Transfert d électrons et oxydations phosphorylantes en un clin d œil

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1 Transfert d électrons et oxydations phosphorylantes en un clin d œil - Dans chaque cellule se déroulent des centaines de réactions chimiques, qui constituent le métabolisme. Les composés chimiques impliqués sont appelés métabolites. - Pratiquement toutes ces transformations ne se dérouleraient que très lentement en dehors de la cellule et de plus dans toutes les directions. Des successions ordonnées de réactions chimiques avec une vitesse élevée (= voies métaboliques), ne sont possibles que grâce à l existence d enzymes spécifiques. A. Vue d ensemble sur le métabolisme intermédiaire - La plupart des cellules et des organismes ont en commun un ensemble de voies métaboliques centrales. - Ces voies qui servent à la synthèse, la dégradation et la transformation de métabolites importants ainsi qu à la conservation de l énergie, forment le métabolisme intermédiaire, dont nous allons examiner ici un schéma simplifié.

2 - Pour vivre, les cellules ont besoin en permanence de matières organiques et inorganiques ainsi que d énergie chimique, qu elles tirent essentiellement de l ATP. - Selon la façon dont ces besoins seront couverts, on distingue les organismes autotrophes ou hétérotrophes: Les espèces autotrophes (végétaux et nombreux micro-organismes), peuvent synthétiser des molécules organiques à partir de précurseurs inorganiques (CO 2 ). Les espèces hétérotrophes (animaux et champignons), dépendent de l apport de substances organiques par la nourriture. - La plupart des substances nutritives (protéines, sucres, acides nucléiques et lipides) ne peuvent être utilisées directement doivent d abord être dégradées en éléments plus petits par des voies cataboliques (flèches roses, Figure 1). - Les métabolites ainsi formés (= compartiment métabolique) vont: 1) soit aboutir à la formation d énergie après de nouvelles transformation cataboliques 2) soit être de nouveau intégrés dans des molécules complexes par des voies anaboliques (flèches bleues, Figure 1).

3 Le métabolisme intermédiaire Nous n avons représenté ici que des métabolites importants, comme le pyruvate, l acétyl-coa et le glycérol. Ces molécules constituent des liens entre les métabolismes des protéines, des sucres et des lipides. Figure 1

4 Les intermédiaires du cycle de l acide citrique font également partie du «pool» métabolique. Cette voie cyclique a des rôles cataboliques aussi bien qu anaboliques, elle est amphibolique - le cycle de l acide citrique est responsable de la production de CO 2 à partir de l acétyl-coa - le NAD+ est un accepteur d électron et est réduit en la forme NADH B-H 2e - B NAD + NADH (oxydée) (réduite) Figure 2

5 - La forme de réserve de l énergie chimique dans toutes les cellules est l adénosine triphosphate (ATP). - La formation d ATP nécessite l utilisation d énergie, le processus est donc endergonique. -de l énergie sera libérée par la coupure de l ATP en ADP et en phosphate. L hydrolyse de l ATP est exergonique. cette hydrolyse permet, via un couplage énergétique, le déroulement de phénomènes nécessitant de l énergie comme la plupart des voies métaboliques anaboliques ainsi que les phénomènes de transport et de mouvement. - La voie la plus importante de synthèse d ATP est la phosphorylation oxydative (Figure 1). - les voies cataboliques du métabolisme génèrent des cofacteurs réduits (NADH, QH2). Les électrons seront ensuite transportés jusqu à l oxygène. - ce processus fortement exergonique est catalysé par la chaîne respiratoire et utilisé indirectement pour la synthèse d ATP. - plusieurs organismes peuvent, dans des conditions anaérobiques (en absence d oxygène) se rabattre sur l ATP provenant de la glycolyse. Ce mode de formation de l ATP, plus rapide mais moins efficace, est la fermentation

