Objectif : identifier la mutation responsable de la maladie parmi les millions de polymorphisme.

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1 Identification de gènes morbides Analyses mutationnelles Maladies monogéniques Objectif : identifier la mutation responsable de la maladie parmi les millions de polymorphisme. Plan : Variations du nombre de copies (CNV) Séquençage haut débit/exome/dbsnp/evs Perte de fonction, pathogénicité Stratégies pour les maladies héréditaires Mutations dominantes Mutations récessives (Néomutations)

2 Variations du nombre de copies (CNV) Délétions ou duplications Array CGH (puces d hybridation génomique comparative) : Lames couvertes de millions d oligonucléotides ordonnés couvrant l ensemble du génome humain Sanlaville D, 2005

3 CNV La résolution des puces à ADN dépend de la densité des oligonucléotides

4 Mécanisme des CNV Réarrangements par hasard (cassures double brin de l ADN) NHEJ : non homologous end joining Causés par des microhomologies (2 à 15 pb) > insertion de qques nucléotides lors de de la réparation Recombinaisons homologues NAHR : non allelic homologous recombination Duplications segmentaires, séquences répétées

5 Séquences Répétées : représentent 60 % du génome humain 45 % séquences dispersées : exemple séquences Alu 2 à (5?) % duplications segmentaires 10 % autres Duplications segmentaires : Eléments de 10 à 300 kb dupliqués Sur un même chromosome ou sur des chromosomes différents Dans la même orientation ou en tête-bèche gène 1 gène 2 gène 3 gène n gène 1 gène 2 gène 3 gène n

6 NAHR non allelic homologous recombination : séquences répétées dispersées (ex séquences Alu) duplications segmentaires : > délétions récurrentes (syndromes microdélétionels: Williams, Di-Georges ) gène 1 gène 2 gène 3 gène 1 gène 2 gène 3 duplication gène 1 gène 2 gène 3 gène 1 gène 2 gène 3 ou délétion

7 Interprétation des CNV CNV polymorphiques : Database of Genomic Variants CNV pathologiques : DECIPHER database Les duplications segmentaires sont responsables de réarrangements récurrents (souvent réarrangements de novo pour les CNV pathologiques dominants) Démonstration d une nouvelle CNV pathologique : - Nécessité de plusieurs patients ayant des CNV identiques ou chevauchants et ayant un tableau clinique commun - ou Confirmation du tableau clinique chez un patient avec une mutation ponctuelle dans l un des gènes du CNV

8 Analyse des petites mutations Séquençage haut débit Substitutions de base Petites insertions ou délétions de 1, 2 ou plusieurs nucléotides Séquençage Sanger Séquençage haut débit (HTS ou NGS) Limitation de la taille des insertions/délétions détectées due à la taille des longueurs de lecture (reads) Reads de 100 nt > insertion/délétion de max 50 nt

9 Séquençage haut débit Système Illumina (Solexa) HiSeq 2000: Up to 200 Gb per run, in 9 days 2 x 100 bp read length, two billion paired-end reads/run. In a single run, sequence two human genomes at ~30x coverage (read depth) for less than $10,000 (USD) per genome.

10 Séquençage haut débit Système Illumina (Solexa) Séquençage par élongation avec des terminateurs fluorescents

11 Système Illumina (Solexa) Amplification clonale sur lame > clones moléculaires

12 Séquençage nucléotide par nucléotide Acquisition des images de la lame à chaque cycle

13 Alignement des reads par rapport au génome humain de référence

14 Ciblage des séquences codantes On n est pas (trop) intéressé par les introns et les régions intergéniques, mais surtout par les exons et les séquences d épissages flanquantes: 1 % du génome humain La solution actuelle : enrichissement des séquences d intérêt par capture ciblée de tous les exons du génome (exome) > réduire le coût par échantillon > meilleure couverture (read depth)

15 Enrichissement par capture d exome 1 million d oligos de 120 bases couvrant les exons des gènes humain Jusqu à 50 megabases couvertes

