VARIATIONS PHOTO-INDUITES DE LA FLUORESCENCE DU NADPH CHLOROPLASTIQUE

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1 THESE de DOCTORAT de l'universite PIERRE et MARIE CURIE (PARIS VI) Spécialité : Biophysique Moléculaire présentée par Gwendal LATOUCHE pour obtenir le grade de DOCTEUR de l'universite PIERRE et MARIE CURIE (PARIS VI) Sujet : FLUORESCENCE BLEU-VERTE VARIABLE DES VEGETAUX VARIATIONS PHOTO-INDUITES DE LA FLUORESCENCE DU NADPH CHLOROPLASTIQUE Soutenue le 28 Novembre 2000 devant le jury composé de : P. VIGNY Président F. MEROLA Rapporteur R. DOUCE Rapporteur I. MOYA Directeur de thèse J.M. SALMON Examinateur Z.G. CEROVIC Examinateur

2 Remerciements Je voudrais tout d'abord remercier Ismaël Moya, qui m'a accueilli au sein de l'équipe Photosynthèse et Télédétection du LURE et m'a fait l'honneur de diriger cette thèse. Je le remercie de m'avoir initié aux mesures de fluorescence, de m'avoir guidé et conseillé sur tous les aspects instrumentaux de ces mesures, et plus généralement pour l'encadrement et le suivi qu'il a assuré tout au long de la thèse. Je tiens tout particulièrement à remercier Zoran Cerovic, qui m'a fait partager sa grande connaissance des plantes et de la photosynthèse, notamment en ce qui concerne l'isolation et l'utilisation des chloroplastes, et qui a toujours été à mes cotés durant l'ensemble de ce travail, aussi bien pour me conseiller et pour discuter, que pour m'aider dans la réalisation des expériences. Sans sa compétence, son ouverture d'esprit et sa persévérance, rien n'aurait été possible. Je remercie Fabienne Merola et Roland Douce d'avoir bien voulu être les rapporteurs de ce travail, ainsi que Paul Vigny et Jean-Marie Salmon qui ont accepté de participer au jury. Je voudrais remercier Laurent Cournac et Gilles Peltier avec qui j'ai eu le plaisir de collaborer lors de l'étude des mutants d'algues Chlamydomonas reinhardtii sans photosystème I. Je tiens à remercier Yves Goulas pour l'aide précieuse qu'il m'a apportée dans tous les aspects modélisation de ce travail, notamment en ce qui concerne les calculs et la programmation. Je remercie Maurice Bergher et Stéphane Tosti, qui ont conçu et réalisé les différents éléments électroniques des montages expérimentaux, et qui m'ont fréquemment aidé à résoudre des problèmes instrumentaux. Je remercie Fabrice Montagnini de l'aide qu'il m'a apportée pour une partie de ce travail lorsqu'il faisait son stage de DEA.

3 Je tiens à remercier Bernard Genty grâce à qui j'ai pu réaliser les spectres de transmittance de solutions de chloroplastes concentrées. Mes remerciements vont également à Myroslawa Migignac-Maslow pour le don de FNR purifiée et à Martin Parry pour le don de Rubisco purifiée. Je remercie Fabienne Merola de m'avoir permis de réaliser les analyses de déclins de fluorescence par la méthode du maximum d'entropie, et Bernard Coutin de m'avoir permis de réaliser les mesures de viscosité. Je tiens à remercier tous les membres de l'équipe Photosynthèse et Télédétection que je n'ai pas encore eu l'occasion de citer pour l'aide et le soutien qu'ils ont pu m'apporter. Enfin, je voudrais remercier l'ensemble des personnes du LURE, ainsi que mes proches, qui m'ont aidé, de près ou de loin, à réaliser ce travail.

