Académie de Nantes THÈSE DE DOCTORAT DE L UNIVERSITÉ DU MAINE Le Mans, FRANCE Spécialité : Biophysiologie des organismes et des populations présentée par Manuela FOUQUERAY pour obtenir le titre de Docteur d Université Dynamique de l acclimatation des diatomées marines aux rayonnements ultraviolets : approches physiologiques, biochimiques et moléculaires Soutenance le 13 décembre 2007 devant le jury composé de M. BERTRAND Maître de Conférences, Intechmer CNAM, rapporteur S. LEFEBVRE Maître de Conférences, Université de Caen Basse-Normandie, rapporteur J. FLEURENCE Professeur, Université de Nantes, examinateur A. MANCEAU Professeur,Université du Maine, co-directeur de thèse J.-L. MOUGET Maître de Conférences,Université du Maine, co-directeur de thèse G. TREMBLIN Professeur, Université du Maine, directeur de thèse
Remerciements : Je remercie tout d abord Monsieur J. Fleurence (Professeur, Université de Nantes) d avoir accepté la présidence de mon jury de thèse, ainsi que Madame M. Bertrand (Maître de conférences, Institut National des Sciences et Techniques de la Mer, Cherbourg) et Monsieur S. Lefebvre (Maître de conférences, Université de Caen) d avoir accepté d être rapporteurs de ce travail. Je les remercie pour leurs commentaires qui ont permis d améliorer le manuscript. Je remercie Monsieur G. Tremblin (Professeur, Université du Maine) d avoir accepté la direction de ma thèse, de m avoir conseillée quand j en avais besoin et de m avoir fait confiance, même quand mes choix n était pas à son goût (utilisation de Latex, par exemple!). Je remercie Madame A. Morant-Manceau (Professeur, Université du Maine), co-directrice, pour l encadrement de ce travail concernant les approches biochimiques et moléculaires. J ai beaucoup appréciée son soutien et son aide pour les enseignements que j ai pû effectué dans le cadre du monitorat. Je remercie Monsieur J.-L. Mouget (Maître de conférences, Université du Maine), co-directeur de cette thèse, pour ses conseils et la con fiance qu il m a accordée lors de mes travaux en fluorimétrie modulée. Je tiens aussi à remercier Mademoiselle A. Caruso (Maître de conférences, Université du Maine), grâce à qui l approche moléculaire a pu être réalisée et qui m a tant appris. Je tiens aussi à exprimer ma reconnaissance à tous ceux qui m ont aidée, scientifiquement ou personnellement, au cours de ce travail de thèse : Yann, Nathalie, Françoise, Vincent et Justine. De même, je tiens à remercier ceux qui m ont aidée dans mes expérimentations, soit par leur expérience (merci beaucoup Elisabeth), soit pour leur patience, je pense à Rose-Marie, Bérengère, Boris et Romain. Je remercie aussi tous mes amis doctorants et docteurs : Nhung, Laurence, Freddy, Céline, Stephane, Cécile, Laurent, Anne, Alex et tous ceux que j oublie. Je remercie aussi ma famille, mes parents et mes soeurs, pour m avoir toujours soutenue, d avoir toujours crû en moi et de m avoir fait confiance dans mes choix. Merci à toi aussi Charlotte. Enfin, je remercie Claude pour son soutien, sa patience, son aide, ainsi qu Ishtar (mon chat!) pour ses câlins quand j en avait besoin. A nous le Japon...
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Table des matières Liste des Figures Liste des Tableaux Abréviations v ix xi I Introduction générale 1 1 La photosynthèse 5 1.1 La photosynthèse oxygénique............................. 5 1.2 Particularités des diatomées.............................. 12 1.2.1 Morphologiques................................. 12 1.2.2 Photosynthétique................................ 13 2 Concept de stress, photoinhibition et rayonnement ultraviolet 17 2.1 Concept de stress.................................... 17 2.2 La photoinhibition................................... 18 2.3 Les rayonnements ultraviolets............................. 20 2.4 Les espèces réactives de l oxygène........................... 22 3 Mécanismes de défense et de protection 25 3.1 Les mycosporines.................................... 25 3.2 Les enzymes antioxydantes............................... 26 II Matériel et Méthodes 31 4 Méthodologie 33 i
ii TABLE DES MATIÈRES 4.1 Matériel végétal..................................... 33 4.2 Culture......................................... 34 4.3 Densité cellulaire et teneur en chlorophylle a..................... 34 4.4 Traitement lumineux.................................. 35 4.4.1 Dispositif expérimental............................. 36 4.4.2 Mesure de la lumière visible et des ultraviolets............... 38 4.4.3 Fonctions Biologiques de Pondération.................... 38 4.4.4 Analyses statistiques.............................. 39 5 Approches physiologiques : Fluorimétrie modulée 41 5.1 Principe......................................... 41 5.2 "Rapid Light Curve".................................. 43 5.2.1 Principe..................................... 43 5.2.2 Mesure...................................... 44 5.3 Courbes de réponse à l exposition........................... 46 5.3.1 Principe..................................... 46 5.3.2 Mesure...................................... 46 5.3.3 Traitement à la lincomycine.......................... 47 6 Approches biochimiques 49 6.1 Enzymes antioxydantes................................. 49 6.1.1 Extraction des protéines hydrosolubles.................... 49 6.1.2 Dosage des protéines hydrosolubles...................... 49 6.1.3 Mesure de l activité superoxyde dismutase.................. 49 6.1.4 Mesure de l activité catalase.......................... 50 6.1.5 Mesure de l activité ascorbate peroxydase.................. 50 6.2 Extraction et dosage spectrophotométrique des mycosporines........... 51 6.3 Mesure de l activité anhydrase carbonique...................... 51 7 Approche moléculaire 53 7.1 Extraction de l ADN génomique............................ 53 7.2 Extraction des ARN totaux.............................. 54 7.3 Transcription inverse................................. 54 7.4 Amplification par PCR................................. 55
