Polytech UEF1. BONCOMPAGNI Éric MCU - Univ. Nice Sophia Antipolis Site WEB : sites.unice.fr/eb. Outils moléculaires pour l analyse des génomes

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1 Polytech UEF1 BONCOMPAGNI Éric MCU - Univ. Nice Sophia Antipolis Site WEB : sites.unice.fr/eb Outils moléculaires pour l analyse des génomes

2 Cloner des séquences d intérêt Le clonage d une séquence But : Disposer à volonté et en quantité d une séquence d ADN d intérêt En la multipliant dans un système bactérien (Escherichia coli) Nécessite un vecteur de clonage qui comporte: 1- Une origine de réplication 2- Un gène de sélection 4- Un site multiple de clonage Exemple de vecteur de clonage MCS du pbluescript SK-

3 Cloner des séquences d intérêt Le clonage d une séquence: Les étapes 1- Digérer l ADN à cloner par une enzyme de restriction adéquate 2- Digérer le vecteur par la même enzyme 4- Mettre en présence le vecteur et fragment à cloner: appariement par complémentarité des bases 5- Ajouter une DNA ligase (referme la molécule d ADN) 6- Transformer une souche d E. coli 7- Sélectionner les bactéries transformées et les isoler Fragment d ADN obtenu facilement par extraction d ADN plasmidique à partir des bactéries transformée

4 Cloner des séquences d intérêt Le clonage d une séquence: la technologie GATEWAY Issue des connaissances acquises sur le processus d intégration du phage Lambda dans le chromosome d E. coli

5 Cloner des séquences d intérêt Le clonage d une séquence: la technologie GATEWAY

6 Cloner des séquences d intérêt Le clonage d une séquence: la technologie GATEWAY Permet de s affranchit : 1- des enzymes de restriction 2- des faibles efficacités de clonage 3- élimine les problèmes de site internes d enzymes 4- contre sélection des clones vides : ccdb 5- multiples vecteurs de destination Inconvénients : 1- Les sites Att de recombinaison s intercalent entre les fragments clones: acides aminés supplémentaires en cas de fusions traductionnelles 2- Technologie brevetée: chère

7 Cloner des séquences d intérêt Le clonage d une séquence: la technologie GOLDEN GATE Basé sur l utilisation d enzymes de restriction dont le site de coupure est distant du site de reconnaissance Ex BsaI (NB site non palindromique). La coupure se fait indépendamment de la séquence bordant le site de restriction. On génère des extrémités cohésives qui peuvent être liguées entre elles.

8 Cloner des séquences d intérêt Avantage: 1- Site non palindromique: clonage orienté 2- Pas de persistance de longue séquence (type bordures Att de Gateway) 3- Réaction de digestion et de ligation dans un seul tube 4- En théorie cumulable à l infini. On peut cloner plusieurs fragments en une fois. 5- L ensemble tant vers la construction finale puisque le site de restrction est perdu. 6- Programme J5 aide au design de la stratégie : Inconvénients: 1- Retour à l utilisation de ligase (enzyme sensible) 2- Les fragments à cloner ne doivent pas contenir de site BsaI

9 Cloner des séquences d intérêt Actuellement : CrispR/Cas9 05/10/2016 9

10 Cloner des séquences d intérêt 05/10/

11 Isoler des gènes d intérêt Banques d ADN génomique Intérêt: disposer de clones correspondant à la totalité du génome d une espèce Méthodologie identique au clonage d un seul fragment mais digestion d ADN génomique total sélection de la taille des fragments récupération d un grand nombre de clone pour avoir toutes les régions du génome

12 Isoler des gènes d intérêt Banques d ADN génomique Taille des génomes en pb / génome haploïde Bactéries Champignons Plantes Insectes Amphibiens Oiseaux Mammifères Diapo A. Attard

13 Isoler des gènes d intérêt Banques d ADN génomique Vecteurs de type BAC (Bacterial Artificial Chromosome) Dérivé du facteur F d E. coli (conjugaison) 1 copie par cellule (stabilité) Maintient des fragments de taille jusqu à 200kb ici SacBII: contre-sélection des plasmides vides

14 Isoler des gènes d intérêt Banques d ADN génomique Vecteurs de type YAC (Yeats Artificial Chromosome) Contiennent télomères et centromères Maintient des fragments de taille jusqu à 500kb

15 Isoler des gènes d intérêt Banques d ADNc Intérêt: disposer de clones correspondant à la totalité des gènes exprimés dans un tissus donné 1- Reverse transcription des ARNm, 2- Synthèse brin complémentaire 3- Clonage (idem banque génomique)

16 Isoler des gènes d intérêt Criblage de banques (génomique ou ADNc) Intérêt: recherche un clone génomique ou un ADNc correspondant à un gène étudié 1- ADN des clones (tous) déposé sur membrane de nylon soit ADN directement soit bactéries Les clones sont ordonnés et leur position est connue 2- Marquage d une sonde correspondant au gène recherché 3- Hybridation de la sonde sur la membrane 4- Détection du signal d hybridation (autoradiographie) 5- les clones détectés peuvent être cultivés et donnent accès à la séquence recherchée.

17 Isoler des gènes d intérêt Criblage différentiel de banques ADNc Intérêt: identifier des gènes différentiellement exprimés dans un tissu donné 1- ADN des clones ADNc déposé sur membranes de nylon Les clones sont ordonnés et leur position est connue 2- Marquage de sondes à partir d ARNm issus des stades à comparer 3- Hybridation de chaque sonde sur un jeu de membranes 4- Détection du signal d hybridation (autoradiographie) 5- Comparaison des résultats d hybridation 6- Les clones détectés dans une condition et pas l autre sont différentiellement exprimés.

18 Application Production hétérologue de protéines d intérêt Intérêt: obtenir en grande quantité une protéine présentant un intérêt fondamental/industriel Utilise des vecteurs de clonage qui comporte: 1- Une origine de réplication 2- Un gène de sélection 4- Un site multiple de clonage kan sequence f1 origin T7 terminator His tag pet-28a(+)/5g2-peptide signal 6404 bp ORF-5G2-peptide signal T7 tag thrombin His tag T7 promoter lac operator Mais aussi 5- Un promoteur inductible (Lac) ColE1 pbr322 origin lac I 6- Des séquences codant pour des peptides facilitant la purification (Tags) NB: respecter le cadre de lecture lors du clonage!!! ex: production d une protéine à activité cellulosique

19 Polytech UEF1 Structure et évolution des génomes