Préparation des échantillons biologiques. Préparation des échantillons biologiques pour l'analyse

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1 Une fois les échantillons reçus par le laboratoire de toxicologie, ils doivent être rapidement analysés, mais dans le cas échéant, tous les milieux biologiques doivent être conservés entre +2 et 8 C, jusqu à leur analyse car beaucoup de substances et leurs métabolites sont instables dans les milieux biologiques à température ambiante et en présence de lumière. Le plasma ou le sérum doivent être séparés du sang dès que possible car le contact prolongé avec les cellules sanguines provoque des modifications dues à l activité enzymatique et/ou aux phénomènes de redistribution. Enfin, si des implications médico-légales sont à prévoir (par exemple s il n est pas établi clairement comment le poison a été administré, ou en cas de décès du patient), tout échantillon restant devra être conservé, de préférence à -20 C jusqu à la conclusion de l enquête. Du fluorure de sodium à 2 %, w/v peut être ajouté pour inhiber les microorganismes et quelques enzymes de dégradation. Sommaire 1 Préparation des échantillons biologiques 2 Techniques de prétraitement des échantillons biologiques Hydrolyse chimique 2.3 Hydrolyse enzymatique 2.4 Précipitation des protéines Préparation des échantillons biologiques Les divers échantillons biologiques confiés aux laboratoires de toxicologies sont des matrices très complexes et dans la majorité des cas la détermination actuelle des xenobiotiques dans ces milieux ne peut être réalisée directement même avec les technologies les plus sophistiquées. Le traitement pré-analytique des échantillons est très certainement l étape la plus importante du screening toxicologique et son impact sur la qualité de l analyse est majeur. (Zhang,2011) On peut résumer l intérêt de la préparation des échantillons à rendre compatible l analyte Analytical Toxicology - Préparation des échantillons biologiques pour l'analyse 1

2 avec le système (ou procédure) analytique à travers : La solubilisation ou l homogénéisation de l échantillon Elimination des résidus insolubles par filtration ou centrifugation Diminution des interférences Rupture des liaisons protéiques Concentration ou dilution de l analyte (selon la sensibilité de la méthode) Stabilisation ou derivatisation de l analyte pour améliorer son extraction et/ou sa détection chromatographique Addition d un étalon interne (Flanagan,2007) Ces dernières années, et parallèlement à l amélioration des performances des outils analytiques, les procédures de traitement d échantillon ont considérablement évoluées et les nombreux efforts réalisés pour l optimisation de cette étape, ont essentiellement portés sur : La diminution des quantités de matrices utilisées afin de réaliser un maximum d analyse sur un même échantillon, particulièrement intéressant lorsque les quantités de prélèvements sont réduites l amélioration de la sensibilité par l utilisation de procédures d extraction et de concentration plus spécifiques l adaptation à l urgence par exemple en mettant en place de procédure de préparation d échantillons «on line» la simplification des méthodes pouvant passer par l uniformisation des méthodes de préparation, quelle que soit la matrice l automatisation de la préparation d échantillons ayant pour objectifs d améliorer le rendement et de diminuer les erreurs manuelles. (Kintz,2012) Le mode de traitement dépend étroitement du milieu disponible et de sa complexité, de la nature du xenobiotique suspecté mais aussi de la technique utilisée pour le screening. Les principales techniques de préparation des échantillons biologiques sont : Les techniques de prétraitement : Précipitation des protéines Analytical Toxicology - Préparation des échantillons biologiques pour l'analyse 2

