BCPST-Véto 1 Mercredi 2 mai Devoir n 8 Durée 3h30 Épreuve de type B (partielle) : Étude de documents - (durée conseillée 2h15) sur 50

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1 BCPST-Véto 1 Mercredi 2 mai Devoir n 8 Durée 3h30 Épreuve de type B (partielle) : Étude de documents - (durée conseillée 2h15) sur 50 Génomes eucaryotes : organisation et conservation Exploitez les documents proposés pour mettre en évidence quelques aspects de l'organisation des génomes des eucaryotes et des mécanismes qui contribuent à leur conservation au cours de différentes étapes du cycle cellulaire. On attend une introduction générale et un bilan à l'issue de chacune des 2 parties mais pas de conclusion générale. Partie 1 : Séquençage et cartographie du génome humain (d'après ENS 2002) Le début de ce siècle est marqué par l'aboutissement du séquençage complet du génome humain ( paires de bases). Plusieurs génomes bactériens et quelques génomes d'eucaryotes (ceux de la levure Saccharomyces cerevisiae, du Nematode (vers rond) Caenorhabditis elegans, de la Drosophile Drosophila melanogaster et de la plante Arabidobsis thaliana) sont aujourd'hui également entièrement séquencés. La séquence complète d'un génome représente une immense gisement d'informations que seul un outil informatique puissant permet d'exploiter. Des comparaisons exhaustives entre génomes séquencés deviennent possibles, facilitant l'étude de la fonction et de l'évolution des gènes. Document 1 : Le nombre de gènes identifiés d'après la séquence complète de leur génome s'élève respectivement à chez l'homme, chez la Drosophile, à chez Caenorhabditis, à 6000 chez la levure, à chez Arabisopsis. La taille (en nombre de paires de bases = pdb) de différents génomes haploïdes, regroupés par grands groupes d'êtres vivants est présentée sur le diagramme ci-dessous : NB : Les génomes des vers (non figurés sur le diagramme) comprennent entre et 10 8 pdb.

2 Document 2 : On cherche à mettre en évidence une des causes des différences de taille entre les génomes dans les grands groupes. Les deux figures suivantes montent les variations de tailles observées parmi les exons (figure 2.1) et les introns (figure 2.2) des gènes de 3 organismes eucaryotes.

3 Document 3 : La recherche des gènes dans le génome humain peut être orientée grâce à certains paramètres caractéristiques. Le pourcentage de bases GC estimé à 41% dans le génome humain. La figure 3.1 présente la distribution du pourcentage de bases GC sur l'ensemble du génome humain, analysé par fenêtres successives de paires de bases. La figure 3.2 présente la densité relative de gènes (nombre de gènes identifiés par unité de longueur d'adn séquencé) en fonction du pourcentage de bases GC des régions correspondantes.

4 Partie 2 : Réponses aux lésions induites par les rayons ultraviolets chez l'homme (d'après ENS 2005) Les rayons ultraviolets (UV) sont capables d'endommager l'adn. Un des principaux effets des UV est de conduire à la formation de dimères de thymine, qui sont responsables d'un blocage des processus de transcription et de réplication de l'adn. On étudie ici le rôle d'une enzyme, la protéine ATR. Document 1 Des cellules humaines cultivées in vitro sont ensemencées sur deux lamelles de verre à la surface desquelles elles adhèrent. Les cellules de deux lots sont incubées 16 heures en présence d'hydroxyurée, un inhibiteur de la réplication de l'adn. L'hydroxyurée est présente pendant toute la durée de l'expérience. Une des deux lamelles est soumise à une irradiation par les UV. Immédiatement après, les cellules des deux lamelles sont incubées pendant 3 heures en présence de thymidine tritiée. Ce nucléoside radioactif pénètre dans les cellules, où il permet la synthèse de dttp radioactif. Après 3 heures, les cellules sont fixées, lavées de manière à éliminer les dttp libres, et autoradiographiées. On obtient les images ci-contre : Document 2 La même expérience que celle décrite dans le document 1 est répétée dans différentes conditions expérimentales, et le nombre de grains d'argent compté dans chaque condition expérimentale est indiqué dans le tableau suivant: Condition expérimentale Irradiation par les UV non oui non oui Traitement par la caféine (inhibiteur de la non non oui oui protéine ATR) Nombre moyen de grains d'argent /cellule Document 3 La protéine ATR purifiée est incubée en présence d'adn bicaténaire linéaire ou circulaire. Une expérience témoin, dans laquelle la protéine ATR est omise, est également réalisée. Les échantillons sont directement analysés par microscopie électronique et les images obtenues les suivantes :

