Imagerie de la paroi

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1 Imagerie de la paroi immunohistochimie des polysaccharides de paroi chez les végétaux Cécile Hervé UMR8227, Roscoff Atelier GlycoOuest, Interactions sucres-protéines Avril 2014, Roscoff

2 I. Sondes moléculaires pour la détection des polysaccharides de paroi production et caractérisation d anticorps monoclonaux utilisation de modules naturelsde reconnaissance (carbohydrate-binding modules, CBM) II. Utilisation des sondes de paroi en immunohistochimie et microscopie principes de l immunohistochimie préparation du matériel végétal immunofluorescence indirecte microscopie électronique observation, interprétation et mise en forme TP. Imagerie de la paroi par immunofluorescence

3 Anticorps monoclonaux et CBMs

4 Pourquoi la paroi? entoure chaque cellule végétale(algues & plantes) rôles dans de nombreuses réponses physiologiques (compartiment dynamique) Signalisation Interface Intégrité Différenciation Adhérence Expansion Morphogenèse

5 Type cellulaire & diversité pariétale (plasticité spatiale/temporelle)

6 les parois végétales sont des structures compactes composées d assortiments de polysaccharides complexes Réseau squelettique cristallin (cellulose-hémicelluloses) dictoylédones Somerville et al. (2004) Science 306, 2206

7 les parois végétales sont des structures compactes composées d assortiments de polysaccharides complexes Réseau squelettique cristallin (cellulose-hémicelluloses) + polysaccharides matriciels (pectines) dictoylédones Somerville et al. (2004) Science 306, 2206

8 les parois végétales sont des structures compactes composées d assortiments de polysaccharides complexes Réseau squelettique cristallin (cellulose-hémicelluloses) + polysaccharides matriciels (alginates/fucanes) algues brunes Deniaud-Bouët et al. (2014) Annals of Botany, in press

9 Pourquoides anticorps? La plupart des connaissances dérivent de méthodes biochimiques, utilisant des polysaccharides purifiés ou des parois fractionnées sur plantes entières: perte de l information spatiale et de développement connaissance limitée des configurations in situ Quels sont les polymères présents? En quelles quantités relatives? Comment sont-ils organisés les uns par rapport aux autres? Quelles variations physiologiques? architectures pariétales & dynamiques sondes moléculaires pour des analyses in situ

10 Qu est-ce qu un anticorps? chaîne légère chaîne lourde région constante région variable antigène épitopes antisérum

11 Sérum d anticorps polyclonaux Facile à obtenir à partir d un échantillon sanguin Si l antigène est pur, possible d obtenir un volume suffisant d antisérum à titre élevé et à forte affinité Contient des anticorps dirigés contre toute une série d épitopes Pas 2 animaux identiques Quantités limitées

12 Immunogènes Les protéines sont directement immunogènes Les glycanesdonnent une faible réponse immunitaire Les oligosaccharides sont conjuguésà une protéine (BSA, KLH) avant injection

13 chaque lymphocyte secrète un type d anticorps, à spécificité unique cellule 1 cellule 2 cellule 3

14 Anticorps monoclonaux Technologie de l hybridome Les lignées cellulaires secrétant les anticorps de spécificités appropriées sont immortalisées rate source de lymphocytes généralement rongeurs (rats, souris) myélome lignées cellulaires immortelles Quantités illimitées Spécificité définie

15 Schéma général de production cellules B FUSION culture cellulaire de myélome criblage des puits donnant une réponse positive sélection clonale des lignées propagation des lignées sélectionnées anticorps à spécificité unique (un épitope) dans le surnageant hybridomal

16 Sélection des hybridomes (1) les cellules myélomateusessont immortelles mais ne synthétisent leurs nucléotides que par la voie de novo car elles sont HPRT-(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, i.e. voie de sauvetage) génie génétique sélection sur milieu HAT (hypoxanthine, aminopterine, thymidine) : l aminoptérinebloque la synthèse de novo, l hypoxanthine et la thymidine sont les substrats de la voie de sauvetage

17 Sélection des hybridomes (2) seules les cellules fusionnées pourront survivre : les lymphocytes apportent la HPRT et les cellules du myélome la capacité à proliférer hybridomes les cellules B non fusionnées et les cellules du myélome (sur milieu HAT) sont éliminées

18 Anticorps monoclonaux Reconnaitun épitope correspond à une région du polymère cible Connaissance a priori de la structure de l épitopeet de l antigène Difficile dans le cas de polymères où la connaissance structurale est limitée (cf. algues) Une caractérisationaprès coup est possible, à l aide d haptènes, d enzymes, etc.

