OPTIMISATION DE LA CROISSANCE ET DE LA PRODUCTION DE GLUCOAMYLASE EXTRACELLULAIRE PAR CANDIDA GUILLIERMONDII (*)

251 Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 27, 146, 251-27 OPTIMISATION DE LA CROISSANCE ET DE LA PRODUCTION DE GLUCOAMYLASE EXTRACELLULAIRE PAR CANDIDA GUILLIERMONDII (*) Mohamed LAGZOULI (1), Reda CHAROUF (2), Mohamed EL YACHIOUI (1), Mohamed OUHSSINE (1), El Hassan BERNY (1), Mohamed JADAL (1) Dix-sept souches de levures amylolytiques ont été isolées à partir d un levain de panification traditionnel sur un milieu semisynthétique contenant l amidon comme seule source de carbone. Les conditions de culture ont été modifiées pour optimiser la croissance et l apparition de glucoamylase. Après avoir testé diverses sources de carbone (glucose, galactose, fructose, maltose, lactose, saccharose, pectine, inuline et cellulose), les résultats obtenus avec Candida guilliermondii montrent que la présence d amidon induit fortement la production de glucoamylase avec un maximum à 5 g/l, les glucides simples donnent une bonne production en biomasse mais inhibent fortement la production d enzymes. Parmi les différentes sources d azote testées, l extrait de levure et l urée ont donné après une culture en fermenteur de 2 litres le maximum de biomasse et de glucoamylase estimée à 2973 µm/l/min après 52 h d incubation à 3 C à 15 tours/min avec un ph initial de 5,5. (*) Manuscrit reçu le 12 décembre 26. (1) Laboratoire de Biotechnologie microbienne, Environnement et Qualité, Faculté des Sciences, Université Ibn Tofaïl, BP 133, 14 Kénitra, Maroc. lagzoulimohamed @yahoo.fr, elyachioui@hotmail.com, ouhssine4@yahoo.fr, hassan_berny@hotmail.com, jadal@caramail.com (2) Laboratoire de Bactériologie, Institut national d Hygiène, 1 Rabat, Maroc. charofreda@yahoo.fr

252 INTRODUCTION Jusqu'au début des années 197, on a considéré que les plantes et les animaux étaient les meilleures sources d enzymes. Cependant, différents microorganismes ont été intensivement utilisés pour la biosynthèse des enzymes amylolytiques [ 8,1,22 ]. L'amylase d'origine fongique s'est avérée plus stable que celle d origine bactérienne [ 7 ]. L utilisation de ces enzymes a été étendue à des secteurs variés, tels que les industries agroalimentaire, pharmaceutique, textile, de la brasserie, et des détergents [ 14 ]. Les amylases extracellulaires ont été trouvées chez diverses espèces de levures [ 19,29 ], chez les champignons [ 29 ] et les bactéries [ 28 ]. L utilisation des levures dans la production d enzymes amylolytiques est de plus en plus sollicitée à cause de la facilité de leur culture et l absence de risques pathogènes [ 9 ]. Le choix du milieu approprié de fermentation est essentiel pour les microorganismes, aussi bien pour la croissance que pour la production d enzymes. La production d enzymes amylolytiques par les levures a été considérablement améliorée par l'addition de différentes sources de carbone et d'azote [ 5 ]. Les sources de carbone ont affecté non seulement la croissance mais aussi l apparition des amylases, mais également la vitesse avec laquelle les hydrates de carbone sont métabolisés [ 25 ]. De même, la source d azote organique ou inorganique est essentielle pour la formation de biomasse cellulaire et d enzymes [ 24 ]. Le présent travail a pour but l isolement et la purification de nouvelles souches de levures possédant une activité amylolytique et la détermination des conditions et facteurs optimaux pour la croissance et la production de glucoamylase.

