Modèles in vitro et tests antibiotiques Julien Buyck, Dr Sc. En collaboration avec Françoise Van Bambeke, Dr Sc. Pharm., Eugénie Basseres, Dr Sc., & Paul M. Tulkens, Dr Med. Pharmacologie cellulaire et moléculaire Louvain Drug Research Institute Université catholique de Louvain, Bruxelles, Belgique Avec approbation de la plateforme belge d'éthique médicale - visa n 13/V1/5773/052539 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 1
Les antibiotiques sauvent-ils toujours? Cet homme a découvert le mode d'action des pénicillines et est décédé d'une infection pneumococcale invasive http://www.cip.ulg.ac.be/newsite/pdf/jmghuysen.pdf 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 2
Quelles sont les méthodes d'évaluation de l'activité des antibiotiques? L'activité des antibiotiques est établie sur base de méthodes in vitro pour des raisons évidentes de facilité et de possibilité de standardisation A ce jour, trois grandes normes à considérer EUCAST (Europe la SFM en fait partie officielle) CA-SFM (France et plusieurs pays francophones) CLSI (Etats-Unis et un grand nombre d'autres pays) http://www.sfm-microbiologie.org Objectifs: Standardiser les méthodologies Etablir des concentrations critiques S accorder sur l expression des concentrations critiques http://www.eucast.org http://www.clsi.org/ 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 3
EUCAST 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 4
EUCAST Consensus Européen (UK, FR, NL, DE, SV, NO) Budget Européen (pas de liens commerciaux) "Breakpoints" communs au travers de l'europe (!) Correction de l'ancienne situation Méthodologie commune pour les méthodes par disque Tout est exprimé en termes de CMI (méthode ISO) 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 5
CA-SFM Recommandations annuelles Depuis 2010, reprend les recommandations de l'eucast car le CA- SFM en fait partie intégrante Mais peut présenter quelques rares divergences en fonction des Recommandations de l Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des Produits de santé (ANSM; ex AFSSAPS) et des Sociétés savantes Posologies et produits spécifiques de la France 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 6
CLSI Disponible pour la plupart des antibiotiques Evaluation des molécules par un comité scientifique indépendant Recommandations très détaillées Très largement utilisé et considéré comme référence dans les publications Mais : Payant Les décisions sont prises avec les industries Les antibiotiques qui ne sont pas enregistrés aux U.S. ne sont pas pris en compte Les concentrations critiques sont souvent plus élevées que celles considérées aujourd'hui comme raisonnables 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 7
CLSI: attention! Since 2006, FDA has reasserted its legal rights to define official breakpoints CLSI may determine and publish breakpoints BUT no sooner than 24 months after FDA decision (and only if the company requests this [?]) In the meantime, only FDA breakpoints will be legal in the US, and will be essentially geared to the protection of the US Public for drugs registered in the US. Non-US organizations have no direct possibility to impact on the FDA-decision process... communicated at the General meeting of EUCAST during the 17th ECCMID & 25th ICC (Munich, Germany) by the CLSI representative 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 8
Comparaison des normes pour la détermination des CMI et la résalisation de l antibiogramme Pseudomonas aeruginosa CA-SFM EUCAST CLSI Souche référence Culture Inoculum ATCC 27853 o/n bouillon ou gélose 0.5 McFarland Milieu Mueller-Hinton (agar ou bouillon) CA-MHB (ou MHA) Temps incubation 18-24h 35-37 C 18 ± 2 h 35 ± 1 C 16-20 h 35 ± 2 C 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 9
Comparaison des breakpoints Pseudomonas aeruginosa CMI (mg/l) Ca-SFM Eucast CLSI S R S R S R Tobramycin 4 > 4 4 > 4 < 4 > 16 Ciprofloxacin 0.5 > 1 0.5 > 1 < 1 > 4 Piperacillin/ Tazobactam 16 > 16 16 > 16 < 16 > 128 Colistin 2 > 4 4 > 4 < 2 > 8 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 10
Comparaison des breakpoints Pseudomonas aeruginosa cumulative percentage (%) 100 80 60 40 20 Piperacilline/Tazobactam N = 90 souches (pneumonie nosocomiale) CLSI EUCAST / SFM 0 0.125 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 Population «sauvage» Riou et al., Int J Antimicrob Agents. 2010; 36:513-22. 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 11
Devons nous améliorer les méthodes d'évaluation de l'activité des antibiotiques? Les méthodes sont définies par les normes établies pour les bactéries en bouillon ou sur gélose... Mais, ces méthodes sont-elles les bonnes pour des bactéries dans un foyer infectieux (milieu, densité, SCV ) en "communauté structurée" (biofilm) dans des niches "protégées" (intracellulaires, abcès, ) 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 12
Activité intracellulaire des antibiotiques Infection intracellulaire Gentamicin 5.0 Extracellulaire CMI = Concentration statique log CFU from time 0 2.5 0.0-2.5 Intracellular Extracellular -5.0-3 -2-1 0 1 2 3 log extracellular concentration (µg/ml) Intracellulaire Puissance relative Efficacité maximale Bactérie: «switch» phénotypique Expression de résistance Antibiotique: Accès aux bactéries Effet milieu Buyck et al., Antimicrob Agents Chemother. 2013; 57:2310-8 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 13
