Rapport présenté par : Fabien PEREZ. Master 1 : Chimie et Matériaux Option Environnement Année 2010

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1 MISE AU POINT ET VALIDATION D UNE METHODE D ANALYSE EN FLUX CONTINU : INDICE CYANURE ET PHENOL. Rapport présenté par : Fabien PEREZ Master 1 : Chimie et Matériaux Option Environnement Année 2010 Maître de stage : Monsieur Jean-Ulrich MULLOT Tuteur de stage : Monsieur Jean-Michel EMERY Date de stage : Du 12/04/2010 au 11/06/2010 1

2 Remerciements J adresse mes remerciements les plus sincères à Madame le Pharmacien en Chef Marie-Françoise CORDAT pour m avoir accueilli au sein du LASEM et mis à ma disposition le matériel nécessaire à la réalisation de mon étude. Je remercie également mon maître de stage Monsieur le Pharmacien Principal Jean-Ulrich MULLOT sans qui je n aurais pu effectuer ce stage. J exprime mes remerciements à Madame l Enseigne de Vaisseau Justine SABATON pour la formation interne qualité. Je tiens à remercier fortement mon tuteur de stage Monsieur Jean-Michel EMERY, Ingénieur Divisionnaire d Etudes et de Fabrications (IDEF), pour sa disponibilité et pour le partage de son savoir-faire. Je souhaite remercier tout particulièrement Madame Sophie CANNIZZARO, Technicien Supérieur d Etudes et de Fabrications (TSEF), pour le suivi attentif apporté à mon travail ainsi que pour son écoute et ses conseils. Mes remerciements vont aussi à Monsieur Cyril GUIOL, Technicien Supérieur d Etudes et de Fabrications, pour la formation interne sécurité ; ainsi qu à l ensemble du personnel du LASEM pour son accueil, son aide et sa sympathie. Enfin, j exprime ma reconnaissance au Docteur Cédric GARNIER pour l attention qu il m a accordé. 2

3 SOMMAIRE Introduction... 5 I. Bibliographie... 6 I.1. Cyanure et phénol... 6 I.2. Méthodes d analyses pour la détermination des cyanures... 7 I.2.1. Méthode standard... 7 I.2.2. Electrode sélective comme sonde... 7 I.2.3. Electrode sélective de cyanure sous forme de détecteur par injection en flux continu... 8 I.2.4. Détecteur potentiométrique par injection en flux continu d ion sélectif déposé électrochimiquement... 8 I.2.5. Tendances modernes... 8 I.2.6. Conclusion... 8 II. Présentation du LASEM de la base navale de Toulon... 9 II.1. Le Personnel... 9 II.2. Sa Mission... 9 II.3. Domaines d activités II.3.1. Activité du Laboratoire de Chimie Analytique (LCA) II.3.2. Activités du Laboratoire de Surveillance Radiologique (LSR) II.3.3. Objectif : Qualité, Normes et Accréditations II Le Comité Français d Accréditation (COFRAC) II LASEM et assurance qualité III. Matériels et méthodes III.1. L Analyse Flux Continu (CFA) III.2. Console «FUTURA» et accessoires III.3. Manipulations III.3.1. Détermination de la concentration en cyanures totaux avec distillation III Principe III Mode opératoire III Opérations instrumentales III.3.2. Détermination de l indice phénol (sans extraction) après distillation III Principe III Mode opératoire III Opérations instrumentales IV. Validation de la méthode d analyse IV.1. Plan A IV.1.1. Organisation des essais et linéarité IV.1.2. Etude de l étalonnage IV.2. Plan B IV.2.1. Organisation des essais et fidélité intermédiaire IV.2.2. Interprétation des paramètres d exactitude pour la LQ IV.3. Plan C

4 IV.3.1. Organisation des essais et fidélité IV.3.2. Interprétation des paramètres d exactitude pour un niveau d ajout IV.4. Plan D IV.4.1. Organisation des essais et justesse IV.5. Résultats Discussion Conclusion Bilan personnel Glossaire Références Bibliographiques Annexe 1 : Organigramme du LASEM Annexe 2 : Tableau des débits Annexe 3 : Tableau des grandeurs retrouvées, des biais et de l étude de cas approche statistique Annexe 4 : Tests de Grubbs Annexe 5 : Calcul des inégalités Annexe 6 : Tableaux des résultats du plan C Annexe 7 : Organisations des essais du plan D Annexe 8 : Calcul pour l étude de l exactitude

5 Introduction Dans le cadre de ma première année de master de chimie à l Université Sud-Toulon-Var La Garde, un stage conventionné de deux mois a été effectué. Mon intérêt pour la chimie analytique, développé au cours de cette année, a orienté mon choix de stage vers le Laboratoire d Analyses de Surveillance et d Expertise de la Marine (LASEM), plus précisément dans le laboratoire d analyse des eaux. En effet, ce laboratoire réalise les analyses physico-chimiques des eaux destinées à la consommation humaine, des eaux de piscines, des eaux salines, des eaux résiduaires, des eaux industrielles et des eaux traitées. Dans le but de fournir les résultats de leurs analyses avec un gage de confiance reconnu, le laboratoire des eaux du LASEM prévoit d être agréé par les ministères en charge de la Santé et de l Environnement. De ce fait, la reconnaissance de ses compétences par le Comité Français d Accréditation (COFRAC) est demandée au laboratoire. Un Analyseur Flux Continu (CFA), acquis récemment par le LASEM, nécessite d être mis en service rapidement afin qu il soit opérationnel au plus tôt pour les analyses de cyanures et de phénol. Les paramètres de ces différentes méthodes utilisées devront être évalués afin de maintenir l accréditation obtenue pour l analyse des cyanures et en vue d une future extension d accréditation pour l analyse du phénol. Les validations de méthodes s effectuent à partir de la norme «NF T » [1]. 5

6 I. Bibliographie I.1. Cyanure et phénol Le cyanure peut être produit par des bactéries, des moisissures ainsi que des algues, et il est contenu dans de nombreuses plantes et aliments. L espèce chimique présente dépend en grande partie du ph, de la température, de l oxygène dissous, de la salinité et des autres ions présents. Tout d abord, on définit les cyanures totaux comme la somme des cyanures liés organiquement, des ions cyanures libres, des complexes et des cyanures liés aux cyanures métalliques simples, à l exception des cyanures sous forme de complexes de cobalt et du thiocyanate. En effet, il existe les cyanures libres qui sont toxiques, les cyanures complexés (qui le sont moins) et l indice cyanures qui est un mode de mesure de la somme des deux formes. Cependant, les cyanures sont peu communs à l état naturel et leur présence dans les eaux naturelles est surtout liée aux rejets industriels. En effet, les principales sources de contamination se trouvent dans les effluents. De plus, l ion cyanure simple (CN-) et l acide cyanhydrique (HCN) sont les formes les plus toxiques par ingestion, inhalation et par absorption cutanée. En effet, le cyanure s'accumule dans les cellules en se fixant aux métalloprotéines ou aux enzymes, tel que la catalase ou la cytochrome-c-oxydase [2]. Le phénol, appelé aussi hydroxybenzène, acide phénique, ou encore acide carbolique, est composé d'un cycle aromatique benzénique (hydrocarbure aromatique) et d'une fonction hydroxyle. Figure 1 : Structure chimique du phénol Le phénol est fortement corrosif pour les organismes vivants et provoque des brûlures qui sont très douloureuses et longues à guérir. De plus, elles peuvent être suivies de complications graves pouvant mener à la mort, de par la toxicité de ce composé et sa capacité à pénétrer dans l organisme en traversant la peau. En ce qui concerne le milieu aquatique, le phénol est plus lourd que l'eau et tend à se déposer. Il se dissout lentement et, même dilué, continue de former des solutions toxiques. En raison de sa forte toxicité dans l'eau, le phénol fait l objet de mesures de limitation des apports au milieu aquatique, passant notamment par sa mesure dans certains effluents 6