TABLE DES MATIÈRES iii 7.4.1 Anhydrase carbonique............................. 55 7.4.2 Phosphoénolpyruvate carboxylase....................... 59 7.5 Clonage / séquençage................................. 62 7.6 Expresssion : Northern Blotting............................ 62 III Résultats 65 8 Effets d une exposition de 5 h aux UV 67 8.1 Evolution de F 0 et de F m............................... 67 8.2 Evolution des rendements quantiques......................... 69 8.3 Constantes de dommages et de réparation...................... 72 8.4 Détermination des paramètres photosynthétiques à l aide des "Rapid Light Curves" 74 8.5 Effets des UV sur l activité anhydrase carbonique.................. 76 8.6 Discussion : Effet d une courte exposition aux UV.................. 77 9 Dynamique de l acclimatation aux rayonnements ultraviolets 81 9.1 Croissance et concentration cellulaire en protéines et en chlorophylle a....... 81 9.2 Suivi de la réponse photosynthétique......................... 84 9.2.1 Evolution des paramètres de fluorescence F 0 et F m............. 84 9.2.2 Evolution du rendement quantique effectif Φ P SII.............. 88 9.2.3 Evolution des constantes de dommages et de réparation.......... 91 9.3 Réponse photosynthétique déterminée à partir des "Rapid light curves"..... 94 9.4 Discussion : Dynamique de l acclimatation...................... 99 10 Mécanismes de protection et de défense 103 10.1 Activités enzymatiques antioxydantes......................... 103 10.2 Mycosporines...................................... 107 10.3 Discussion........................................ 109 11 Caractérisation et expression des gènes 111 11.1 Recherche des gènes de l anhydrase carbonique.................... 111 11.1.1 α-anhydrase carbonique............................ 111 11.1.2 β-anhydrase carbonique............................ 112 11.2 Recherche des gènes de la phosphoénolpyruvate carboxylase............ 114
iv TABLE DES MATIÈRES 11.3 Expression des gènes de la phosphoénolpyruvate carboxylase............ 122 11.4 Discussion........................................ 123 IV Discussion générale et perspectives 127 Bibliographie 133 A Eau de mer artificielle et solutions 147 B Evolution des rendements quantiques maximum : paramètres F v /F m 151 C Article 157
Liste des Figures 1.1 Schéma détaillé de l organisation des complexes protéiques photosynthétiques.. 6 1.2 Representation schématique du centre réactionnel d un photosystème....... 6 1.3 Fonctionnement d une unité photosynthétique.................... 7 1.4 Schéma thermodynamique en "Z" du transfert des électrons à travers la chaîne photosynthétique.................................... 8 1.5 Schéma du cycle de Calvin............................... 9 1.6 Mode d action de la Rubisco.............................. 11 1.7 Métabolisme carboné de type C4........................... 11 1.8 Représentation des différents composants du frustule d une diatomée....... 12 1.9 Schéma de l origine hypothétique des algues..................... 13 1.10 Cycle des xanthophylles chez les Hétérokontophytes................. 14 1.11 Représentation des mécanismes de concentration du carbone chez les diatomées. 16 2.1 Phases successives d un stress............................. 18 2.2 Effet théorique des rayonnements ultraviolets.................... 20 2.3 Sites de production des espèces réactives de l oxygène dans une cellule végétale. 23 2.4 Production des espèces réactives de l oxygène au niveau des thylacoïdes..... 24 3.1 Cycle redox de l ascorbate dans le chloroplaste................... 27 4.1 Photographies en microscopie optique des diatomées étudiées........... 34 4.2 Spectres des sources lumineuses employées...................... 36 4.3 Représentation schématique du montage expérimental............... 37 4.4 Spectre de transmission du film de polyéthylène utilisé............... 37 4.5 Spectre des lampes ultraviolettes du montage après pondération avec les "BWF" 39 5.1 Evolution de l émission de fluorescence........................ 42 v
vi LISTE DES FIGURES 5.2 "Rapid Light Curves" d Amphora coffeaeformis................... 45 7.1 Alignement des séquences protéiques d α-anhydrase carbonique.......... 56 7.2 Alignement de séquences protéiques de β-anhydrase carbonique.......... 58 7.3 Schéma du principe de la Nested PCR........................ 60 7.4 Alignement des séquences nucléiques de la PEPCase de Phaeodactylum tricornutum et Thalassiosira pseudonana........................... 61 8.1 Variation des paramètres F 0 et F m au cours d une exposition de 5 h aux UV... 68 8.2 Variation des paramètres Φ P SII et F v /F m pour Amphora coffeaeformis et Entomoneis paludosa.................................... 69 8.3 Variation des paramètres Φ P SII et F v /F m pour Haslea ostrearia, Odontella aurita et Skeletonema costatum............................... 70 8.4 Courbes retr/e établies avec Amphora coffeaeformis, Entomoneis paludosa, Haslea ostrearia, Odontella aurita et Skeletonema costatum au cours d une exposition aux UV......................................... 74 8.5 Activité anhydrase carbonique (AC) externe, interne et totale (unité enzymatique par mg de Chl a) après une exposition de 5 heures aux UV............ 76 9.1 Evolution du taux de croissance ( j 1 ) pendant 8 jours de traitement UV..... 82 9.2 Evolution de la concentration cellulaire en protéines (en µg par million de cellules) après 1, 3, 5 et 8 jours de traitement UV....................... 82 9.3 Evolution de la concentration cellulaire en chlorophylle a (µg par million de cellules) après 1, 3, 5 et 8 jours de traitement UV................... 83 9.4 Variation des paramètres F 0 et F m au cours du stress UV chez (a) Amphora coffeaeformis et (b) Entomoneis paludosa après 1, 3, 5 et 8 jours d exposition aux UV............................................ 85 9.5 Variation des paramètres F 0 et F m au cours du stress UV chez (a) Haslea ostrearia et (b) Odontella aurita après 1, 3, 5 et 8 jours d exposition aux UV........ 86 9.6 Variation des paramètres F 0 et F m au cours du stress UV chez Skeletonema costatum après 1, 2 et 3 jours d exposition aux UV.................. 87 9.7 Variation du paramètre Φ P SII chez Amphora coffeaeformis, Entomoneis paludosa, Haslea ostrearia et Odontella aurita durant 1, 3, 5 et 8 jours de traitement UV. 88
