elles ne sont pas adaptées au mode de vie sédentaire. Concrètement, au petit déjeuner, il faut choisir des céréales complètes (exemple flocon d avoine). Les corn- flakes, le blé et le riz soufflés sont des aliments imaginés par l industrie agroalimentaire et dont l index glycémique est élevé. Il faut privilégier le pain complet, de préférence de seigle et au levain, car il bénéficie ainsi d un index glycémique favorable. Un autre élément déterminant dans l index glycémique du pain est la densité de sa mie: plus elle est resserrée, mieux c est. Le pain blanc et les viennoiseries ont peu d intérêt, et les chercheurs de Harvard rappellent que leur consommation régulière peut entraîner des troubles de la santé, à commencer par la baisse du «bon» cholestérol, l augmentation des triglycérides, nnnnn

119 la résistance à l insuline. Les pâtes, le riz complet et le riz basmati (les riz «long grain» ont aussi un index glycémique plus favorable) sont de bons choix. Le riz cuisson rapide et le riz gluant devraient être consommés avec parcimonie. Les pommes de terre sous toutes leurs formes, et en particulier les frites, sont déconseillées dans le GMS, en tout cas sur une base régulière Une alimentation raisonnée : Les principaux aliments associés au risque de diabète sont ceux d un régime alimentaire pauvre en fibres mais riche en sodas, riz, pain blanc et pommes de terre. Le risque de diabète est multiplié par 2,17 chez les hommes par 2,5 chez les femmes (Salmeron, 1997). Le pain blanc présente des risques de diabète. En effet, la vitamine E, la vitamine B6, le magnésium, les fibres insolubles sont importants pour la santé cardio-vasculaire et la prévention du diabète. Or, après raffinage, la farine blanche a perdu 95% de sa vitamine E d origine, 87% de sa vitamine B6, 85% de son magnésium et 78% de ses fibres (Liu, 2002). Céréales raffinées et obésité : Le pain complet ne fait pas grossir, mais le pain blanc, lui, est dans une population sédentaire un moteur probable d obésité, comme le suggèrent des études récentes. En fait, lorsqu on conseille à des adolescents obèses de manger moins de féculents et de céréales, et de puiser surtout leurs glucides dans les fruits, les légumes, les oléagineux ou les laitages, ils maigrissent plus que lorsqu ils suivent un régime pauvre en ooooo

120 calories et en graisses, probablement parce que les céréales, surtout raffinées, ne bénéficient pas d un index glycémique bas (Newby, 2003; Kelishadi, 2003; Ebbeling, 2003). Un indice glycémique élevé présente différents risques : Augmentation, au moins chez la femme, du risque d infarctus du myocarde. Les amidons raffinés de haut indice glycémique, lorsqu ils sont consommés en grande quantité, font baisser le niveau de «bon» cholestérol et monter celui des triglycérides, deux facteurs importants du risque cardiovasculaire. Ils élèvent aussi le taux d une protéine pro- inflammatoire (CRP), qui augmente le risque de maladie cardiaque (Liu, 1998 ; Liu, 2002). Parmi les aliments à indice glycémique élevé on peut citer le pain blanc, le riz blanc, les céréales du petit déjeuner, type corn- flakes, le riz soufflé, la pomme de terre, les confiseries, les barres chocolatées, les viennoiseries, le sucre blanc, les confitures, les gâteaux Index insulinémique (Indice I): Elévation de l insuline provoquée par la digestion d un aliment. En effet, lorsqu on mange une barre chocolatée, l indice I monte à 122 ; un pain blanc le fait monter à 100 (comme le glucose) ; un Yaourt nature présente un indice I de Recommandations alimentaires: Le «guide pour manger sainement», ou GMS (Chercheurs Canadiens de l Université de Havard) est basé sur un nombre considérable d études conduites depuis plus de vingt ans à Harvard et ailleurs. «Les preuves scientifiques sont ppppp

121 suffisamment fermes pour pouvoir faire des choix informés de régime alimentaire avec l espoir raisonnable d améliorer substantiellement les chances de rester actif et en bonne santé jusqu à un âge avancé». 1. Les graisses : Le guide de Harvard commence par réhabiliter les graisses : Il n y a aucune relation entre le pourcentage de calories fourni par les graisses et l obésité ou même les maladies chroniques. Il n y a pas de raison de ne sélectionner que des aliments allégés, de cuire sans corps gras et de mesurer chichement l assaisonnement de vos salades. Vous pouvez en revanche être sélectif sur le type de graisses: un petit peu moins de graisses saturées (beurre, laitages) et un peu plus de graisses végétales, qu il faut choisir avec soin pour leur ratio oméga-6/oméga-3 le plus équilibré possible. Cela signifie que vous pouvez manger chaque jour quelques noix non grillées et salées. Vous puiserez des oméga- 3 à longue chaîne (EPA et DHA) dans le poisson gras et les crustacés, à inclure deux ou trois fois par semaine dans votre régime. Pour les huiles, l huile d olive (source d acide oléique mono-insaturé) est la meilleure. Pour la cuisson à la poêle, l huile d olive ou encore l huile d arachide, très stable à la chaleur sont les meilleures. Les chercheurs de Harvard recommandent d éviter ce qu on appelle «acides gras trans», que l on trouve surtout dans les corps gras solides pour fritures et dans certaines préparations comme les gâteaux («graisses partiellement hydrogénées», lit-on alors sur l étiquette). 2. Les fruits et les légumes : Les conseils du GMS de Harvard visent à encourager la consommation des fruits et légumes qui aident à qqqqq

