UNIVERSITE PARIS XII VAL DE MARNE

UNIVERSITE PARIS XII VAL DE MARNE THESE D UNIVERSITE Présentée pour obtenir le grade de DOCTEUR D UNIVERSITE Mention Biologie cellulaire et moléculaire Par Anouar DEKAKI IMPACT DE L UTILISATION D UN COMPOST VERT SUR L ACTIVITE ET LA DIVERSITE DE LA MICROFLORE TELLURIQUE Soutenue le 16 décembre 2008 devant le jury composé de : MORA Ph. Professeur, Université Paris XII Président LABAT M. Directeur de recherches, IRD Rapporteur FILALI-MALTOUF A. Professeur, Université Mohamed V Rapporteur PELE Ph. Société Vert Compost, Epiais Rhus Examinateur ROULAND C. Directeur de recherche, IRD Directeur de thèse

A tous ceux que j aime A Ahmad-Jamal A Tasnim

Remerciements Je tiens à exprimer toute ma reconnaissance et mes remerciements à Madame Corinne Rouland-Lefèvre, Directeur de recherches à l IRD, qui a accepté de diriger cette thèse et qui m a toujours témoigné de sa confiance tout au long de ce projet. Merci pour votre soutien, vos orientations et vos précieux conseils qui m ont permis de réaliser ce travail dans de bonnes conditions. Votre patience et vos encouragements m ont été très utiles à la réalisation de ma thèse. Encore merci Un grand merci aux membres de jury qui m ont fait l Honneur de juger ce travail. A Monsieur Philippe Pellé et Madame Laurence Tachon de la société Vert Compost qui a financé ce projet. Merci pour votre confiance et d avoir accepter d évaluer mon travail. A Monsieur Philippe Mora, Professeur à l université Paris 12. Merci pour vos conseils précieux et votre disponibilité tout au long de ma thèse. Merci également d avoir accepter d examiner mon travail. A Monsieur Abdelkarim Filali-Maltouf, Professeur à l Université Mohamed V à Rabat (Maroc). Merci pour vos encouragements et l intérêt que vous avez apporté à mon projet de recherche. Merci d avoir accepté d être rapporteur de ma thèse et de faire le déplacement pour juger mon travail. A Monsieur Marc Labat, Directeur de recherche à l IRD, Merci de m avoir fait l honneur d être rapporteur de ma thèse et de votre présence dans le jury. Je remercie particulièrement Monsieur Driss Azariz, Mesdemoiselles Cristelle Pichon et Fatima-Zahra Sellami qui ont participé activement à la réalisation de ce travail. Merci pour votre implication sérieuse dans ce projet et de votre curiosité scientifique. Je remercie vivement Monsieur Edouard Miambi, maître de conférences à l université Paris 12, pour sa bonne humeur quotidienne, ses critiques constructives ainsi que ses orientations et ses conseils en biologie moléculaire. Un grand merci à mon ancien collègue Monsieur Michel Diouf qui m a beaucoup aidé dans mes premières expériences en biologie moléculaire. Merci également à Monsieur George Reversat pour l aide et les conseils sur les cultures de plantes. Je tiens aussi à remercier vivement Mesdames Annabelle Mellot, Anne Pando et Joceline Roman pour leur disponibilité et de m avoir facilité techniquement et administrativement mon travail et mon intégration dans cette belle équipe du LEST.

Un grand merci à tous mes collègues et stagiaires du LEST et particulièrement ceux de la salle 15, avec qui j ai partagé de très bons souvenirs et de fructueux échanges sur des sujets scientifiques et non scientifiques. Merci à Alain, Anan, Backary, Choutinan, Dung, Herbert ou Joseph!, Hind, Jérôme, Kam Rigne, Louis, Roll, Sebastian, Simon, Thierry, Thomas, Trang, Yong Tao Je m excuse si j ai oublié d autres noms. Je voudrais aussi exprimer tout mon amour et ma reconnaissance à mes chers parents pour leur soutien et leur encouragement lors de la réalisation de ce travail. Une pensée toute particulière pour mon épouse Jamila. Merci pour ta patience et ton soutien qui m ont beaucoup aidé pour avancer dans mes travaux. Un grand merci à tous les membres de ma famille et mes proches, qui, par leurs soutiens et encouragements m ont aidé à réaliser ce projet. Et particulièrement, merci à Sabah, Mounia, Rajae, Soumia, Siham, AbdelMounaim, jamal et Hicham. Enfin, je ne peux terminer ces remerciements sans remercier tous mes amis au Maroc et en France (la liste est longue). Merci pour votre soutien et votre amitié.

