PC Brizeux AD N 2 Altmayer- Henzien Approche documentaire N 2 Synthèse peptidique

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1 P Brizeux AD N 2 Altmayer- Henzien Approche documentaire N 2 Synthèse peptidique bjectif : Le but de cette approche documentaire est d analyser les stratégies de synthèse in vitro et in vivo à partir de documents relatifs à la synthèse peptidique. Travail à réaliser A partir des différents documents, répondre aux questions suivantes : 1. Définitions et contexte général a) Tracer le diagramme de prédominance en ph d un acide α- aminé et indiquer sa forme majoritaire à ph physiologique. b) Définir une liaison peptidique. Quelle est sa géométrie? Justifier la réponse par l écriture de formes mésomères. c) Définir un peptide et une protéine. En quoi diffèrent- ils? d) ombien de tripeptides différents peut- on obtenir à partir des acides α- aminés humains? onclure quant à la difficulté de synthétiser un tripeptide précis tel le glutathion qui est présent dans beaucoup de cellules et qui les protège des agents oxydants. 2. Synthèse de peptides in vitro a) Quelle problématique principale est soulevée par la synthèse peptidique? omment le chimiste y répond- il? b) Recenser dans un tableau les groupements protecteurs utilisés en synthèse peptidique décrits dans ces documents en indiquant dans chaque cas la fonction protégée, les conditions de protection et les conditions de déprotection. c) Proposer un mécanisme pour la protection d une fonction amine par un groupement bz. d) A quoi sert le passage par un ester de p- nitrophényle décrit dans la synthèse de l ocytocine? e) Quel est l inconvénient d une stratégie de synthèse organique utilisant de nombreuses protections/déprotections? 3. Synthèse de peptides en phase solide a) Quel est un des avantages majeurs du procédé Merrifield? b) n désire synthétiser un peptide constitué de 60 acides aminés. n suppose que les acides aminés protégés sur la fonction amine sont commerciaux et que? pour chaque résidu, la séquence «activation de H- couplage- déprotection de NH 2» a un rendement de 98 %. alculer le rendement de la synthèse. c) omment pourrait- on améliorer ce rendement? 4. Synthèse de protéines in vivo Résumer de manière succincte comment s effectue la synthèse des protéines in vivo. 1/8

2 P Brizeux AD N 2 Altmayer- Henzien Document 1 : Présentation des acides aminés et des peptides Référence : D après Les acides aminés et la synthèse peptidique, acides- aminés- et- la- synthèse- peptidique. 1. Introduction Les protéines, un assemblage tridimensionnel d acides aminés, sont omniprésentes dans nos organismes. En effet, elles assurent une multitude de fonctions biologiques telles que la régulation de gènes, la structuration des cellules ou encore la catalyse de processus biologiques. Après avoir étudié la nature de ces macromolécules, on s intéressera à leur synthèse. elle- ci présente deux enjeux majeurs : en recréant les protéines de leur choix, les scientifiques peuvent d une part mieux les étudier et comprendre leurs modes de fonctionnement et, d autre part, mettre à profit leurs multiples fonctions. 2. Macromolécules a. Acide α- aminé Structure générale : Un acide α- aminé est un composé polyfonctionnel possédant à la fois un groupe caractéristique - H et un groupe caractéristique - NH 2. En milieu biologique où le ph est souvent tamponné aux alentours de 7, les acides α- aminés sont chargés d une part négativement avec le groupe - (pk A = 3) et, d autre part, positivement avec le groupe - NH + 3 (pk A = 9). L atome de carbone «en alpha» immédiatement voisin du groupe - H porte une chaîne carbonée appelée chaîne latérale ou résidu et notée R : R R H α H H α Selon la nature de cette chaîne, l acide α- aminé considéré aura différentes propriétés. Une chaîne alkyle engendrera ainsi un caractère hydrophobe alors que la présence d une fonction alcool rendra l acide aminé hydrophile. Par ailleurs, la charge totale de l acide α- aminé peut varier selon la présence de groupes chargés dans la chaîne latérale (- -, - NH ). En outre, il convient de noter que les acides α- aminés sont des molécules chirales dont un seul énantiomère ou diastéréoisomère existe dans la nature. H R α Les 20 acides α- aminés naturels : Dans le corps humain, il existe 20 acides α- aminés différents, bien que l un d entre eux, la proline, fasse plus rigoureusement partie de la famille des imino- acides. La chaîne 2/8