122 prévenir le cancer même si leurs vertus anticancer sont largement surestimées par les nutritionnistes français. Parmi les légumes anticancer les plus intéressants figurent les crucifères (chou-fleur, choux rouge et blanc, chou de Bruxelles, chou chinois, chou brocoli, radis, navet, cresson, moutarde) parce qu ils activent dans l organisme une famille d enzymes qui neutralisent un grand nombre de substances cancérogènes, comme les résidus de pesticides. Les fruits et légumes offrent une protection réelle contre les maladies cardio- et cérébro- vasculaires. Les chercheurs ont aussi observé que le risque d accident vasculaire cérébral est diminué de 6% chaque fois qu on augmente d une unité les portions quotidiennes de fruits et de légumes. On peut aussi conseiller de manger chaque jour de l ail, oignon, poireau, des légumes verts (persil, cerfeuil, céleri, cardon ), des aromates (gingembre, curcuma, romarin, sauge, thym...); des agrumes (orange, citron, clémentine ). Les légumes peuvent être consommés crus, c est même préférable pour les crucifères (la cuisson les empêche d activer nos enzymes protectrices). En revanche, les tomates seront cuites, de préférence avec un corps gras, pour bénéficier au maximum de leur teneur en lycopène, la substance qui donne à la tomate sa couleur. Le lycopène est en effet un puissant antioxydant, associé à un risque réduit de certains cancers. 3. Les protéines animales : Si les viandes blanches (deux ou trois fois par semaine) et le poisson sont conseillés, les chercheurs de Harvard mettent en garde contre l excès de viande rouge, et surtout rrrrr

123 de charcuteries, associé à un risque accru de cancers digestifs. Cependant les enfants, les adolescents ainsi que les femmes entre puberté et ménopause ne doivent pas négliger les viandes rouges qui aident à répondre aux besoins en fer. Dans ce cas, ils peuvent être consommés de trois à cinq fois par semaine. On devrait consommer du poisson gras deux ou trois fois par semaine (saumon, sardine, anchois sans sel), des coquillages ou des crustacés, du poisson maigre une ou deux fois par semaine. Certains poissons gras ne doivent pas être mangés régulièrement car ils apportent trop de mercure. C est le cas du thon, du brochet, de l espadon, du flétan et du requin (pas plus d une fois par semaine). Certaines protéines végétales, comme le soja, répondent aussi bien aux besoins de l organisme que les protéines animales. Les chercheurs estiment que le soja peut dans certains cas se substituer à la viande, mais ils mettent en garde contre une consommation quotidienne tant qu on n en sait pas plus sur les effets du soja à long terme. 4. Les laitages : Les laitages perdent dans le GMS la place prépondérante qu ils occupent, d une part parce que leur intérêt dans la prévention de l ostéoporose est douteux, d autre part parce que des études conduites à Harvard suggèrent qu ils pourraient augmenter le risque de cancer. La plupart des adultes n ont pas besoin de deux ou trois laitages par jour. Il faut penser au lait comme un aliment optionnel, et non pas comme une exigence à satisfaire trois fois par jour. On trouve facilement du calcium dans les fruits et dans les légumes, dans le poisson (sardines) et dans les sssss

124 eaux minérales calciques, et la santé de l os dépend aussi des apports en vitamine D, bicarbonates, potassium (fruits et légumes) et, peut- être, en antioxydants et en acides gras oméga-3. L activité physique, notamment la musculation à l approche de la cinquantaine, est l un des meilleurs moyens de renforcer les os. 5. Les boissons: Il faut boire de l eau, bien sûr; en priorité. Les sodas, et surtout les sodas sucrés, sont déconseillés. Les jus de fruits sont acceptables, à condition de ne pas en faire une boisson régulière. Le café ne pose pas de problème à moins de trois tasses par jour. Les boissons apportant des flavonoïdes, molécules antioxydantes, comme le thé et les tisanes, peuvent être consommées chaque jour; même si les chercheurs de Harvard restent réservés sur leurs réels effets protecteurs, qu ils jugent «montés en épingle». Les alcools sont préjudiciables, surtout pour la femme (risque de cancer de sein). 6. Les compléments de vitamines et de minéraux : Nouveauté spectaculaire, les chercheurs conseillent de prendre chaque jour un complément multivitaminé, parce qu ils reconnaissent que l alimentation ne couvre plus les besoins optimaux en vitamines et en minéraux, et qu ils ont trouvé qu une telle mesure réduisait cancers et maladies cardio-vasculaires. Pour cela, choisissez un complément de vitamines et de minéraux modérément dosé (de une à trois fois les apports conseillés) ne contenant de préférence ni fer; ni cuivre, ni manganèse. Ces trois minéraux peuvent en effet réagir avec la vitamine C et générer des radicaux libres. Les enfants peuvent bénéficier eux aussi d un ttttt

125 complément de vitamines et de minéraux. De nombreux Français ne reçoivent pas assez de potassium, un minéral très important pour la prévention de l infarctus, de l accident vasculaire cérébral et de l ostéoporose Un sport adapté : Tout excès de poids entraîne une augmentation des besoins en insuline (fabriquée par le pancréas ou injectée par le diabétique). Il est donc important de maigrir et d éviter l obésité. Le sport est une aide pour cette perte de poids ainsi que pour le maintien d un équilibre du diabète. Les exercices physiques améliorent la circulation du sang, favorisent une augmentation de la consommation de glucose par les cellules musculaires, ce qui entraîne une baisse de la glycémie et une sensibilisation de l organisme à l insuline. Le sport favorise aussi la diminution de la tension artérielle, des triglycérides et du cholestérol total et augmente le HDL cholestérol (c est-à-dire le " bon " cholestérol) ; il améliore donc le " profil lipidique " et le bien-être de l organisme. Mais avant de pratiquer un sport, le diabétique doit adapter son alimentation en fonction de la durée des efforts physiques. En effet, le sport a tendance à faire baisser le taux de sucre dans le sang. Les diabétiques qui prennent des comprimés hypoglycémiants doivent par conséquent veiller à prévenir une hypoglycémie au cours de leur activité sportive ou après celle-ci. Dans ce but, ils réduiront la dose d insuline ou la quantité de comprimés et/ou ingéreront un supplément d hydrates de carbone. Cet ajustement s effectuera en fonction du sport, de la durée et de l intensité de l effort. A cet égard, il est nécessaire de consulter son uuuuu