253 MATÉRIEL ET MÉTHODES Milieux de culture Le milieu de culture utilisé pour l isolement est un milieu semisynthétique contenant l amidon comme seule source de carbone, avec la composition suivante par litre : 4 g amidon, 15 g (NH 4 ) 2 SO 4, 3 g KH 2 PO 4,,5 g MgSO 4, 5H 2 O, 4 g extrait de levure et 1 ml de microéléments en solution [ 3 ]. Le milieu semi-synthétique solide est obtenu par addition de 15 g/l d agar. Les milieux (liquide et solide) sont autoclavés quinze minutes à 12 C, le ph initial étant fixé avant stérilisation à 5 par HCl,1 M. Les glucides stérilisés par filtration sur membrane millipore (,45 µm) sont additionnés aseptiquement après refroidissement pour le milieu de culture liquide, et à 45 C pour le milieu gélosé. Isolement et purification des souches amylolytiques Plusieurs échantillons de levains pour panification traditionnelle ont été prélevés dans différentes régions du Maroc. Un gramme de chaque échantillon est mis directement dans des Erlenmeyers de 25 ml contenant 5 ml de milieu de culture semi-synthétique liquide avec l amidon comme seule source de carbone. Pour inhiber la croissance de contaminants bactériens, du chloramphénicol (5 mg/l) stérilisé par filtration millipore (,45 µm) est additionné après stérilisation des milieux, avant solidification à 45 C pour le milieu gélosé. Après 72 heures d incubation à 3 C à 15 rotations par minute (rpm), 1 ml de chaque culture est ensemencé en surface après plusieurs dilutions adéquates avec de l eau physiologique (8,5 g/l NaCl) sur milieu semi-synthétique solide contenant l amidon comme seule source de carbone. La mise en évidence de la dégradation de l amidon est révélée par addition d une solution iodo-iodurée (1 g/l d iode, 2 g/l d iodate de potassium). Les souches présentant un halo clair autour de leurs colonies sont retenues, la taille du halo étant notée pour chaque souche de levure testée.

254 Les souches isolées sont purifiées après cinq repiquages successifs sur le milieu de culture semi-synthétique solide, contenant la même composition que celle pour l isolement. Après purification, ces souches sont conservées à 4 C sur milieu PDA (Potato Dextrose Agar) en tubes inclinés, et à -18 C en milieu semisynthétique liquide en présence du glycérol à 2 %. Optimisation de la croissance et de l apparition de l activité enzymatique Étude de la croissance L étude de la croissance des différentes souches est réalisée dans des Erlenmeyers de 1 ml contenant 2 ml de milieu de culture semisynthétique liquide, avec 5 g/l d amidon comme seule source de carbone. L incubation est réalisé 72 h à 3 C à 15 rpm. La culture cellulaire est mesurée à 6 nm. Effet du ph initial L effet du ph initial est testé sur milieux semi-synthétique à des ph initiaux de 3, 4,5, 5, 5,5, 6, 7 et 8, l incubation est réalisée en milieu liquide à 3 C sous agitation rotative 72 h à 15 rpm. L ajustement du ph initial est réalisé par une solution de HCl,1 N pour les ph inférieurs à 5, et de NaOH N/9 pour les ph supérieurs. Les ph initial et final sont mesurés par un ph-mètre type Consort C831, après étalonnage à l aide de solutions étalon à ph 7,2, 4 et 9,1. Effet de la température Afin d étudier l effet de la température sur la croissance et la production de glucoamylase, des cultures sur milieux semi-synthétiques liquides sont réalisées à 2, 25, 3, 35, 4 et 45 C, l incubation étant effectuée 72 h à ph 5 à 15 rpm. Effet de la source de carbone Des cultures sont réalisées sur milieux semi-synthétiques en présence de monosaccharides (glucose, galactose, fructose), de disaccharides (maltose, lactose, saccharose) et de polymères (pectine,