3 P Brizeux AD N 2 Altmayer- Henzien latérale R donne son nom à l acide α- aminé considéré. Pour plus de commodité, un code international de correspondance de 3 lettres peut être utilisé pour désigner chacun de ces vingt acides aminés. as à part Glycine (G, Gly) H Acide glutamique (E, Glu) H H H H H 2 H 2 H 2 Acide aspartique (D, Asp) Sérine (S, Ser) Hydroxyl- H 2 H Lysine (K, Lys) Thréonine (T, Thr) H HH H 3 H H H 2 H 2 H 2 H 2 H 2 Arginine (R, Arg) H 2 H 2 NH Asparagine (N, Asn) H2 N Amido- Glutamine (Q, Gln) H H H 2 H 2 Histidine (H, His) H2 N H H 2 H NH NH H 2 H Polaires et non chargés Polaires et chargés Négativement Méthionine (M, Met) ontenant du soufre Aliphatiques ystéine (, ys) H H H 2 H 2 H 2 S H 3 Alanine (A, Ala) SH Valine (V, Val) H H H 3 H H 3 H 3 NH 3 Positivement Tryptophane (W, Trp) Aromatiques NH 2 NH 2 Phénylalanine (F, Phe) H H H 2 H 2 Leucine (L, Leu) H 3 H H 2 H H 3 H NH Isoleucine (I, Ile) H H H 3 H 2 H 3 H 2 Tyrosine (Y, Tyr) H H 2 H Proline (P, Pro) H 2 H H 2 Non polaires Non polaires b. Peptide Liaison peptidique : Un peptide est un enchaînement d acides α- aminés reliés entre eux par une liaison peptidique. Il s agit d une liaison amide obtenue par réaction d une fonction acide carboxylique et d une fonction amine avec libération d une molécule d eau. Les quatre atomes (, N, et H) sont alors dans un même plan. 3/8

4 P Brizeux AD N 2 Altmayer- Henzien R 1 R 2 R 2 H H + H H H N H H H + H 2 R 1 Peptides et protéines : Un polypeptide est un polymère d acides α- aminés possédant deux extrémités réactives. Dans l écriture d une chaîne peptidique, l acide aminé N- terminal (extrémité aminée) est représenté par convention à gauche et l acide aminé - terminal (extrémité carboxylique) à droite. Il est en effet capital de distinguer l ordre d enchaînement des acides α- aminés car les peptides obtenus ne possèdent pas les mêmes propriétés. En général, on parle de protéine lorsque la chaîne contient plus de 50 acides aminés. Les protéines sont ainsi des macromolécules de masse molaire élevée. La séquence des acides aminés définit leur structure primaire et leur mode de repliement dans l espace correspond à leurs structures secondaires et tertiaires. Document 2 : Synthèse de protéines in vitro Références : himie organique, Jonathan layden, Nick Greeves et Stuart Warren, éditions De Boeck, Dans cette partie, nous parlerons en détail de la synthèse d une catégorie de molécules biologiquement importantes, les peptides. e faisant, nous vous présenterons les groupes protecteurs de deux groupements fonctionnels, les amines et les acides carboxyliques. L aptitude à contrôler la réactivité de ces groupements est essentielle pour la synthèse des peptides. e domaine s est considérablement élargi depuis l introduction du groupe protecteur Z ou bz en 1932 et on peut aujourd hui programmer des machines pour synthétiser automatiquement des peptides. ommençons par réfléchir à la façon de faire réagir ensemble deux aminoacides pour faire un dipeptide la leucine et la glycine par exemple. Si nous voulons que le groupement - NH 2 de la leucine réagisse avec le groupement - H de la glycine, nous activerons d abord l acide carboxylique vis- à- vis de l addition nucléophile en faisant par exemple le chlorure d acyle ou un ester particulièrement réactif. Mais le problème principal vient du fait qu il y a, d une part, un autre - H libre qui pourrait réagir avec le groupement - X pour former un anhydride et, d autre part, deux amines libres différentes qui peuvent donner à la fois le dipeptide LeuLeu dont nous ne voulons pas et LeuGly que nous désirons former. 4/8