LISTE DES FIGURES vii 9.8 Variation du paramètre Φ P SII pour Skeletonema costatum durant 1, 2 et 3 jours de traitement UV.................................... 89 9.9 Constantes de dommages maximum (k inh ), de dommages (k) et de réparation (r) aux jours 1, 3, 5 et 8 de traitement UV, calculées à partir du paramètre Φ P SII pour Amphora coffeaeformis, Entomoneis paludosa, Haslea ostrearia et Odontella aurita.......................................... 91 9.10 Evolution du rapport r/k aux jours 1, 3, 5 et 8 de traitement UV, calculé à partir du paramètre Φ P SII pour Amphora coffeaeformis, Entomoneis paludosa, Haslea ostrearia et Odontella aurita............................. 92 9.11 Constantes de dommages maximum (k inh ), de dommages (k) et de réparation (r) et rapport r / k aux jours 1, 2 et 3 de traitement UV, calculées à partir du paramètre Φ P SII pour Skeletonema costatum.................... 93 9.12 Evolution de l efficacité photosynthétique, du taux relatif maximum de transport des électrons et de l irradiance de saturation au cours du stress UV pour Amphora coffeaeformis et Entomoneis paludosa aux jours 1, 3, 5 et 8 de traitement UV.. 95 9.13 Evolution de l efficacité photosynthétique, du taux relatif maximum de transport des électrons et de l irradiance de saturation au cours du stress UV pour Haslea ostrearia et Odontella aurita aux jours 1, 3, 5 et 8 de traitement UV....... 96 9.14 Evolution de l efficacité photosynthétique, du taux relatif maximum de transport des électrons et de l irradiance de saturation au cours du stress UV pour Skeletonema costatum aux jours 1, 2, et 3 de traitement UV................ 97 10.1 Activité spécifique de la superoxyde dismutase (SOD), de l ascorbate peroxydase (APX) et de la catalase (CAT) chez Amphora coffeaeformis et Entomoneis paludosa en fonction du jour d exposition aux UV.................... 104 10.2 Activité spécifique de la superoxyde dismutase (SOD), de l ascorbate peroxydase (APX) et de la catalase (CAT) chez Haslea ostrearia et Odontella aurita en fonction du jour d exposition aux UV........................... 105 10.3 Activité spécifique de la superoxyde dismutase (SOD), de l ascorbate peroxydase (APX) et de la catalase (CAT) chez Skeletonema costatum en fonction du jour d exposition aux UV.................................. 106
viii LISTE DES FIGURES 10.4 Spectres d absorption entre 250 et 400 nm d extraits méthanoliques chez Amphora coffeaeformis, Entomoneis paludosa, Haslea ostrearia et Odontella aurita en fonction du jour d exposition aux UV........................... 108 11.1 Alignement des séquences nucléotidiques de la β-ac de Phaeodactylum tricornutum obtenues à partir de l ADNg et de l ADNc................... 113 11.2 Caractérisation de l extrémité 3 de la PEPCase d Amphora coffeaeformis par RT- PCR et Nested PCR.................................. 114 11.3 Caractérisation de l extrémité 3 de la PEPCase d Amphora coffeaeformis après clonage.......................................... 115 11.4 Séquences nucléique et protéique du clone codant une PEPCase putative d Amphora coffeaeformis...................................... 116 11.5 Alignement des séquences nucléiques de la PEPCase d Amphora coffeaeformis, Phaeodactylum tricornutum et Thalassiosira pseudonana.............. 117 11.6 Alignement des séquences protéiques de la PEPCase................ 119 11.7 Arbre phylogénétique de la phosphoénolpyruvate carboxylase........... 121 11.8 Analyse par Northern Blot de l accumulation des transcrits de PEPCase codant une phosphoenolpyruvate carboxylase putative chez Amphora coffeaeformis exposée à 1, 3, 5 et 8 jours de traitement UV....................... 122 B.1 Variation du paramètre F v /F m chez Amphora coffeaeformis, Entomoneis paludosa, Haslea ostrearia et Odontella aurita durant 1, 3, 5 et 8 jours de traitement UV. 152 B.2 Variation du paramètre F v /F m chez Skeletonema costatum durant 1, 2 et 3 jours de traitement UV.................................... 153 B.3 Evolution des constantes de dommages (k), de réparation (r) et de dommages sans renouvellement de la protéine D1 (k inh ) aux jours 1, 3, 5 et 8 de traitement UV, calculées à partir du paramètre F v /F m pour Amphora coffeaeformis, Entomoneis paludosa, Haslea ostrearia et Odontella aurita.................... 154 B.4 Evolution du rapport r/k aux jours 1, 3, 5 et 8 de traitement UV, calculé à partir du paramètre F v /F m pour Amphora coffeaeformis, Entomoneis paludosa, Haslea ostrearia et Odontella aurita............................. 155 B.5 Evolution des constantes de dommages (k), de réparation (r) et de dommages sans renouvellement de la protéine D1 (k inh ) et ratio r / k aux jours 1, 2 et 3 de traitement UV, calculées à partir du paramètre F v /F m pour Skeletonema costatum 156
Liste des tableaux 4.1 Caractéristiques du traitement UV utilisé...................... 36 4.2 Caractéristiques du stress UV appliqué pour les expérimentations......... 38 7.1 Séquence de l amorce Oligo(dT) 16 VN......................... 55 7.2 Séquences des amorces oligonucléotidiques utilisées pour la recherche d α-anhydrase carbonique........................................ 56 7.3 Séquences des amorces oligonucléotidiques utilisées pour la recherche de la β- anhydrase carbonique intracellulaire......................... 57 7.4 Séquences des amorces oligonucléotidiques dégénérées utilisées pour la recherche du gène de la β-ac................................... 57 7.5 Température d hybridation appliquée en fonction des couples d amorces utilisées. 59 7.6 Séquences des amorces oligonucléotidiques utilisées pour la recherche du gène codant pour la phosphoenolpyruvate carboxylase.................... 59 8.1 Valeur initiale (T 0 ) et pourcentage de réduction des paramètres de fluorescence Φ P SII et F v /F m après 5 h d exposition aux UV................... 71 8.2 Constantes de dommages maximum (k inh, 10 3 min 1 ), de dommages (k, 10 3 min 1 ) et réparation (r, 10 3 min 1 ) pour les algues témoins ou exposées à cinq heures de traitement UV et calculées à partir des valeurs de Φ P SII............ 72 8.3 Constantes de dommages maximum (k inh, 10 3 min 1 ), de dommages (k, 10 3 min 1 ) et réparation (r, 10 3 min 1 ) pour les algues témoins ou exposées à cinq heures de traitement UV et calculées à partir des valeurs de F v /F m............ 73 ix