7 I.2. Méthodes d analyses pour la détermination des cyanures Les niveaux maximums de contaminant pour la décharge de cyanure dans l'environnement varient de 0,05 à 0,07 mg/l pour l'eau potable et de 0,200 à 0,500 mg/l pour les eaux résiduaires, alors que pour le cyanure total il est de 1 mg/l (beaucoup plus élevé). Les directives du Conseil des communautés européennes et la réglementation française précisent comme valeur limite admissible dans les eaux destinées à la consommation humaine 0,05 mg/l Pourtant, les sources industrielles de contamination de cyanure continuent d augmenter chaque année. Afin de palier à ce problème, il existe de nombreuses méthodes pour déterminer et évaluer la concentration du cyanure dans différentes matrices. I.2.1. Méthode standard Cette méthode est basée sur le dégagement du HCN à partir d un échantillon acidifié au moyen d acide sulfurique, après un long procédé de distillation. Puis, le gaz HCN formé est dissous dans une solution alcaline. La concentration en cyanure dans la solution est alors déterminée par spectrophotométrie (qui mesure l'absorbance ou la densité optique) ou potentiométrie (qui mesure une différence de potentiel). Puisque les espèces de cyanure montrent différentes caractéristiques, physiques, chimiques et de toxicité, le cyanure total contenu n'est pas approprié pour l'évaluation des risques environnementaux. Les données les plus pertinentes sont obtenues lorsque le cyanure se prête à la méthode de chloration. En effet, la chloration permet de déterminer la quantité de cyanures métalliques simples et de la plupart des cyanures complexes, à l'exception des cyanures de fer [3]. Ce procédé se compose de deux mesures analytiques : cyanure total (qui est une mesure de tous les cyanures, y compris les complexes fer-cyanure) et cyanure après chloration. Cependant, cette méthode a de nombreux inconvénients : il y a beaucoup d'interférents et une libération incomplète de cyanure. I.2.2. Electrode sélective comme sonde Cette électrode est un capteur qui convertit l'activité d'un ion spécifique dissous dans une solution, en potentiel électrique. La partie de détection de l'électrode est généralement composé d une membrane sélective des ions à doser, dont le potentiel est mesuré par rapport à une électrode de référence. L avantage est la mesure directe de la concentration libre en ions cyanures. Une première approche de la détermination des cyanures est la potentiométrie directe. La potentiométrie directe (avec des électrodes sélectives de cyanure), basée sur AgI homogène ou hétérogène et/ou Ag 2 S. Mais, avec une membrane mixte du type AgI/Ag 2 S, une meilleure stabilité de la réponse est obtenue [4]. La réponse de l électrode au cyanure est régie par la dissolution ou la corrosion. Les inconvénients principaux sont: un faible signal de stabilité, une vie courte, un temps de réponse lent et une limite de détection élevée. 7

8 I.2.3. Electrode sélective de cyanure sous forme de détecteur par injection en flux continu Cet appareillage de mesure a une capacité unique à répondre directement aux espèces de cyanure les plus toxiques, De plus, ces caractéristiques analytiques sont conformes aux limites écologiques de la détection. Cependant, lorsqu il n y a pas d équilibre, la limite de détection augmente. Ainsi, plusieurs modifications hétérogènes sur la composition de membrane et des nouvelles formes géométriques ont été essayées, mais elles ne semblent pas assez fiables pour être mise en application [5]. Cela implique donc des recherches en vue d examiner de nouveaux matériaux pour les membranes sensibles au cyanure. I.2.4. Détecteur potentiométrique par injection en flux continu d ion sélectif déposé électrochimiquement La stratégie est basée sur le dépôt potentiostatique cathodique sur place de couches minces, d un chalcogénure (composé comprenant un chalcogène en tant qu'ion négatif) binaire ou ternaire (de composition et de stœchiométrie non triviales), sur un substrat conducteur. Les électrodes utilisées sont des sondes de surfaces et leur réponse est donnée par l interface membrane/solution. Leur comportement analytique est régi par la nature de la conductivité électrique et la stœchiométrique du chalcogenure correspondant. I.2.5. Tendances modernes Récemment on a observé un moyen de remplacer la séparation classique du cyanure par une séparation utilisant l analyse en flux. Les méthodes d'analyse en flux permettent l'automatisation des modes opératoires en chimie en solution et conviennent tout particulièrement au traitement de grandes séries d'échantillons à une fréquence d'analyse élevée. L'analyse peut être effectuée avec injection de flux (FIA) ou avec flux continu (CFA) [6]. Les deux méthodes présentent la caractéristique d'un dosage automatique de l'échantillon dans un dispositif en flux (manifold) dans lequel les composants de l'échantillon réagissent avec les réactifs au cours de leur circulation dans le manifold. La préparation de l'échantillon peut être intégrée dans le manifold et le produit de réaction est mesuré dans un détecteur à flux. I.2.6. Conclusion De nos jours, la présence de cyanure dans les eaux ne cesse d augmenter. Il est donc nécessaire de mesurer finement et régulièrement les concentrations dans le milieu hydrique afin de garder un équilibre au niveau environnemental. Différentes méthodes pour la détermination du cyanure existent, mais elles comportent souvent quelques inconvénients, notamment en ce qui concerne l utilisation de matériaux pour les membranes. Les besoins écologiques motivent donc la recherche, ainsi que le développement de nouvelles approches et instrumentations. Des techniques ont donc été innovées, mais l'équipement est 8

9 souvent trop difficile à miniaturiser ou trop cher pour le travail courant de laboratoire. Par exemple, le besoin de séparer un échantillon limite l'utilisation de méthode dans les systèmes analytiques automatisés portatifs. Ce problème pourrait être facilement évité en supposant qu'un système sélectif de détecteur pourrait être développé. II. Présentation du LASEM de la base navale de Toulon Les Laboratoires d Analyses de Surveillance et d Expertise de la Marine, au nombre de trois, sont répartis au sein des Bases Navales de Cherbourg, de Brest et de Toulon. Ils sont issus de la fusion du Laboratoire de Chimie Analytique (LCA) et du Laboratoire de Surveillance Radiologique (LSR) depuis le 12 mars Outre les domaines d activité communs à tous les LASEM, le LASEM de Toulon est spécialisé dans l'identification et les mesures d empoussièrement amiante, ainsi que l analyse des autres contaminants particulaires atmosphériques. II.1. Le Personnel Le LASEM est un laboratoire du Ministère de la Défense, il est subordonné au Commandant en Chef de la Méditerranée (CECMED) et placé sous l autorité du commandant de la Base Navale. Sa direction est confiée à un Pharmacien en Chef appartenant au Service de Santé des Armées assisté d un: - Pharmacien du Service de Santé des Armées, responsable du LSR. - Pharmacien du Service de Santé des Armées, responsable du LCA, secondé par un Pharmacien du Service de Santé des Armées. Le chef du LASEM relève organiquement du commandant de la base navale du port d'implantation dont il est l'un des chefs de groupement de services. L état major de la marine, par l intermédiaire de l amiral chargé des affaires nucléaires et de l environnement et du bureau «Maîtrise des risques» qui lui est subordonné, supervise les activités des LASEM. Le personnel du laboratoire comprend : - Les militaires d active du Service de Santé des armées rattachés à la Marine durant cette affectation. - Le personnel civil (Fonctionnaires, Techniciens à Statut Ouvrier et des Ouvriers d Etats). L effectif du LASEM comprend donc un personnel militaire et civil (voir annexe 1). II.2. Sa Mission Le LASEM a pour mission d apporter aux autorités maritimes un concours scientifique et 9

10 technique afin de satisfaire leurs besoins en analyses et en expertises qui peuvent être d ordre: - Réglementaire, prévu par le code de la consommation et des marchés et le code de la santé publique, réalisé en application des dispositions du code du travail ou ordonné par les législations et les réglementations relatives à la protection de l environnement. - Opérationnel pour vérifier la conformité des matières de type industriel au regard des normes techniques définies par la Marine pour le soutien des forces. Cependant, l activité du LASEM peut s étendre à d autres organismes de la Défense, de la fonction publique, voire exceptionnellement au secteur privé. Le LASEM peut également développer des partenariats avec d autres laboratoires dans le cadre d études, de renforcement ou de partage de son savoir-faire. II.3. Domaines d activités Le LASEM est compétent pour les analyses et expertises en chimie analytique ainsi que pour les mesures de radioactivité. Il exerce ses activités dans les cinq domaines suivants : - Conformité des eaux destinées à la consommation humaine. - Santé et Sécurité au Travail (SST). - Soutien aux forces navales par des analyses de type industriel. - Surveillance et protection de l environnement (dans le domaine des risques chimiques et nucléaires). - Actions de l Etat en mer ordonnées par le préfet Maritime. Le soutien des bâtiments, tant pour les analyses à caractère industriel que pour celles relevant de l hygiène navale, ainsi que les analyses réglementaires destinées à la surveillance et à la protection de l environnement restent malgré tout les activités prioritaires du LASEM. Néanmoins, les activités différent selon le service, le LASEM étant partagé en deux laboratoires : - Le Laboratoire de Chimie Analytique. - Le Laboratoire de Surveillance Radiologique. II.3.1. Activité du Laboratoire de Chimie Analytique (LCA) Le Laboratoire de Chimie Analytique est divisé en plusieurs Unités Techniques (UT) : l UT Gaz, l UT Amiante, l UT Expertise et l UT Eaux. Les activités du LCA sont les suivantes : - Analyses physico-chimiques des eaux destinées à la consommation humaine, eaux de piscines, eaux salines et eaux résiduaires. 10