5 Document 4 L'intervention de la protéine ATR est analysée par le protocole suivant: Étape 1 : Un anticorps reconnaissant spécifiquement la protéine ATR est fixé de manière covalente sur des billes d'agarose: Étape 2 : Les billes, ainsi couvertes d'anticorps anti-atr, sont incubées en présence de protéine ATR purifiée. Après 4 heures d'incubation, les billes sont récupérées et lavées. Étape 3 : Après ce traitement, les billes sont incubées en présence d'un excès de l'un des deux ADN bicaténaires suivants : Ces deux ADN (ADN 1 et ADN 2 ) sont marqués radioactivement. Étape 4 : Après 30 minutes d'incubation des billes avec un des deux ADN, les billes sont lavées, et la radioactivité qui leur est associée est quantifiée. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau suivant (lignes 1 et 2). Les lignes 3 et 4 présentent les résultats obtenus si la même expérience est réalisée sans mettre les billes en présence de la protéine ATR (= même protocole sans l'étape 2). Conditions expérimentales 1 + ATR + ADN ATR + ADN ATR + ADN ATR + ADN 2 17 Radioactivité (unités arbitraires) Document 5 Des études ont montré que la protéine p53 est un substrat de la protéine kinase ATR. On étudie in vitro la phosphorylation de p53 par ATR, en présence d'une molécule d'adn bicaténaire non endommagée (ADN1) ou endommagée (ADN2). Après 30 minutes d'incubation à 30 C en présence d'atp radioactif, les différents constituants sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes. L'autoradiographie du gel est présentée ci-contre : Épreuve de type A (partielle) - (durée conseillée : 1h15) sur 25 La conformité de la reproduction cellulaire La reproduction cellulaire (mitose + cytocinèse) conduit à deux cellules identiques, c'est donc un processus de reproduction conforme des cellules. Cette conformité de la reproduction cellulaire est assurée par différents phénomènes se déroulant au cours du cycle cellulaire. Présentez ces phénomènes en précisant en quoi ils assurent cette conformité. On se limitera à l'exemple des cellules animales. On attend un plan détaillé (titres et mots clefs des différents paragraphes, schémas envisagés), une introduction et une conclusion.