x LISTE DES TABLEAUX 8.4 Efficacité maximale de la photosynthèse (α, unité relative), taux de transport maximum relatif des électrons (retr max, unité relative) et irradiance de saturation (E k, µmol photons m 2 s 1 ), déterminés à partir des RLC au début (T 0 ) et à la fin du traitement UV (T 300 )........................... 75 9.1 Pourcentage de réduction de Φ P SII à la fin (T 300 ) d une exposition aux UV calculé par rapport aux valeurs mesurées avant (T 0 )..................... 90 9.2 Résultats des ANOVAs comparant les paramètres k inh et k pour chaque jour de mesures, obtenus à partir des variations de Φ P SII pour chaque espèce....... 93 9.3 Efficacité maximale de la photosynthèse, taux de transport maximum relatif des électrons et irradiance de saturation, déterminés à partir des RLC avant (T 0 ) les traitements UV des jours 1, 3, et 8 de traitement UV................ 98 A.1 Composition de l eau de mer artificielle........................ 148 B.1 Pourcentage de réduction de F v /F m à la fin (T 300 ) d une exposition aux UV calculé par rapport aux valeurs mesurées avant (T 0 )..................... 152 B.2 Résultats des ANOVAs comparant les paramètres k inh et k pour chaque jour de mesures, obtenus à partir des variations de F v /F m................. 153
Abréviations α Efficacité maximale photosynthétique AC Anhydrase carbonique ADNc Acide désoxyribonucléique complémentaire ADNg Acide désoxyribonucléique génomique APX Ascorbate peroxidase ARNm Acide ribonucléique messager ATP Adénosine tri-phosphate BSA Serum albumine bovine BET Bromure d éthidium BWF "Biological Weighting Functions" CAT Catalase Chl a Chlorophylle a CTAB Bromure de Cétyltriméthylammonium DEPC Diéthyl pyrocarbonate dntp Désoxynucléotide phosphate DTT Dithiothreitol EDTA Acide éthylènediaminotétraacétique E k ERO F 0 F m Irradiance de saturation Espèces réactives de l oxygène Fluorescence minimale (à l obscurité) Fluorescence maximale (à l obscurité) F m Fluorescence maximale (à la lumière) F s F v /F m k inh Fluorescence satbilisée (à la lumière) Rendement quantique maximal de PSII Constante d inhibition maximale xi
xii Abréviations k MAA s MOPS φ P SII PAR PCR PEPCase PSI PSII PVP r retr retr max RLC SOD SDS SSC TE UV UV-A UV-B Constante d inhibition "Mycosporine like amino-acids" Acide 3-(N-Morpholino)propanesulfonique Rendement quantique effectif de PSII Radiation photosynthétiquement active Réaction de polymérisation en chaîne Phosphoénolpyruvate carboxylase Photosystème I Photosystème II Polyvinylpyrrolidone Constante de réparation Taux relatif de transport des électrons Taux relatif maximum de transport des électrons "Rapid Light Curve" Superoxyde dismutase Sodium dodécyl sulfate Citrate de sodium salin Tris-EDTA Radiations ultraviolettes Radiations ultraviolettes A (320-400 nm) Radiations ultraviolettes B (280-320 nm)
Première partie Introduction générale 1
Introduction 3 Introduction Depuis la découverte d une diminution de la couche d ozone stratosphérique au niveau des pôles, liée aux activités humaines, de nombreuses études ont montré les effets négatifs d une augmentation des radiations ultraviolettes sur les êtres vivants. Des travaux récents [McKenzie et al., 2003] indiquent qu en dehors des régions polaires, la diminution de la couche d ozone est peu importante. Le principal facteur contrôlant l intensité lumineuse (dont les UV) est l angle solaire au zénith, c est à dire que la dose d UV reçue aux tropiques est plus importante que sous les latitudes moyennes. De ce fait, les latitudes moyennes de l hémisphère nord sont moins affectées par la diminution de la couche d ozone que les régions australes. Toutefois, l effet des ultraviolets ne doit pas pour autant être minimisé car des rétroactions existent entre l atmosphère et la biosphère. Les UV, surtout les UV-B et les UV-C, sont des agents mutagènes. L augmentation de ces rayonnements peut réduire la productivité du phytoplancton océanique diminuant ainsi la quantité de CO 2 atmosphérique piégé lors de la photosynthèse. De plus, le phytoplancton, dont les diatomées [Levasseur et al., 1994], participe à la production du sulfure diméthylique (DMS) qui est une source importante de noyaux de condensation des nuages. Cela affecte finalement la taille des gouttelettes dans les nuages, la réflectivité des nuages et par conséquent l albédo planétaire [Zepp et al., 2003]. Environ 50 % de la biomasse sur Terre est d origine aquatique [Hader et al., 2007] ; les écosystèmes aquatiques incorporent au moins autant de dioxide de carbone que les écosystèmes terrestres [Zepp et al., 2007]. Les organismes photosynthétiques sont à la base des réseaux trophiques et fournissent l énergie chimique accumulée grâce à la photosynthèse, aux consommateurs des chaînes alimentaires. Ainsi la qualité de la lumière est un paramètre important pour les organismes photosynthétiques, les rayonnements ultraviolets ayant un effet négatif sur leur productivité et leur survie [Davidson, 1998, Sinha et al., 1998, Holzinger et Lütz, 2006]. Parmi les organismes photosynthétiques aquatiques, les diatomées marines sont responsables du quart de la fixation annuelle du carbone inorganique dans les océans [Granum et al., 2005]. Ces microalgues sont le premier maillon des chaînes alimentaires en milieu marin et jouent donc un rôle écologique essentiel. Elles ont par ailleurs une importance économique pour les activités aquacole telle que l ostréiculture. De plus certaines espèces, comme Odontella aurita, sont capables de synthétiser des lipides de la série des oméga 3 et sont de ce fait exploitées industriellement. Il existerait 250 genres et environ 10 à 12 000 espèces de diatomées [de Reviers, 2002]. L omniprésence et la variabilité d habitat de ces organismes en font de bons indicateurs de la qualité des eaux (Indice