11 - Identification des fibres d amiante dans des matériaux, prélèvements et comptages des fibres d amiante dans l atmosphère. - Contrôle de viabilité des enceintes confinées, de la pollution atmosphérique des locaux et surveillance de la qualité de l air. - Contrôles de mélanges gazeux pour plongée. - Délivrance de certificats de «salubrité-viabilité» lors de dégazages. - Contrôle des gaz médicaux. - Formation de personnel compétent pour la surveillance de locaux confinés. - Analyses des produits industriels et eaux traitées (soutien des forces navales). - Expertise (recherche et dosage de polluants, analyses de dépôts ou produits de dégradation ). II.3.2. Activités du Laboratoire de Surveillance Radiologique (LSR) Le Laboratoire de Surveillance Radiologique regroupe deux Unités Techniques : l UT Mesures Physiques et l UT Radiochimie. - Surveillance radiologique du site nucléaire et de son environnement, - Evolution de l état zéro du site toulonnais et du littoral méditerranéen proche, - Contrôle des installations nucléaires à terre et des installations nucléaires embarquées. II.3.3. Objectif : Qualité, Normes et Accréditations II Le Comité Français d Accréditation (COFRAC) Le COFRAC est une Association loi de 1901 à but non lucratif française, fondée en 1994 à Paris et ayant pour but d accréditer en France des organismes étatiques ou privés donnant ainsi une reconnaissance nationale et internationale. Certaines exigences à respecter dans le cadre de la démarche qualité se trouvent dans des documents et programmes qualité COFRAC tels que : le document LAB REF 02 [7] qui constitue un guide d utilisation de la norme «NF EN ISO/CEI 17025» applicables aux laboratoires d essais. L instruction de la Marine en matière de qualité met en évidence les priorités d obtention des accréditations pour les LASEM (agrément et accréditation des LASEM) ou de normes techniques. Le COFRAC édite des programmes sur lesquels les laboratoires s appuient lorsqu ils sont candidats à une accréditation. Les méthodes d analyses suivent donc les programmes 11

12 d accréditation du COFRAC faisant eux-mêmes référence à des normes AFNOR (Agence Française de Normalisation) en vigueur. II LASEM et assurance qualité Le LASEM, comme tout laboratoire, est tenu de fournir à ses clients les résultats demandés avec une assurance qualité. Toujours dans l idée d un système qualité et de climat de confiance, le LASEM s est fait accréditer COFRAC en vu de l obtention de l agrément des ministères en charge de la Santé et de l Environnement. Cet agrément permettra de répondre à plusieurs besoins tels que le stipule les articles de l arrêté du 24 janvier 2005 [8]. Cet agrément est donc subordonné à une accréditation préalable par le Comité français d accréditation (COFRAC). Suivant l agrément C-4 «analyse chimiques composés minéraux» pour les eaux destinées à la consommation humaine, les méthodes d analyses seront des méthodes normalisées fixées par le programme du COFRAC [9] et l arrêté du 17 septembre 2003 [10] relatif aux méthodes d analyse des échantillons d eau et à leurs caractéristiques de performances. En l absence de norme ou en cas de modifications de celles-ci, des méthodes internes au laboratoire peuvent être utilisées après avoir effectué au préalable une caractérisation de la méthode dans laquelle sont prévus différents paramètres que nous décrirons plus loin (limite de détection, limite de quantification ). Une validation de la méthode selon la norme «NF T » sera réalisée. Elle sera complétée par des contrôles qualités externes (essais interlaboratoires) si cela est possible. Le laboratoire des eaux va alors procéder à la validation des méthodes en évaluant certains critères de performance. III. Matériels et méthodes III.1. L Analyse Flux Continu (CFA) L Analyse Flux Continu permet d automatiser intégralement les techniques analytiques complexes comme : préparation et traitement d échantillons, dilutions, ajout de réactifs, mélange, dialyse, distillations, incubations et extraction liquide-liquide. On utilise la photométrie pour mesurer l absorbance des échantillons et en déterminer leur concentration. La technique CFA fonctionne de la manière suivante : L échantillon est placé dans un godet sur le passeur d échantillon. Le préleveur aspire l échantillon, l eau ou une solution de rinçage de manière alternative. Ensuite, une bulle d air est insérée entre l échantillon et la solution de rinçage ce qui évite le mélange des échantillons. Au cours de son trajet jusqu à la cellule de mesure, les réactifs vont être introduits au fur et à mesure. La réaction se déroule sous des conditions constantes dans le circuit (ou la cassette) analytique et provoque une coloration qui peut être mesurée par spectrophotométrie. En effet, dans la cuve à circulation du spectrophotomètre, on réalise une mesure continue de la densité optique (DO) à une longueur d onde spécifique pour le paramètre mesuré. Un débullage avant la cuve de mesure est nécessaire et peut être réalisé de manière mécanique ou électronique afin de réduire la contamination inter échantillons et permettant ainsi d augmenter la cadence. 12

13 L Analyse Flux Continu est une méthode comparative ou les échantillons inconnus et les étalons sont analysés dans le même lot pour être mesurés dans les mêmes conditions. La concentration de chaque échantillon est ensuite calculée par le logiciel à partir de la courbe d étalonnage. Les courbes de mesures sont affichées en temps réel sur l écran de l ordinateur et de la console «FUTURA». Sur ces courbes, chaque échantillon est représenté par un pic et l aire du pic est directement proportionnelle à la concentration du paramètre. III.2. Console «FUTURA» et accessoires Image 1 : Console «FUTURA» La console «FUTURA» est capable d effectuer des analyses grâce à son automatisation poussée et à son extrême modularité. Celle-ci repose sur la possibilité d ajouter de nombreux accessoires dédiés, de changer les cassettes analytiques rapidement et facilement, et d utiliser plusieurs consoles simultanément pour mener différentes analyses en parallèle. La console est caractérisée par : - Clavier. Menu Retour (Choix précédent) Entrer (Validation) Suivant Image 2 : Description du clavier 13

14 - Compartiment réactifs amovible. - Vannes automatiques rinçage / réactifs à 5 voies. Les vannes ont 3 positions : - Blocage : réactif et rinçage bloqués (rien ne peut refouler dans les bidons). - Rinçage : le liquide de rinçage alimente tous les tubes utilisés vers la pompe. - Réactif : les réactifs viennent des bidons et sortent vers la pompe. Figure 2 : Disposition des vannes - Pompe péristaltique 12 tubes à fermeture et ouverture automatique. La pompe péristaltique fonctionne en continu à vitesse constante. Elle permet d aspirer l échantillon et les différents réactifs en tenant compte des proportions nécessaires pour la réalisation de la chimie. Le choix des diamètres des tubes de pompe détermine le débit et donc la quantité de chaque solution (voir annexe 2). Les tubes de pompe sont de différents diamètres internes, repérables par un code couleur des ergots de fixation. - Arrêt et démarrage automatiques. - Extraction immédiate de l ensemble des tubes de pompe d une cassette analytique. Le circuit analytique étant l ensemble formé des éléments nécessaires au développement de la réaction. Il est spécifique à chaque paramètre à doser et il est adapté à la gamme de mesure. Le circuit analytique est composé : d injecteurs 2 ou 3 voies, de bobine de mélange (ou de délai), de dialyseurs pour éliminer les interférences des molécules ou des ions, de bains maries pour maintenir le flux à une température spécifique, d unité de distillation ou d extracteurs liquide-liquide pour purifier l échantillon, de tubes de liaisons et enfin de tubes de pompe. - Bain marie étanche (régulation optimale). 14

15 Colorimètre Bain marie de coloration Circuit analytique Pompe péristaltique (levée) Ergot de fixation Arrivée du réactif Image 3 : Vue du dessus de la console «FUTURA» - Colorimètre nm à débullage électronique. Figure 3 : Fonctionnement du colorimètre - Trajet optique ajustable : cuve de 10, 15 ou 50 mm. - Grand écran digital à cristaux liquides rétro-éclairé comprenant : Nom de la méthode et unités. Pics en temps réel avec zoom. Affichage de l énergie, hauteur des pics et DO. Affichage de la température. Alerte pour le changement des tubes de la pompe. Mémorisation des 300 derniers résultats. 15

