SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE

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1 SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE 1/8 DS n 7 Épreuve de biologie 23 avril 2015 Durée : 2 heures Les calculatrices programmables et alphanumériques sont autorisées. L usage de tout ouvrage de référence et de tout document est strictement interdit. Les candidats doivent respecter les notations de l énoncé et préciser, dans chaque cas, la numérotation de la question posée. Une grande attention sera apportée à la clarté de la rédaction et à la présentation des différents schémas. Il n est pas nécessaire de rédiger une introduction et une conclusion. Les documents peuvent être découpés et collés sur la copie à condition d être légendés, commentés ou exploités. THÈME 1 QUELQUES ASPECTS DU MÉTABOLISME DES LEVURES : LA FERMENTATION D après sujet de G2E 2010 Des levures (Saccharomyces cerevisiæ) sont mises en suspension dans un tampon phosphate de ph = 6,2 et on fait buller du N2 dans la suspension afin d en éliminer le maximum d O2. Puis on transfère 4 ml de cette suspension dans une enceinte de mesure dans laquelle plonge une sonde à éthanol reliée à un système informatique d acquisition de données. Cette sonde a été préalablement étalonnée avec des solutions d éthanol de concentration connue (document 1a). 1a - Schéma du montage expérimental permettant le suivi de la fermentation alcoolique des levures

2 2/8 À l aide de la seringue d injection, on ajoute dans l enceinte de mesure une solution de glucose à 1 mmol.l -1 et on suit la production d éthanol au cours du temps. La même expérience est ensuite réalisée avec 4 autres solutions de glucose de concentrations croissantes. L ensemble des résultats est juxtaposé sur le document 1b. 1b - Résultats expérimentaux du suivi de la fermentation par des levures (Saccharomyces cerevisiae) de 5 concentrations de glucose 1.1. Comparer les 5 graphiques obtenus donnés par le document 3b. Que peut-on déduire de la quasi superposition des courbes Glu 4 et Glu 5? La transformation du glucose se déroule en 2 grandes étapes : - glycolyse : transformation du glucose en 2 pyruvates, produisant 2 ATP et 2 NADH,H + ; - fermentation réduisant le pyruvate en éthanol, en consommant 1 NADH,H + et libérant 1 CO2 par pyruvate. À l aide de la seringue d injection, on ajoute cette fois dans l enceinte de mesure une seule solution de glucose à 100 mmol.l -1 et on suit la production d éthanol au cours du temps. La même expérience est ensuite réalisée successivement avec des solutions à 100 mmol.l -1 de saccharose, maltose, galactose, lactose et enfin amidon. L ensemble des résultats est présenté sur le document 1c. Il faut noter que, malgré tout le soin apporté à la réalisation des solutions et au nettoyage de l enceinte de mesure, des traces des glucides successifs peuvent être encore finalement présentes.

3 3/8 1c - Résultats expérimentaux du suivi de la fermentation par des levures (Saccharomyces cerevisiae) de 6 glucides 1.2. Comparer les graphiques Glu, Sac, Mal, Lac et Amidon obtenus et donnés par le document 1c. Conclure. Le cas du galactose (Gal) est abordé plus loin Quel problème dans l utilisation industrielle de la levure de bière (Saccharomyces cerevisiæ), les résultats obtenus pour le maltose et l amidon mettent-ils en évidence? Comment ce problème peut-il être résolu? À l aide d une bandelette destinée à mesurer la glycémie, on teste la solution de saccharose au cours de l expérience précédente à t = 1, s : le test est positif. Dans un second temps, à la fin de l expérience, cette solution de saccharose est diluée au dixième puis passée sur un filtre ne laissant passer que les éléments dont la taille est inférieure à 1 µm. On ajoute alors au filtrat obtenu 5 ml d une nouvelle solution pure de saccharose ; le tout est placé au bain marie à 30 C pendant 20 minutes puis on teste la solution avec une nouvelle bandelette : le test est de nouveau positif Quelle est l enzyme mise en évidence par ces deux expériences? Quelle réaction catalyse-telle? Cette enzyme (appelée invertase) est-elle cytosolique ou extracellulaire? En déduire l existence ou non d un transporteur membranaire du saccharose? du glucose? du fructose?