5 P Brizeux AD N 2 Altmayer- Henzien Pour cette raison, nous devons protéger à la fois le groupement - NH 2 de la leucine et le groupement - H de la glycine. Quels types de groupements protecteurs doit- on utiliser? Nous devons pouvoir les enlever après qu ils ont rempli leur office et il n est donc pas question d utiliser, par exemple, un amide pour protéger l amine parce que nous aurions une grande difficulté à l hydrolyser en présence de la liaison amide que nous essayons de construire. Idéalement, nous ne voulons pas seulement pouvoir enlever les groupes protecteurs dans des conditions douces qui ne détruisent pas le reste de la molécule mais nous voulons aussi deux groupes (un pour - NH 2 et l autre pour - H) que l on puisse enlever dans des conditions différentes. Nous aurions alors la possibilité de modifier à volonté l une ou l autre extrémité du dipeptide. Un bon couple de conditions pourrait être le couple acide/base : nous pourrions protéger le groupement - NH 2 par un groupe protecteur qu on peut enlever seulement en milieu acide et le groupement - H par une protection que l on peut enlever seulement en milieu basique. Nous avons présenté comme exemple le dipeptide LeuGly parce qu il constitue l extrémité d une hormone peptidique, l ocytocine. La première étape de la synthèse de l ocytocine est effectivement le couplage de la glycine et de la leucine. Voici comment cela a été fait par Vigneaud et Bodanszky. D abord, l acide carboxylique de la glycine a été protégé sous forme d ester éthylique. La transformation en ester est un moyen évident d empêcher le groupement - H d intervenir en tant qu acide ou nucléophile. Toutefois, les esters simples de méthyle ou d éthyle peuvent poser un problème : ils peuvent en effet réagir avec des nucléophiles comme les amines et ne sont stables que si leur groupement amine est protégé. L ester éthylique de la glycine doit donc être conservé sous forme de son chlorhydrate : le groupement - NH 2 est alors protégé sous forme de - NH /8

6 P Brizeux AD N 2 Altmayer- Henzien Pour le résidu leucine, le groupement - NH 2 devait être protégé par un groupe stable en milieu basique puisqu il fallait utiliser une base pour libérer le groupement - NH 2 du chlorhydrate de la glycine. Le groupe protecteur utilisé est l un des plus importants groupes protecteurs de l azote : le groupe Z ou bz (carboxybenzyle). elui- ci est introduit par traitement avec le chloroformiate de benzyle et une base faible. Les amines protégées par bz se comportent comme des amides : elles ne sont plus nucléophiles car le doublet libre de l azote est bloqué par sa conjugaison avec le groupement carbonyle. Elles résistent aux solutions aqueuses d acide et de base mais elles possèdent un talon d Achille : le groupement benzyl. En effet, les conditions qui permettent d éliminer les éthers benzyliques (HBr ou l'hydrogénolyse) élimineront également bz. La leucine protégée par bz devait ensuite être activée pour réagir avec la glycine. Le chlorure d acyle ne convient pas parce qu il est instable. Une alternative courante en chimie peptidique consiste alors à faire un ester de p- nitrophényle ou de 2,4,6- trichlorophényle. Le phénolate, surtout lorsqu il est substitué par des groupements électro- attracteurs, est un bon groupe partant. L ester de p- nitrophényle de la bz- leucine est donc activé et réagit avec le chlorhydrate de l ester éthylique de la glycine en présence d une base faible telle que la triéthylamine pour libérer le groupement - NH 2 de la glycine. Notez la chimiosélectivité de cette étape : le groupement - NH 2 doit choisir entre trois groupements carbonyl mais il ne réagit qu avec le plus électrophile portant le meilleur groupe partant. 6/8