255 inuline et cellulose soluble sous forme de carboxyméthylcellulose). Chaque sucre est utilisé séparément à 5 g/l comme seule source de carbone. Les milieux sont incubés 72 h à 3 C à ph 5 et 15 rpm. Par ailleurs, l effet de la concentration en amidon est testé sur milieu semi-synthétique contenant de l amidon à, 2,5, 5, 7,5 et 1 g/l. Les glucides stérilisés par filtration sur membrane millipore (,45 µm) sont ajoutés aseptiquement au milieu à 5 g/l. Effet de la source d azote Pour déterminer l effet de la concentration en extrait de levure, des cultures sont effectuées sur milieu semi-synthétique contenant l amidon en présence d extrait de levure comme seule source d azote à, 1, 2, 3, 4 et 5 g/l. L étude de l effet des différentes sources d azote sur la production de glucoamylase est effectuée par des cultures sur milieux semi-synthétiques en présence de diverses sources d azote inorganique (CH 4 N 2 O, NaNO 3, (NH 4 ) 2 HPO 4, SO 4 (NH 4 ) 2 ), organique (extrait de levure, peptone, tryptone, extrait de viande), et mixtes (peptone + urée, tryptone + urée, extrait de viande + urée, extrait de levures + urée, NaNO 3 + extrait de levure et (NH 4 ) 2 HPO 4 + extrait de levure). Toutes les cultures sont incubées 72 h à 3 C, à 15 rpm et ph initial de 5. Détermination de l activité enzymatique La détermination de l activité glucoamylase a été réalisée par dosage des glucides réducteurs par la méthode de Somogyi [ 26 ] et Nelson [ 2 ]. Le milieu réactionnel contient,1 ml du surnageant,,25 ml d une solution d amidon dans une solution tampon phosphate à ph 5 et,15 ml du tampon phosphate à ph 5, le mélange réactionnel est incubé 3 min à 4 C, la réaction est arrêtée par addition de 2 ml du réactif de Somogyi [ 26 ], suivie d un chauffage à 1 C au bain-marie pendant 15 min. Un ml du réactif de Nelson [ 2 ] est ajouté aux tubes à essais contenant le mélange réactionnel après refroidissement dans un bac de glace.

256 Le dosage des sucres réducteurs est déterminé par absorbance à 54 nm, contre un témoin blanc contenant,5 ml du tampon phosphate à ph 5,5. La concentration en glucides réducteurs est déterminée par une courbe étalon préparée extemporanément à partir d une solution mère de glucose de,6 g/l. L activité enzymatique est définie en µm de sucres réducteurs par litre d enzyme par min (µm/l/min). Dosage des glucides totaux Les glucides totaux sont dosés par la méthode au phénol [ 6 ], la lecture des résultats est effectuée par absorbance à 49 nm, les concentrations sont déterminées par une gamme étalon préparée extemporanément à partir d une solution d amidon de,6 g/l. Culture en fermenteur Tenant compte des paramètres optimaux testés, une culture contrôlée a été réalisée en fermenteur de type SETRIC (SET 2M) de deux litres. La cuve est remplie avec le milieu semi-synthétique contenant la composition suivante : 5 g/l amidon, 3 g/l KH 2 PO 4,,77 g/l CH 4 NO 2, 3 g/l extrait de levure et 1 ml de microéléments en solution [ 3 ], le ph initial étant ajusté avant stérilisation à 5,5 par HCl,1 N. Un litre du milieu semi-synthétique est préparé, 9 ml sont introduits dans la cuve du fermenteur et 1 ml dans un Erlenmeyer de 5 ml. La cuve et l Erlenmeyer sont autoclavés 15 min à 12 C. Les 1 ml utilisés comme préculture de 24 h sont inoculés aseptiquement au fermenteur. Des échantillons de 5 ml de la culture sont prélevés aseptiquement chaque heure pendant 24 h et chaque 4 h après. La fermentation a été menée 72 h à 15 rpm et à une température contrôlée de 3 C.

257 RÉSULTATS Isolement et caractérisation des souches amylolytiques À partir des levains de panification traditionnels prélevés dans différentes régions du Maroc, dix-sept isolats de levures ont été isolés et purifiés (Tableau I). Les levures sont repérées par l addition d une solution iodo-iodurée. L apparition d un halo autour des colonies traduit la dégradation de l amidon. Parmi les seize souches isolées, quatre levures ont montré une production marquée de glucoamylase avec des diamètres du halo sur milieu solide de 13 à 26 mm. Les seize souches sont ensuite cultivées sur milieu semi-synthétique en Erlenmeyers pour étudier la croissance et la production de la glucoamylase. Les quatre souches présélectionnées ont montré une activité glucoamylasique plus importante que les douze souches restantes. La plus grande activité est obtenue avec la souche LGZ 14 (792 µm/l/min), suivie par la souche LGZ 17 (774 µm/l/min), puis avec une activité moindre les souches LGZ 15 (699 µm/l/min) et LGZ 12 (575 µm/l/min). La souche LGZ 14 a été identifiée par la galerie API (gallery ID 32C, biomérieux, REF 32 2) comme étant Candida guilliermondii et a été retenue pour la suite de ce travail.