126 médecin avant de se lancer dans la pratique sportive et d envisager si nécessaire un bilan avant la mise au point d un programme d efforts. Le sport doit donc être bien choisi. Il faut éviter les exercices physiques dont la sécurité est difficilement maîtrisable tels que les courses de voitures, de motos, le parachutisme, les sports aéronautiques, le ski nautique, le voile, les escalades de falaises et les sports de combats. Les mouvements quotidiens et les sports d endurance tels que course à pied, marche, cyclisme, natation, ski de fond, patinage sont particulièrement recommandés aux diabétiques. Leur intensité est facilement dosable et ils ont des effets positifs sur la santé en général. Les sports d équipe, tels que le volley-ball sont également appropriés ainsi que d autres sports comme le tennis de table, la gymnastique et l aquagym. Une fois le sport choisi, sa fréquence, sa durée et son intensité ne peuvent être augmentées que de manière progressive. L exercice physique est donc recommandé, sans excès brutal ni trop prolongé (risque d hypoglycémie). L idéal est de le pratiquer tous les jours plutôt que de concentrer son activité physique sur une journée Conclusion : Le diabète est une maladie qui, pour être surmontée, nécessite du patient une bonne organisation dans: Toute sa vie : surveillance du poids, suivi, contrôle, diagnostic et bilans sanitaires réguliers, Son alimentation : régime riche en légumes et fruits, pauvre en produits animaux, vvvvv

127 Ses activités : exercices physiques, sport d endurance, Son comportement : prévention de tabagisme et d alcoolisme. Le diabétique est donc le patient qui doit être à la fois discipliné, organisé et prudent afin d éviter les complications de sa maladie. wwwww

128 Chapitre VIII : Synthèse générale Quelque 2 millions d'adultes de plus de 30 ans au Maroc sont diabétiques et la plupart d'entre eux sont des non- insulino- dépendants (NID), le type de diabète le plus fréquent (9 cas sur 10 environ), selon les dernières statistiques du Ministère de la santé. De même, quelques deux cents mille marocains souffrent du diabète insulino- dépendants (DID) et environ 150 millions de personnes en sont atteintes au niveau mondial et ont besoin d injection d insuline. Le diabète est un problème de santé publique et le nombre de malades continue de progresser au Maroc où cette maladie engendre encore des complications graves qui peuvent toucher les reins, les yeux, le coeur et plusieurs autres organes du corps humain. Le nombre de personnes concernées par le diabète doublera dans les 25 prochaines années, et le besoin en insuline ne cessera d augmenter, ce qui alourdira davantage le coût de traitement des diabétiques ; tout ce qui peut contribuer à la réduction de ce coût sera la bienvenue. Par ailleurs, le diabète se caractérise par la présence de sucre (glucose) dans le sang à un taux trop élevé qui devient toxique. Le diagnostic du diabète est réalisé après une visite chez le médecin qui prescrit une prise de sang lorsque le patient présente des symptômes de fatigue, de difficulté de concentration, de soif intense et de fréquente envie d uriner. On est diabétique quand on a une glycémie supérieure à 1,26 g/l, mesurée après 8 heures de jeûne lors de deux mesures différentes. xxxxx

129 Le glucose provient soit d un apport alimentaire (après un repas) soit d une production par le foie. Il se trouve dans les vaisseaux sanguins pour être transporté vers les tissus qui vont l utiliser (les muscles ou le cerveau principalement) ou le stocker (le foie, les graisses ou les muscles). Pour quitter le sang et gagner ces sites d utilisation ou de stockage, l intervention de l insuline est nécessaire. Tout défaut de production de l insuline par le pancréas ou de son utilisation dans l organisme risque de provoquer le diabète et d endommager les vaisseaux à travers tout le corps. De plus, les yeux, les reins et les nerfs sont susceptibles d être atteints. En outre, les diabétiques présentent souvent un excès pondéral préjudiciable à l action de l insuline. En effet, tout excès de poids entraîne une augmentation des besoins en insuline (fabriquée par le pancréas ou injectée par le diabétique). Il est donc important de maigrir et d éviter l obésité. Le sport est une aide pour cette perte de poids ainsi que pour le maintien d un équilibre du diabète. Les exercices physiques améliorent la circulation du sang, favorisent une augmentation de la consommation de glucose par les cellules musculaires, ce qui entraîne une baisse de la glycémie et une sensibilisation de l organisme à l insuline. Le sport favorise aussi la diminution de la tension artérielle, des triglycérides et du cholestérol total et augmente le bon cholestérol de l organisme. Le diabète est une maladie qui, pour être surmontée, nécessite du patient une bonne organisation dans : yyyyy

130 Sa vie quotidienne : surveillance du poids, suivi, contrôle, diagnostic et bilans sanitaires réguliers, Son alimentation : régime riche en légumes et fruits, pauvre en produits animaux, Ses activités : exercices physiques, sport d endurance, Son comportement : prévention de tabagisme et d alcoolisme. Le diabétique est donc le patient qui doit apprendre à être discipliné, organisé et prudent afin d éviter les complications de sa maladie. Par ailleurs, la connaissance approfondie sur la biochimie de l insuline et sur les mécanismes de son métabolisme dans l organisme humain est à l origine de la production de cette hormone d une manière commerciale et économe, en utilisant les plantes comme support biologique, génétiquement modifié. L insuline «humaine» d origine végétale se comporte exactement comme l insuline naturelle et constitue, par conséquent, un produit prometteur, aussi bien pour l industriel que pour le consommateur encouragé par un coût, 40 à 60 % moins élevé que l insuline «traditionnelle» disponible sur le marché. Toutefois, la technologie actuelle de production de l insuline humaine qui utilise des microorganismes (cultures de bactéries et de levures dans des bioréacteurs) n est plus adaptée à cette forte demande en insuline à cause du coût élevé de sa production. L alternative qui s avère nettement plus économique, récemment découverte par des scientifiques canadiens, est la production d insuline à base de graines de Carthame génétiquement zzzzz