4 Table des matières Remerciements Table des matières Liste des abréviations Introduction générale...3 I. Introduction...9 I.1. La photosynthèse dans les chloroplastes... 9 I.1.1. Réduction photosynthétique du NADP I.1.2. Oxydations photosynthétiques du NADP I.1.3. Interactions entre les chloroplastes et le reste de la cellule I.2. Fluorescence des végétaux I.2.1. Fluorescence de la chlorophylle I.2.2. Fluorescence bleu-verte I.3. Fluorescence du NAD(P)H et des flavines I.3.1. Fluorescence du NAD(P)H I Conséquences de la liaison avec les protéines I.3.2. Fluorescence des flavines I.4. Techniques expérimentales de mesure de la fluorescence I.4.1. Fluorimétrie impulsionnelle I.4.2. Mesures de fluorescence résolue en temps et comptage de photo-électron unique corrélé en temps II. Matériels, méthodes et montages expérimentaux II.1. Préparation des échantillons II.1.1. Culture des plantes et préparation des mésophylles II Culture de pois pour l'extraction de chloroplastes II Culture de pois pour l'élaboration de mésophylles II.1.2. Isolation des chloroplastes II Chloroplastes isolés intacts II Chloroplastes reconstitués II Thylakoïdes lavés II.1.3. Les algues Chlamydomonas reinhardtii : mutations, culture et préparation des échantillons II.2. Mesure de l'activité photosynthétique et du taux de chloroplastes intacts avec une électrode à oxygène II.2.1. Principe de fonctionnement de l'électrode à oxygène II.2.2. Mesure de l'activité photosynthétique... 56

5 II.2.3. Mesure du taux de chloroplastes intacts II.3. Montages expérimentaux II.3.1. Le spectrofluorimètre FLU3 de Super-ACO II Description du montage expérimental II Source de lumière : le rayonnement synchrotron II Différents éléments permettant de définir les caractéristiques du faisceau d'excitation II Echantillons et lumière actinique II Collection et détection de la fluorescence II Version précédente de ce montage utilisée dans quelques expériences II Mesures spectrales II Correction des spectres d'excitation de fluorescence II Correction des spectres d'émission de fluorescence II Evaluation du rapport signal/bruit en utilisant le Raman de l'eau II Mesure de déclins de fluorescence et de spectres résolus en temps II Mesure expérimentale de la résolution temporelle II Obtention des paramètres temporels de la fluorescence à partir des déclins expérimentaux II Méthode des moindres carrés nonlinéaires II Méthode du maximum d'entropie II Conditions d'utilisation de la diode laser comme lumière actinique II Etude de l'influence combinée de la photosélection et du mouvement des molécules sur les déclins de fluorescence enregistrés avec le montage FLU II Estimation du temps de relaxation rotationelle du NADPH libre et du NADPH lié aux protéines... 77

6 II Estimation expérimentale de l'influence de la photosélection sur les mesures de temps de vie de fluorescence dans le cas des principaux types d'échantillons utilisés II.3.2. Le fluorimètre impulsionnel UV-PAM II Description du montage expérimental II La source de lumière et les différents éléments qui définissent le faisceau d'excitation II Echantillons et illumination actinique II Collection et détection de la fluorescence II Quelques caractéristiques du montage expérimental II Les détecteurs et les techniques utilisées pour rendre la détection insensible à la lumière continue II Les détecteurs à photodiode II Le détecteur à photomultiplicateur II Rapport signal/bruit et fluorescence non-spécifique du montage II Forme des bandes spectrales de détection de la fluorescence bleuverte et de la fluorescence rouge II Vérification de la linéarité de la réponse du détecteur à photomultiplicateur II Etude de la fluorescence du milieu général à l'aide du fluorimètre impulsionnel III. La fluorescence bleu-verte et ses variations photo-induites dans les chloroplastes III.1. Introduction III.2. Variations photo-induites de fluorescence bleu-verte III.2.1. Dépendance de la fluorescence bleu-verte variable par rapport au PSI