19 BioSupplies Abs, Australia Centres de ressources CCRC-Mx Georgia, USA JIMx( ) John Innes, UK LMx(1991-onwards) Leeds, UK BAMx(in progress) Leeds, UK Brown Algae

20 anti-pectines EX. d anticorps monoclonaux LM8 xylogalacturonan JIM5 partially Me-esterified HG JIM7 partially Me-esterified HG LM5 (1 4)-b-D-galactan PAM1 blockwise de-esterified HG LM6 (1 5)-a-L-arabinan LM7 non-blockwise de-esterified HG LM13 (1 5)-a-L-arabinan 2F4 unesterieid, calcium cross-linked HG CCRC-M2 RGI

21 Sous-structure pectique (LM7) homogalacturonan partiellement Me-esterifié pea stem Willats et al. (2001) J. Biol. Chem.; Clausen et al. (2003) Carbohdr. Res.

22 LM10 anti-xylanes LM11 LM10 LM11 LM11

23 Caractérisation des anticorps (1) principe de l ELISA (enzyme-linkedimmunosorbentassay) -dosage immuno-enzymatique S P HRP HRP lavages lavages lavages fixation de l antigène reconnaissance par l Ac spécifique liaison du conjugué révélation

24 Caractérisation des anticorps (2) 1. déterminer la dilution appropriée en anticorps 2. déterminer les haptènes compétiteurs (ELISA compétitif) 100 % 100 % 0 % fraction liée 0 % 90 % du maximum de fixation concentration en anticorps fraction liée 0 % 50 % concentration en haptène inhibition de la fixation de l anticorps 100 % concentration en anticorps à utiliser IC 50

25 LM15, a rat monoclonal antibody directed to the XXXG oligosaccharide of xyloglucan developed from a XXXG-BSA neoglycoprotein (Marcus S., VerhertbruggenY., HervéC. et al. 2008, BMC Plant Biol8: 60) XXXG

26 forêt tropicale forêt de Laminaires La dégradation de la biomasse végétale par les microorganismes est une étape clé dans le recyclage de la matière carbonée évolution de protéines reconnaissant les polysaccharides de paroi Carbohydrate-bindingmodules (CBMs)

27 Glycosylhydrolases microbiennes Structure modulaire : module catalytique module(s) de fixation des polysaccharides : CBMs carbohydrate binding module module catalytique et CBM associé ont généralement la même spécificité Cellulose et autres polysaccharides de paroi le CBM dirige l enzyme à proximité de son substrat et la maintien en contact prolongé avec celui-ci

28 domaine catalytique séquence de liaison Carbohydrate Binding Module (CBM) Himmel et al., Cellulase Animation, NREL (2000).

29 classés en 68 familles suivant une base de similitude de séquence protéique cellulose, xylane, mannane, glucomannane, β-1,3-glucanes (callose, laminarine), β-1,3-1,4-glucanes (MLG, lichenane), xyloglucanes, galactanes, chitine, amidon, agar, etc.

30 Utilisation des CBMsen tant que sondes moléculaires les CBMs sont produits de façon recombinante, avec une étiquette permettant leur (purification et) immunodétection S P utilisation analogue aux anticorps monoclonaux : test immuno-enzymatique (ELISA, etc.) microscopie (localisation des ligands in planta) CBM HRP ex. His-tag

31 Anticorps monoclonaux spécificité connue quantité illimitée immunisation animale CBMs protéine recombinante reconnaissance différentielle in situ couverture polysaccharidique

32 2 Utilisation des sondes sur matériel végétal

33 La détection des antigènes d intérêt par l utilisation des sondes (anticorps/cbm) nécessite l emploi d un système de révélation tests immuno-enzymatiques = enzymes telles que peroxydase et phosphatase alcaline microscopie à fluorescence = fluorochromestels que FITC, Alexafluors microscopie électronique = particules d or Dans la majorité des cas un protocole d immunomarquage indirect est utilisé

34 Immunohistochimie indirecte incubation avec un anticorps primaire/cbmcontre l antigène d intérêt puis incubation avec un anticorps secondairequi reconnait la région constante de l anticorps primaire (étiquette dans le cas d un CBM), couplé au traceur Ce système est très versatile : combinaisons multiples pour un même AcI+ nombreux AcII disponibles commercialement

35 Des témoins doivent toujours être réalisés lors d un protocole d immunomarquage Un CONTRÔLE NEGATIFpeut inclure un anticorps primaire qui ne reconnait pas le matériel d étude où, plus simplement, omettre l anticorps primaire Un contrôle positifest un anticorps primaire qui reconnait le matériel d étude ; il peut être utile dans la phase initiale d immunohistochimie sur des antigènes encore non étudiés

36 Préparation pour la microscopie La littérature sur la préparation des échantillons pour la microscopie (fixation/inclusion/coupes) est très abondante. Le choix dépend du but recherché. fixation coupes immunomarquages

37 Fixer =rester le plus proche possible de l état vivant, stabiliser l ultrastructure et protéger des dommages aldéhydes fréquemment utilisés attention aux conditions physicochimiques, notamment équilibre osmotique plante ~300 mosm, algue marine ~1100 mosm échantillons aussi petits que possibles <2x2x2 mm plusieurs types d inclusion/coupessuivant la résolution souhaitée (à la main, inclusion en paraffine/résine LR-white, etc.) -plus elle est importante, plus le temps de préparation sera long