258 Tableau I : Activité enzymatique des souches de levures isolées sur milieu semisynthétique contenant l amidon comme seule source de carbone (5 g/l) à ph 5 et 3 C. Isolats de levures Détermination Diamètre (mm) AE (µm/l /min) LGZ 1 Candida sp. 2 13 LGZ 2 Candida sp. 1 8 LGZ 3 Saccharomyces sp. 3 28 LGZ 4 Saccharomyces sp. 3 38 LGZ 5 Saccharomyces sp. < 1 2 LGZ 6 Debaryomyces sp. 3 36 LGZ 7 Candida guilliermondii 4 88 LGZ 8 Candida sp. 2 38 LGZ 9 Candida sp. 2 16 LGZ 1 Saccharomyces sp. 1 9 LGZ 11 Candida tropicalis 2 67 LGZ 12 Candida sp. 13 575 LGZ 13 Candida holmii 2 35 LGZ 14 Candida guilliermondii 21 792 LGZ 15 Debaryomyces sp. 26 699 LGZ 16 Saccharomyces sp. 1 22 LGZ 17 Candida famata 26 774 Optimisation de la croissance et de l activité glucoamylase Effet du ph initial La croissance de la souche de Candida guilliermondii LGZ 14 augmente en fonction du ph initial. La croissance est maximale avec un ph initial égal à 5 et diminue progressivement au-delà de cette valeur. Alors que le maximum d activité enzymatique est obtenu au ph initial 5,5, le ph final enregistré, après 72 heures de croissance a augmenté pour atteindre la valeur de 6,77, avec une activité enzymatique de 1298 µm/l/min (Tableau II).

259 Tableau II : Effet du ph initial sur la croissance et sur l apparition de l activité glucoamylase de Candida guilliermondii LGZ 14. ph initial Biomasse Activité enzymatique (A 6 nm) (µm l -1 min -1 ph final ) 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 3 2,55 2,14 3,96 31 161 483 4,55 6,41 6,39 4 3,93 4,35 4,35 263 61 637 6,19 6,4 6,46 4,5 4,3 4,413 4,814 253 6 681 6,29 6,34 6,49 5 4,85 4,875 4,925 522 618 736 6,5 6,56 6,59 5,5 4,35 4,575 4,845 712 115 1298 6,69 6,78 6,77 6 4,152 4,179 4,45 68 118 1237 6,91 6,88 7,15 7 3,8 3,983 4,165 325 912 1116 7,16 7,6 7,26 8 3,56 3,845 4,165 31 618 638 7,62 7,2 7,2 Effet de la température La croissance de la souche de Candida guilliermondii LGZ 14 augmente avec la température, atteint un maximum à 3 C, puis diminue rapidement. L activité enzymatique présente un profil parallèle à la croissance. Le maximum de production de glucoamylase (1298 µm/l/min) est obtenu à 3 C (Figure 1). Biomasse (A 6 nm) 8 7 6 5 4 3 2 1 Biomasse Activité enzymatique Glucoamylase (µm/l/min) 3 25 2 15 1 5 2 25 3 35 4 45 Température ( C) Fig. 1 : Effet de la température sur la croissance et l apparition de l activité enzymatique de Candida guilliermondii LGZ 14.

26 Influence de la nature et la concentration du substrat carboné La croissance de la souche de Candida guilliermondii LGZ 14 est fonction de la concentration en amidon. Ainsi la biomasse augmente pour atteindre une valeur maximale à 1 g/l (Figure 2). L activité enzymatique s accumule progressivement dans le milieu au cours de la croissance pour atteindre une valeur maximale estimée à 1742 µm/l/min au bout de 72 h de culture en présence de 5 g/l d amidon. Biomasse (A 6 nm) Glucoamylase (µm/l/min) 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Biomasse Activité enzymatique 2,5 5 7,5 1 g/l d'amidon 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 Fig. 2 : Effet de la concentration en amidon sur la croissance et l apparition de glucoamylase de Candida guilliermondii LGZ 14. Les glucides simples favorisent la croissance cellulaire. La plus importante croissance est obtenue avec le glucose, suivi du fructose et du galactose. Cependant, la glucoamylase produite est quasi nulle ou absente pour tous les glucides simples étudiés (Tableau III). Le saccharose donne une meilleure croissance cellulaire après 48 h, suivi du maltose, et enfin du lactose, mais la production de glucoamylase reste faible. Le maximum d activité enzymatique est observé en présence du maltose (587 µm/l/min), suivi du lactose (227 µm/l/min) puis du saccharose avec une glucoamylase nulle. Pour les polysaccharides, la croissance cellulaire est faible après 72 h d incubation pour l inuline, la pectine et la carboxyméthylcellulose. L activité enzymatique est nulle pour tous les polysaccharides étudiés.