4 Introduction Biologique Diatomées). L étude des effets des rayonnements ultraviolets sur les diatomées a donc de multiples intérêts. De par leur importance dans les milieux aquatiques, une réduction de la productivité des diatomées liée aux rayonnements ultraviolets est encore difficile à quantifier en milieu naturel et a un effet négatif aussi bien au niveau économique (conchyliculture) qu écologique (cycles biogéochimiques du carbone par exemple). De précédents travaux ont montré que certaines espèces de diatomées étaient capables à long terme de s acclimater et de survivre en présence de rayonnement ultraviolet [Rech et al., 2005]. Toutefois les mécanismes de cette acclimatation ne sont pas encore bien définis. De plus les causes d une absence d acclimatation observée chez certaines espèces restent encore inconnues. Ce travail de thèse vise à mettre en évidence la dynamique de l acclimatation des diatomées aux UV. Ce mémoire est composé de trois parties, dont la première est consacrée à une synthèse bibliographique sur la photosynthèse, les diatomées, les effets des UV et les mécanismes de défense et de protection. Cette première partie se termine par les objectifs précis de ce travail. La deuxième partie (Matériel et méthodes) présente le matériel d étude, ainsi que les techniques analytiques des différentes approches utilisées : physiologiques, biochimiques et moléculaires. La partie "Résultats" se compose de quatre chapitres. Les deux premiers concernent l approche physiologique des effets d un traitement UV sur les miroalgues marines après une seule exposition (chapitre 8) et pendant 8 jours de traitement (chapitre 9). Le chapitre 10 est consacré aux mesures biochimiques des mécanismes de défense et de protection vis à vis des UV. Enfin le chapitre 11 présente l ensemble des résultats de l approche moléculaire. Pour conclure, la discussion générale reprend les principaux comportements observés pour chaque espèce de diatomées étudiées afin de dégager les axes de recherche à développer.
Chapitre 1 La photosynthèse 1.1 La photosynthèse oxygénique La photosynthèse est la conversion biologique de l énergie lumineuse en énergie chimique, qui est stockée sous forme de pouvoir réducteur (NADPH, H + ) et d énergie (ATP). Ces deux composés organiques sont ensuite utilisés lors de l incorporation du carbone inorganique afin de produire des glucides suivant la réaction chimique : 6 CO 2 + 12 H 2 O + Energie lumineuse C 6 H 12 O 6 + 6 H 2 O + 6 O 2 (1.1) La photosynthèse se déroule en deux phases. La première phase implique des réactions photochimiques durant lesquelles l énergie lumineuse, via un transport d électrons, induit la synthèse d ATP et de NADPH. Ces derniers sont utilisés lors de la seconde phase de la photosynthèse durant laquelle une succession de réactions biochimiques, le cycle de Calvin, permet la fixation du CO 2 et la synthèse de glucides. Chez les eucaryotes, ces réactions se déroulent dans les chloroplastes. Les chloroplastes sont caractérisés par la présence de pigments photosynthétiques et d une structure lamellaire constituée par les thylacoïdes [Farineau et Morot-Gaudry, 2006] baignant dans un stroma. Les thylacoïdes sont constitués d une membrane lipidique délimitant un espace intérieur appelé lumen. Ces membranes renferment les complexes protéiques nécessaires à la photosynthèse (Figure 1.1) : les photosystèmes I et II (PSI et PSII), sièges des réactions photochimiques, les plastoquinones, le complexe b6/f et les plastocyanines, formant la chaîne de transport des électrons du PSII au PSI, 5
6 1 La photosynthèse l ATP synthase, système enzymatique permettant la synthèse d ATP. Chez les plantes, ces thylacoïdes sont accolés en grana, qui concentrent les PSII, tandis que dans les zones agranaires se trouvent les PSI, les complexes b6/f et l ATP synthase. Figure 1.1 Schéma détaillé de l organisation des complexes protéiques photosynthétiques impliqués dans le transport des électrons et des protons dans la membrane des thylacoïdes des plantes, d après Nield [1997]. Figure 1.2 Representation schématique du centre réactionnel d un photosystème, (a) vue perpendiculaire à la surface de la membrane ; (b) vue en coupe latérale, d après Farineau et Morot-Gaudry [2006]. Les photosystèmes sont constitués de complexes antennaires et d un centre réactionnel composé de polypeptides et de chlorophylle. Il existe trois complexes antennaires (Figure 1.2) : les antennes périphériques ou LHCI et II ("Light Harvesting Complex"), respectivement
1.1 La photosynthèse oxygénique 7 liées aux PSI et PSII, constituées de plusieurs sous-unités protéiques et de pigments dits "accessoires"(chlorophylle b, caroténoïdes, etc), absorbant dans les plus courtes longueurs d ondes, les antennes intermédiaires, absentes au niveau du PSI, les antennes internes, au contact du centre réactionnel. Les centres réactionnels sont différents en fonction des photosystèmes. Le centre du photosystème I est composé de deux protéines cœurs, A et B, présentant 85 % d homologie et codées par des gènes chloroplastiques, psaa et psab, respectivement. Ces protéines ont une masse de 65 à 85 kda. Ce centre contient aussi trois petites protéines extrinsèques, C (codée par le gène chloroplastique psac ), D (gène nucléaire psad) et E (gène nucléaire psae), et ont une masse de 10 kda. Les cinq protéines A, B, C, D et E sont entourées par un grand nombre de protéines hydrophobes (codées par des gènes chloroplastiques). Dans le photosystème II, le cœur est constitué de deux protéines D1 et D2, de 32 à 34 kda, codées respectivement par les gènes chloroplastiques psba et psbd. Ces protéines, bien que de composition différente présentent 30 % d homologie. Ce photosystème comporte des protéines extrinsèques de 17, 23 et 33 kda logées dans le lumen. Elles assurent la protection du complexe à manganèse à l origine de la production d oxygène par photolyse de l eau [Farineau et Morot-Gaudry, 2006]. Figure 1.3 Fonctionnement d une unité photosynthétique, d après Farineau et Morot-Gaudry [2006]. L énergie lumineuse est captée par les pigments des antennes périphériques, entraînant le passage des molécules d un état stable à un état excité (Figure 1.3) [Farineau et Morot-Gaudry, 2006]. Ces antennes, de par la présence de pigments accessoires, absorbent dans des longueurs d ondes courtes et donc très énergétiques. Les antennes internes absorbant dans des longueurs d ondes plus grandes, sont donc capables d absorber des excitons de moindre énergie contraire-