4 4/8 À l aide de nouvelles bandelettes destinées à mesurer la glycémie, on teste la solution de maltose au cours de l expérience précédente (document 1c) à t = 1, s : le test est négatif. Dans un second temps, à la fin de l expérience, cette solution de maltose est diluée au dixième puis passée sur un filtre ne laissant passer que les éléments dont la taille est inférieure à 1 µm. On ajoute alors au filtrat obtenu 5 ml d une nouvelle solution pure de maltose ; le tout est placé au bain marie à 30 C pendant 20 minutes puis on teste la solution avec une nouvelle bandelette : le test est de nouveau négatif Quelle enzyme recherche-t-on chez la levure de bière (Saccharomyces cerevisiæ) par ces deux expériences? Quelle réaction catalyse-t-elle? Cette enzyme est-elle cytosolique ou extracellulaire? En déduire l existence ou non d un transporteur membranaire du maltose? Justifier votre réponse Formuler deux hypothèses pour expliquer le graphique Gal obtenu et donné par le document 1c. Des levures (Saccharomyces cerevisiae) sont préalablement cultivées, en suspension dans un tampon phosphate de ph = 6,2, bien agité et aéré, en présence de glucose (milieu A : ajout de glucose à 300 mmol.l -1 ) ou de galactose (milieu B : ajout de galactose à 300 mmol.l -1 ). Après 24 heures, on fait buller du N2 dans la suspension afin d en éliminer le maximum d O2. Puis on transfère 4 ml du milieu A dans l enceinte de mesure utilisée dans les expériences précédentes (document 1a). À l aide de la seringue d injection, on ajoute cette fois dans l enceinte de mesure une solution de galactose à 100 mmol.l -1 et on suit la production d éthanol au cours du temps. La même expérience est ensuite réalisée avec le milieu B. Pour les milieux C et D les protocoles sont identiques, respectivement, au milieu Glu et au milieu Gal, de l expérience du document 1c. L ensemble des résultats est juxtaposé sur le document 1d Comparer les graphiques 1, 2, 3 et 4. Conclure sur le rôle du glucose puis du galactose sur la fermentation du galactose. Préciser les hypothèses faites au 1.6.

5 5/8 1d - Résultats expérimentaux du suivi de la fermentation par des levures (Saccharomyces cerevisiae) du glucose et du galactose THÈME 2 ORIGINE ET SYNTHÈSE DE LA CYTOCHROME OXYDASE La cytochrome oxydase est une protéine impliquée dans la chaîne respiratoire de transporteurs d électrons de la mitochondrie. Les différentes expériences vont permettre de préciser sa structure et sa synthèse. Expérience 1 Une culture de levures en croissance est divisée en trois lots : - le lot T reçoit un mélange d acides aminés tritiés. - le lot A reçoit simultanément des acides aminés tritiés et du chloramphénicol (CAP), antibiotique qui inhibe sélectivement la traduction sur les ribosomes de type 70S (bactériens, mitochondriaux et chloroplastiques). - le lot B reçoit simultanément des acides aminés tritiés et de la cycloheximide (CHI) antibiotique qui inhibe sélectivement la traduction sur les ribosomes de type 80S (cytoplasmiques). Après deux jours d incubation, chacun de ces lots est divisé en trois fractions.