261 La glucoamylase enregistrée est nulle au bout de 24 h avec un milieu de culture avec l amidon et le glucose, elle atteint 168 µm/l/min après 48 h alors qu après 72 h elle atteint 23 µm/l/min. Au contraire, en présence de fructose, l activité après 72 h est beaucoup plus grande (1375 µm/l/min). Tableau III : Effet de la source de carbone à (5 g/l) sur la croissance et sur l apparition de glucoamylase de Candida guilliermondii LGZ 14. Source de carbone (5 g/l) Activité enzymatique Biomasse (A 6 nm) (µm/l/min) 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h Glucose 7,5 7,88 7,935 Fructose 7,35 7,215 7,275 Galactose 7,13 7,13 7,12 Maltose 6,9 6,38 6, 295 572 587 Lactose 1,161 1,183 1,178 163 185 227 Saccharose 7,45 8,15 8,15 Amidon + glucose 7,5 8,8 8,125 169 23 Amidon + fructose 7,385 7,725 7,77 529 1278 1375 Inuline 2,16 2,64 2,634 Pectine 2,46 2,559 2,595 Carboxyméthylcellulose 1,977 2,418 2,544 Influence de la nature et la concentration de la source d azote La croissance de la souche de Candida guilliermondii LGZ 14 augmente avec la concentration de l extrait de levure pour atteindre une valeur maximale à 5 g/l (Figure 3). La production de glucoamylase augmente parallèlement à la concentration de l extrait de levure pour atteindre un maximum de 1795 µm/l/min à 3 g/l, les concentrations supérieures donnant des résultats plus faibles.

262 Biomasse (A 6 nm) Glucoamylase (µm/l/min) 7 6 5 4 3 2 1 Biomasse Activité enzymatique 1 2 3 4 5 Concentration en extrait de levures (g/l) 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 Fig. 3 : Effet de la concentration de l extrait de levures sur la croissance de Candida guilliermondii LGZ 14 et l apparition de glucoamylase. Parmi les sources d azote minéral testées, la meilleure croissance (Tableau IV) est obtenue avec CH 4 NO 2, suivi de (NH 4 ) 2 HPO 4 et NaNO 3, alors que le maximum de glucoamylase produite est obtenu avec (NH 4 ) 2 HPO 4 (1792 µm/l/min) suivi de CH 4 NO 2 (125 µm/l/min), l activité enzymatique étant réduite pour NaNO 3. L association de l extrait de levure avec l urée a donné la meilleure croissance cellulaire et la meilleure production de glucoamylase (2519 µm/l/min), suivi de la peptone plus l urée (193 µm/l/min), la tryptone plus l urée (1762 µm/l/min) et enfin l extrait de viande et l urée (176 µm/l/min).

263 Tableau IV : Effet des sources d azote sur la croissance et la production de glucoamylase par Candida guilliermondii LGZ 14. Source d azote Biomasse à 72 h (A 6 nm) Activité enzymatique (µm/l/min) Urée 4,25 125 NaNO 3 2,36 (NH 4 ) 2 HPO 4 3,69 1792 Extrait de levures 4,97 1844 Peptone 6, 1172 Tryptone 6,45 89 Extrait de viande 7,38 995 Peptone + urée 4,11 193 Tryptone + urée 4,855 1762 Extrait de viande + urée 4,855 176 Extrait de levures + urée 5,59 2519 NaNO 3 + extrait de levure 5,825 1328 (NH 4 ) 2 HPO 4 + extrait de levure 5,65 188 Cinétique de croissance et de biosynthèse de glucoamylase en fermenteur La courbe de l activité enzymatique est liée à la croissance cellulaire (Figure 4A). Cette activité s accumule progressivement dans le milieu et atteint un maximum de 2973 µm/l/min à la fin de la phase exponentielle. Parallèlement, l amidon est progressivement dégradé dans le milieu pendant la croissance (Figure 4B). Son hydrolyse est plus intense pendant la phase logarithmique. Le ph initial réglé préalablement à 5,5 a atteint une valeur de 6 après inoculation du milieu de culture par les 1 ml de la préculture. Le profil du ph indique une évolution très faible jusqu'à 12 h d incubation. Après 26 h, le ph continue son évolution avec une vitesse beaucoup plus grande et au-delà de 52 h, il se stabilise à 9,6.