8 1 La photosynthèse ment aux antennes périphériques. Ainsi, l énergie d excitation est transmise entre molécules de pigments jusqu à une paire "spéciale" de chlorophylle du centre réactionnel appelée P680 pour le PSII et P700 pour le PSI [Farineau et Morot-Gaudry, 2006]. Figure 1.4 Schéma thermodynamique en "Z" du transfert des électrons à travers la chaîne photosynthétique. L échelle des ordonnées correspond au potentiel redox. Mn, cluster de Manganèse ; PSII, photosystème II ; P680, chl-centre du PSII ; Q A et Q B, quinones ; PQ, plastoquinone ; PC, plastocyanine ; PSI, photosystème I ; P700, chl-centre du PSI ; F x, F A et F B, centres fer-soufre ; hυ, photons. Lorsque le P680 du centre réactionnel du PSII capte l énergie d excitation, il passe d un état stable P680 à un état excité P680 et cède alors un électron à une molécule proche et devient P680 + : c est la séparation de charge (Figure 1.4). Le vide électronique créé par la perte de l électron est comblé par l apport d un électron provenant de l oxydation de l eau avec comme intermédiaire un résidu tyrosine de la protéine D1 du PSII. L accepteur initial des électrons est une phéophytine a (chlorophylle sans magnésium), qui va ensuite les transmettre à des plastoquinones, Q A, liée au centre réactionnel, et Q B qui est mobile [Jupin et Lamant, 1997]. La molécule Q B fait partie du pool de plastoquinones (PQ) membranaires ; cette molécule subit deux réductions et la forme Q B H 2 devient mobile. Elle rejoint le pool de PQ membranaires et une molécule de Q B oxydée prend sa place sur la protéine D1. Les plastoquinones réduisent les cytochromes b6/f, libérant ainsi deux protons dans le lumen du thylacoïde. Les cytochromes transfèrent ensuite leurs électrons à la plastocyanine, qui les cède au P700 du PSI. Le P700 passe
1.1 La photosynthèse oxygénique 9 Figure 1.5 Schéma du cycle de Calvin : production d un sucre en C 6, le fructose. à l état excité (P700 ), de la même manière que le P680, puis cède un électron à un accepteur primaire A 0 (une chlorophylle). Les électrons sont acheminés jusqu au NADP + par une chaîne de transporteurs d électrons, une phylloquinone (A 1 ) et trois complexes Fer-Soufre (F x, F A et F B ). La réduction du NADP + est catalysée par la NADP-férredoxine-oxydoréductase. L oxydation de l eau au niveau du PSII libère quatre protons dans le lumen pour chaque molécule d O 2 libérée. De même, l oxydation des Q B H 2 au niveau du cytochrome b6/f libère deux protons dans le lumen. La membrane du thylacoïde étant peu perméable aux protons, une différence de ph se crée de part et d autre de la membrane. Cette force protomotrice est alors utilisée par l ATP synthase pour phosphoryler l ADP du côté du stroma et ainsi produire de l ATP [Jupin et Lamant, 1997, Farineau et Morot-Gaudry, 2006]. Le NADPH et l ATP formés par les réactions photochimiques sont utilisés pour la fixation du CO 2 dans le cycle de Calvin (Figure 1.5) afin de synthétiser le fructose. Six CO 2 sont fixés sur six molécules de ribulose 1,5 biphosphate (RuBP) en présence d une enzyme, la Rubisco (ribulose 1,5 biphosphate carboxylase oxygenase). Douze molécules d APG (acide phosphoglycérique) sont produites qui, grâce à 12 NADPH, seront réduites en 12 G3-P (glycéralhéhyde 3-phosphate) sucre
10 1 La photosynthèse à 3 carbones à l origine des autres sucres (fructose) et à la régénération des accepteurs de départ (RuBP). La Rubisco (E.C. 4.1.1.39) est une enzyme multimérique de 550 kda, localisée dans le stroma des chloroplastes où elle représente 50 % des protéines solubles. Chez tous les organismes réalisant la photosynthèse oxygénique [Farineau et Morot-Gaudry, 2006], la Rubisco est constituée d un assemblage de : 8 sous-unités L (Large subunit) de 51 à 58 kda chacune. Ces sous-unités portent les sites catalytiques, 8 sous-unités S (Small subunit) de 12 à 18 kda chacune, dont le rôle est encore mal connu. Cet hexadécamère L 8 S 8 forme la Rubisco dite de type I, la Rubisco type II étant caractérisée par une absence de sous-unité S et ne se retrouve que chez les bactéries pourpres. Chez les plantes, la concentration dans les fluides cellulaires est de 10 µm pour le CO 2 et de 250 µm pour l O 2, à 25 C. Avec des K m de 10 à 15 µm pour le CO 2 et de 250 µm pour l O 2, les fonctions carboxylase et oxygénase de la Rubisco ne sont pas saturées. La solubilité de l oxygène étant liée à la température, une augmentation de celle-ci engendre une réduction des carboxylations photosynthétiques, et une augmentation de l activité oxygénase de la Rubisco. Il se forme alors une seule molécule de PGA et une molécule de glycolate, c est la photorespiration (Figure 1.6) [Lüttge et al., 2002]. Il existe des variantes évolutives de l assimilation photosynthétique du carbone : les métabolismes C4 et CAM. Ces métabolismes sont caractérisés par la génération d oxaloacétate puis d acide malique, un composé à 4 carbones, par la phosphoénolpyruvate carboxylase (PEPC) [Lüttge et al., 2002]. Chez les organismes en C4 (Figure 1.7), la fixation du CO 2 en malate a lieu dans les cellules du mésophylle, puis il est transporté dans les cellules de la gaine périvasculaire. L acide malique subit alors une décarboxylation oxydative et fournit du CO 2 au cycle de Calvin. Ce type de métabolisme entraîne un enrichissement en CO 2 au voisinage de la Rubisco, permettant aux plantes de conserver leurs stomates fermés, et ainsi de minimiser la transpiration. Chez les plantes de type CAM, la fixation du CO 2 a lieu la nuit, leur permettant de conserver leurs stomates fermés le jour.