16 Les accessoires qui accompagnent la console sont les suivants : - Préleveur XYZ caractérisé par : Capacité : Pour des tubes de 11 ml, 4 racks de 60 positions Pot de rinçage mobile Deux options : un diluteur automatique (qui repère les échantillons hors gamme et les contaminés) et un lecteur code barre (qui prend en compte l identification des échantillons). - Une lampe UV-B (312nm) et une bobine de décomposition en verre borosilicaté qui sont utilisées pour filtrer les rayons UV de longueur d onde inférieure à 290 nm. Il est également possible d utiliser une lampe UV ayant une grande longueur d onde (351 nm) n émettant pas de lumière au dessous de 290 nm avec une bobine de décomposition en quartz ou en polytetrafluoroéthylène (PTFE). Ainsi, lorsque les accessoires sont réunis à la console nous obtenons le montage suivant : Image 4 : Console «FUTURA» et accessoires Avec pour légende : 1 = Température du bain marie de distillation. 7 = Clavier. 2 = Arrivée de l azote. 8 = Préleveur XYZ. 3 = Ecran digital. 9 = Ordinateur relié à la console. 4 = Bain marie de distillation. 10 = Débitmètre (azote). 5 = Console «FUTURA». 11 = Compartiment réactifs amovible. 6 = Lampe UV. 12 = Solution rince XYZ. 16

17 L Analyse Flux Continu permet alors de réaliser des analyses pour diverses applications. III.3. Manipulations III.3.1. Détermination de la concentration en cyanures totaux avec distillation III Principe Les cyanures complexes sont décomposés dans un flux continu à un ph de 3,8 sous l effet de rayons U.V. Le cyanure d hydrogène présent à ph = 3,8 est séparé par distillation en ligne à 125 C. Le cyanure d hydrogène est alors dosé par spectrophotométrie. Le dosage spectrométrique repose sur la réaction du cyanure avec la chloramine-t en formant du chlorure de cyanogène, qui réagit à l acide pyridine-4-carbonique et à l acide diméthyl-1,3-barbiturique pour former un complexe de coloration rouge mesuré à 600 nm. III Mode opératoire Figure 4 : Schéma du circuit analytique des cyanures totaux Tous les réactifs doivent être de qualité analytique reconnue afin de ne pas polluer les étalons et les échantillons. L eau utilisée est de l Eau Déminéralisée filtrée (ED) de résistivité de 18 m. 17

18 - Préparation des réactifs (R) : R1 : Tampon ph = 3,8. Réactif de digestion et distillation (stable 3 mois). Dans une fiole jaugée de 1000 ml, dissoudre 20 g d acide citrique dans environ 700 ml d'ed. Ajouter 100 ml d hydroxyde de sodium (1 mol/l) et si nécessaire ajuster à ph = 3,8 avec de l acide chlorhydrique (1 mol/l) ou de la soude (1 mol/l). Puis, ajouter 25 ml d acide chlorhydrique (1 mol/l) et diluer à 1000 ml avec ED. R2 : ED. R3 : Tampon ph = 5,2 (stable 3 mois). Dans une fiole jaugée de 1000 ml, dissoudre 2,3 g de soude dans 500 ml d ED. Ajouter 20,5 g d hydrogenphtalate de potassium et diluer à approximativement 975 ml d ED. Si nécessaire ajuster le ph à 5,2 avec de l acide chlorhydrique (1 mol/l) ou de la soude (1 mol/l). Compléter à 1000 ml avec ED. R4 : Chloramine-T (stable 1 semaine). Dans une fiole jaugé de 500 ml, dissoudre 2 g de chloramine-t dans 500 ml d ED. R5 : Réactif coloré (stable 3 mois). Dans une fiole jaugée de 1000 ml, diluer 7 g de soude dans 500 ml d ED. Ajouter 16,8 g d acide diméthyl-1,3-barbiturique, 13,6 g d acide pyridine-4-carbonique et diluer dans environ 975 ml d ED. Si nécessaire ajuster le ph à 5,2 avec de l acide chlorhydrique (1 mol/l) ou de la soude (1 mol/l). Compléter à 1000 ml avec ED. - Préparation de la solution mère : Dans une fiole jaugée de 1000 ml, dissoudre 0,25 g de cyanure de potassium dans 800 ml de soude (1 mol/l). Compléter à 1000 ml avec de la soude. Une solution commerciale étant disponible, celle-ci a été utilisée pour la réalisation de l étalonnage tandis que celle préparée a été utilisée pour la préparation de témoins. - Préparation des solutions étalons : La gamme correspond à celle du mode opératoire «N MOLE0022» du LASEM. Tout d abord, il est nécessaire de réaliser les solutions filles A et B dans des fioles jaugées de 100 ml à partir de la solution mère. De la soude est ajoutée dans chaque solution avec une pipette automatique de 50 à 1000 µl, afin de mieux conserver les solutions et d éviter la volatilité du cyanure. 18

19 Solution Mère Fille A Fille B Teneur en cyanure 1 g/l 100 mg/l 1 mg/l Préparation Matériel Solution ajoutée Solution certifiée à 1 g/l 10 ml de solution Mère Pipette automatique de 0,1 à 25 ml 1 ml de soude 1 mol/l 1 ml de solution Fille A Pipette automatique de 50 à 1000 µl 1 ml de soude 1 mol/l Compléter avec ED QSP 100 ml QSP 100 ml Durée de conservation 1 an 1 semaine 1 jour Tableau 1 : Préparation des solutions filles Ensuite, la solution fille B permet de préparer une série de 5 étalons (de 5 à 100 µg/l) dans des fioles jaugées de 100 ml suivant le tableau ci-dessous : Solution Blanc Etalon 1 Etalon 2 Etalon 3 Etalon 4 Etalon 5 Teneur en cyanure (µg/l) Solution Fille B (ml) Pipette automatique utilisée Ajout de soude (1 mol/l) Compléter avec ED Durée de conservation ,5 2,5 5 7,5 10 De 50 à 1000 µl De 500 à 5000µL De 50 à 5000 µl De 0,1 à 25 ml De 0,1 à 25 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml QSP 100 ml QSP 100 ml QSP 100 ml QSP 100 ml QSP 100 ml QSP 100 ml 1 jour 1 jour 1 jour 1 jour 1 jour Tableau 2 : Préparation des solutions étalons - Préparation des solutions matricielles : Enfin, ces solutions sont préparées dans des fioles jaugées de 100 ml à partir de la solution fille B. En premier temps, l Eau Brute (EB) du réseau de distribution a été utilisée mais la formation d un précipité blanc (causé par la réaction entre la soude et les métaux contenus dans EB) entraînait de mauvais résultats. Ainsi, de l eau «Cristaline» a été utilisée. Le principe est d avoir des solutions avec les teneurs en cyanure suivantes : Une teneur de la Limite de Quantification présupposée (LQ), soit 5 µg/l. 20 % de la teneur du maximum de la courbe d étalonnage, soit 20 µg/l. 50 % de la teneur du maximum de la courbe d étalonnage, soit 50 µg/l. 80 % de la teneur du maximum de la courbe d étalonnage, soit 80 µg/l. 19

20 Solution LQ 20% 50% 80% Teneur en cyanure (µg/l) 5 µg/l 20 µg/l 50 µg/l 80 µg/l Solution Fille B 500 µl 2 ml 5 ml 8 ml Pipette automatique utilisée De 50 à 1000 µl De 100 à 5000 µl De 100 à 5000 µl De 0,1 à 25 ml Ajout de soude (1 mol/l) 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Compléter avec de la «Cristaline» QSP 100 ml QSP 100 ml QSP 100 ml QSP 100 ml Durée de conservation 1 jour 1 jour 1 jour 1 jour III Opérations instrumentales Tableau 3 : Préparation des solutions matricielles Avant de lancer une analyse, l Analyse Flux Continu nécessite un certains nombre de manipulations. - Démarrage du système : Allumer la machine et le préleveur XYZ. Ouvrir le robinet d eau de refroidissement du distillateur. Ouvrir la vanne d alimentation de l azote. Démarrer en totalité le système à froid en pompant de l eau. Allumer la lampe UV. Allumer le chauffage du bain-marie de distillation. Attendre la stabilisation de la température de distillation à la valeur de consigne (125 C). Vérifier la température du bain-marie de coloration (45 C) Attendre la stabilisation de la ligne de base et régler le zéro. Lancer le logiciel et charger la méthode (en l occurrence celle des cyanures). Entrer la table de prélèvement. Déposer les tubes contenant les étalons sur le rac du préleveur. Lancer l analyse. Il est conseillé de vérifier certains réglages tel que la séquence de prélèvement et les gains. - Arrêt du système : Eteindre la lampe UV. Couper le chauffage du bain-marie de la distillation. Pomper une solution d acide chlorhydrique par la ligne du réactif de distillation (R1) pendant 10 minutes pour une température inférieure à 90 C. Puis, pomper de l eau pendant 5 minutes. Fermer le robinet du circuit d eau. Fermer la vanne d alimentation de l azote. Arrêter le système de pompage. 20