Résumé Le compostage est une technique de valorisation des déchets organiques en un produit stable et riche en matières humiques. Certains composts «verts» se sont révélés être de 2 à 3 fois plus efficaces sur la croissance des plantes que les composts classiques. Notre étude réalisée sur un compost fabriqué à partir de déchets végétaux a permis de suivre l évolution de la densité et de la diversité de la microflore (bactéries, champignons) au cours du processus de maturation puis de tester l impact de ce compost sur la diversité et l activité de la microflore tellurique. Cette analyse a été effectuée par des techniques complémentaires : biochimiques (dosages enzymatiques), microbiologiques (cultures in vitro) et de biologie moléculaire (PCR- DGGE, Séquençage). Les résultats montrent qu au cours de sa maturation, le compost étudié présente une baisse significative de son taux d humidité et une augmentation sensible de son ph. Sa microflore subit une complète restructuration avec apparition de souches bactériennes susceptibles de dégrader des composés polluants comme les plastiques, les pesticides et les hydrocarbures. L ajout de ce compost à deux types de sol présentant des propriétés physico-chimiques différentes, n a pas montré de modifications importantes et durables de la diversité microbienne et fonctionnelle de celui-ci. Les causes de l effet remarquable de ce compost sur la croissance végétale sont discutées. Mots clés : Compost vert, sol, MPN, extraction d ADN, PCR, DGGE, dosages enzymatique. Summary Composting is a technique of transformation organic waste in a stable product rich in organic materials. Some "green" compost proved to be from 2 to 3 times more benefit on the growth of the plants than traditional composts. The main of this study is to follow the evolution of density and diversity of the microflora (bacteria, fungi) during the process of maturation of green compost manufactured from vegetable wastes, and to investigate the impact of this compost on the diversity and the activity of the telluric microflora. This analysis was carried out by complementary techniques: biochemical (enzymatic activity), microbiological (in vitro cultures) and molecular biology (PCR-DGGE, DNA sequencing). The results show that during its maturation, the studied compost presents a significant decrease of its water content and an appreciable increase in its ph. The microflora undergoes a complete reorganization with appearance of bacterial strain suitable for degrade polluting compounds like the plastics, the pesticides and hydrocarbons. The addition of this compost with two types of soil presenting of the different physicochemical properties, did not show significant and durable modifications of the microbial and functional diversity of this one. The causes of the remarkable effect of this compost on the vegetable growth are discussed. Key words: activity. Green compost, soil, MPN, extraction of ADN, PCR, DGGE, enzymatic

Sommaire Liste des figures....... 1 Liste des tableaux... 2 Liste des photos & schéma.. 3 Introduction générale Introduction. 5 Analyse Bibliographique I. Le compostage....... 8 I.1. Un peu d histoire... 8 I.2. Quelques définitions.. 8 I.3. L intérêt du compostage 9 I.4. Les phases du compostage 10 I.5. Les paramètres du compostage.. 11 a. Le taux d oxygène lacunaire.... 11 b. l humidité ou la teneur en eau du substrat... 11 c. La température. 12 d. Les caractères physico-chimiques des substrats.. 12 I.6. Les principales techniques de compostage 12 a.le compostage en andain ou en tas avec retournement.. 12 b. Le compostage en andain ou en tas statique avec aération active... 13 c. Le compostage en andain ou en tas statique avec aération passive. 13 d. Le compostage en andain ou en tas sans aération 13 I.7. Les différents types de compost 14 a. Les déchets urbains compostés 14 b. Autres composts... 15 II. Evolution des principales caractéristiques du compost au cours du compostage.. 15 II. 1. La teneur en eau.. 16 II.2. Le carbone organique... 16 II.3. L azote 16 II.4. Le rapport C/N.... 16 II.5. Le ph 17 II.6. La capacité d échange cationique (CEC). 17 III. Evolution de la matière organique des composts au cours du compostage... 17 III-1. Stabilisation de la matière organique des composts au cours du compostage..... 17 III- 2. Evolution de la composition biochimique de la matière organique des composts au cours du compostage.... 18 IV- Notion de maturité des composts.. 19 IV.1. Stabilité biologique de la matière organique du compost.. 19 IV.2. Suivi du rapport d humification (CAH/CAF).... 20

IV.3. L évolution de certaines caractéristiques physico-chimiques classiques... 20 IV.4. Autres critères de la maturité d un compost.. 21 V. Effet du compost sur la croissance végétale... 21 VI. Le compostage en France : conditions réglementaires de l utilisation des composts en agriculture... 22 Matériel et méthodes I. Matériel utilisé 25 I.1. Le compost.... 25 I.1.1. Echantillonnage.. 25 I.1.2. Mesure de l humidité et ph 28 a. Humidité... 28 b. Détermination du ph 28 I.2. Le sol..... 28 II. Effet de l ajout du compost sur le développement de deux plantes. 29 II.1. Dispositif expérimental.... 29 II.2. Mesure de la croissance des plantes..... 30 III. Effet de l ajout du compost sur l activité et la diversité de la microflore tellurique........ 30 III.1. Calibrage et étude de la stabilité du sol en microcosme. 30 III.2. Dispositif expérimental... 30 III.3. Prélèvements... 31 IV. Etude des communautés microbiennes..... 32 IV.1. Analyse de la microflore cultivable.... 32 IV.1.1. Microflore fongique 32 IV.1.2. Microflore bactérienne totale.. 32 a. Principe.... 32 b. Méthodologie... 32 IV.1.3. Etude fonctionnelle des souches isolées.. 33 a. Métabolisme. 33 b. Capacité à utiliser certains substrats de croissance.. 33 IV.2. Etude de la structure génétique des communautés microbiennes.. 33 IV.2.1. Extraction de l ADN 34 a. Dispersion des microorganismes..34 b. Lyse physique et chimique... 34 c. Précipitation et purification.. 34 d. Extraction sans phénol. 35 e. Précipitation de l ADN. 35 f. Contrôle de l ADN extrait 35 IV.2.2. Amplification ou Réaction de Polymérisation en Chaîne (PCR) 35 a. PCR pour bactéries... 36 b. PCR pour champignons... 36 c. Contrôle de l amplification.. 37 IV.2.3. Electrophorèse en Gradient de Dénaturation (DGGE) 37

