4-Principes généraux en microscopie électronique.

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1 3-Microscopie confocale La microscopie confocale est une des avancées technologiques les plus notables en microscopie optique depuis une centaine d années. Elle est basée sur une architecture technologique comprenant des lasers, des éléments optiques, des dispositifs de balayage rapide et des ordinateurs qui traitent les images en deux ou trois dimensions. Les images obtenues en microscopie à fluorescence classique ont une faible définition car l excitation est généralement réalisée sur une épaisseur importante de la coupe et les émissions fluorescentes diffusent notablement dans tout le volume de la coupe rendant l image diffuse et un peu floue. L utilisation conjointe de rayons laser très pénétrants et précisément focalisés dans un plan de la coupe et d un diaphragme variable (trou de filtrage) qui élimine le signal fluorescent provenant d autres plans a permis d améliorer considérablement la définition des images obtenues. Cette méthode nécessite bien sur la présence dans les tissus de molécules fluorescentes introduites par les procédés traditionnels d immunohistochimie (anticorps marqués) ou injection de traceurs fluorescents. En outre, grâce au génie génétique, et en particulier à la transgénèse, il est aujourd hui possible de faire produire ces molécules «in situ» après modification du génome de l espèce étudiée. En effet, on peut associer un gène responsable de la synthèse d une protéine fluorescente (protéine GFP par exemple) à un gène responsable de la synthèse d une protéine naturelle (récepteur, protéine G, élément du cytosquelette etc.) et ainsi d obtenir des protéines naturelles marquées et donc facilement identifiables en microscopie confocale. Diverses méthodes de microscopie confocale non destructives ont été développées et permettent de suivre l évolution de ces protéines marquées aussi bien in vitro qu in vivo. 4-Principes généraux en microscopie électronique. La microscopie optique est relativement limitée par les propriétés physiques de la lumière. Ainsi même avec un microscope très performant, on ne peut espérer raisonnablement dépasser un grossissement de 1200 fois. Ceci est très frustrant lorsque l on désire obtenir des informations sur la structure des organites cellulaires, des membranes ou des contacts 1

2 synaptiques. On fait alors appel à une autre forme de microscopie qui utilise non pas de la lumière mais des particules arrachées à des atomes : les électrons. Le principe est assez simple mais le matériel est complexe et onéreux. a- Microscopie électronique de transmission (TEM pour Transmission Electron Microscopy en anglais): Très schématiquement, il s agit de générer, dans une enceinte tubulaire où règne le vide, un faisceau d électrons grâce à un canon à électron soumis à une très forte différence de potentiel. Ce faisceau d électrons est projeté sur une coupe très fine de tissu introduite dans le tube. Certains organites cellulaires présents dans la coupe sont suffisamment denses (opaques) pour retenir une partie des électrons, mais les électrons qui n ont pas été absorbés (qui été transmis) sont recueillis à l extrémité du tube sur un capteur ou un film photographique. L image obtenue correspond ainsi à l ombre chinoise des structures cellulaires présentes dans la coupe. Le faisceau d électrons transmis peut être élargi à volonté par le jeu de lentilles magnétiques placées le long du tube. Cette méthode permet d obtenir des grossissements de l ordre de fois. Le protocole de traitement des échantillons est assez similaire à celui que nous avons décrit pour l histologie classique. Il faut procéder à une double fixation chimique, inclure dans de la résine, et réaliser des coupes très fines. Pour obtenir un maximum de détails, il est nécessaire traiter les échantillons et les coupes avec des produits chimiques spécifiques qui rendent les structures cellulaires plus opaques aux électrons. Pour localiser de façon précise en microscopie électronique des molécules dans des organites cellulaires, on peut faire appel à pratiquement toutes les méthodes d histochimie décrites plus haut. Il suffit que les marqueurs utilisés soient très opaques aux électrons (microparticules d or, par exemple). b- Microscopie électronique à balayage (MEB en français ou SEM pour Scanning Electron Microscopy, en anglais) : ici l échantillon n est pas coupé en tranches, mais simplement fixé puis recouvert d une minuscule couche métallique (de l or en général), déposé par pulvérisation. Cet échantillon est placé sous un faisceau d électrons animé d un mouvement de balayage. Les électrons re-émis par l échantillon sont recueillis sur un capteur ou une plaque photographique. On obtient alors une vue très précise, en trois dimensions de la surface de l échantillon (Fig. A-15a). Les techniques les plus modernes permettent d observer directement, sans traitement préalable des coupes congelées ou des échantillons frais dans une enceinte à très haute pression. Les 2

3 appareil s appellent des «environnemental scanning electron microscope» ou ESEM. B) Techniques d exploration anatomique sur l animal ou le sujet vivant Les progrès de la Physique, appliqués à la Biologie et a la Médecine ont permis le développement de techniques d exploration anatomique utilisables sur le sujet humain ou l animal vivant intact, anesthésié ou non. 1- Radiographie classique et angiographie. La radiographie classique du cerveau ne donne que très peu d informations sur la structure du tissu cérébral car toutes les parties du cerveau ont pratiquement la même densité aux rayons X. Pour observer quelque chose de façon précise, il faut provoquer des augmentations de contraste entre, par exemple le tissu nerveux et les vaisseaux cérébraux. Cette augmentation de contraste est obtenue par injection de substances opaques aux rayons X dans la circulation. C est ainsi que l on réalise des angiogrammes cérébraux, radiographies qui permettent de détecter des anomalies vasculaires qui peuvent traduire des problèmes circulatoires ou encore la présence de tumeurs cérébrales. Par le passé, on a provoqué l apparition de contrastes dans le cerveau en remplaçant le liquide céphalorachidien par injection d air. Cette méthode primitive (pneumoencéphalographie) permettait d observer la forme des ventricules cérébraux. 2- La tomographie aux rayons X (ou encore Scanner). C est une technique de radiographie assistée par ordinateur qui permet de visualiser les organes par tranches (tomos en grec) de quelques millimètres d épaisseur. Il existe plusieurs types de scanners, dont le principe général consiste à balayer (to scan en anglais) une partie du corps par un faisceau étroit de rayons X. L intensité des rayons transmis est enregistrée à chaque déplacement du faisceau par des capteurs très sensibles. Le balayage se fait plusieurs fois sous des angles différents. Pour un même point de l organisme on dispose donc de nombreuses informations sur sa densité aux rayons X. Les données sont recueillies sous la forme d une matrice qui est traitée par un logiciel d analyse d image qui restitue une image 3