16 Enrichissement par capture (exome)(2)

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18 Analyse IGV (Integrative Genomics Viewer)

19 Analyse IGV (Integrative Genomics Viewer - 2)

20 Analyse bioinformatique Environ SNP et indel par exome Elimination des artéfacts liés à la technologie Elimination des polymorphismes fréquents : dbsnp138 Analyse de la fréquence des SNP plus rares : - dbsnp135 (inclut les données 1000 genomes, 1KG) - Exome Variant Server (uniquement pour les SNP, pas pour les indel) : chromosomes European American chromosomes African American

21 Analyse bioinformatique Analyse de la fréquence des SNP plus rares : (dbsnp135, 1KG, EVS) - Pour les maladies dominantes, la mutation ne doit pas correspondre à un SNP connu (< 1/6 000 individus) - Pour les maladies récessives, la mutation est soit privée, soit elle correspond à un SNP de fréquence inférieure à 1/500 ou 1/1 000 selon la fréquence de la maladie (fréquence de la maladie < 1/ à <1/ ) > élimination des SNP trop fréquents

22 Analyse bioinformatique Perte de fonction, pathogénicité (1) Les gains de fonction ne sont pas prédictibles. Les pertes de fonction partielles sont parfois difficiles à prédire. ARN prémessager site donneur G AG/GT A AGT - Les mutations non-sens, indel, d épissage -1, -2, +1, +2 sont en général délétères. Exceptions : certaines indel respectant le cadre de lecture - Pour les autres mutations d épissage, il faut utiliser des programmes de prédiction basés sur les matrices des sites. consensus (Spliceport, Human Splicing Finder, NNSPLICE, MaxEntScan ) Il faut vérifier l altération de l épissage sur des cultures de cellules. A site accepteur ( C ) 11 N C AG/G T T

23 Perte de fonction, pathogénicité (2) - Les variations silencieuses sont en général non délétères > éliminées - Les mutations faux-sens : 9000 variations faux-sens par exome - score de Grantham (degré de changement physico-chimique) - scores de conservation : programmes Polyphen et SIFT. Ces programmes utilisent des bases de données d alignement de séquence protéique C

24 Stratégies pour les maladies héréditaires - Mutations dominantes Il faut plusieurs individus indépendants avec différentes mutations (dans ce cas, les mutations sont souvent regroupées dans un même domaine > gain de fonction), ou avec la même mutation (effet fondateur) Si grandes familles avec LOD score élevé, deux familles (mutations) peuvent suffirent - Mutations récessives Il faut 2 individus indépendants non-consanguins > 4 mutations dans le même gène Si grandes familles consanguines avec LOD score élevé, deux familles (mutations) peuvent suffirent Si une SEULE grande famille consanguine avec LOD score élevé, il faut démontrer que la mutation cause une perte de fonction (plus facile pour les mutations nonsens, tronquantes ou d épissage; analyse fonctionnelle pour les faux-sens) - Néomutations (cf cours du Dr Jean-Baptiste Rivière)

25 1 er succès du WES (Whole Exome Sequencing) Syndrome de Miller (Ng et al. Nature Genetics 2010) Maladie syndromique polymalformative Séquençage de l exome de 4 patients de 3 familles > gène DHODH Autre exemple (Mallaret et al. Brain 2013 sous presse) Ataxie épilepsie retard mental, linkage in 16q21-23 (2007) Nb of sequenced bases Total SNP Novel SNP Novel homozygous SNP Novel homozygous SNP in linkage region Novel homozygous SNP in linkage region, affechng coding or splice sequence c.139c>a, p.pro47thr in WWOX gene ConfirmaHon : exome on 2 nd family c.1114g>c, p.gly372arg Consanguinity, 2 affected in WWOX gene

26 Les puces CGH et le séquençage haut débit ne sont pas adaptés pour l identification des expansions de trinucléotides > nécessité des études de liaison génétique Hexanucleotide Repeat Expansion in C9ORF72 As the Cause of familial ALS-FTD, Renton et al Neuron 2011

27 Avenir exome ou génome complet? séquençage de molécules uniques d ADN