6 Les réactions d oxydo-réduction - les réactions d oxydo-réduction, qui se traduisent par des transferts d électrons, fournissent la plus grande partie de l énergie libre aux organismes Réduction -> gain d électrons NAD + + H + + 2e - NADH le NAD + est un accepteur d électrons ou agent oxydant ou forme oxydée le NADH est un donneur d électrons ou agent réducteur ou forme réduite Oxydation -> perte d électrons H2O ½O 2 + 2H + + 2e - (photosynthèse) - l efficacité thermodynamique du transfert d électron peut être déterminé par les valeurs de potentiel d oxydo-réduction standard (E ) - l affinité d un agent oxydant pour les électrons augmente avec la valeur de son potentiel d oxydo-réduction standard (E ) NAD + + H + + 2e - NADH E = V H 2 O ½O 2 + 2H + + 2e - E = V plus le potentiel d oxydo-réduction standard est positif, plus la forme oxydée a tendance à accepter les électrons et à devenir une forme réduite

7 - de ces deux réactions, c est la réaction O 2 /H 2 O qui a la valeur de E la plus élevée et donc la plus grande affinité pour les électrons - si ces deux réactions sont maintenant couplées en une réaction d oxydo-réduction, c est le NADH qui sera le donneur d électrons et O 2 l accepteur ½O 2 + NADH + H + H 2 O + NAD + la différence de potentiel d oxydo-réduction (ΔE ) de cette réaction est: ΔE = E (l accepteur d électron) - E (donneur d électron) ΔE = (-0.315) = V On peut calculer la variation d énergie libre de cette réaction par l équation: ΔG = -nfδe où n = nombre d électrons transférés par mole de substrat F = constante de Faraday ( C/mol) - pour la réaction ci-haut, le ΔG sera de -218 kj/mol => réaction très exergonique - pour produire 1mol d ATP à partir d ADP et de P i, la quantité d énergie libre requise est de 30,5 kj/mol => la variation d énergie libre de l oxydation du NADH par O 2 est amplement suffisante pour produire plusieurs moles d ATP

8 Respiration et fermentation A. Oxydation aérobique et anaérobique du glucose - En présence d oxygène (conditions aérobies) la plupart des cellules animales sont capables de «respirer», c est-à-dire de dégrader complètement par des processus oxydatifs divers types d aliments (lipides, acides aminés et sucres). - Si l oxygène manque (conditions anaérobies), seul le glucose peut encore servir à la formation d ATP. Bien que la dégradation du glucose dans ces conditions se termine précocement au niveau du lactate, et ne fournisse que de faibles quantités d ATP, elle a une importance considérable pour la survie des cellules en l absence d oxygène.

9 Oxydation aérobique et anaérobique du glucose cytoplasme ATP mitochondrie NAD + NADH Figure 3 total: 32 ATP/glucose total: 2 ATP/glucose

10 Conditions aérobiques (Figure 3 à gauche) - l ATP est obtenu presque exclusivement par phosphorylation oxydative. - les acides gras parviennent dans les mitochondries avec l aide de la carnitine et y seront dégradés par β-oxydation en groupements acétyls liés au coenzyme A. - Le glucose sera transformé en pyruvate dans le cytoplasme par la glycolyse. -le pyruvate sera transporté dans la matrice mitochondriale pour y être décarboxylé de façon oxydative en acétyl-coa par le complexe pyruvate-déshydrogénase. - Les équivalents réducteurs (2 NADH par glucose) apparus durant la glycolyse atteignent la matrice mitochondriale grâce à la navette du malate. - Les groupements acétyls formés seront oxydés en CO 2 dans le cycle de l acide citrique. - La dégradation des acides aminés génère également des groupements acétyls ou des produits qui peuvent s insérer directement dans le cycle de l acide citrique. - Les équivalents réducteurs obtenus seront en cas de besoin transférés à l oxygène via la chaîne respiratoire, ce qui libère de l énergie libre utilisée pour former de l ATP par l intermédiaire d un gradient de protons.