21 Desserrer les presses du système de pompage. Eteindre la machine et le préleveur XYZ. Une fois que ces manipulations sont terminées, les boîtes contenant les réactifs sont bouchées avec du papier film, puis mises au réfrigérateur afin d y être conservé entre 2 et 5 C. La solution fille A (100 mg/l) et la solution fille B (1 mg/l) sont jetées dans une poubelle réservée aux déchets cyanurés, alors que les étalons (de concentration comprise entre 5 et 100 µg/l) sont jetés sous eau à l évier. III.3.2. Détermination de l indice phénol (sans extraction) après distillation III Principe L échantillon est amené dans un flux vecteur continu, mélangé à l acide phosphorique, puis distillé en ligne à ph = 1,4 à une température de 155 C. Le distillat contenant les composés phénoliques volatils à la vapeur est ensuite mélangé aux solutions s écoulant sans interruption d amino-4 antipyrine et d hexacyanoferrate(iii) de potassium. Les composés phénoliques présents dans le distillat sont oxydés par l hexacyanoferrate(iii) et les quinones qui en résultent réagissent à l amino-4 antipyrine en formant des produits de condensation de couleur jaune, mesurés par spectrométrie dans un spectromètre de flux entre 505 nm et 515 nm. Le schéma du circuit analytique correspond au même que celui des cyanures totaux, cependant il est possible d avoir un circuit analytique spécifique aux phénols. Figure 5 : Schéma du circuit analytique spécifique des phénols 21

22 III Mode opératoire - Préparation des réactifs (R) : R1 : Réactifs de distillation (stable 6 mois). Dans une fiole jaugée de 1000 ml, ajouter 100 ml d acide phosphorique dans 800 ml d ED. Compléter à 1000 ml avec ED. R2 et R4 : ED. R3 : Solution d amino-4 antipyrine (stable 1 jour). Dans une fiole jaugée de 250 ml, dissoudre 0,1625 mg d amino-4 antipyrine dans ED. Dégazer en filtrant sous pression avant utilisation. R5 : Tampon ferricyanure de potassium (stable 1 semaine). Dans une fiole jaugée de 1000 ml, dissoudre 2 g d hexacyanoferrate(iii) de potassium, 3 g d acide borique et 5 g de chlorure de potassium dans 800 ml d ED. Ajuster le ph à 10,3 avec de l hydroxyde de potassium (1 mol/l). Compléter à 1000 ml avec ED. Dégazer en filtrant sous pression avant utilisation. - Préparation de la solution mère : Dans une fiole jaugée de 1000 ml, dissoudre 1 g de phénol dans 800 ml d ED. Ajouter 4,17 ml d acide chlorhydrique concentré (37 %). Compléter à 1000 ml avec ED. Ces manipulations sont à réaliser sous une hotte et avec toutes les précautions requises (salle isolée, port d un masque à gaz avec filtre polyvalent et port de gants). De même, une solution commerciale a été utilisée. - Préparation des solutions étalons et des solutions matricielles : La gamme étalon est la même que celle des cyanures, c est à dire de 5 à 100 µg/l. Nous réalisons tout d abord les solutions filles, puis les étalons et enfin les matrices dans des fioles jaugées de 100 ml. Cependant, le phénol étant très volatil les manipulations sont effectuées sous une hotte. De même, la solution de soude 1 mol/l est remplacée par une solution d acide chlorhydrique (1 mol/l) prélevée à l aide d une pipette manuelle de 100 à 1000 µl. Quant aux solutions matricielles, les fioles sont complétées avec EB. III Opérations instrumentales - Démarrage du système : La procédure est équivalente mais nécessite quelques réglages. 22

23 L analyte étant différent les filtres doivent être changés. Pour la mesure, le filtre passe de 600 nm pour les cyanures à 510 nm pour les phénols et pour la référence il passe de 460 nm à 720 nm. Ainsi, il est nécessaire de régler le gain du photomètre pour qu il soit dans la bonne plage de travail, puis de faire l ajustement du zéro du convertisseur. La lampe UV n est pas allumée, la température de distillation est de 155 C et la température du bain-marie de coloration est fixée au minimum possible (10 C). - Arrêt du système : Les étapes sont identiques excepté qu il faut pomper 15 minutes de l ED par l échantillon et le tube du réactif de distillation après avoir une température inférieure à 90 C. La gamme étant identique, les solutions sont jetées de la même manière mais sous une hotte. IV. Validation de la méthode d analyse La validation d une méthode fait partie du processus de mise en œuvre d une nouvelle technique d analyse, il s'agit d'un objectif important pour le LASEM du fait de la mise en place des systèmes d assurance qualité. C est ainsi un moyen d assurer une totale crédibilité auprès des clients et de pouvoir travailler dans un climat de totale confiance. En effet, ces critères de qualité sont la linéarité, la sensibilité, la répétabilité, les limites de quantification, la fidélité, la justesse, l exactitude. Ces caractéristiques garantissent l aptitude de la méthode à donner des résultats exacts dans des conditions opératoires fixées. La méthode d analyse correspond à l ensemble des opérations nécessaires pour effectuer l analyse du paramètre à doser. L analyse comprenant la préparation de l échantillon, des réactifs, l utilisation de l appareillage, l expression des résultats et le rapport d essai. Pour procéder à la validation d une méthode d analyse, nous suivons la norme «NF T » de mai 2009 «Qualité de l eau. Protocole d évaluation initiale des performances d une méthode dans un laboratoire» qui se propose de guider un laboratoire d analyse dans le domaine des eaux pour l évaluation d une méthode (commerciale ou interne de laboratoire). Cette évaluation doit permettre à tout analyste d utiliser la méthode en connaissant ses performances. Si la méthode répond aux critères statistiques alors elle sera validée. Cette norme recommande de suivre quatre plans d expériences. - le plan A : Etude de la fonction d étalonnage. - le plan B : Etude de la Limite de Quantification présupposée. - le plan C : Etude des rendements. - le plan D : Etude de l exactitude. Chaque plan est caractérisé par un certain nombre d essais à réaliser que l on devra ensuite valider au moyen de tests statistiques. 23

24 Nous ne détaillerons pas les calculs statistiques dans ce rapport, mais nous contenterons de les appliquer. En effet, les tests statistiques sont réalisés par des feuilles de calcul sur «Excel» qui ont été élaborées et vérifiées par un personnel du LASEM. De même, seuls les résultats de la validation de la méthode des cyanures sont traités, les nombreuses et diverses manipulations concernant les phénols n étant pas concluantes. IV.1. Plan A Le plan d expérience de type A caractérise la linéarité. Ce plan permet d évaluer une fonction d étalonnage dans un domaine considéré par un test d adéquation ou une comparaison. En effet, il compare l erreur de modèle observée par rapport à l erreur expérimentale observée sinon il compare les biais observés à des Ecarts Maximaux Acceptables (EMA). Dans notre cas, il s agit de l erreur observée par rapport à l erreur expérimentale qui est comparé. IV.1.1. Organisation des essais et linéarité L étude de la linéarité s effectue au minimum sur 5 niveaux, c est à dire 5 étalons de concentrations différentes (voir tableau 2) et répétés chacun au moins 5 fois. De plus, pour respecter l indépendance des mesures, chaque répétition doit être faite sur une solution étalon préparée indépendamment. L appareil mesure alors la valeur d information, ici la densité optique (DO). La linéarité est la capacité d une méthode d analyse, dans un domaine d application défini, à fournir une valeur d information ou des résultats proportionnels à la quantité d analyte à doser dans l échantillon. Les limites de linéarité sont des limites expérimentales de grandeurs entre lesquelles un modèle d étalonnage linéaire peut être appliqué avec un niveau de confiance connu (1%). IV.1.2. Etude de l étalonnage Tout d abord, il y a le test de Fisher qui consiste à vérifier si la variance due à la régression n est pas inférieure à la variance due à l erreur expérimentale. Dans ce cas, le modèle linéaire est accepté. De même, avant d entreprendre toute évaluation des caractéristiques de la fonction d étalonnage, il faut au préalable réaliser : un test de Cochran qui permet de vérifier si les variances, obtenues à partir des répétitions de chaque solution étalon, sont homogènes. un test de Grubbs qui permet de vérifier l absence de points aberrants. Si les résultats expérimentaux ne répondent pas à ces deux tests alors les variances ne sont pas homogènes et une régression linéaire pondérée peut corriger ce défaut. Sinon, l équation est la suivante : 24

