Détections des carbapénèmases chez les Entérobactéries
CMI CASFM 2011 Souches Ertapénème intermédiaires ou résistantes Tests complémentaires
CMI Techniques : E-test : problèmes des micro-colonies Automatisées : variabilité selon inoculum Souches exprimant faiblement la carbapénèmase
Tests complémentaires CMI imipénème (et méropénème si à rendre) Test avec cloxacilline : Milieu MH avec cloxacilline à 250mg/l Disques avec cloxacilline + antibiotique Synergie avec inhibiteurs en disques: EDTA : 750 µg par disque antibiotique Acide boronique : 400 à 600 µg par disque antibiotique Acide clavulanique : synergie avec disque amox+ac.clavulanique disque double commercialisés Test de Hodge
Test de Hodge : réalisation E. coli multisensible (0,5 McF dilué au 1/10) Disque d imipénème 10 µg (ou ertapénème 10 µg) Stries fines de la bactérie à tester prélevée sur milieu solide (öse de 1 µl) Gélose MH 24 heures à 37 C en aérobiose
Test de Hodge : réalisation Test de Hodge négatif = souche non productrice de carbapénémase Culture confluente d E. coli Diamètre d inhibition d E. coli Test de Hodge positif = souche productrice de carbapénémase (?)
Test de Hodge : réalisation CQ1 et CQ2 : souches non productrices de carbapénèmases CQ3 et CQ4 : souches de K.pneumoniae productrices d OXA-48
Test de Hodge : réalisation K.pneumoniae : bla KPC sauvage BLSE + perte de porine Sensible (100 %) Mais : Réalisation et interprétation délicate si non expérimenté Problème de spécificité (90%) Endimiani et al., JCM 2010
Synergie en disques carbapénèmes avec et sans inhibiteurs Cloxacilline EDTA (ou acide dipicolinique) chélateur : inhibe les métallo-enzymes Acide boronique Acide 3-aminophénylboronique (APB) Inhibe ± les céphalosporinases chromosomiques Inhibe les KPC Gélose MH, suspension à 0,5 McF, 18-24 h à 37 C Apprécie l activité des inhibiteurs seuls Basée sur la restauration d activité du pénème
Synergie en disques carbapénèmes avec et sans inhibiteurs EDTA Cloxa ATB EDTA + ATB Cloxa + ATB APB APB + ATB APB : acide boronique Cloxa : cloxacilline ATB : carbapénème
EDTA 5 mm EDTA < 5 mm Cloxa EDTA + ATB Cloxa EDTA + ATB < 5 mm Cloxa + ATB APB < 5 mm Cloxa + ATB APB < 5 mm 5 mm APB + ATB APB + ATB Métallo-carbapénémase de classe B Carbapénémase de classe A (KPC, ) EDTA Cloxa EDTA + ATB 5 mm Cloxa + ATB APB APB + ATB AmpC + imperméabilité < 5 mm 5 mm EDTA Cloxa EDTA + ATB < 5 mm Cloxa + Erta APB < 5 mm APB + ATB Ni AmpC ni carbapénémase (ou de classe D)
Synergie E-Tests combinés carbapénèmes avec et sans inhibiteurs Présence d une métallo-ß-lactamase CMI Imipénème/CMI IMP+EDTA : rapport 8 Zone fantôme Déformation
Mécanisme Test de Hodge Chélateur (EDTA) Acide boronique Cloxacilline Carbapénèmase classe A = KPC + - + - Carbapénèmase classe B = VIM, NDM-1 + + - - Carbapénèmase classe D = OXA + - - - Céphalosporinase (AmpC) + imperméabilité? - + + Ni AmpC, ni KPC, ni MBL - - - - Rappel : en présence d une carbapénémase, il n y a pas lieu de modifier l interprétation des carbapénèmes catégorisés comme sensibles (CA-SFM 2011)
Carbapénèmases Classe D / 2d Oxacillinase Tests des disques combinés EDTA Cloxa AB AB : Ac.boronique 20mg/ml x 20µl Cloxa : Cloxacilline 25 mg/l x 30 µl EDTA O,5 M/L : 10µl MEM MEM MEM MEM Rien! OXA-48
Imperméabilité et Céphalosporinase hyperproduite Sans Cloxa Avec Cloxa 250 mg/l Reste l imperméabilité Inhibe la céphalosporinase MOX MOX ATM ERT ERT AMC AMC ATM FEP FOX FOX FEP
Carbapénèmases Classe A / 2f KPC AB : Ac.boronique 400µg EDTA Cloxa AB Cloxa : Cloxacilline 750µg EDTA O,5 M/L : 10µl Synergie nette avec Ac.boronique MEM MEM MEM MEM
Carbapénèmase de classe B MBL ( IMP-13 ) IMP 5 10 15 EDTA +EDTA 5l +EDTA 15l 5 +EDTA +EDTA 10l 10 EDTA 15 CMI = 128 mg/l +EDTA = 16 mg/l Hydrolyse significative de l imipénème, inhibée par EDTA.
Carbapénèmase de classe A / 2f IMI-2 AMX AMC TCC TIC AMC AMC AMC CF CTX CAZ TZP FOX MA CRO CXM EDTA EDTA AMC AMC AMC
Recettes Acide boronique 20 mg/ml soit 120 mg dans 3 ml de DMSO + 3 ml d eau Dépôt de 20 µl par disque, soit 400 µg par disque Ou disques Rosco EDTA ph = 8, concentration = 0,5 M Dépôt de 5 ou 10 µl par disque Acide dipicolinique Disques Rosco (250 µg) Cloxacilline 1 g d Orbénine dans 40 ml d eau distillée Dépôt de 10 µl par disque, soit 250 µg par disque
La confirmation moléculaire Tests phénotypiques parfois délicats d interprétation Confirmation moléculaire indispensable apporte une certitude rapide de la présence ou non du gène d une carbapénémase Nombreuses techniques décrites PCR classiques PCR en temps réel (VIM, KPC )
Milieux sélectifs et/ou chromogènes Milieu Brillance Oxoid Milieu maison Drig + Caz 1mg/l E.coli (NDM-1) et K.pneumoniae (OXA-48 + BLSE)
Mais Milieu Brillance Oxoid Milieu Brillance Oxoid K.pneumoniae (BLSE + imperméabilité) C.freundii (AmpC hyperproduite)