38 Immunomarquage le matériel doit fermement adhérer à la lame : certains réactifs tels que la poly-l-lysineet le Vectabond améliorent l adhérence des immunomarquagesen tubes eppendorfsont également possibles (coupes à la main, graines, etc.) Le matériel végétal doit toujours resté hydraté l immunomarquagepeut être combiné à des marquages chimiques (ex. anticorps couplé au FITC + calcofluorwhite pour la cellulose) longueurs d onde d émission différentes

39 Microscope à fluorescence 3. ne laisse passer que les longueurs d onde comprises entre 500 et 550 nm, dont le signal fluorescent vert 2. reflète la lumière en dessous de 510 nm et transmet celle au-dessus de 510 nm 1. seule la lumière bleue ayant une longueur d onde comprise entre 450 et 490 nm passe à travers le filtre

40 red channel Asplenium aethiopicum

41 Calcofluor stain Asplenium aethiopicum

42 anti-1,5-arabinan Asplenium aethiopicum

43

44

45 calcofluor(cellulose) LM10 (xylane)

46 fibres phloémiennes vaisseaux xylémiens

47 Les inclusions permettent de réaliser des coupes fines ou semi-fines et offrent une résolution intéressante. Néanmoins les coupes manuelles sont rapides et peuvent permettre un premier criblage. Certains échantillons peuvent même être utilisés entiers.

48 graine d Arabidopsis filaments d Ectocarpus poil absorbant de carotte embryon de Fucus

49 Pour des analyses très fines au niveau cellulaire, la microscopie électronique est requise. Le principe d immunomarquageest identique. L anticorps secondaire est couplé à des particules d or denses aux électrons.

50 cellule 1 JIM5/7 reconnaissent des pectines (HG) ayant différents degrés d estérification espace intercellulaire cellule 3 paroi cellule 2 Knox et al., Planta 181(4):512

51 L observation d échantillons prélevés à différents temps permet de suivre la localisation des polymères au cours du développement lien fonctionnel? 0 24h cellulose M-alginate fucanes sulfatés

52 Un échantillon soumis à des conditions environnementales différentes peut présenter des variations pariétales lien fonctionnel? 1 cm 1 cm 100 % edm fucanes sulfatés 5 % edm fucanes sulfatés

53 Distinguer autofluorescence& fluorescence! certains composés cellulaires peuvent émettre de la fluorescence à des longueurs d onde qui interfèrent avec le fluorochrome le glutaraldéhyde intensifie cet artéfact ce problème est particulièrement marqué chez les algues brunes et rouges le choix préalable du fluorochromeet du mode de détection ne doit pas être négligé

54 Ex. autofluorescencechez les algues rouges filtre d émission >515 nm filtre d émission nm Chondrus Ceramiale

55 Prudence sur l interprétation! le signal observé est-il bien lié au fluorochrome? (témoin négatif pour contrôler l autofluorescence) l absence de détection ne signifie pas forcement absence d épitopes antigène soluble expression transitoire liée au développement épitopenon accessible/masqué par d autres polymères

56 Xyloglucan detection & pectate lyase treatment Marcus S., VerhertbruggenY., Hervé C. et al. 2008, BMC Plant Biol8: 60 e cl cp x ip pp _ cp x LM15 + PL

57 JIM5 pectic HG LM15 xyloglucan C C is

58 pectate lyase/jim5 pectate lyase/lm15 HG-masked xyloglucan

59 JIM5 -pl x JIM5 + pectate + lyase x cl pf cl pf CjCBM15 CjCBM15 cl pf x cl pf x Hervé C., Rogowski A., Gilbert H.J. and Knox J.P 2009, The Plant Journal 58(3):

60 Quantification de l immunofluorescence number of pixels 100% fluorescence intensity + enzyme + enzyme number of pixels 34% fluorescence intensity Hervé C., Rogowski A., Gilbert H.J. and Knox J.P 2009, The Plant Journal 58(3):

61 Autres sondes/utilisations anticorps par phage display, autres protéines recombinantes d origine bactérienne (SusD), évolution dirigée de modules d intérêt (ex. aptamèrespar SELEX), enzymes modifiées, etc. ces sondes moléculaires sont également des outils performants pour détecter des épitopesdans des mélanges complexes glycoarrays(compp) Epitope Detection Chromatography(EDC)

62 Pour aller plus loin protocoles : HervéC., Marcus S.E. and Knox J.P. (2011) Monoclonal antibodies, carbohydrate-binding modules, and the detection of polysaccharides in plant cell walls. Methods Mol Biol, 715, évolutionet diversitédes paroisde planteset macroalgues: Popper Z.A., Michel G., HervéC., DomozychD.S., WillatsW.G.T., TuohyM.G., KloaregB. and Stengel D.B. (2011) Evolution and diversity of plant cell walls: from algae to flowering plants. Annual Review of Plant Biology, 62, les sondespariétales(trèsexhaustifavec production, utilisation, articles scientifiques) : sites de J. P. Knox avec et Most of my talk s content has been inspired by Paul s lectures, so thanks Paul My cecile.herve@sb-roscoff.fr