11 Conditions anaérobiques (Figure 3 à droite) - comme l accepteur d électrons de la chaîne respiratoire (l oxygène) manque, le NADH et le QH ne peuvent plus être réoxydés. - Ce n est donc pas seulement la synthèse mitochondriale d ATP qui se bloque mais presque tout le métabolisme de la matrice mitochondriale. - Une des causes majeures de ce phénomène est l élévation de la concentration de NADH, qui inhibe entre autres le cycle de l acide citrique et la pyruvatedéshydrogénase. - La β-oxydation et la navette du malate, qui ont besoin de NAD +, sont également arrêtées. - Comme la dégradation des acides aminés ne peut plus conduire à la formation d énergie, la cellule est complètement dépendante de la formation d ATP via la dégradation du glucose par la glycolyse. - Si ce processus doit se poursuivre continuellement, le NADH formé doit être réoxydé en permanence. Comme ceci ne peut plus s effectuer dans les mitochondries, les cellules animales réduisent le pyruvate en lactate dans des conditions anaérobies et libèrent ce lactate dans le sang. - Ce type de processus est appelé fermentation et leur rendement en ATP est faible : c est ainsi que lors de la formation du lactate on n obtient que 2 ATP par glucose.

12 - Si l on veut évaluer le nombre de molécules d ATP formées dans des conditions aérobiques, il est nécessaire de connaître le quotient P/O, - le rapport molaire entre l ATP formé («P») et l eau formée («O»). - Au cours du transport de deux électrons du NADH à l O 2, on estime aujourd hui que 10 protons seront accumulés dans l espace intermembranaire, tandis qu à partir de l ubiquinone (QH 2 ) il n y en aura que 6. - L ATP-synthase a besoin de trois H + pour la synthèse d un ATP, de sorte que les rapports P/O maximaux possibles sont environ de 3 ou 2. - Cependant, le transport des métabolites dans la matrice mitochondriale et l échange de ATP 4- contre ADP 3- dans l espace intermembranaire utilisent aussi des protons. - donc, les rapports P/O pour l oxydation de NADH et du QH 2 sont plutôt de l ordre de 2,5 ou 1,5 selon le cas. - Si l on évalue le bilan énergétique de la glycolyse aérobie sur la base de ces données, on aboutit à un rendement de 32 ATP par glucose (certains livres rapportent des rapports P/O de 3 pour le NADH et 2 pour le QH 2, ce qui donne un rendement de 38 ATP par glucose)

13 Mitochondries : organisation et rôles (Chapitre 20, Voet et Voet) 1. Organisation des mitochondries (Figure 4) - Les mitochondries sont des organites de la taille d une bactérie (taille d environ 1 x 2 μm), présents en grand nombre dans pratiquement toutes les cellules eucaryotes. - il en existe à peu près 2,000 par cellule et occupent jusqu à 25% du volume d une cellule. - les mitochondries sont bordées par deux membranes: -une membrane externe lisse -une membrane interne plissée qui présente donc une surface importante et traverse l espace matriciel. Les replis de la membrane interne s appellent des crêtes. - l espace intermédiaire entre la membrane externe et la membrane interne est désigné le plus souvent sous le terme d espace inter membranaire. - les tissus ayant un métabolisme oxydatif intense comme par exemple le muscle cardiaque possèdent des mitochondries contenant de nombreuses crêtes.

14 Figure 4

15 Les membranes mitochondriales contiennent des protéines intégrales. - Dans la membrane externe, sont présentes: - des porines, formant des pores qui rendent la membrane perméable aux molécules de taille inférieure à 10 kda ainsi permettant l échange de ces molécules entre le cytoplasme et l espace intermembranaire. - La membrane interne des mitochondries est au contraire imperméable à la plupart des molécules (à l exceptions de l O 2, CO 2, et H 2 O). - elle contient des cardiolipines, un type de phospholipide particulier. - parmi les protéines de la membrane interne, on va trouver des transporteurs spécifiques qui permettent un transport contrôlé de substances, des enzymes et d autres composants de la chaîne respiratoire ainsi que l ATP-synthase. - La matrice est également riche en protéines, et en particulier en enzymes du cycle de l acide citrique.

