Techniques d imagerie à base d impulsions femtosecondes

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1 Lasers femtosecondes : principes et applications en physique, chimie et biologie (5/6) Techniques d imagerie à base d impulsions femtosecondes 1. Tomographie cohérente optique 2. Microscopie à deux photons 3. Microscopie par génération d harmoniques 4. Microscopie CARS 5. Microscopie non-linéaire cohérente Manuel Joffre

2 Tomographie cohérente optique G.J. Tearney et al., Opt. Lett. 21, 1408 (1996)

3 Tomographie cohérente optique : principe Profil de réflexion de l'échantillon 200 µm Enveloppe de la corrélation Chemin optique Corrélation (mesure brute)

4 Intérêt du laser femtoseconde? Diode large bande ϕ" G.J. Tearney et al., Opt. Lett. 21, 1408 (1996)

5 Tomographie cohérente optique : imagerie du cœur d un têtard 500 µm Images Images d'un d'un embryon embryon de de grenouille grenouille obtenues obtenues par par tomographie tomographie cohérente cohérente optique. optique. La La zone zone représentée représentée correspond correspond au au coeur coeur de de la la grenouille. grenouille. L'image L'image A, A, correspondant correspondant à un un temps temps d'acquisition d'acquisition assez assez long, long, est est brouillée brouillée en en raison raison des des mouvements mouvements du du coeur. coeur. Au Au contraire, contraire, les les images images B et et C ont ont été été obtenues obtenues en en une une fraction fraction de de seconde, seconde, montrant montrant l'état l'état du du coeur coeur de de la la grenouille grenouille à deux deux instants instants successifs. successifs. En En montant montant de de telles telles images images les les unes unes à la la suite suite des des autres, autres, il il est est possible possible de de reconstituer reconstituer un un film film des des battements battements du du coeur. coeur. Ces Ces images images sont sont extraites extraites d'un d'un article article de de G.J. G.J. Tearney Tearneyet et al., al., du du Massachusetts Massachusetts Institute Instituteof oftechnology Optics OpticsLetters Letters21, 21, (1996)). (1996)).

6 Tomographie cohérente optique à haute résolution 100 µm W. Drexler et al., Opt. Lett. 24, 1221 (1999)

7 2. Microscopie à deux photons

8 Rappel : microscopie confocale Détecteur pinhole LASER

9 Microscopie confocale à "pinhole" virtuel C. Yang et J. Mertz, Opt. Lett. 28, 224 (2003)

10 Fluorescence par excitation à deux photons Fluorescence proportionnelle au carré de l'intensité Résolution intrinsèquement tri-dimensionnelle. Seule la zone effectivement observée est excitée.

11 Fluorescence par excitation à deux photons Laser Ti:Sa Laser Argon Photo: Brad Amos, MRC, Cambridge

12 Microscopie à deux photons : schéma de principe W. Denk, J. H. Strickler, and W. W. Webb, Science 248, 73 (1990)

13 Microscopie par excitation à deux photons C. Xu, W.W. Webb (1995)

14 Développement d un embryon de Drosophile Reconstruction tridimensionnelle W. Supatto, D. Débarre, B. Moulia, E. Brouzés, J.-L. Martin, E. Farge, E. Beaurepaire Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 102, 1047 (2005)

15 3. Microscopie par génération d harmoniques

16 Microscopie par génération de second harmonique L. Moreaux et al., Biophys. J. 80, 1568 (2001)

17 Microscopie par génération de second harmonique L. Moreaux et al., Biophys. J. 80, 1568 (2001)

18 Microscopie par génération de second harmonique Sensibilité au potentiel transmembranaire L. Moreaux et al., Opt. Lett. 28, 625 (2003)

19 Microscopie par excitation à deux photons et génération d harmoniques Une série de tranches enregistrées à des profondeurs successives permet ensuite d obtenir une image tridimensionnelle. Paroi d artère de Rat non marquée E. Beaurepaire, T. Boulesteix, A.-M. Pena, M.-P. Sauviat, M.-C. Schanne-Klein

20 Morphogénèse dans un embryon de drosophile Microscopie par génération de troisième harmonique W. Supatto, D. Débarre, B. Moulia, E. Brouzés, J.-L. Martin, E. Farge, E. Beaurepaire In vivo modulation of morphogenetic movements in Drosophila embryos with femtosecond laser pulses Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 1047 (2005)

21 4. Microscopie CARS

22 Coherent Antistokes Raman Scattering F Avantages pour la microscopie : Processus non-linéaire Ne nécessite pas de marqueur fluorescent Emission cohérente ω S Inconvénients : Nécessiste deux lasers picosecondes synchronisés. Contribution non-résonnante importante ω P ω CARS ω P

23 Microscopie CARS Ji-Xin Cheng, Y. Kevin Jia, Gengfeng Zheng et X. Sunney Xie, Biophys. J. 83, 502 (2002)

24 Diagrammes de rayonnement Ji-Xin Cheng, Y. Kevin Jia, Gengfeng Zheng et X. Sunney Xie, Biophys. J. 83, 502 (2002)

25 Comparaison émissions avant et arrière Ji-Xin Cheng, Y. Kevin Jia, Gengfeng Zheng et X. Sunney Xie, Biophys. J. 83, 502 (2002)

26 Visualisation des chromosomes Ji-Xin Cheng, Y. Kevin Jia, Gengfeng Zheng et X. Sunney Xie, Biophys. J. 83, 502 (2002)

27 5. Microscopie non-linéaire cohérente

28 Microscopie CARS à impulsions façonnées Méthanol CH 2 Br 2 CH 2 Cl 2 N. Dudovich, D. Oron, Y. Silberberg, Nature 418, 512 (2002).

29 Microscopie CARS à impulsions façonnées Forme d impulsion maximisant l émission résonnante. Forme d impulsion minimisant l émission résonnante. a - b Impulsion limitée par transformée de Fourier. N. Dudovich, D. Oron, Y. Silberberg, Nature 418, 512 (2002).

30 Contrôle cohérent de l absorption à deux photons D. Meshulach et Y. Silberberg, Nature 396, 239 (1998)

31 When there is no intermediate resonant level E E E = 2 E M. M. Salour, Rev. Mod. Phys. 50, 667 (1978)

32 Spectre d absorption à deux photons 2) 2 (2) Champ doublé : E ( t) E( t) = E ( ω)exp( iωt) ( d SHG SHG ω ω d ( ω) = E + Ω E Ω 2 2 2π ( 2) Ω E SHG ω 2π (2) E (ω) SHG 2 Spectre doublé, ou spectre à deux photons Signal g ( 2) (2) 2 d ( ω) ESHG( ω) ω 2π g (2) ( ω) Spectre d excitation de la fluorescence à deux photons I. Pastirk, J.M. Dela Cruz, K.A. Walowicz, V.V. Lozovoy, M. Dantus, Opt. Expr. 11, 1695 (2003) T. Brixner, N. H. Damrauer, B. Kiefer, G. Gerber, J. Chem. Phys. 118, 3692 (2003)

33 Utilisation du dazzler avec un oscillateur Il faut sélectionner les impulsions correctement mises en forme.

34 Images obtenues pour différentes phases spectrales 1ps

35 Images obtenues pour différentes phases spectrales Le dazzler permet de commuter entre deux impulsions à 10 khz.

36 Microscopie non-linéaire cohérente à 2 photons Microscope Dazzler Blue pulse Yolk emission 25 µm Red pulse GFP emission J.P. Ogilvie, D. Débarre, X. Solinas, J.-L. Martin, E. Beaurepaire, M. Joffre, Opt. Express 14, 759 (2006)