V. Dosage des activités enzymatiques.. 38 V.1. Dosage des phosphatases. 38 V.2. Dosage des polysaccharidases.... 39 V.3. Dosage des hétérosidases. 40 V.4. Dosage des activités uréases 40 V.5. Dosage des arylsulfatases. 40 VI. Analyse statistique... 41 Résultats et discussions Chapitre 1 : Effet de l ajout du compost sur le développement de deux plantes Introduction..... 44 Résultats.. 44 I. Effet sur la croissance de la Véronique de Perse.... 44 II. Effet sur la croissance du blé... 46 Discussion 47 Chapitre 2 : Evolution des communautés microbiennes au cours du processus de maturation du compost I. Evolution du ph et du taux d humidité dans le compost au cours du temps... 49 I.1. Le ph. 49 I.2. L humidité relative 50 II. Evolution de la densité et de la diversité microbienne au cours du processus du compostage.... 50 II.1. Numération des communautés microbienne 50 II.1.1. Communautés fongiques... 51 II.1.2. Communautés bactériennes... 51 II.2. Etude de la diversité fongique et évolution fonctionnelle au cours de la maturation..... 52 II.2.1. Souches cultivables... 53 II.2.2. Place taxonomique des isolats sélectionnés.. 53 II.2.3. Caractérisation fonctionnelle des souches.... 54 a. Enzymologie. 54 b. Capacité à utiliser différents polysaccharides comme substrat de croissance.. 56 II.2.4. Comparaison entre les capacités fonctionnelles des composts C1 et C12... 57

II.3. Etude de la diversité actinomycétale et évolution fonctionnelle au cours de la maturation. 59 II.3.1. Diversité morphotypique de la flore cultivable. 59 II.3.2. Caractérisation fonctionnelle des souches. 59 a. Dégradation des aromatique. 59 b. Enzymologie.... 60 II.4.3. Comparaison entre les capacités fonctionnelles des composts C1 et C12... 61 II.4. Evolution de la structure génétique des communautés bactriennes au cours de la maturation du compost. 62 Discussion... 65 Chapitre 3 : Impact de l ajout du compost sur l activité et la diversité de la microflore tellurique I. Comparaison des propriétés physicochimiques et biologiques des deux sols étudiés...... 69 I.1. Propriétés physico-chimiques....69 I.2. Caractéristiques biologiques. 69 I.2.1. Numération bactérienne par MPN...... 69 I.2.2. Numération fongique.. 70 I.2.3. Activités enzymatiques... 70 II. Evolution de la microflore tellurique en présence de compost 71 II.1 Numération bactérienne.... 72 II.2. Numération fongique 73 III. Effet de l ajout du compost sur la diversité fonctionnelle de la microflore tellurique 73 III.1. Cycle du carbone.... 73 a. ß-glucosidase.... 74 b. Amylase... 75 c. Cellulase... 75 d. Xylanase... 75 III.2. Cycle du phosphore.... 75 a. Phosphatase acide.... 75 b. Phosphatase alcaline 76 III.3. Cycle de l azote... 76 a. N-acétyl-glucosaminase... 76 b. Uréases.. 77 III.4. Cycle du soufre... 78 Arylsulfatase 78 III.5. Comparaison des potentialités fonctionnelles des sols B et F avec ou sans compost... 78 IV. Diversité de la microflore fongique cultivable après l ajout du compost.. 80 IV.1. Diversité morphotypique de la flore cultivable.. 80 IV.2. Diversité métabolique des morphotypes 82

IV.2.1. Test Api-zym... 82 VI.2.2. Capacités de souches fongiques à utiliser des macromolécules végétales pour leur croissance..... 83 V. Diversité de la microflore bactérienne... 84 V.1. Extraction et amplification d ADN. 84 V.2. DGGE des expérimentations avec le sol B. 84 V.3. DGGE des expérimentations avec le sol F...... 86 Discussion I. Evolution de la microflore tellurique en présence de compost. 87 II. Effet de l ajout du compost sur l activité biologique du sol. 88 III. Effet de l ajout du compost sur la diversité de la microflore..... 90 Conclusions et perspectives Conclusions générales..... 93 Perspectives. 95 Bibliographie Bibliographie... 97 Annexes Liste des annexes..... 106