7 P Brizeux AD N 2 Altmayer- Henzien Le dipeptide est maintenant obtenu mais il est toujours protégé. La déprotection (HBr/AcH) donne le bromhydrate de l ester éthylique de LeuGly, prêt pour des réactions ultérieures. Le reste du peptide est construit de la même façon : chaque aminoacide est introduit sous la forme de son ester de p- nitrophényle protégé par bz avant d être déprotégé pour le couplage suivant jusqu à ce que les neuf aminoacides de l ocytocine aient tous été introduits. Document 3 : Le procédé Merrifield Références : himie tout- en- un P- P*, B. Fosset, J.B. Baudin et F. Lahitète, éditions Dunod, Une synthèse automatisée des protéines sur support solide a été mise au point par R.B. Merrifield qui a reçu le prix Nobel de chimie en La méthode consiste à réaliser la synthèse sur un support solide constitué par des billes de polystyrène greffé. Lors de cette synthèse, on réalise les étapes suivantes : greffage du premier acide aminé dont la fonction amine est protégée sur le support solide ; déprotection de la fonction amine ; ajout du deuxième acide aminé avec une fonction amine protégée en présence de D, un agent de couplage qui active l électrophilie de la fonction acide carboxylique ; déprotection de la fonction amine. 7/8

8 P Brizeux AD N 2 Altmayer- Henzien Le processus se poursuit à l identique un grand nombre de fois afin de former un polypeptide. Le décrochage de la protéine du support solide est finalement effectué par action de HBr dans F 3 H. ette méthode de synthèse des protéines est particulièrement efficace car toutes les étapes de purification sont considérablement simplifiées, un simple lavage de la résine par un solvant approprié étant suffisant. En utilisant cette méthode, on observe une durée de 4 heures environ par cycle d ajout d un nouvel acide aminé. Il a ainsi été possible de synthétiser la ribonucléase, une protéine constituée de 124 acides aminés par une séquence comportant étapes automatisées avec un rendement global de 17 % (soit un rendement voisin de 99 % par étape). Pour comparaison, la nature synthétise une protéine de 150 acides aminés en une minute environ 8/8

9 P Brizeux AD N 2 Altmayer- Henzien Document 4 : Synthèse de protéines in vivo Référence : D après Les acides aminés et la synthèse peptidique, acides- aminés- et- la- synthèse- peptidique. 1. Description des éléments mis en jeu dans la cellule Les protéines nécessaires au bon fonctionnement d un organisme sont produites dans les cellules à partir d acides aminés issus de la digestion des aliments par lecture du code génétique contenu dans l ADN. e dernier est une macromolécule constituée d une succession de nucléotides notés A,, G et T. L ADN est constitué de deux brins dont l appariement via des liaisons hydrogène lui permet d adopter une structure en double hélice. ertaines portions de l ADN peuvent être copiées à l aide d une enzyme, l ARN polymérase, sous forme de molécules d ARNm (ARN messager), des macromolécules formées d acides nucléiques légèrement différents par rapport à l ADN. ette étape est appelée transcription. Après quelques modifications, l ARNm est traduit en une séquence d acides aminés dans les ribosomes : c est la traduction.... A... T G ADN T G A G G T... A... transcription ARN polymérase ARN...-AGU-GG-U... traduction ribosomes protéine...-ser-ala Etapes de la traduction Le ribosome est chargé d établir un lien entre la séquence d ARNm et la séquence d acides aminés à produire. Un véritable système de lecture est mis en place au sein du ribosome et se déroule en différentes étapes : un ensemble de 3 acides nucléiques, connu sous le nom de «codon» est lu par le ribosome ; l acide aminé correspondant à ce codon est capté dans le milieu environnant à l aide d un ARN de transfert possédant une séquence complémentaire au codon ; l acide aminé est ajouté à la chaîne d acides aminés par formation de liaison peptidique (le ribosome sert de catalyseur et oriente les substrats, la protection d une extrémité réactive de l acide aminé est donc inutile) ; le codon suivant est ensuite lu par le ribosome et le cycle d élongation de la chaîne d acides α- aminés continue. Au cours des cycles d élongation, l enchaînement d acides aminés croît progressivement de l extrémité N- terminale à l extrémité - terminale. Lorsque le ribosome atteint la fin de l ARNm, il relâche l enchaînement d acides aminés correspondant à la protéine nouvellement formée. 9/8