131 modifié. Ces graines sont riches en corps lipidiques, entourés de membranes qui contiennent de l oléosine, liée à la pré-insuline, nécessitant quelques modifications et manipulations de centrifugation et de purification pour être transformée en insuline, prête à l utilisation. La modification génétique du Carthame consiste à faire lier le gène de l insuline humaine au gène végétal codant pour l oléosine. Le gène hybride, une fois introduit dans le génome de la plante, mène à la production de protéine chimère, oléosine/insuline humaine, à séparer et purifier pour être biologiquement active. La méthode de production de l insuline humaine à l aide des plantes de carthame est actuellement optimisée. Des essais cliniques ont été conduits sur trois années et ont prouvé la réussite du choix de cette plante pour la production de l insuline et la facilité de sa purification. Les chercheurs pensent être capables de répondre aux besoins mondiaux dès 2010, en exploitant moins de 8000 hectares de plants de carthame génétiquement modifié. Au Maroc, cette plante est disponible et son extension sur plus de quelques milliers d hectares est encouragée par les programmes de l INRA. La culture du Carthame pourrait donc être encouragée et valorisée au Maroc par cette utilisation pharmaceutique. En outre, des mesures réglementaires et de protection des champs de culture contre la dissémination des graines dont le génome est modifié doivent être prises avant toute utilisation. aaaaaa

132 Certains scientifiques sont pour cette production d insuline «humaine» d origine végétale génétiquement modifiée, qualifiée d extraordinaire, pouvant bouleverser le monde, en mettant à la disposition des diabétiques une insuline qui coûte la moitié de son prix actuel. Les arguments avancés présument que la pro insuline humaine est très rapidement dégradée pour qu'elle perde de son activité une fois ingérée par les animaux du milieu. D autres avis contre, présument que l inhalation de la pro insuline contenue dans les débris des graines dispersées au champ de culture constitue un danger à l environnement ; ils présument qu elle reste active pendant une certaine période après la récolte des graines du carthame. Les chercheurs de SembioSys écartent la possibilité que les débris inhalés et la poussière du carthame transgénique puissent être actifs, mais les scientifiques qui s opposent à l utilisation des OGM (organismes génétiquement modifiés) donnent des contre- exemples. Il est probablement prudent de dire que toutes les espèces menacées et les êtres humains peuvent être des victimes potentielles de la dissémination de plantes vivrières génétiquement modifiées pour produire l'insuline humaine, mais ces risques peuvent en très grande partie être surmontés par un contrôle efficace et par l application de mesures sérieuses de protection de l environnement. Le rapport de l organisme officiel américain USDA-APHIS a présenté différents arguments contrastés, en faveur et en défaveur de la production bbbbbb

133 de l insuline humaine par le carthame génétiquement modifié, mais l avis favorable l a emporté et la société canadienne SembioSys a été autorisée à effectuer cette production. Toutefois, la culture de Carthame est prometteuse et pourrait, lorsqu elle est génétiquement modifiée, valoriser le terrain et les intrants des agriculteurs pour une utilisation pharmaceutique. En effet, confrontée à la mondialisation des marchés, l agriculture et les secteurs industriels qui lui sont associés doivent renforcer leur compétitivité et assumer les nouvelles exigences du marché en terme de qualité, modes de production, diversification et transformation. D une part, les consommateurs des produits non alimentaires, notamment pharmaceutiques, recherchent des produits peu coûteux et respectant l environnement. D autre part, les industriels de la transformation de la matière agricole exigent des produits de composition stable et à forte valeur ajoutée. Les agriculteurs, quant à eux, demandent des produits rentables, permettant de valoriser les intrants et leur assurant un revenu conséquent. Ainsi, il ne suffit plus d améliorer uniquement la productivité, mais il apparaît nécessaire d ouvrir la voie à de nouveaux débouchés de la production agricole en répondant aux exigences de la qualité. Les progrès génétiques et des pratiques culturales respectueuses de l environnement permettent de progresser dans cette voie. Ainsi, ces préoccupations environnementales et économiques poussent le monde agricole vers un mode de production efficace dans l obtention du produit ciblé et de la qualité désirée; les organismes de Recherche et de Développement accompagnent cette démarche. cccccc

134 Dans le secteur des oléagineuses, la filière du carthame produisant uniquement de l huile s est fragilisée, notamment par la concurrence d autres cultures oléagineuses, comme le colza. Toutefois, une meilleure valorisation des produits et co-produits de la récolte et une diversification des utilisations permettrait à la culture de rester compétitive vis-à-vis des autres espèces oléagineuses. Dans le secteur non alimentaire, principalement le secteur pharmaceutique, la production de l insuline humaine d origine végétale est prometteuse puisqu elle est de plus en plus demandée dans le monde pour résoudre le problème du diabète. Les plantes offrent donc un fort potentiel pour la production en masse de protéines recombinantes d intérêt thérapeutique. Cependant, sous leur forme brute, elles ne sont pas encore idéales pour la production de ces protéines parce qu elles produisent des molécules dont la glycosylation n est pas toujours compatible avec une application thérapeutique chez l homme. Aussi, la modification de la capacité de glycosylation des plantes, de telle sorte que ce système d expression soit mieux adapté à la production de glycoprotéines à usage thérapeutique, fait-il l objet de nombreux travaux de recherche et d inventions géniales et originales. Les étapes de synthèse de l oléosine génétiquement modifiée dans les graines de Carthame ne diffèrent pas de celles de la synthèse des protéines dans la cellule végétale. Cependant, des manipulations génétiques, souvent compliquées, sont nécessaires afin de conduire à bien la synthèse de la molécule d intérêt (insuline). dddddd

135 D une manière générale, glycosylation, acétylation, acylation et phosphorylation sont des étapes qui jouent un rôle important dans la synthèse de protéines conformes. Les enzymes qui catalysent ces modifications devront donc être présentes en quantité suffisante dans les cellules productrices de protéines recombinées. Ces dernières doivent subir une maturation qui les rend actives. Elles doivent également être traitées de manière à éviter leur dégradation, en les exprimant dans un compartiment cellulaire loin des protéases ou en présence d inhibiteurs de ces protéases. Ces protéines doivent ensuite être extraites puis purifiées pour leur utilisation. L industrie de l agriculture moléculaire et le gouvernement ont donc de nombreux défis à relever. Ils doivent, entre autres, s assurer de l innocuité des cultures pour la santé humaine et animale, de la sécurité des travailleurs et de la minimisation des impacts négatifs de la moléculture sur l environnement. De plus, ils devront présenter cette nouvelle façon de produire des médicaments à la population, être à l écoute de ses craintes et pouvoir répondre à ses questions. La mise en place d une réglementation claire, transparente et basée sur la science ainsi que d un système de surveillance solide, sont essentiels. Enfin, l agriculture moléculaire semble là pour rester et elle va se développer. Cependant, il est crucial que ce développement ne se fasse pas au détriment de la santé des humains, des animaux et de l environnement. L industrie doit maintenant prouver à la population que l agriculture moléculaire végétale comporte des avantages pour la eeeeee