6 Corrigé du devoir n 8 du mercredi 2 mai 2007 Génomes eucaryotes : organisation et conservation (Type B partiel) Sur 50 Introduction : définition de génome présentation des 2 parties et des problèmes traités. Partie 1 : Organisation du génome A. Relation entre taille, complexité du génome et complexité des organismes. Le nombre de gènes varie chez les eucaryotes dans des proportions de 1 à 5. le nombre de pdb varie de 10 7 à soit d'un facteur d'un facteur chez les eucaryotes Arabidopsis comporte 300 fois moins de paires de bases que l'homme alors qu'il contient un nombre de gènes du même ordre de grandeur. Drosophile comporte autant de pdb alors que nombre de gènes 2 fois moins grand que chez Arabidopsis. => La taille du génome ne varie pas en proportion du nombre de gènes Les génomes du lys ou celui du triton comportent plus de 10 fois plus de pdb que celui de l'homme => La taille du génome n'augmente pas en proportion de la complexité de l'organisme L'Homme comporte cependant le nombre le plus élevé de gènes, la complexité de l'organisme semble corrélée au nombre de gènes. B. Importance relative des exons et des introns Définition des exons et introns Les exons ont des longueurs variables dans les trois espèces, les plus nombreux ont une longueur autour de 100pdb. Chez la drosophile et le vers, il existe des exons de plus de 300pdb alors qu'ils n'existent pas chez l'homme qui comporte en proportion plus d'exons de moins de 200 pdb. => Les exons sont plus courts dans l'espèce humaine que dans les deux autres espèces. Ils sont plus courts car interrompus par de plus nombreux introns. Les introns ont des longueurs variables dans les trois espèces. Plus de 50% des introns ont une longueur inférieure à 100pdb chez le vers et la drosophile, alors que chez l'homme plus de 50% ont une longueur comprise entre 100 et 2000 pdb. Chez l'homme, près de 40% ont une longueur supérieure à 2000pdb alors que ces longueurs ne représentent qu'environ 10% chez la drosophile et autour de 5% pour le vers. => Les introns chez l'homme sont plus longs que ceux de la drosophile, eux-même plus longs que ceux du vers. L'augmentation de taille du génome entre vers, drosophile et Homme peut donc être attribué au moins en partie au fait que les gènes contiennent des introns de plus en plus nombreux et de plus en plus longs. C. Relation entre pourcentage de paires GC et densité des gènes dans le génome - Le pourcentage de paires de bases GC varie entre 30 et 68 % selon les fenêtres étudiées avec une fréquence la plus représentée autour de 40%. Il y a par exemple 40 fois plus de séquences à 40% de GC que de séquences à 60% de GC. Les bases G et C sont reliées par 3 liaisons H et les bases AT par deux. Une faible proportion de GC implique plus de facilité à ouvrir le double hélice pour la réplication et la transcription. - On constate que le pourcentage de paires GC augmente avec la densité de gènes. La densité de gènes est 13 fois plus élevée dans une séquence comportant 60% de GC que dans une séquence comportant 40% de GC. (on sait que les séquences riches en GC sont présentes dans les séquences régulatrices proches du promoteur) On peut donc orienter la recherche des gènes dans les séquences qui comportent des proportions élevées de paires GC. Bilan : Chez les eucaryotes, la taille du génome et le nombre de gènes varient. Il n'y a pas de relation facile à établir entre taille du génome, nombre de gènes et complexité des organismes. L'organisation même des gènes diffère avec un morcellement variable. Il semble que les organismes les plus complexes (Homme en particulier) aient des gènes plus morcelés. L'étude statistique des bases montre que les portions d'adn qui contiennent des gènes contiennent des proportions plus élevées de bases GC. Ceci est un indice qui permet d'orienter à l'issue du séquençage systématique l'étude vers des séquence plus susceptibles que d'autres de contenir des gènes. En effet chez l'homme, malgré le séquençage de la totalité du génome, seule la moitié des gènes est actuellement localisée. Partie 2 : Réponses aux lésions induites par les rayons ultraviolets chez l'homme A. La réparation des altérations de l'adn dues aux UV. Les altérations dues aux UV sont des dimérisations de la thymine : schéma explicatif Dans les cellules irradiées l'incorporation de dttp radioactif est beaucoup plus élevée que chez les cellules non irradiées. Comme les cellules ne sont pas en réplication à cause de la présence de l'inhibiteur, on doit déduire que les nucléotides incorporés le sont au cours d'un processus de réparation.