16 2. Rôles métaboliques (Figure 5) - Les mitochondries sont appelées les «usines biochimiques» de la cellule car elles génèrent au cours de la dégradation oxydative des substances alimentaires via la phosphorylation oxydative la majeure partie de l ATP. - dans la matrice sont localisé la pyruvate déshydrogénase (transformation du pyruvate en acétyl-coa), les enzymes du cycle de l acide citrique, de la dégradation des acides gras par β-oxydation, et d une partie du cycle de l urée. - la chaîne respiratoire couplée à la synthèse d ATP (dont l ensemble est désigné sous le nom de phosphorylation oxydative) ainsi que les enzymes de la biosynthèse des hèmes sont associées à la membrane interne. - les mitochondries fournissent aux cellules les produits intermédiaires de leur métabolisme et constituent une réserve de calcium qui maintient la concentration cytoplasmique à une valeur constante faible (~ 1 μm).

17 Figure 5

18 Formation d un gradient de protons - la membrane interne joue un rôle important dans la phosphorylation oxydative : comme elle est imperméable aux protons, la chaîne respiratoire (complexes I, III et IV à la Figure 6), qui pompe des protons dans la matrice et les accumulent dans l espace intermembranaire, va générer au niveau de cette membrane interne un gradient de protons. - Ce gradient permet de conserver l énergie chimique libérée par l oxydation du NADH. L ATP-synthase (complexe V à la Figure 6) utilise ensuite l énergie accumulée dans ce gradient pour former de l ATP à partir d ADP et de phosphate inorganique. Figure 6

19 RÔLES - point d entrée des électrons du NADH -pompe àh + -introduit les électrons du FADH 2 dans la chaîne - pompe à H + -pompe àh + -réduction de l oxygène - synthèse d ATP Figure 7

20 La chaîne de transport des électrons: aspects thermodynamiques -le transfert d électrons s effectue vers l agent oxydant avec le potentiel d oxydo-réduction (E ) le plus élevé - le transfert d électrons entre les complexes s accompagne d une variation d énergie libre (ΔG ) favorable qui sera utilisée pour pomper des protons (H + ) dans l espace intermembranaire Figure 8

21 Figure 9

22 Récapitulation :: Rôles métaboliques des des mitochondries Les Les mitochondries sont sont appelées les les «usines biochimiques» de de la la cellule car car elles elles produisent la la majeure partie de de l ATP, au au cours cours de de la la dégradation oxydative des des substances alimentaires. Les Les processus suivants se se déroulent dans dans les les mitochondries :: transformation du du pyruvate en en acétyl-coa, cycle cycle de de l acide citrique, chaîne respiratoire couplée à la la synthèse d ATP (dont (dont l ensemble est est désigné sous sous le le nom nom de de phosphorylation oxydative), dégradation des des acides gras gras par par β-oxydation et et une une partie du du cycle cycle de de l urée. l urée. La La tâche tâche fondamentale des des mitochondries est est de de prélever dans dans le le cytoplasme les les substrats du du métabolisme énergétique (acides gras, gras, pyruvate, squelette carboné des des acides aminés) et et de de réaliser une une dégradation oxydative de de ces ces substances en en CO CO 2 2 et et H 2 O 2 en en échange d ATP. Les Les réactions du du cycle cycle de de l acide citrique qui qui se se déroulent principalement dans dans la la matrice fournissent du du carbone complètement oxydé (CO (CO 2 ) 2 ) et et des des équivalents réducteurs liés liés à des des coenzymes (NADH et et QH2).

23 Récapitulation :: La La chaîne respiratoire La La chaîne respiratoire qui qui réoxyde les les coenzymes est est localisée dans dans la la membrane interne des des mitochondries. Elle nécessite comme agents réducteurs (fournissant des des électrons) du du NADH et et du du FADH 2 liés 2 liés à un un enzyme pour pour réduire l oxygène et et former l H l H 2 O. 2 O. Cette réaction fortement exergonique est est divisée en en plusieurs étapes et et couplée avec avec le le transport de de protons (H (H + + ), ), depuis la la matrice jusqu à l espace intramembranaire à travers la la membrane interne des des mitochondries. Il Il se se forme ainsi ainsi de de part part et et d autre de de la la membrane interne un un gradient électrochimique. Les Les mitochondries utilisent ces ces gradients pour pour la la synthèse d ATP à partir d ADP et et de de P i, i, catalysée par par l ATP-synthase; par par ailleurs, certains systèmes de de transport spécifique seront stimulés.