264 La période de latence enregistrée pour la biomasse est relativement faible (4 h). La culture sur fermenteur de Candida guilliermondii LGZ 14 a montré un maximum de croissance après 36 h suivi d une stabilité à la phase stationnaire, alors que pour la production de glucoamylase, la phase de latence est beaucoup plus grande. Biomasse (A 6 nm) 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1,5 A Biomasse Activité enzymatique Glucoamylase (µm/l/min) 35 3 25 2 15 1 5 3 5 11 13 15 17 44 52 7 9 19 21 23 28 36 ph 7,2 7 6,8 B ph Amidon % d'amidon 12 1 6,6 8 6,4 6,2 6 6 4 5,8 5,6 2 5,4 15 21 23 52 3 5 7 9 11 13 17 19 28 36 44 Heures Fig. 4 : Culture sur fermenteur de la souche de Candida guilliermondii. A : Suivi de la croissance et de la production de glucoamylase B : Suivi du ph et de la dégradation de l amidon en fonction du temps.

265 DISCUSSION ET CONCLUSION L'isolement de levures susceptibles d'utiliser l amidon comme source de carbone est justifié non seulement en raison de l'intérêt économique du substrat, mais aussi de son produit d'hydrolyse. Au cours de cet isolement, seize souches de levures à activité amylolytique ont été purifiées. La souche LGZ 14 de Candida guilliermondii qui synthétise dans le milieu de culture une quantité prometteuse de glucoamylase a été retenue. La souche LGZ 14 produit à 3 C une meilleure croissance et production de glucoamylase. Cette valeur concorde avec celle trouvée chez des Ascomycètes [ 31 ]. La température optimale pour une meilleure production d enzymes amylolytiques chez Yarrowia lipolytica est de 28 C [ 23 ]. Le ph initial de la culture a été fixé à 5,5. Des valeurs similaires variant de 5 à 6,5 ont permis de donner un maximum de production des enzymes amylolytiques chez Filobasidium capsuligenum [ 4 ]. Chez Lipomyces kononenkoae, un ph initial de 5,5 a permis de donner une meilleure production d enzymes amylolytiques [ 27 ]. De même, d après Taylor et al. [ 3 ], Humicola lanuginosa produit deux formes de glucoamylases, présentant un optimum de ph de 4,9 et de 6,6. Contrairement à d autres bactéries, un Bacillus a présenté un optimum de ph pour la croissance et la production d amylase de 7 [ 31 ]. L amidon ajouté au milieu de culture à 5 g/l a permis d augmenter la production de glucoamylase. La même concentration a été utilisée pour la production d amylase chez Filobasidium capsuligenum [ 15 ], Clostridium thermosulfurogenes [ 12 ] et Clostridium thermohydrosulfuricum [ 25 ], alors que pour d autres espèces de levures, comme Lipomyces kononenkoae [ 27 ] et Schwanniomyces alluvius [ 18 ], la concentration en amidon utilisée pour produire l amylase est de 1 g/l. La faible production de glucoamylase en présence d amidon et de glucose suggèrent que la glucoamylase produite par Candida guilliermondii est une enzyme fortement induite par l amidon, et que son activité est probablement sous l effet d une répression catabolique du glucose. Ces résultats sont en accord avec ceux trouvés dans l étude de la répression catabolique du glucose chez Trichoderma reesei [ 13 ] et Aspergillus oryzae RIB4 [ 33 ]. Le même phénomène de répression catabolique a été observé chez Clostridium thermohydrosulfuricum [ 12 ] et Bacillus sp. [ 15 ].