25 y = a0 + a1 x Equation 1 : Equation de la fonction d étalonnage linéaire Avec : y : Absorbance (Unité d Absorbance UA). a0 : Coefficient pour l'ordonnée à l'origine qui correspond à la réponse du blanc (L.UA /µg). a1 : Coefficient pour la pente qui correspond à la sensibilité (L.UA /µg). x : Concentration (µg/l). La sensibilité étant le rapport de la variation de la valeur d information de la méthode d analyse sur la variation de la grandeur en analyte (variation de la concentration des différents étalons). La méthode est dite sensible si une variation de la quantité d analyte entraîne une variation importante de la valeur d information. IV.2. Plan B L objectif est de vérifier qu une Limite de Quantification présupposée est acceptable dans une matrice considérée. La LQ étant la plus petite concentration de l analyte pouvant être quantifiée avec une incertitude acceptable, dans les conditions expérimentales décrites de la méthode. IV.2.1. Organisation des essais et fidélité intermédiaire Pour l étude de la limite de quantification, un volume suffisant d eau la plus représentative possible de la matrice considérée (ici, la «Cristaline») est dopé avec une quantité d analyte qui correspond à cette limite de quantification choisie (en l occurrence 5 µg/l). Une analyse est alors réalisé dans des conditions de fidélité intermédiaire (voir tableau 3), puis des tests statistiques sont effectués à partir des valeurs d informations. Les conditions de fidélité intermédiaire sont respectées lorsque les conditions où les résultats d'essai sont obtenus par la même méthode sur des individus d'essai identiques dans le même laboratoire avec des changements de conditions, parmi lesquelles : personne, étalonnage, équipement, environnement, temps écoulé entre les mesure. IV.2.2. Interprétation des paramètres d exactitude pour la LQ Il s agit de s assurer de l exactitude de la limite de quantification présupposée par rapport à un écart maximal acceptable de 60% de la LQ en vérifiant les deux inégalités suivantes : Equation 2 : Inégalités du plan B Si au moins une des deux inégalités n est pas vérifiée alors la LQ n est pas vérifiée. 25

26 IV.3. Plan C L objectif est de caractériser l influence de l étape de préparation lorsque celle-ci n est pas prise en compte dans l étude de l étalonnage. IV.3.1. Organisation des essais et fidélité Pour cette étude, nous réalisons 2 niveaux d ajout sur une même eau représentative du domaine d application (l eau «Cristaline») et 5 essais sur chaque niveau de cette matrice afin de les analyser dans des conditions de fidélité intermédiaire. Pour notre analyte (le cyanure) les niveaux correspondent à 20%, 50% et 80% du maximum du domaine. La fidélité est l étroitesse d accord entre les résultats d essais indépendants obtenus sous des conditions stipulées. IV.3.2. Interprétation des paramètres d exactitude pour un niveau d ajout Si le rendement moyen pour chaque niveau est compris entre 90% et 110% (ce qui équivaut à une erreur de 10%), le rendement de la méthode est considéré comme correct. Dans le cas contraire, le laboratoire devra tenir compte, dans le calcul des incertitudes, du biais introduit par l absence de correction du rendement. L Analyse Flux Continu des cyanures est une méthode normalisée utilisée dans son domaine d application, ainsi l étude des interférences (spécifiques et non spécifiques) n est pas nécessaire. IV.4. Plan D L étude de l exactitude porte sur l évaluation de la fidélité intermédiaire et du biais par rapport à des valeurs qui servent de référence. Elle est vérifiée sur des échantillons de valeur de référence et selon un EMA issue d une exigence réglementaire, normative ou fixée (par le client ou le laboratoire). IV.4.1. Organisation des essais et justesse L étude de l exactitude repose sur le même principe que le plan C mais avec un niveau d ajout supplémentaire. Il s agit donc du même principe que le plan C. La justesse est l étroitesse de l accord entre la valeur moyenne obtenue à partir d une large série de résultats d essais et la valeur de référence acceptée. IV.5. Résultats Plan A : La première étape consiste à initialiser les paramètres macros du logiciel «Excel», puis d entrer les densités optiques obtenues pour la régression (calculs et graphe). 26

27 On obtient : Nombre de niveaux p : 5 Nombre de gammes n : 13 Étalon de grandeur théorique Fonction d'étalonnage Linéaire Niveau 1 Niveau 2 Niveau 3 Niveau 4 Niveau 5 y=ax+b Ordonnée origine b Pente a Gamme n 1 0,0148 0,0773 0,1517 0,2372 0,3172-0, , Gamme n 2 0,0137 0,0782 0,1581 0,2363 0,3131-0, , Gamme n 3 0,0145 0,0773 0,1558 0,2333 0,3126-0, , Gamme n 4 0,0148 0,0775 0,1571 0,2357 0,3176-0, , Gamme n 5 0,0152 0,0796 0,1599 0,2399 0,3274-0, , Gamme n 6 0,0149 0,0790 0,1575 0,2589 0,3216-0, , Gamme n 7 0,0162 0,0801 0,1595 0,2456 0,3256-0, , Gamme n 8 0,0184 0,0819 0,1632 0,2453 0,3291 0, , Gamme n 9 0,0136 0,0785 0,1623 0,245 0,3331-0, , Gamme n 10 0,0142 0,08 0,1637 0,2464 0,3303-0, , Gamme n 11 0,0135 0,0785 0,1606 0,2437 0,3275-0, , Gamme n 12 0,013 0,0761 0,1574 0,2429 0,3245-0, , Gamme n 13 0,0153 0,079 0,1605 0,2423 0,3241-0, , Tableau 4 : Résultats des gammes Graphe 1 : Fonction d étalonnage 27

28 De même, «Excel» réalise le tableau des grandeurs retrouvées, le tableau des biais et l étude de cas approche statistique (voir annexe 3). Ensuite, nous réalisons une approche statistique qui effectue le test de Fisher (voir tableau 5), de Cochran (qui affiche «on accepte l hypothèse selon laquelle les variances des populations sont égales entre elles), puis Grubbs 1 et 2 (voir annexe 4). Sources de variation Critère calculé (1,663) < Valeur critique au risque =1% (3,339) La fonction d'étalonnage est considérée comme acceptable dans le domaine étudié. L'erreur du modèle est négligeable par rapport à l'erreur expérimentale observée. Tableau 5 : Résultats du test de Fisher D après les tests, les résultats sont acceptés. Plan B : Somme des carrés d'écart Étude de cas approche statistique Degrés de liberté Variances Critère calculé Les valeurs obtenus, qui sont cette fois les concentrations des LQ à ± 2S LQ, permettent la réalisation des calculs des inégalités (voir annexe 5) et le tracé du graphe. Valeur critique au risque =1% Modèle 3,98 5 0,796 1,663 3,339 Expérimentale 28, , Totale 32,71 65 Graphe 2 : Exactitude de la LQ 28

29 Conclusion : L'exactitude de la limite de quantification proposée à 5 µg/l est vérifiée De plus, il a pu être démontré que les calculs par rapport à un EMA de 20% de la LQ sont valables. Plan C : Pour l étude des rendements, les tableaux des résultats (voir annexe 6) pour 3 ajouts de teneurs en cyanure différentes donnent: Ajout (nombre(s) de niveau(x)) Nombre de séries : n 5 Nombre de répétitions par série : r 2 Variance de répétabilité : S répet ² 0,912 1,97 0,46 Variance des moyennes : S (zi) ² 5,715 1,036 3,895 Variance inter-séries : S B ² 5,259 0,051 3,665 Variance de fidélité intermédiaire : S FI ² 6,171 2,021 4,125 Rendement moyen en % : Rdt 95,858 97,494 97,956 Écart-type de fidélité intermédiaire en % : S FI 2,484 1,422 2,031 CV de fidélité intermédiaire en % : S FI 2,6 1,5 2,1 Tableau 6 : Calcul du rendement Les rendements de la méthode sont donc bien compris entre 90% et 110%. Plan D : Ce plan n a pas eu besoin d être abordé pour la validation car la méthode des cyanures est normalisée, cela signifie que ce plan ne fait pas partie du protocole. Cependant, les organisations d essais (voir annexe 7), les calculs d exactitude (voir annexe 8) et le graphe sont valables. 29