136 production de médicaments et que les risques sont rigoureusement contrôlés. Le consommateur, quant à lui, ne peut que se réjouir de toute découverte, sur la base de laquelle le prix de l insuline baisse sensiblement. ffffff

137 Conclusion générale Le diabète est une maladie qui demande du patient d apprendre à être discipliné, organisé et prudent afin d éviter les complications de sa maladie. Le diagnostic du diabète est réalisé après une visite chez le médecin qui prescrit une prise de sang lorsque le patient présente des symptômes de fatigue, de difficulté de concentration, de soif intense et de fréquente envie d uriner. On est diabétique quand on a une glycémie supérieure à 1,26 g/l, mesurée après 8 heures de jeûne lors de deux mesures différentes. En outre, les diabétiques présentent souvent un excès pondéral préjudiciable à l action de l insuline. Les exercices physiques améliorent la circulation du sang, favorisent une augmentation de la consommation de glucose par les cellules musculaires, ce qui entraîne une baisse de la glycémie et une sensibilisation de l organisme à l insuline. Le sport favorise aussi la diminution de la tension artérielle, des triglycérides et du cholestérol total et augmente le bon cholestérol dans l organisme. Le nombre de personnes concernées par cette maladie ne cesse d augmenter chaque année. A l échelle mondiale, ce nombre dépassera les trois cents millions patients dans les deux prochaines décades et les besoins en insuline vont connaître une grande augmentation en quantité et en coût de traitement. gggggg

138 Toutefois, la technologie actuelle de production de l insuline humaine qui utilise des microorganismes (cultures de bactéries et de levures dans des bioréacteurs) n est plus adaptée à cette forte demande en insuline à cause du coût élevé de sa production. L alternative qui s avère nettement plus économique, récemment découverte par des scientifiques canadiens, est la production d insuline à base de graines de Carthame génétiquement modifié. Ces graines sont riches en corps lipidiques, entourés de membranes qui contiennent de l oléosine liée à la pré insuline. Après quelques modifications et manipulations de centrifugation et de purification, l oléosine peut être séparée de l insuline ; celle-ci sera purifiée pour être active et prête à l utilisation. Au niveau du Ministère de la santé publique, la mise en place d une réglementation claire, transparente et basée sur la science ainsi que d un système de surveillance solide, sont essentiels. Enfin, l agriculture moléculaire semble là pour rester et elle va se développer. Cependant, il est crucial que ce développement ne se fasse pas au détriment de la santé des humains, des animaux et de l environnement. L industrie doit maintenant prouver à la population que l agriculture moléculaire végétale comporte des avantages pour la production de médicaments et que les risques sont rigoureusement contrôlés. hhhhhh

139 Résumé Le nombre de diabétiques ne cesse d augmenter dans le monde. Il atteindra plus de trois cents millions dans les deux décades qui viennent. Le besoin en insuline suivra cette augmentation, particulièrement si l inhalation et la voie orale remplacent l injection qui ne fait pas plaisir aux patients. En adoptant l inhalation, les quantités nécessaires d insuline devront être multipliées par 5 à 10 afin de couvrir les besoins en cette hormone protéique. Le coût du traitement du diabète ne serait donc pas facile à supporter, ni par les individus, ni par la société civile. La technologie actuelle de production d insuline à partir des bactéries et de la levure s avère donc inadaptée et coûteuse et doit être remplacée par une autre technologie plus appropriée. L utilisation des plantes comme usine de production de l insuline s avère la voie la plus rentable et la moins coûteuse. Elle permettrait de réduire le coût du traitement de 40 à 60 %. Les plantes médicinales et d utilisation pharmaceutique sont nombreuses mais assez mal connues. L agriculture qui s occupe de leur production est connue sous le nom de moléculture. Le carthame (Carthamus teinturis L) est l un de ces plantes qui attirent de plus en plus l attention des chercheurs en pharmacie, particulièrement celle des chercheurs canadiens qui ont développé un carthame génétiquement modifié capable de produire une grande quantité d insuline à faible coût. Le présent rapport décrit succinctement les potentialités de production de l insuline de cette plante médicinale, la structure biochimique de cette insuline ainsi que les voies de sa biogenèse végétale, les atouts de la moléculture en tant qu agriculture de rénovation en confrontation à la mondialisation, ainsi que l état d art et de connaissances relatives au diabète et à sa prévention par une alimentation adéquate. Le présent rapport comporte des illustrations parmi les plus récentes (2007) montrant les différentes composantes de la chaîne de production de l insuline par voie végétale. iiiiii

140 Summary The number of diabetics does not stop increasing in the world. It will reach more than three hundred millions in the two coming decades. The need in insulin will follow this increase, particularly if the oral way (inhalation) replaces the injection that does not make pleasure to the patients. While adopting this oral way, the necessary quantities of insulin should be multiplied by 5 to 10 in order to cover the needs in this hormone. The cost of the treatment of the diabetes would not be therefore easy to support, neither by the individuals, nor by the civil society. The present technology of insulin production from bacteria and yeast is therefore maladjusted and expensive and must be replaced by another more suitable technology. The use of the plants like factory of production of the insulin proves to be the way the most profitable and least expensive. It would permit to reduce the cost of the treatment by 40 to 60%. Industrial medicinal plants of pharmaceutical use are numerous but they are not enough known. The agriculture that takes care of their production is known as moleculture. The safflower (Carthamus teinturis L) is one of these plants that attract the attention of researchers in pharmacy, particularly Canadian ones who developed a genetically modified safflower able to produce a great deal of insulin to low cost. The present report describes succinctly the potentialities of production of the insulin of this medicinal plant, the biochemical structure of this hormonal protein as well as the ways of its plant biogenesis. In this report, the assets of the molecular agriculture as agriculture of renovation in confrontation to internationalization are described, as well as the state of art and relative knowledge to the diabetic illness and its prevention by an adequate diet. The present report includes also some illustrations among the most recent ones (2007) showing different parts of the crop insulin fabrication line. jjjjjj