6 6/8 Étude de la fraction 1 Les levures sont broyées, les mitochondries sont isolées et les membranes mitochondriales sont purifiées et traitées avec un détergent. Les cytochromes oxydases ainsi solubilisées dans chaque lot sont purifiées puis déposées sur un gel de polyacrylamide contenant du dodécylsulfate de sodium (SDS) et un agent réducteur. Après électrophorèse, le gel est coloré avec un colorant des protéines puis autoradiographié. (voir figure 2). Dans une autre électrophorèse effectuée en parallèle pour une analyse plus quantitative, 100 μg de cytochrome oxydase extraite du lot T sont déposés sur un gel. Après migration, les différentes bandes révélées par coloration sont découpées et leur contenu en μg de protéines est déterminé. Les résultats sont portés en vis-à-vis de chaque bande sur la figure 1. Figure Déterminez la structure de la cytochrome oxydase, en précisant la proportion relative de ses sous unités constitutives, sachant que la masse moléculaire du complexe est de 175 kda. 1 Da = 1 g.mole Dans quels compartiments cellulaires les différentes sous-unités de la cytochrome oxydase sont elles synthétisées? 2.3. Quelle est la localisation probable de l information génétique nécessaire à la synthèse de ces différentes sous-unités? 2.4. Quelle hypothèse pouvez vous formuler concernant le devenir des polypeptides 4 à 9 après leur synthèse?

7 7/8 Étude des fractions 2 et 3 Les fractions 2 et 3 sont utilisées pour vérifier les hypothèses que vous venez de formuler. - Fraction 2 : les cellules sont préparées pour l analyse en microscopie électronique. Les coupes sont autoradiographiées et examinées. - Fraction 3 : l activité enzymatique de la cytochrome oxydase est dosée dans des broyats cellulaires. Les résultats obtenus sur les fractions 2 et 3 sont résumés dans le tableau 1. Autoradiographie des cellules Cytosol Mitochondries Activité de la cytochrome oxydase Lot T xxxx xxxx ++++ Lot A (+ CAP) xxxx xx + Lot B (+ CHI) -- x + x : présence de grains d argent -- : absence de grains d argent + : activité de l enzyme par µg de protéines totales présentes dans le broyat CAP = chloramphénicol et CHI = cycloheximide Tableau I 2.5. La présence de grains d argent au niveau des mitochondries du lot A traité par le chloramphénicol peut paraître paradoxale. Pouvez vous l expliquer avec l hypothèse formulée précédemment? 2.6. Expliquez la conséquence du traitement par la CHI dans le lot B? 2.7. Quelle information principale apportent les mesures d activité de l enzyme? NB : le temps d incubation de cellules en présence de ces antibiotiques est long (deux jours) et la croissance des cultures dans ces conditions est très ralentie voire arrêtée. THÈME 3 CYTOCHROME ET CHAÎNE RESPIRATOIRE DE LA MITOCHONDRIE Tout comme le chloroplaste, la mitochondrie possède une chaîne d oxydo-réduction dans sa membrane interne. Afin d identifier les molécules impliquées dans la chaîne respiratoire mitochondriale, des scientifiques utilisent un spectrophotomètre, ce dernier fait passer une lumière très intense à travers l échantillon étudié puis à travers un prisme qui décompose le spectre du rouge au bleu. Si des molécules de l échantillon absorbent la lumière à des longueurs d onde particulières, des bandes sombres interrompent les couleurs de l arc en ciel.

8 8/8 Des études menées sur des mitochondries de différents tissus et dans différentes conditions expérimentales ont permis de conclure que le diagramme d absorption est dû à trois composants que l on nommera cytochromes a, b et c. (voir figure 1) Quelle est la propriété commune de ces cytochromes? Quelle différence existe entre eux? On compare les bandes d absorption des cytochromes en présence et en absence de dioxygène, accepter final des électrons, en bout de chaîne rédox. On obtient le résultat suivant : Figure Interprétez le résultat, quelle est la forme réduite ou oxydée des cytochromes, à l origine des bandes observées? L introduction de cyanure (KCN) en aérobie donne la bande d absorption suivante. Figure Formulez une hypothèse sur l action du cyanure. L ajout d uréthane (inhibiteur du transport d électrons) donne la bande d absorption suivante (D). En utilisant un cytochrome c seul, la bande d absorption (E) est obtenue. Figure A partir de ces données, déduisez l ordre dans lequel les trois cytochromes transportent les électrons des substrats intracellulaires vers le dioxygène. Jusitfiez votre réponse.