266 L importance de l extrait de levure dans la croissance et la production de glucoamylase dans cette étude est prouvée. Le maximum de croissance et de production de glucoamylase est atteint avec 3 g/l d extrait de levure. Le maximum de production de glucoamylase par Thermomyces lanuginosus est obtenu pour des concentrations en extrait de levure allant de 2 à 5 g/l [ 16 ], alors qu avec Aspergillus fumigatus, cette concentration est de 2 g/l [ 2 ]. Différentes concentrations en extrait de levure testées par d autres chercheurs ont permis de produire des enzymes amylolytiques. L amylase produite par Aspergillus niger est obtenue à 5 g/l [ 33 ], alors que le maximum d activité amylolytique produite par un Bacillus est obtenu avec 2 g/l [ 31 ]. L association de,77 g/l d urée à 3 g/l d extrait de levure comme source d'azote active très fortement la croissance et l apparition de l'enzyme. Nguyen et al. [ 21 ] ont trouvé que l extrait de levure favorise la croissance et la production d enzymes amylolytiques. Chez Thermomyces lanuginosus [ 16 ], la peptone donne le maximum de glucoamylase suivi de la tryptone, de l extrait de viande et de l extrait de levure, alors que pour les sources d azote inorganique, le sulfate d ammonium a donné la meilleure production suivi de l urée, du nitrate d ammonium, le nitrate de sodium donnant l activité la plus faible. La culture en fermenteur a permis de produire une biomasse beaucoup plus grande en un temps relativement réduit qu avec les Erlenmeyers. Ceci est dû au contrôle de la température et des facteurs gênant la croissance (épuisement du milieu, agitation, contrôle des variations de la température ). La période de latence marquée pour la glucoamylase est probablement due au changement de volume et de température lors de l inoculation par la préculture effectuée à température ambiante. Par contre, la croissance a marqué une période de latence de courte durée, probablement suite à l adaptation préalable de la levure au milieu. Aussi la phase d encensement de la préculture correspond à la phase exponentielle dans la préculture. La production de cette enzyme est fortement induite par l amidon et très peu par le maltose. Elle est absente en présence des glucides simples, bien qu un effet glucose ait été constaté. L optimisation des paramètres de croissance et de l apparition d enzymes de Candida guilliermondii a permis d améliorer la croissance et la production de glucoamylase. Les essais de croissance et de production

267 d'enzyme en fermenteur montrent que cette souche est prometteuse pour l approfondissement des études pour l amélioration de la production de glucoamylase en vue d une application industrielle. Une étude statistique a été menée parallèlement et a confirmé l importance du ph initial, des concentrations en amidon et en extrait de levure sur la production de glucoamylase [ 17 ]. RÉFÉRENCES 1 - Chen (J.), Li (D.C.), Zhang (Y.Q.), Zhou (Q.X.) - Purification and characterization of a thermostable glucoamylase from Chaetomium thermophilum. - J. Gen. Appl. Microbiol., 25, 51(3), 175-181. http://www.jstage.jst.go.jp/article/jgam/51/3/175/_pdf 2 - Cherry (H.M.), Towhid Hossain (M.D.), Anwar (M.N.) - Extracellular glucoamylase from the isolate Aspergillus fumigatus. - Pak. J. Biol. Sci., 24, 7(11) 1988-1992. 3 - Cooney (N.L.), Levine (D.W.) - Microbial utilization of methanol. - Adv. Appl. Microbiol., 1972, 15, 337-365. 4 - De Mot (R.), Verachtert (H.) - Purification and characterization of extracellular amylolytic enzymes from the yeast Filobasidium capsuligenum. - Appl. Environ. Microbiol., 1985, 5(6), 1474-1482. 5 - Dubey (A.K)., Suresh (C.), Kavitha (R.), Karanth (N.G.), Umesh- Kumar (S.) - Evidence that the glucoamylases and α-amylase secreted by Aspergillus niger are proteolytically processed products of a precursor enzyme. - FEBS Lett., 2, 471(2), 251-255. 6 - Dubois (M.), Gilles (K.A.), Hamilton (J.K.), Rebers (P.A.), Smith (F.) - Colorimetric method for determination of sugars and related substances. - Anal. Chem., 1956, 28, 35-356. http://pubs. acs.org/spotlight/ac6111a17.pdf 7 - Duo-Chuan (L.), YiJun (Y.), You-Liang (P.), Chong-Yao (S.) Peijin (Z.), Yicun (H.) - Purification and properties of a thermostable alpha amylase from the thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus.- Acta Microbiol. Sin., 1997, 37, 17-114. 8 - Fogarty (W.M.), Kelly (C.T.) - Amylase, amyloglucosidase and related glucanases. In Rose (A.H.) Ed. Economic microbiology, microbial enzymes and bioconversion. London: Academic Press, 198, Vol. 5, p. 115-17.

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