1.1 La photosynthèse oxygénique 11 Figure 1.6 Mode d action de la Rubisco. La partie supérieure décrit l activité carboxylase, et la partie inférieure l activité oxygénase, d après Lüttge et al. [2002] ; PGA, acide phosphoglycérique. Figure 1.7 Métabolisme carboné de type C4, d après Lüttge et al. [2002].
12 1 La photosynthèse 1.2 Particularités des diatomées 1.2.1 Morphologiques Les diatomées (Diatomophyceae ou Bacillariophyceae) sont une classe de l embranchement des Ochrophyta, appartenant au sous-règne des Heterokontophytes [de Reviers, 2002]. Les Ochrophyta sont des algues à chlorophylles a et c. Les Bacillariophyceae sont des micoorganismes photosynthétiques ubiquistes mesurant de 2 à 1000 µm [Loir, 2004]. Ils sont caractérisés par la présence d une enveloppe externe composée de silice appelée frustule (Figure 1.8). Figure 1.8 Représentation des différents composants du frustule d une diatomée, d après Zurzolo et Bowler [2001]. Chez les algues, les réserves glucidiques sont sous forme de glucane, polymère de glucose. Chez les Ochrophytes, les glucanes de réserves β-1,3 ramifiés en β-1,6 sont appelés chrysolaminarine. Ces glucanes sont stockés dans les vacuoles et ne sont pas colorés par le lugol [de Reviers, 2002]. Chez les Hétérokontophytes, dont font partie les diatomées, les plastes sont entourés de quatre membranes contrairement aux Chlorophytes (plantes et algues vertes) et aux Rhodophytes (algues rouges). Cette particularité aurait pour origine une double endocytose (Figure 1.9). Dans un premier temps, un procaryote photosynthétique, comme une actuelle cyanobactérie, aurait été phagocyté par un hôte non photosynthétique, et par évolution aurait donné les Chlorophytes et les Rhodophytes. Les Hétérokontophytes proviendraient d une endocytose secondaire, au cours de laquelle un ancêtre des actuelles Rhodophytes aurait été phagocyté par un hôte eucaryote. Ce processus serait à l origine des membranes additionnelles entourant les chloroplastes, d un transfert secondaire de gènes et d une translocation partielle des voies métaboliques
1.2 Particularités des diatomées 13 Figure 1.9 Schéma de l origine hypothétique des algues avec des plastes primaires et secondaires, résultant d endocytoses primaire et secondaire, respectivement. Les plastes primaires seraient originaires d une cyanobactérie qui a été phagocytée par une cellule hôte hétérotrophe et plus tard transformée en organite. Les descendants sont les Chlorophytes, les Rhodophytes, et les Glaucophytes. Les diatomées, les algues brunes et quelques groupes apparentés ont évolué par endocytose secondaire : un ancêtre unicellulaire des algues rouges modernes a été phagocyté et réduit à un plaste. C : cyanobactérie ; P : plaste ; M : mitochondrie ; N : noyau, RE : réticulum endoplasmique ; REC : réticulum endoplasmique chloroplastique ; d après [Wilhelm et al., 2006]. de l endosymbionte [Delwiche et Palmer, 1997]. Les thylacoïdes des diatomées sont groupés par faisceau de trois sur toute la longueur du chloroplaste. De plus, trois thylacoïdes accolés doublent l enveloppe chloroplastique, formant la "girdle lamellae" typique des Ochrophytes [Graham et Wilcox, 2000]. Les thylacoïdes ne sont pas accolés, il existe un espace d environ 2 nm entre eux, [Pyszniac et Gibbs, 1992], et ils ne forment donc pas de grana comme chez les plantes. 1.2.2 Photosynthétique Les complexes antennaires des Hétérokontophytes sont appelés LHCF (Light-Harvesting Complex Fucoxanthin) ou FCP (Fucoxanthin Chl a/c Protein) et ne sont pas spécifiques d un photosystème, comme chez les plantes. Les LHCF contiennent de la Chl c, au lieu de la Chl
14 1 La photosynthèse b des plantes, et le caroténoïde majeur est la fucoxanthine [Wilhelm et al., 2006]. De plus, la stoichiométrie des pigments montre un ratio de 1 chlorophylle / 1 caroténoïde dans les LHCF alors qu il est de 14 chlorophylles / 4 caroténoïdes dans le LHCII des plantes [Papagiannakis et al., 2005]. Toutefois, l analyse des séquences d ADNc des protéines des FCP de Phaeodactylum tricornutum a montré de fortes homologies avec les protéines des LHCII des plantes [Bhaya et Grossman, 1993]. Les diatomées possèdent aussi deux autres xanthophylles : la Diadinoxanthine (DD) et la Diatoxanthine (DT) [Lavaud, 2002]. La dé-époxidation de la DD en DT se fait en présence de lumière, ce qui en fait un mécanisme de photoprotection par dissipation de l énergie lumineuse (Figure 1.10). Figure 1.10 Cycle des xanthophylles chez les Hétérokontophytes. Le carbone inorganique est plus abondant dans les océans que dans l atmosphère : 38 400 10 15 g contre 720 10 15 g, respectivement [Falkowski et Raven, 1997]. Il se retrouve sous 3 formes distinctes, dioxyde de carbone (CO 2 ), bicarbonate (HCO 3 ) et carbonate (CO2 3 ), suivant les réactions : CO 2 + H 2 O HCO 3 + H+ CO 2 3 + 2 H + (1.2) L équilibre de ces réactions est déplacé vers la droite pour des ph élevés, et donc dans les océans, où le ph est alcalin, les formes majoritaires du carbone sont les ions carbonates et bicarbonates [Falkowski et Raven, 1997]. La Rubisco, enzyme responsable de la fixation du carbone inorganique, ne peut utiliser que le dioxyde de carbone comme substrat. Les organismes photosynthétiques marins ont mis en place des mécanismes de concentration du carbone (Figure 1.11)