30 Graphe 3 : Interprétation graphique de l exactitude de la méthode En conclusion, d après les résultats obtenus sur les différents plans, la validation de la méthode d analyse des cyanures est réussite. 30

31 Discussion Tout d abord, je pense avoir sous estimé l importance des normes dans un laboratoire travaillant dans un contexte très contraint par l assurance qualité au début de mon stage. En effet, en m y intéressant plus rapidement certaines manipulations auraient pu être évitées, me donnant ainsi un gain de temps pour la suite de mon étude. De plus, après une semaine de manipulations et d analyse, la console «FUTURA» ne donnait plus les résultats attendus. En effet, la console a totalement été déréglée et il a fallu apporter de nombreuses modifications afin de corriger les problèmes. Ces différentes corrections qui ont été apportées m ont permis de mieux comprendre le fonctionnement de la machine et de son logiciel. Cependant, je n ai pu corriger les soucis qu un par un et du temps fut perdu, car une semaine entière a été consacrée à sa bonne remise en route. Cela est d autant plus regrettable qu une formation sur ma console a eu lieu alors que l ensemble des problèmes étaient réglés. Au final, le point positif est que le personnel du LASEM saura quels sont les endroits du logiciel à vérifier en cas de mauvais résultats. Ceci a concouru à une meilleur «appropriation» du matériel, y compris ses faiblesses potentielles, par l ensemble de l équipe du LASEM. En ce qui concerne les manipulations en elles-mêmes, je n ai pas vraiment éprouvé de difficultés, si ce n est pour la préparation de la solution mère de phénol à 1 g/l (utilisation du masque à cartouches). En effet, dans l ensemble, mes préparations ont été réalisées avec toutes les précautions requises au laboratoire et je n ai donc pas eu matière à m inquiéter. Grâce à la diversité du personnel du LASEM, j ai pu approfondir mes connaissances en chimie et en apprendre beaucoup sur les différents parcours professionnels possibles et sur le fonctionnement d un laboratoire réputé pour la qualité de son travail et de ses analyses. De plus, il m a été permis de suivre une formation interne qualité, ainsi qu une formation interne sécurité. Ce stage m a donc permis de mettre en service la console «FUTURA», de réaliser de nombreuses manipulations (utilisant différentes poudres et solutions) et de valider la méthode des cyanures qui sera très utile par la suite pour les analyses du LASEM. En effet, la validation des cyanures va permettre au LASEM de maintenir l accréditation. L essentiel de mon stage, la validation d une méthode d analyse, a donc été mené à terme. J ai par ailleurs appris a utilisé les macros du logiciel «Excel». Néanmoins, je regrette la non validation de la méthode d analyse des phénols, les résultats de l Analyse Flux Continu des phénols n ayant rien donné. Pourtant, je pense avoir testé méthodiquement les différents points pouvant interférer sur les résultats : vérification de l ensemble du circuit analytique et changement de certains tubes, changement de solution mère 31

32 (utilisation d une solution commerciale) et de réactifs, nettoyage du circuit analytique, vérification des données du logiciel... N étant pas disponibles, seul les filtres du colorimètres n ont pas été changés. Une fois reçus, il serait intéressant de comparer les résultats obtenus aux précédents. Quant à la globalité du stage, une aisance ainsi qu une rapidité plus importante ont été acquise suite à la répétition des manipulations. De même, cela m a permis de développer une certaine réflexion personnel, spécifique au travail en laboratoire de chimie. 32

33 Conclusion Les sources industrielles font augmenter la présence de cyanures dans les eaux. De ce fait, il était nécessaire de mettre au point une méthode de dosage conforme aux normes afin de vérifier, a minima, la potabilité des eaux destinées à la consommation humaine Cette étude a donc eu pour but de caractériser les performances d une méthode de dosage déjà utilisé au LASEM mais mise en œuvre sur un matériel nouveau. Cette caractérisation a été effectuée par l étude du domaine d étalonnage et en effectuant les plans A, B, C et D en se référant à la norme «NF T ». La linéarité, la sensibilité, la répétabilité, les limites de quantification, la fidélité, la justesse et l exactitude ont été étudiées et attestent que la méthode, concernant les cyanures, a les performances nécessaires pour répondre aux exigences de la réglementation française dans le domaine des analyses d eau destinées à la consommation humaine. Ainsi à l issue de cette évaluation, le laboratoire pourra utiliser cette méthode lors de ses prochaines analyses et pourra maintenir l accréditation lors d un prochain audit. Cependant, la validation de la méthode pour le phénol n a pas pu être menée à terme. Par conséquent, le LASEM pourra reprendre la suite mes travaux afin de valider la méthode d analyse des phénols. Bilan personnel Ce stage m a beaucoup apporté autant sur le plan humain que sur le plan professionnel. En effet, ce stage m a permis d intégrer rapidement une équipe dynamique dans laquelle j ai pu m épanouir, acquérir une certaine confiance en moi, puis découvrir le parcours scolaire et professionnel de chacun ainsi que leurs méthodes de travail. De même, j ai été confronté sur une période de deux mois à la réalité du travail de laboratoire (travail et organisation d équipe, essais inter-laboratoire, commandes de produits, pannes matérielles...). Enfin, ce stage a complété ma formation acquise en chimie, notamment sur les normes analytiques et la validation d une méthode d analyse. C est une chance que d avoir pu travailler auprès d un personnel aussi expérimenté et je remercie encore l ensemble du LASEM. 33

34 Glossaire AFNOR : Agence Française de Normalisation CECMED : Commandant en Chef de la Méditerranée CFA : Analyse Flux Continu COFRAC : Comité Français d Accréditation COT : Carbone Organique Total DO : Densité Optique EB : Eau Brute ED : Eau Déminéralisée EMA : Ecart Maximal Acceptable FIA : Analyse avec Injection de Flux IDEF : Ingénieur Divisionnaire d Etudes et de Fabrications LASEM : Laboratoire d Analyse de Surveillance et d Expertise de la Marine LCA : Laboratoire de Chimie Analytique LQ : Limite de Quantification LSR : Laboratoire de Surveillance Radiologique PTFE : Polytetrafluoroéthylène SST : Santé et Sécurité au Travail QSP : Quantité Suffisante Pour TSEF : Technicien Supérieur d Etude et de Fabrication UA : Unité d Absorbance UT : Unité Technique 34

35 Références Bibliographiques [1] NF T , Protocole d évaluation initiale des performance d une méthode dans un laboratoire AFNOR [2] Ellenhorn, M.J. et Barceloux, D.G. Medical toxicology. Diagnosis and treatment of human poisoning. Elsevier Science Publishing Company, New York, NY (1988) [3] Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR). Toxicological profile for cyanide. Draft for public comment. Prepared for the U.S. Public Health Service by Technical Resources, Inc., under Contract No Revised by Syracuse Research Corporation under Contract No Oak Ridge National Laboratory (1988) [4] Tan J., Bergamin J., Meroci, A., Alegret S., Sevilla III, F. Oil dispersion of AgI/Ag2S salts as a new electroactive material for potentiometric sensing of iodide and cyanide. Sens. Actuators B 2004, 101,57-62 [5] Hassan S., Marzouk S., Mohamed A., Badaway,N. Novel dicyanoargentate polymeric membrane sensors for selective determination of cyanide ions. Electroanalysis 2004, 16, [6] Journal of Analytical Chemistry, Vol. 55, No. 7, 2000, p Translated from Zhurnal Analiticheskoi Khimii, Vol. 55, No. 7, 2000, pp Original Russian Text Copyright by Zolotov [7] LAB REF 02 Exigences pour l accréditation des laboratoires selon la norme NF EN ISO/CEI COFRAC Mars 2009 [8] Arrêté du 24 janvier 2005, Conditions d'agrément des laboratoires pour la réalisation des prélèvements et des analyses du contrôle sanitaire des eaux [9] PROGRAMME N ANALYSES PHYSICO-CHIMIQUES DES EAUX COFRAC Juin 2000 [10] Arrêté du 17 septembre 2003, Méthodes d'analyses des échantillons d'eau et à leurs caractéristiques de performance 35