24 Études expérimentales de la chaîne de transport des électrons - l élucidation de la séquence des transporteurs de la chaîne de transport d électrons est due, pour une large part, à l utilisation d inhibiteurs spécifiques de composantes de cette chaîne: - la roténone (une toxine végétale) - l amytal (un barbiturique) - l antimycine A (un antibiotique) - le cyanure - ces inhibiteurs bloquent le transport des électrons le long de la chaîne (Figure 11) - l activité de la chaîne de transfert d électrons peut être mesurée grâce à sa vitesse de consommation d oxygène - utilise une électrode à oxygène pour mesurer la concentration en O 2 => Figure 10

25 Sites d interaction des inhibiteurs dans la chaîne de transport des électrons Figure 11

26 Figure 12 Tracé théorique obtenu par l électrode à l oxygène plongée dans une suspension de mitochondries en présence d un excès d ADP et Pi. Aux points numérotés, les réactifs indiqués sont injectés dans la suspension et les variations de [O 2 ] sont enregistrées. Les chiffres (1 à 6) correspondent à ce qui est écrit dans le texte des pages suivantes

27 Les expériences suivantes montrent comment les inhibiteurs indiqués ci hauts ont été utilisés: Une solution tampon contenant de l ADP et du P i en excès est équilibrée dans la cellule réactionnelle d une électrode à oxygène. On fait différentes additions dans la cellule et on enregistre la consommation d O 2 : 1) Des mitochondries et du ß-hydroxybutyrate sont ajoutés dans la cellule. Les mitochondries assurent l oxydation du ß-hydroxybutyrate NAD + -dépendante: Figure 13 Au fur et à mesure que le NADH formé est oxydé par la chaîne de transfert d électrons avec O 2 comme accepteur terminal d électrons, la concentration en O 2 dans le mélange réactionnel diminue.

28 2) L addition de roténone ou d amytal arrête complètement l oxydation du ß- hydroxybutyrate. 3) L addition de succinate, qui s oxyde par l intermédiaire du FAD, rétablit la consommation d O 2. Les électrons du FADH 2 peuvent donc réduire l oxygène en présence de roténone ; cela signifie que les électrons du FADH 2 entrent dans la chaîne de transfert d électrons après le site d inhibition de la roténone. 4) L addition d antimycine A inhibe le transfert d électrons provenant du FADH 2. 5) Bien que le NADH et le FADH 2 soient les donneurs d électrons physiologiques de la chaîne respiratoire, on peut utiliser aussi des donneurs d électrons artificiels pour explorer le cheminement des électrons. Le tétraméthyl-p-phénylène-diamine (TMPD) est un transporteur d électrons réduit par l ascorbate et qui transfère ses électrons directement au cytochrome c.

29 HO N N + HO O O Tétraméthyl-p-phénylènediamine (TMPD), forme oxydée HO OH Acide ascorbique HO NH NH + HO O O Figure 14 TMPD, forme réduit O O Acide déhydroascorbique L addition de TMPD et d ascorbate au mélange réactionnel inhibé par l antimycine fait repartir la consommation d oxygène ; il y a donc un troisième point d entrée pour les électrons dans la chaîne de transfert d électrons. 6) L addition de cyanure inhibe complètement l oxydation des trois donneurs d électrons, ce qui indique qu il bloque la chaîne de transfert d électrons après le troisième point d entrée des électrons.

30 Cl DPIP Na O N O Bleu Cl Cl 2e - + 2H + DPIPH 2 Na O N OH Incolore H Cl Dans votre expérience portant sur la chaîne respiratoire de la mitochondrie, l utilisation du colorant DPIP permet l étude du fonctionnement de la chaîne de transport d électrons et déduire les sites d interaction du DPIP et du DPIPH 2 Figure 15