7 Les cellules irradiés ont donc subi les réparations des dimères de thymine avec excision des dimères et remplacement de la partie manquante par une activité ADN polymérase. B. Une protéine intervenant dans la réparation : l'atr Le nombre de grains d'argent qui représente la quantité de dttp incorporé en présence d'uv est 5 fois plus faible si on ajoute un inhibiteur de l'atr, la caféine (inhibition non totale? Ou autres processus mis en jeu?) On doit donc en déduire que l'atr joue un rôle essentiel dans la réparation de l'adn. Les quelques grains d'argent observés en l'absence d'uv peuvent correspondre aux réparations des dimères non provoqués par les UV. Ces dernières ne sont pas en quantité plus faibles en présence de caféine (différence non significative?) C. Le site d'action de l'atr : l'adn Sur les chromosomes incubés en présence d'atr, on observe au microscope électronique, une tache blanche qui ne peut correspondre qu'à l'atr. On en déduit que l'atr se fixe à l'adn. D. Les conditions de fixation de l'atr à l'adn A l'issue de l'étape 2, les billes portent des molécules d'atr fixées sur les anticorps (schéma) A l'issue de l'étape 4, la radioactivité est due au fait que l'adn radioactif s'est fixé à l'atr. Cette fixation est 3 fois plus importante l'adn2 que sur l'adn 1. Les témoins sans ATR montrent que la fixation aléatoire est de moitié égale à la fixation sur l'adn1. L'ADN2 comportant un dimère de thymine, on en déduit que la présence d'un dimère de thymine augmente la fixation de l'atr sur l'adn. E. L'action de l'atr sur la p53 On constate la présence de p53 phosphorylée seulement si l'atr est mise en présence d'adn, mais il y en a beaucoup plus si l'adn comporte un dimère de thymine. L'activité kinase de l'atr n'existe donc qu'en présence d'adn et est accrue si si l'adn comporte un dimère de thymine. Bilan : Les UV déclenchent la dimérisation des thymines. Un processus conduit à l'élimination des thymines dimérisées et, via l'incorporation de nouveaux nucléotides permet la réparation de l'adn. Une protéine, l'atr, qui se fixe sur l'adn et plus particulièrement sur l'adn où des dimères sont présents intervient dans le processus. Cette protéine est une kinase qui phosphoryle la p53. On peut donc supposer que la p53 joue un rôle dans la réparation. Plan Rigueur du raisonnement Présentation des documents, clarté et soin La conformité de la reproduction cellulaire (Type A plan) Introduction présentation du sujet définitions : cycle cellulaire = phase M + interphase phase M = mitose et cytocinèse présentation du plan I. Des phénomènes se déroulant pendant l'interphase A. La réplication conforme de l'adn dans le noyau 1. Une polymérisation assurant la conservativité de l'information mode semi-conservatif (sch.), complémentarité des bases (sch ), antiparallèlisme, ADN polymérases (sch.) 2. Des mécanismes de correction des erreurs pendant la réplication formes tautomères (sch.), activité exonucléasique des polymérases (sch.) 3. Des mécanismes de correction des erreurs après la réplication système de correction des mésappariements, réparation de modifications spontanées par excision de bases ou excision de nucléotides (sch.) B. Les phénomènes extranucléaires 1. La duplication du centrosome préparant la mitose centrioles et matrice péricentriolaire (sch.), centre organisateur des microtubules, mécanisme de duplication 2. D'autres phénomènes préparant la cytocinèse Divisions des organites semi autonomes, réplication de leur chromosomes, des synthèses de différents Sur 25

8 constituants, une répartition équilibrée dans une cellule sub sphérique Transition : après réplication distribution... II. Une mitose séparant l'information génétique en deux lots identiques A. La condensation de l'information génétique dans les chromosomes mitotiques Squelette protéique non histone (sch.) Intervention de condensine rapprochant les boucles de chromatine, de la cohésine reliant les chromatides soeurs, activité ATPasique (sch.) Rôle protecteur, facilitation de la séparation des 2 molécules d'adn B. Un appareil mitotique permettant une séparation équitable de l'information 1. La mise en place du fuseau à partir des centrioles Complexe en anneau, γ tubulines, polymérisation (sch.) l'intervention des protéines motrices (kinésine, dynéines) dans l'ajustement de son positionnement (sch.) 2. La. capture des chromosomes par des microtubules au niveau des centromères kinétochore, dépolymérisation et polymérisation, intervention des protéines motrices dans le positionnement au niveau équatorial (sch;) 3. La séparation des chromatides clivage du centromère, rôle des microtubules, dépolymérisation, intervention de protéines motrices (sch.) (rares cas d'erreurs conduisant à des aneuploïdies ou des recombinaisons entre homologues) Transition : après répartition de l'information, la division du cytoplasme... III.Une cytocinèse répartissant les constituants du cytoplasme A. L'intervention des microtubules et de protéines motrices au niveau de l'anneau contractile positionnement à l'équateur, intervention d'actine (sch.) B. La répartition au hasard des organites semi autonomes. Transmission de l'info génétique, nombre à peu près équivalent. Conclusion : peu d'erreurs, phénomènes contrôlés conformité mais ensuite différenciation cellulaire peut entraîner des différences dues à variations de l'expression de l'info génétique