3 Les techniques d extraction : Extraction liquide-liquide (LLE) Extraction en phase solide Micro-extraction en phase solide La dérivatisation Techniques de prétraitement des échantillons biologiques Ces techniques regroupent l ensemble des techniques réalisées avant l analyse ou avant une technique d extraction comme l homogénéisation, la dilution, la centrifugation, l hydrolyse des conjugués ou la précipitation des protéines. Les métabolites β-glucuroconjugués et sulfoconjugués des xenobiotiques sont des dérivés très stables dont la présence peut gêner l analyse. Leur hydrolyse rend disponible les fractions libre des molécules parents ou celles issues du métabolisme de phase I pour une meilleur identification. Le clivage des conjugués concerne surtout les urines et peut être effectué par hydrolyse chimique rapide ou enzymatique douce mais lente. Hydrolyse chimique Hydrolyse chimique acide : Obtenue par incubation à 100 C en présence d un acide fort, en général de l HCl 37 %, pendant 15 minutes (Kintz,2012). Hydrolyse alcaline : n est utile que pour le clivage des ester conjugués. (Maurer,2010) L hydrolyse chimique acide est la plus utilisée et le mieux adaptée à l urgence car elle permet un clivage rapide avec un recouvrement élevé. Néanmoins, elle présente comme principal inconvénient le risque de dégradation de l échantillon et notamment les molécules sensibles aux conditions extrêmes de ph (Benzodiazépines, dérivés opiacés..). De plus la formation de certains artefacts doit être prise en considération (Maurer,2010) Analytical Toxicology - Préparation des échantillons biologiques pour l'analyse 3

4 Hydrolyse enzymatique Elle consiste à laisser en contact les urines avec une enzyme, dans des conditions de ph et de température bien précises. Les enzymes les plus utilisées sont la β-glucuronidase d E.coli ou d Helix pomatia, parfois combinées avec une arylsulfatase. L incubation peut durer une nuit à 37 C ou 90 minutes à 50 C. Bien que plus longue et plus couteuse, l hydrolyse enzymatique est préférable à l hydrolyse chimique car elle permet d obtenir des extraits plus propres avec un minimum d interférences et une meilleure stabilité des analytes d intérêt. Il faut savoir que les β-glucuronidases sont spécifiques aux D-glucuronides. Cependant, certains glucuronides subissent des réarrangements dans leur structure durant l incubation, ce qui les rend résistants à l action des β-glucuronidases (Zhang,2007). C est le cas de certains dérivés conjugués tels que les acyl-glucuronides des AINS (Maurer,2010). L intérêt et la nécessite de l hydrolyse dépend étroitement des techniques utilisées : Réactions colorées : l hydrolyse acide est nécessaire pour l identification colorée de certaines molécules telles que le paracétamol et les benzodiazépines. Analyse par GCMS : l hydrolyse des conjugués est nécessaire avant extraction car ces derniers ne peuvent être analysés par GCMS du fait de leur poids moléculaire et leur polarité trop élevés (Polettini,1999) Analyse par HPLC : ne nécessite pas d hydrolyse car les conjugués intactes peuvent être analysés par cette technique. (Polettini, 1999) Analyse par LCMS : une hydrolyse, surtout enzymatique, est nécessaire dans presque toutes les procédures de screening dans les urines par LC-MS(/MS) (Maurer,2010) Précipitation des protéines Méthode conventionnelle de traitement d échantillon surtout pour le sang total. Son principe est très simple : les protéines sont des molécules chargées et leur précipitation peut être obtenue par modifications de : La force ionique, par ajout d une solution saline saturée de sulfate d ammonium ; ph, par ajout en petite quantité de solutions d acides forts (acide perchlorique ou trichloracétique) ou de solutions basiques (sulfate de zinc/ hydroxyde de sodium) Analytical Toxicology - Préparation des échantillons biologiques pour l'analyse 4

5 La constante diélectrique, par ajout d acétonitrile, de méthanol, d éthanol ou d acétone. Après centrifugation, le surnageant pourra être directement injecté, ou évaporé s il s agit d un solvant organique pour une meilleure concentration de l échantillon (Kintz,2012). Cette méthode permet l élimination de plus de 98% des protéines dans un plasma humain si on utilise le solvant adéquat (Zhang,2011). Elle présente de nombreux autres avantages tels que sa rapidité, sa simplicité et son utilisation directe pour l analyse de molécules très hydrosolubles et donc difficilement extractibles par les solvants organiques. Elle peut être entièrement automatisée et reste particulièrement bien adaptée à l analyse en toxicologie. Cependant, elle n élimine pas tous les interférents présents dans la matrice et l utilisation d acides forts peut endommager la phase stationnaire en HPLC. C est pourquoi, elle correspond plus à une étape de prétraitement avant l extraction pour les matrices très chargées en protéines qui peuvent entraîner des émulsions gênantes (Kintz,2012). Analytical Toxicology - Préparation des échantillons biologiques pour l'analyse 5