1.2 Particularités des diatomées 15 [Raven et Beardall, 2003]. Chez les diatomées, ces mécanismes correspondent principalement à la présence de l anhydrase carbonique et à la voie de β-carboxylation appelée C4-like [Reinfelder et al., 2000]. L anhydrase carbonique (E.C. 4.2.1.1) est une métallo-enzyme à zinc qui catalyse la déshydratation réversible des ions HCO 3 en CO 2 [Bagder et Price, 1994]. Il en existe au moins trois formes différentes, α, β et γ, sans homologie de séquences [Moroney et al., 2001]. Chez l algue verte, Chlamydomonas reinhardtii, des formes α et β ont été identifiées et localisées [Bagder et Price, 1994, Moroney et al., 2001] : au niveau périplasmique : deux α-ca (CAH1 et CAH2), hétérotétramères composés de deux sous-unités de 37 kda et de deux sous-unités de 4 kda, reliées par des ponts disulfures, au niveau mitochondrial : une β-ca de 21 kda, au niveau chloroplastique : dans la membrane des thylacoïdes, une α-ca de 30 kda (CAH3). La majorité du carbone inorganique marin étant sous forme HCO 3, les formes externes de l anhydrase carbonique chez Chlamydomonas reinhardtii, CAH1 et CAH2, permettent la conversion en CO 2, qui sous cette forme diffuse à travers la membrane plasmique [Moroney et al., 2001]. La forme interne, CAH3, permettrait la concentration du carbone au voisinage de la Rubisco afin d optimiser sa fonction carboxylase [Matthews, 1999]. De plus, chez les diatomées, une voie photosynthétique C4-like permettrait le stockage temporaire du carbone sous forme d acide carboxylique [Riebesell, 2000]. La phosphoénolpyruvate carboxylase (PEPCase ; E.C. 4.1.1.31) est la première enzyme de cette voie métabolique. Elle catalyse la carboxylation du phosphoénolpyruvate en utilisant le HCO 3 comme substrat pour produire de l oxaloacétate puis du malate. Ce dernier serait stocké et transporté vers les chloroplastes, où une décarboxylase (phosphoénolpyruvate carboxykinase ou enzyme malique) pourrait libérer le CO 2 pour la Rubisco [Giordano et al., 2005] (Figure 1.11). La phosphoénolpyruvate carboxylase est une enzyme homotétramérique composée de sousunités de 100 à 110 kda [O Leary, 1982]. Tous les motifs importants pour la structure tridimensionnelle et les acides aminés formant le site actif sont très conservés chez les plantes et les bactéries [Sanchez et Cejudo, 2003].
16 1 La photosynthèse Figure 1.11 Représentation des mécanismes de concentration du carbone chez les diatomées, d après Roberts et al. [2007a].
Chapitre 2 Concept de stress, photoinhibition et rayonnement ultraviolet 2.1 Concept de stress D après Gaspar et al. [2002], un stress est le reflet de la pression environnementale au niveau physiologique. Tous les changements de facteurs environnementaux influencent le développement et la croissance des organismes végétaux, mais les déviations d un paramètre par rapport à son optimum ne sont pas nécessairement un stress pour un organisme flexible et adapté à son environnement. Les mécanismes qui permettent de survivre au stress sont appelés mécanismes de résistance. Les réponses physiologiques à un stress se résument à trois possibilités : la tolérance : les organismes ont des mécanismes qui permettent de maintenir à un niveau élevé les activités métaboliques, sous un stress modéré, mais qui se traduisent par une réduction d activité en cas de stress intense, l évitement : implique une réduction de l activité métabolique et induit un état dormant sous un stress extrême, les dommages : induisant des mutations et la mort par des nécroses et/ou apoptose. De plus il est nécessaire de distinguer l adaptation de l acclimatation. L adaptation résulte de modification génétique, c est à dire de la sélection des génotypes favorables dans une population. L acclimatation est la capacité d ajustement physiologique d un organisme, sans modification du génotype. Pendant l acclimatation, un organisme altère son homéostasie, son état d équilibre physiologique, afin de s accommoder des changements de son environnement. 17
18 2 Concept de stress, photoinhibition et rayonnement ultraviolet Une contrainte, au niveau cellulaire, induit la déstabilisation d un certain nombre de structures (membranes, etc) et de fonctions métaboliques. Le catabolisme l emporte sur l anabolisme, c est la réaction fondamentale du stress ("Alarm phase", Figure 2.1). Puis, la résistance se met en place avec des processus de réparation, de restauration de l état initial, de synthèse de molécules de protection ; l anabolisme devient supérieur au catabolisme, c est la phase de récupération ("Restitution"). Si le facteur de stress continue, voire s intensifie, l organisme réagit, c est la phase de résistance, où certains caractères vont être accentués par rapport à l état moyen. Toutefois, si le facteur de stress s intensifie trop ou dure trop longtemps, il peut entraîner une phase d épuisement ("Phase of exhaustion") et la mort directe ou indirecte de l organisme [Leclerc, 1999]. Figure 2.1 Phases successives d un stress, d après Larcher [2003], indiquant la variation de l équilibre des phénomènes de stimulation (eustress) et des phénomènes d inhibition (distress) des activités vitales. 2.2 La photoinhibition Les organismes photosynthétiques absorbent l énergie lumineuse et la convertissent en énergie chimique pour assurer leur croissance t et leur reproduction. Les variations quantitatives et qualitatives de leur environnement lumineux impliquent la présence de mécanismes de régulation et de protection. Le résultat général de l ajustement dans la structure et le fonctionnement du PSII et du reste de l appareil photosynthétique, est appelé la photoacclimatation. L excès de lumière peut induire une réduction du taux de photosynthèse soit par la photoinhibition, c est à dire des dommages de l appareil photosynthétique et en particulier des centres réactionnels [Trebst, 1995], soit par la photoprotection [Bouchard et al., 2006]. Cette dernière implique la