Quelle est l'importance du milieu? Infection intracellulaire = antibiotiques en milieu pour cellules eucaryotes MIC (mg/l) Antibiotic CA-MHB ph 7.4 ph 5.5 RPMI-1640 Aminoglycosides Gentamicin 2 8 4 Amikacin 4 64 4 Tobramycin 1 8 1 -lactams Piperacillin/Tazobactam 16 16 16 Cefepime 4 8 4 Ceftazidime 2 4 2 Aztreonam 8 16 8 Meropenem 1 1 2 Fluoroquinolones Ciprofloxacin 0.125 0.25 0.125 Polymyxins Buyck et al. Clin Infect Dis. 2012; 55:534-42 Colistin 1 2 2 Azithromycine 128 >512 16 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 14
Quelle est l'importance du milieu? Influence du milieu sur les CMI des macrolides MIC of azithromycin (mg/l) 512 256 128 64 32 16 8 4 2 512 256 128 64 32 16 8 4 2 HS MHB FCS MHB HS RPMI FCS RPMI MICs in mice BAL = 16 mg/l 1 Ca-MHB LB TS BHI RPMI Medium RPMI-S MEM MEM-S 1 0 10 25 50 75 Percentage of serum in medium L activité de l AZM est meilleure dans les milieux «biologiques» Buyck et al. Clin Infect Dis. 2012; 55:534-42 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 15
Quelle est l'importance du milieu? OprM X 1 5 MexAB-OprM MexXY-OprM prot X oprm X prot 2 4 3 MHB high MIC RPMI low MIC Buyck et al. Clin Infect Dis. 2012; 55:534-42 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 16
Quelle est l'importance du milieu? 100 NPN C nitrocefin OprM Outer Membrane permeability (%) 75 50 25 0 A MHB B BAL RPMI a MHB b RPMI prot 1 prot MexAB-OprM MexXY-OprM oprm MHB high MIC RPMI low MIC Buyck et al. Clin Infect Dis. 2012; 55:534-42 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 17
Quelle est l'importance du milieu? OprM 1 prot 2 prot MexAB-OprM MexXY-OprM MHB high MIC oprm RPMI low MIC C 14 -CLR accumulation (ng/mg of prot.) 6 5 4 3 2 1 0 MHB RPMI * 0 4 8 Time (h) Buyck et al. Clin Infect Dis. 2012; 55:534-42 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 18
Quelle est l'importance du milieu? OprM 1 prot 2 prot 3 X RPMI-1640 no AZM CA MHB AZM 1 mg/l MexAB-OprM MexXY-OprM oprm 1.50 * oprm relative expression 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 4 8 * 4 8 MHB high MIC RPMI low MIC time (h) Buyck et al. Clin Infect Dis. 2012; 55:534-42 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 19
Quelle est l'importance du milieu? 1 X OprM MexAB-OprM MexXY-OprM prot X oprm X prot 2 4 3 MHB high MIC RPMI low MIC Buyck et al. Clin Infect Dis. 2012; 55:534-42 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 20
Quelle est l'importance du milieu? OprM 1 X 5 MexAB-OprM MexXY-OprM prot X oprm X prot 2 4 3 MHB high MIC RPMI low MIC Buyck et al. Clin Infect Dis. 2012; 55:534-42 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 21
Et pour le biofilm? Modèle de biofilm dans l ASM (artificial sputum medium) L ASM mime l environnement retrouvé dans les poumons des patients mucoviscidosiques : Croissance des bactéries plus lente Habilité à former des micro et macro colonies P. aeruginosa + ASM Croissance 24h (biofilms jeunes) ou 12 jours (biofilms matures). ASM: mucine ADN amino acids sels jaune d oeuf chélateur de fer (Sriramulu et al., 2005) Crystal violet Liaison à la matrice biomasse Fluorescein DiAcetate Molécule qui fluoresce quand elle est clivée pas les estérases viabilité 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 22
Et pour le biofilm? Développement du biofilm MHB ASM 80000 70000 viabilité biomasse 15 80000 70000 15 em fluorescence 518 nm 60000 50000 40000 30000 20000 10 5 absorbance 590 nm em fluorescence 518nm 60000 50000 40000 30000 20000 10 5 absorbance 590nm 10000 10000 0 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 jours 0 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 jours 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 23
Et pour le biofilm? Activité des antibiotiques sur les biofilms matures Biofilms de 12 jours, traitement antibiotique de 24 h MHB ASM % fluorescence par rapport au controle non traité 100 75 50 25 viabilité biomasse 100 75 50 25 % absorbance par rapport au controle non traité % fluorescence par rapport au controle non traité 100 75 50 25 viabilité biomasse 100 75 50 25 % absorbance par rapport au controle non traité 0 0-1.5-1.0-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 log concentration ciprofloxacine (µg/ml) 0 0-1.5-1.0-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 log concentration ciprofloxacine (µg/ml) 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 24
Conclusions Les normes sont une chose pour le laboratoire (et sont utiles) mais la réalité pour l'infectiologue en est une autre Des efforts pourraient être faits pour définir des milieux utilisables in vitro qui soient plus pertinents de la situation clinique La situation prévalent in vivo devrait être mieux modélisée en termes de réponse aux antibiotiques L'impact du biofilm sur l'évaluation de la sensibilité est essentiel et devrait être inclus dans les méthodes standards 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 25
Déclaration de Transparence Le laboratoire a bénéficié de crédits de sources nationale belge (Politique Scientifique Fédérale), communautaire (Fonds de la Recherche Scientifique) et régionales (Région de Bruxelles-Capitale/Brussels Hoofdstedelijke Gewest et Région Wallonne) Les activités concernant l'étude des biofilms est soutenue par SMB-Galephar (Belgique) et Rib-X Pharmaceuticals (Etats-Unis) Cette présentation a été soutenue par BioFilm Control SAS. 12/6/2013 14èmes Journées Nationales d'infectiologie, Clermont-Ferrand 26