4 composite de la tranche explorée. Dans le cas du cerveau, il est souvent nécessaire d injecter dans la circulation des produits qui augmentent le contraste des images. Si l on répète l examen sur plusieurs niveaux successifs, il est possible de réaliser un assemblage informatique des différentes tranches (images) obtenues et ainsi de construire une vue en trois dimensions de l organe exploré. Grâce aux progrès de l informatique, on obtient aujourd hui avec un scanner, de très belles images du cerveau, avec une résolution de l ordre de quelques mm. Toutefois, l exposition régulière aux rayons X est très nocive et il est déconseillé de répéter ces examens fréquemment. L apparition de l imagerie par résonance magnétique permet aujourd hui aux médecins de suivre régulièrement l évolution d une intervention neurochirurgicale ou d un traitement médicamenteux. 3- Imagerie par résonance magnétique IRM La RMN. Tout d abord qu est ce que la résonance magnétique nucléaire (RMN)? Nous allons expliquer son principe avec l exemple des atomes d hydrogène car ils sont présents dans toutes les molécules organiques. Très schématiquement le principe repose sur les propriétés électromagnétiques de la matière. Le noyau de chaque atome d hydrogène (proton) est assimilable à un petit aimant. Dans les conditions standard, les axes (ou moments magnétiques ou encore spin) des petits aimants sont orientés de façon aléatoire dans toutes les directions. Lorsqu on impose à ces protons un champ magnétique puissant (Bo), leurs spins vont tous s orienter parallèlement à l axe du champ magnétique Bo (comme le fait l aiguille d une boussole avec le champ magnétique terrestre). Si, pendant un bref instant, on applique grâce a une antenne, un autre champ magnétique (B1) d orientation différente, on provoque la déviation du spin des protons. Lorsque B1 sera coupé, ils retrouveront en résonant, leur orientation imposée par Bo (comme la fait l aiguille d une boussole quand on lui donne un petit coup). En se relaxant, c est à dire en retournant à leur état d équilibre, les protons émettent de l énergie sous la forme d ondes électromagnétiques qui sont captées par des antennes spécifique. Le comportement des protons diffère selon la nature des atomes qui l entourent. Ces ondes réémises portent donc des informations sur la nature des tissus exposés aux champs magnétiques. Les signaux diffèrent selon que les tissus sont plus ou moins riches en eau (matière grise) ou en lipides (matière blanche). La localisation spatiale des atomes est obtenue grâce à un gradient directionnel appliqué sur le champ magnétique de base. La relaxation des 4

5 protons sera alors modifiée par la variation du champ magnétique. Des techniques de traitement du signal utilisant des algorithmes de transformées de Fourier rapides permettent alors de localiser l'évènement et de construire des images très détaillées de la matière étudiée IRM anatomique (IRMa) C est donc grâce à la «vibration» de ces atomes que l on a pu mettre au point une technique d imagerie qu on appelle l imagerie par résonance magnétique anatomique (IRMa). L acquisition des informations électromagnétiques émises par les noyaux d hydrogène se fait un peu de façon analogue à la technique du scanner : le système acquière les données par tranches successives et le traitement informatique produit les images sous forme de coupes (Fig. A-19 à A-21). La sensibilité des appareils dépend de l intensité du champ Bo : les appareils de 1,5 Tesla (les plus répandus) ont une résolution de l ordre du mm alors que les appareils plus puissants, dotés d aimants de 3 à 4 Tesla, ont une résolution de l ordre de 0,1 mm. Cette technique présente des avantages certains par rapport au scanner: - pas d irradiation aux rayons X qui sont nocifs (lésion de l ADN) - possibilité de renouveler fréquemment les examens - résolution très supérieure à celle du scanner X seuls inconvénients : les sujets porteurs corps étrangers non compatibles avec l IRM (vis, clips vasculaire, prothèses, éclats métalliques divers introduits accidentellement) ne peuvent subir cet examen sans précautions car le champ magnétique très puissant pourrait provoquer un déplacement objets et ainsi léser les tissus environnants. IRM de diffusion (IRMd) L IRM possède de nombreuses applications, dont l IRM fonctionnelle que nous étudierons plus loin. L IRM de diffusion est une de ces applications qui permet de reconstruire les faisceaux de matière blanche qui relient les différentes structures cérébrales. Très schématiquement, cette méthode utilise des gradients de champs magnétiques qui permettent d étudier en chaque point de l image la diffusion des molécules d eau le long des fibres nerveuses et ainsi de reconstruire leur trajet dans les trois dimensions (Fig. A-22). Cette méthode très précise permet de localiser des faisceaux touchés par une tumeur (gliome par 5

6 exemple) ou encore une lésion de la matière blanche (par exemple une plaque de sclérose en plaques) Elle permet aussi l évaluation de la maturation de la matière blanche chez les jeunes enfants. 6