141 هلخص إ ػذد ان شضى ان صبث ثذاء انسكشي ف تضا ذ يست ش ف انؼبنى لذ ف ق زا انؼذد ثالث بئخ يال س خ خالل انؼمذ ان مجه. ؼ رنك أ االحت بجبد ي يبدح أ سه )insuline( ستشتفغ كزنك خبصخ إرا ت صم انخجشاء إنى استؼ بن ب ػ طش ك االثتالع انشى ػ ض انحم انزي ال حجز جم ان شضى. ستشتفغ تهك االحت بجبد أكثش ي خ س إنى ػشش يشاد إرا ػى زا ان ع ي االستؼ بل ػ طش ك انجهغ orale) (voie ثزنك ستشتفغ كهفخ ان ذا اح صؼت تح م يصبس ف انؼالج ػهى األشخبص ان جت غ ان ذ. فبنتك ن ج خ انحبن خ إل تبج يبدح أ سه انت تستؼ م انجكت ش ب انخ شح نى تؼذ يالئ خ نشذح غالئ ب ال ثذ ي إ جبد ثذ م ن ب. كزا تؼتجش ان جبتبد انطج خ يص ؼب بجغ انفؼبن خ له م انكهفخ لذ فش ص بء 04 إنى 04 ف ان بئخ ي كهفخ اإل تبج. تؼذ ان جبتبد انطج خ كث شح يت ػخ إال أ ب غ ش يؼش فخ ثذلخ تحتبج إنى تغ ش ج. تس ى انضساػخ انت ت تى ث زا ان ع ي اإل تبج صساػخ جض ئ خ moléculaire).)agriculture ك ب ؼذ جبد "انؼصف س" teinturis( )Carthamus أحذ ز ان جبتبد انت تجزة أ ظبس انجبحث خبصخ ي ى انك ذ انز ت صه ا إنى إديبج ج أ سه ف زا ان ضس ع نهحص ل ػهى أكجش إ تبج ألم تكهفخ ي ز ان بدح انجشت خ انحسبسخ. تى تمش ش زا انجحث ث صف جبد "انؼصف س" ز ان بدح ان شي خ انضساػخ kkkkkk

142 انجض ئ خ انجذ ذح انت جذ أ ال ثذ ي ب نه ل ف أيبو غطشسخ انؼ ن خ ان بفسخ انص بػ خ انؼبن خ ك ب صف داء انسكشي ان لب خ ي ػهى طش ك انتغز خ ان الئ خ ششح يشاحم ص بػخ أ سه ان جبت خ. Références bibliographiques Références bibliographiques du 1 er chapitre : 1. Bamouh A., A. Bouaziz et M. Elassri, Les oléagineuses au Maroc. Bulletin PNTTA. 2. Faye L., N. Landry, P. Lerouge, V. Gomord & L-P. Vezina, La production de protéines à usage biopharmaceutique dans les plantes. Synthèse ; médecine/sciences 2001 ; m/s n 8-9, vol. 17: Guevara CA., Inhaled insulin for diabetes mellitus. N Engl J Med., 356(20): Guth J., V. Lentner, C. Cappabianca & Lonza Inc., Oleosomes, A natural and multifunctional route to cold process emulsions. Cosmetics and toiletries manufacture worldwide, Lang M. & A. Baum, City firm creates insulin from plants. Calgary Herald, A8, Monday, February 28, Morishita M, N. Kamei, J. Ehara, K. Isowa & K. Takayama, A novel approach using functional peptides for efficient intestinal absorption of insulin. J Control Release 2007, 118(2), Moschini G., J. Miranowiski, B. Babcock, M. Dufy, R. Wisner, J. Beghin, D. Hayes, S. Lence, P. Baumel & N.E. Harl, Economic perspectives on GMO market segregation. Staff Paper no Iowa State University. Departments of Economics. 8. Ni T, Y. Hu, L. Sun, X. Chen, J. Zhong, H. Ma & Z. Lin, Oral route of miniproinsulin-expressing Ganoderma lucidum decreases blood glucose level in streptozocin-induced diabetic rats. Int J Mol Med. 2007, 20(1), llllll

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149 86. Markley N., Bio Pharm. Producing Proteins Using Transgenic Oilbody- Oleosin Technology. Progress has been significant in producing therapeutic proteins in plants. Insulin is an early candidate for commercialization. 87. Nykiforuk C.L., 2006, "Transgenic expression and recovery of biologically active recombinant human insulin from Arabidopsis thaliana seeds", Plant Biotechnology Journal 4: 77-85, "Company engineers safflower plants for insulin", CBC News, Références bibliographiques du 6 ème chapitre : 88. Davidson H., Pro- insulin processing. Cell Biochemistry and Biophysics 2004 Supplement, El Jabiri A., Rappel sur l insuline commercialise au Maroc. Taourirte, le 07 Septembre Faye L., N. Landry, P. Lerouge, V. Gomord & L.P. Vézina, La production de protéines à usage biopharmaceutique dans les plantes. Synthèse ; médecine/sciences 2001 ; m/s n 8-9, vol. 17: Giroud J.P. & Assan R., Insuline et medicaments hypoglycémiants. Pharmacologie clinique. Bases de la thérapeutique. 2 ème Ed., pp Ismaili Alaoui O., L insuline : Aspects fondamentaux et pratiques. Thèse 92 de l Université Mohamed V. Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat. 93. Kaaks R., Plasma insulin. IGF-I and Breast cancer. Gynécologie Obstétrique & Fertilité. Vol. 29, Issue 3, March 2001, pp Nykiforuk C.L., 2006, "Transgenic expression and recovery of biologically active recombinant human insulin from Arabidopsis thaliana seeds", Plant Biotechnology Journal 4: 77-85, "Company engineers safflower plants for insulin", CBC News, Ruhlman T., R. Ahangari, A. Devine, M. Samsam & H. Daniell, Expression of cholera toxin B-proinsulin fusion protein in lettuce and tobacco chloroplasts--oral administration protects against development of insulitis in non-obese diabetic mice. Plant Biotechnol J., 5(4), Sellam J.I., Le traitement de diabète de type 1. EMC, R-30. Références bibliographiques du 7 ème chapitre : ssssss