36 Annexe 1 : Organigramme du LASEM 36

37 Annexe 2 : Tableau des débits 37

38 Annexe 3 : Tableau des grandeurs retrouvées, des biais et de l étude de cas approche statistique Tableau des grandeurs retrouvées Gamme n 1 5,564 25,17 48,509 75, ,427 Gamme n 2 4,635 25,093 50,435 75,239 99,598 Gamme n 3 4,991 25,028 50,075 74, ,104 Gamme n 4 5,214 24,912 49,919 74, ,342 Gamme n 5 5,382 25,072 49,624 74, ,838 Gamme n 6 5,179 24,569 48,314 78,986 97,952 Gamme n 7 5,358 24,906 49,195 75, ,007 Gamme n 8 5,394 24,807 49,661 74,76 100,378 Gamme n 9 5,461 24,79 49,749 74,38 100,62 Gamme n 10 5,108 24,881 50,032 74, ,096 Gamme n 11 5,242 24,905 49,742 74,88 100,231 Gamme n 12 5,505 24,671 49,366 75, ,122 Gamme n 13 5,234 24,808 49,851 74, ,121 Tableau des biais Gamme n 1 0,564 0,17-1,491 0,331 0,427 Gamme n 2-0,365 0,093 0,435 0,239-0,402 Gamme n 3-0,009 0,028 0,075-0,198 0,104 Gamme n 4 0,214-0,088-0,081-0,388 0,342 Gamme n 5 0,382 0,072-0,376-0,916 0,838 Gamme n 6 0,179-0,431-1,686 3,986-2,048 Gamme n 7 0,358-0,094-0,805 0,534 0,007 Gamme n 8 0,394-0,193-0,339-0,24 0,378 Gamme n 9 0,461-0,21-0,251-0,62 0,62 Gamme n 10 0,108-0,119 0,032-0,116 0,096 Gamme n 11 0,242-0,095-0,258-0,12 0,231 Gamme n 12 0,505-0,329-0,634 0,336 0,122 Gamme n 13 0,234-0,192-0,149-0,014 0,121 Moyenne des biais 0,251-0,107-0,425 0,216 0,064 Écart-type des biais 0,247 0,17 0,604 1,202 0,703 38

39 Annexe 4 : Tests de Grubbs TEST DE GRUBBS pour 1 valeur aberrante NIVEAU 1 NIVEAU 2 NIVEAU 3 NIVEAU 4 NIVEAU 5 Gtable 5% 2,462 Gtable 1% 2,699 Valeur Test pour la plus grande valeur 2,462 < 2,597 < 2,699 DOUTEUX 2,126 < 2,462 ACCEPTÉ 1,425 < 2,462 ACCEPTÉ 2,462 < 2,507 < 2,699 DOUTEUX 1,492 < 2,462 ACCEPTÉ Valeur Test pour la plus petite valeur 1,273 < 2,462 ACCEPTÉ 1,718 < 2,462 ACCEPTÉ 2,231 < 2,462 ACCEPTÉ 1,406 < 2,462 ACCEPTÉ 1,648 < 2,462 ACCEPTÉ TEST DE GRUBBS pour 2 valeurs aberrantes NIVEAU 1 NIVEAU 2 NIVEAU 3 NIVEAU 4 NIVEAU 5 Gtable 5% 0,2836 Gtable 1% 0,2016 Valeur Test pour les deux plus grandes valeurs Valeur Test pour les deux plus petites valeurs 0,2016 < 0,252 < 0,2836 DOUTEUX 0,759 > 0,2836 ACCEPTÉ 0,48 > 0,2836 ACCEPTÉ 0,727 > 0,2836 ACCEPTÉ 0,848 > 0,2836 ACCEPTÉ 0,96 > 0,2836 ACCEPTÉ 0,96 > 0,2836 ACCEPTÉ 0,996 > 0,2836 ACCEPTÉ 0,915 > 0,2836 ACCEPTÉ 0,959 > 0,2836 ACCEPTÉ 39

40 Annexe 5 : Calcul des inégalités Série Répétitions calculs Date Opérateur 1 2 Moyenne Variance des séries 1 4,26 4,25 05/05/2010 FP 4,255 5E ,54 4,51 06/05/2010 FP 4,525 0, ,79 5,08 07/05/2010 SJ 4,935 0, ,28 4,94 10/05/2010 FP 5,11 0, ,81 4,77 11/05/2010 FP 4,79 0,0008 Messages d'information --> OK Limite de quantification présupposée en µg/l 5 µg /L Variance de répétabilité 0,02023 Ecart maximal acceptable (60% par défaut) 60 Nombre de répétitions (r) 2 Grandeur moyenne calculée 4,723 Nombre de séries (n) 5 Ecart-type de fidélité intermédiaire calculé 0,353 Variance inter-séries 0, LQ + 60 * LQ 8 LQ - 60 * LQ 2 Z LQ +2xS LQ 5,429 Z LQ -2xS LQ 4,017 40

41 Annexe 6 : Tableaux des résultats du plan C Série Teneur initiale avant ajout Teneur ajoutée Tableau des résultats pour un ajout à 20µg/L Teneur retrouvée Rendement en pourcentage Statistiques élémentaires Moyenne S² série ,4 18, ,55 91,78 0, ,41 19,35 97,05 96,75 96,9 0, ,18 19,18 95,9 95,9 95, ,88 19,29 99,4 96,45 97,93 4, ,39 19,32 96,95 96,6 96,78 0,061 Série Teneur initiale avant ajout Teneur ajoutée Tableau des résultats pour un ajout à 50µg/L Teneur retrouvée Rendement en pourcentage Statistiques élémentaires Moyenne S² série ,98 48,11 95,96 96,22 96,09 0, ,28 49,16 96,56 98,32 97,44 1, ,46 48,59 96,92 97,18 97,05 0, ,34 48,39 100,68 96,78 98,73 7, ,36 48,8 98,72 97,6 98,16 0,627 Série Teneur initiale avant ajout Teneur ajoutée Tableau des résultats pour un ajout à 80µg/L Teneur retrouvée Rendement en pourcentage Statistiques élémentaires Moyenne S² série ,57 77,86 96,96 97,32 97,14 0, ,76 81,25 100,95 101,56 101,26 0, ,04 78,51 96,3 98,14 97,22 1, ,65 77,12 95,81 96,4 96,1 0, ,21 78,69 97,76 98,36 98,06 0,18 41

42 Annexe 7 : Organisations des essais du plan D Organisation des essais pour le niveau 20 Série Répétitions 1 2 Moyenne Variance des séries 1 18,4 18,31 18,35 0, ,41 19,35 19,38 0, ,18 19,18 19, ,88 19,29 19,58 0, ,39 19,32 19,36 0,002 Organisation des essais pour le niveau 50 Série Répétitions 1 2 Moyenne Variance des séries 1 47,98 48,11 48,04 0, ,28 49,16 48,72 0, ,46 48,59 48,53 0, ,34 48,39 49,36 1, ,36 48,8 49,08 0,157 Organisation des essais pour le niveau 80 Série Répétitions 1 2 Moyenne Variance des séries 1 77,57 77,86 77,72 0, ,76 81, , ,04 78,51 77,78 1, ,65 77,12 76,89 0, ,21 78,69 78,45 0,115 42

43 Annexe 8 : Calcul pour l étude de l exactitude Estimation des paramètres d'exactitude de la méthode pour 3 niveaux Niveau 1 Niveau 2 Niveau 3 Nombre de séries : 5 Nombre de répétitions par série : 2 Valeur de référence Incertitude-type sur Réf : U réf Écart maximal acceptable par rapport à Réf en % : EMA % Écart maximal acceptable par rapport à Réf : EMA Variance de répétabilité : S répét ² 0,036 0,492 0,293 Variance des moyennes : s(z i )² 0,23 0,259 2,471 Variance interséries : S B ² 0,212 0,013 2,324 Variance de fidélité intermédiaire : S FI ² 0,248 0,505 2,617 Moyenne générale : z 19,17 48,746 78,368 Écart-type de fidélité intermédiaire : S FI 0,498 0,711 1,618 CV de fidélité intermédiaire : CVF I en % 2,6 1,5 2,1 Interprétation de l'exactitude de la méthode Écart normalisé EN 0,41 0,62 0,77 Conclusion sur un biais négligeable VÉRIFIÉE EN < 2 VÉRIFIÉE EN < 2 VÉRIFIÉE EN < 2 Réf + EMA z + 2 x S FI 20,17 50,17 81,6 z - 2 x S FI 18,17 47,32 75,13 Réf - EMA Conclusion sur l'exactitude de la méthode VÉRIFIÉE VÉRIFIÉE VÉRIFIÉE 43