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152 Annexe 1: Correspondences avec SembioSys Adresse d envoi des e- mails: Nykiforuk, Ph.D.,"Company engineers safflower plants for insulin", CBC News, ; Site internet de SemBioSys Plantes Bt et insectes utiles N 16 Avril 2003 Page 3 (Cory biochemistry group leader at SemBioSys Genetics Inc. ([email protected]) 1- Première lettre envoyée fin Novembre 2007 : From: Miss Kaoutar skiredj [mailto:[email protected]] Sent: Monday, November 26, :44 PM To: SemBioSys, [email protected] Subject: carthame and insulin Hi; I'm a student in pharmacy University of Morocco. I'm writing my memory of the end of studies. My subject is as follows: "Carthame and insulin production". By Internet navigating, I found the address of your society and that you're working on the same subject. Would you like to send me any documentation about this plant and Pro insulin production. I like to include the name of your society in my references, specially the names of some scientifics working in this theme; would you please send me interesting references of litterature to include in my thesis. I would appreciate if one or two of your specialists can assist as jury members, next July, to my thesis presentation. Sincerely yours Miss Kaoutar; [email protected]; vvvvvv

153 Aucune réponse! 2-2 ème demande de documentation et d autorisation pour inclure les photos dans la thèse, cette-fois-ci adressée à des noms connus: From: Miss Kaoutar skiredj [mailto:[email protected]] Sent: Tuesday, December 11, :37 PM To: Nancy Markley; Cory Nykiforuk; Joseph Boothe; Maurice Moloney; [email protected] Subject: carthame and insulin Hello, I m a student in pharmacy. This year is the final and I should present my memory in the presence of a jury. The subject I write on is as follows: Carthame and insulin. I ve been pleased to find in the Net your following article: Nancy Markley, Cory, Nykiforuk, Joe Boothe, and Maurice Moloney, Bio Pharm. Producing Proteins Using Transgenic Oilbody- Oleosin Technology. Progress has been significant in producing therapeutic proteins in plants. Insulin is an early candidate for commercialization. The Science and Business of Pharmaceuticals. June So I really appreciate if you can send me more scientific documentation to do my thesis. In this article, unfortunately, the pictures are impossible to reproduce or copy. Can I have your permission to get these pictures reproducible and to have your name as a bibliographical reference? As I m Moroccan and I speak French, I appreciate if you send me documentation in French, if it s available. Thank you very much. wwwwww

154 Sincerely yours Miss Kaoutar Skiredj Toujours pas de réponse! 3-3ème lettre: From: Miss Kaoutar skiredj Sent: Tuesday, December 25, :17 AM To: Nancy Markley; Cory Nykiforuk; Joseph Boothe; Maurice Moloney; Subject: carthame and insulin Dear Cory Nykiforuck, I m pleased to write to you for the second time. In fact, I asked you, last month, to let me (Miss Kaoutar Skiredj) to have some documentation to do my thesis in pharmacy, about insulin and Carthame. I had your permission and I thank you very much. By the way, I like to wish you good and happy new year Sincerely yours Miss Kaoutar Skiredj 4ème: La réponse: "Miss Kaoutar skiredj" <[email protected]> "Cory Nykiforuk" <[email protected]> Wed, 12 Dec :48: carthame and insulin Dear Kaoutar, xxxxxx

155 I have attached pdf. files for your use and have included the websites of the articles from which you should be able to use an online translator for French. In order to use the images check with copyright laws/rules on the websites for requirements, otherwise if using in a presentation it should not be a problem. prevsearch= &cookieset=1 =9655 Sincerely, Cory L. Nykiforuk, Ph.D., Biochemistry Group Leader, SemBioSys Genetics Inc. Phone: (403) ; Cell: (403) ; Fax:(403) ; [email protected]; CONFIDENTIALITY NOTICE: This communication, including any attachments, may contain information that is confidential and/or privileged and is intended for the exclusive use of the individual to whom it is addressed (the "addressee"). Any review, distribution, copying, disclosure or release of the information contained within this communication by a person other than the addressee is strictly prohibited. If you have received this communication in error, please notify the sender immediately and delete all copies of this message, including any attachments. 5ème: Lettre de remerciement: From: Miss Kaoutar skiredj [mailto:[email protected]] Sent: Wednesday, Jan 9, :02 AM yyyyyy

156 To: Nancy Markley; Cory Nykiforuk; Joseph Boothe; Maurice Moloney; Cory Nykiforuk Subject: carthame and insulin Thank you very much for your pdf.files on carthame and insulin. To give my thesis a good aspect I need to include pictures; I really appreciate if you give me your and SemBioSys authorization. Thanks again. Sincerely yours. Miss Kaoutar 6- Dernière correspondence: RE: information about insulin extracted from carthame seeds Mercredi 3 Septembre h04mn 59s De: "Cory Nykiforuk" <[email protected]> À: [email protected], "Joseph Boothe" <[email protected]>, "Nancy Markley" <[email protected]>, "Maurice Moloney" <[email protected]>, "Karen Sparrow" <[email protected]> Ms. K. Skiredj, Congratulations on completing your Thesis. Please refer to the SemBioSys website but currently this product is not commercially available. As mentioned previously, the product is currently going through regulatory approval in the US and Europe. An IND was filed in the US over a month ago, allowing the next step in the zzzzzz

157 regulatory approval process to proceed. Therefore, Phase I/II clinical trials (testing of the Safflower-derived insulin in human patients) are to begin at the end of the year. Thereafter, Phase III production will proceed with the hopes of attracting commercial partners to forward the product into different applications and/or markets. I hope this provides some insight into the current status of the insulin product, but please feel free to ask further questions. All the best, Cory L. Nykiforuk, Ph.D. Biochemistry Group Leader; SemBioSys Genetics Inc.; Phone: (403) Cell: (403) ; Fax:(403) ; [email protected] Annexes 2. Illustrations Dans ce qui suit, différentes illustrations sont présentées afin de cerner les techniques de production et de purification de l oléosine/insuline : 1- Section transversale d une graine de carthame afin de montrer la localisation des protéines (Fig. 8): aaaaaaa

158 2- Structure d un corps lipidique d une graine de carthame : Localisation de l oléosine en surface (Fig. 9): 3- Introduction du gène d intérêt (Fig. 10 a): bbbbbbb

159 Fusion oléosine-gène d insuline (Fig. 10 b) : A= Une protéine oléosine transférée à la surface du corps lipidique B= Système biologique de stratosome dans lequel une oléosine et une protéine recombinée (Géne X) ont été fusionnées et transférées au corps lipidique d une graine de carthame 4- Carte d un Système biologique de stratosome (Fig. 11): ccccccc

160 5- Technologie d extraction d un corps lipidique d une graine de carthame (Fig. 12): 6- Représentation schématique de l insuline humaine (Fig. 13): ddddddd

161 7- Détermination des protéines préparées à partir des corps lipidiques d une graine de carthame transgénique (oléagineuse) par chromatographie (20 µg) : A= Position des transgènes ERi et Obi par rapport à celle du type sauvage (Wt), avec ERi : affinity capture technology ; OBi : Stratosome technology. La séparation des protéines est effectuée sur la base de 15 % SDS- PAGE et coomasse. B= Tache correspondante en utilisant un anticorps E2E3 monoclonal anti insuline (ab 9569), (abcam), (cambridge), (Mass), (M : Marqueur moléculaire). Fig. 14 : chromatographie eeeeeee

162 8- Test de tolérance de l insuline : Changements temporaires de niveaux de glucose de sérum dans des souris mâles B6, suite à une injection (IP) d insuline standarde (humulin Roche) en comparaison à l insuline de type Obi dérivant du Des- B30 et témoins négatifs (fractions de protéines non recombinées OBi). Fig. 15 : Test de tolérance 9- Analyse spectrale de masse de l insuline d origine végétale (Fig. 16): La figure suivante représente une comparaison des intensités (%) en fonction des masses (m/z) des 3 insulines : humaine standard (Sigma), l insuline Des- B30 qui dérive du trypsine du réticulum endoplasmique mûr ERi (Des-B30 Insulin-KDEL); et l insuline qui dérive de la surface du corps lipidique des graines oléagineuses (OBi : Oilbodies)(Des-B30). Avant analyse, les échantillons ont été purifiés par chromatographie en phase liquide haute performance inverse. fffffff

163 ggggggg Fig. 16 : Analyse spectrale de masse

164 Serment de Galien Je jure en présence des maîtres de cette faculté : - D honorer ceux qui m ont instruit dans les préceptes de mon art et de leur témoigner ma reconnaisse en restant fidèle à leur renseignement. - D exercer ma profession avec conscience, dans l intérêt de la santé public, sans jamais oublier ma responsabilité et mes devoirs envers le malade et sa dignité humain. - D être fidèle dans l exercice de la pharmacie à législation en vigueur aux règles de l honneur, de la probité et du désintéressement. - De ne pas dévoiler à personne les secrets qui m auraient été confiés ou dont j aurais eu connaissance dans l exercice de ma profession, de ne jamais consentir à utiliser mes connaissances et mon état pour corrompre les mœurs et favoriser les actes criminels. - Que les hommes m accordent leur estime si je suis hhhhhhh

165 fidèle à mes promesses, que je sois méprisé de mes confrères si je manquais à mes engagements أن أراقب هللا ف مهنت أن أبجل أساتذت الذ ن تعلمت على أ د هم مبادئ مهنت وأعترف لهم بالجم ل وأبقى دوما وف ا لتعال مهم. أن أزاول مهنت بوازع من ضم ري لما ف ه صالح الصحة العموم ة وأن ال أقصر أبدا ف مسؤول ت وواجبات تجاه المر ض وكرامته اإلنسان ة. أثناء ممارست للص دلة بالقوان ن المعمول بها أن أألتزم وبأدب السلوك والشرف وكذا باالستقامة والترفع. أن ال أفش األسرار الت قد تعهد إلى أو الت قد أطلع عل ها أثناء الق ام بمهام وأن ال أوافق على استعمال معلومات إلفساد األخالق أو تشج ع األعمال اإلجرام ة. بتقد ر الناس إن أنا تق دت بعهودي أو أحتقر من ألححظى طرف زمالئ إن أنا لم أف بالتزامات. شه د" "وهللا على ما أقول iiiiiii

166 jjjjjjj

167 جاهعت دمحم الخاهض كليت الطب و الصيذلت بالزباط ط ت 8002 أطزوحت رقن: 40 إ خاج األ ظليي ا طالقا هي بذور باث العصفىر الوغيز جي يا أطزوحت قذهج و ىقشج عال يت يىم:... هي طزف اآل ظت كىثز طكيزج )الوشدادة يىم 82 هاي 3821 بفاص( ل يل شهادة الذكخىرا في الصيذلت الكلواث األطاطيت: أ ظليي داء الظكزي باث العصفىر أجظام هغيزة جي يا ححج إشزاف اللج ت الوكى ت هي األطاحذة الظيذ عبذ القادرالخايب أستبر ف ػهى انتم بد انح ا خ الظيذ لحظي الكظابي أستبر ف ػهى تأث ش األد خ ػهى انجسى الظيذ حويذ ب شياى أستبر يجشص ف ػهى انص ذنخ انسش ش خ الظيذ أحوذ سهيذي أستبر يجشص ف انك بء انؼالج خ هشزف رئيض أعضاء kkkkkkk