7 III.2.2. Feuilles, mésophylles et chloroplastes III.2.3. Chloroplastes intacts et chloroplastes reconstitués III.3. Analyse spectrale et résolue en temps des variations photo-induites de la fluorescence bleu-verte dans les chloroplastes reconstitués III.3.1. Analyse temporelle au maximum d'excitation et d'émission du NADPH III.3.2. Spectre d'excitation résolu en temps III Transfert d'énergie des protéines vers NADPH III.3.3. Spectre d'émission résolu en temps III.4. Analyse spectrale et résolue en temps des variations photo-induites de la fluorescence bleu-verte dans les chloroplastes intacts III.4.1. Analyse temporelle aux maxima d'excitation et d'émission du NADPH et spectre d'excitation résolu en temps III.4.2. Comparaison avec les résultats obtenus sur chloroplastes reconstitués à l'aide d'un modèle estimant la répartition du NADPH entre forme libre et forme liée III Equations et processus de calcul du modèle III Paramètres d'entrée et résultats du modèle III.4.3. La fluorescence des flavines dans les chloroplastes intacts, comparaison avec les chloroplastes reconstitués III.5. Analyse spectrale et temporelle des variations de la fluorescence bleue des mesophylles lors de transitions obscurité/airlumière/azote III.6. Correction des spectres d'émission de fluorescence de chloroplastes reconstitués pour s'affranchir de la déformation due à l'absorption des pigments photosynthétiques III.6.1. Modélisation de l'influence des pigments photosynthétiques sur la fluorescence bleu-verte des chloroplastes en solution III.6.2. Validation expérimentale du modèle III.6.3. Application au spectre d'émission de fluorescence des chloroplastes reconstitués III.7. Rapport entre la fluorescence bleue et la concentration en NADPH dans les chloroplastes III.8. Discussion et conclusion IV. Utilisation de la fluorescence bleu-verte du NAD(P)H pour l'étude de la régulation du métabolisme photosynthétique des végétaux IV.1. Voie chlororespiratoire de réduction non-photochimique des plastoquinones chez les algues Chlamydomonas reinhardtii

8 IV.1.1. La chlororespiration chez les algues Chlamydomonas reinhardtii IV.1.2. Interaction chloroplastes-mitochondries et transfert d'électron entre PSII et O 2 dans les mutants de Chlamydomonas reinhardtii sans PSI IV Effets des inhibiteurs du transport d'électrons mitochondrial IV Mesures simultanées de la fluorescence bleu-verte et de la fluorescence chlorophyllienne IV Effets du propyl gallate et des découplants IV Effets comparatifs et combinés des inhibiteurs mitochondriaux, du propyl gallate et des découplants sur la fluorescence bleu-verte et sur la fluorescence chlorophyllienne IV.1.3. Discussion et conclusion IV.2. Voie de réduction non-photochimique des plastoquinones dans les chloroplastes de plantes supérieures IV.2.1. Introduction IV Transitions lumière-obscurité IV.2.2. Mesures simultanées de la fluorescence bleu-verte et de la fluorescence rouge lors de transitions lumière-obscurité IV.2.3. Conclusions Conclusion générale Publications personnelles sur le sujet Références bibliographiques Annexe A : mesure de la viscosité absolue Annexe B : estimation du volume d'une protéine à partir de sa masse molaire Annexe C : schéma électronique du détecteur à photomultiplicateur Annexe D : théorie de Kubelka-Munk

9 Liste des abréviations : ADP : ASS : ATP : CAT : CA1P : CCCP : CE : Chl : CPUCT : Adénoside diphosphate Algues sur support solide Adénoside triphosphate Cycle des acides tricarboxyliques 2-carboxy-D-arabinitol 1-phosphate m -chlorophenylhydrazone Extrait chloroplastique ("Chloroplast extract") Chlorophylle Comptage de photo-électron unique corrélé en temps Crown : Dicyclohexyl-18-crown -6 CRPP : DCMU : DFPP : DO : FAD : FBV : Fd : FNR : GAPDH : GPIB : GR : IR : LED : LMH : MDH : MDHAR : NAD : Cycle réductif du pentose phosphate 3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea Densité de flux de photons photosynthétiques Densité optique Flavine adénine dinucléotide Fluorescence bleu-verte Ferrédoxine Ferrédoxine-NADP réductase NAD(P)-glycéraldéhyde-3-phosphate déhydrogénase General purpose instrument bus Glutathione réductase Infrarouge Diodes électroluminescentes ("Light emitting diode") Largeur à mi-hauteur NADP-malate déhydrogénase Monodéhydroascorbate réductase Nicotinamide adénine dinucléotide

10 NADH : NAD + : NADP : NAD(P) : NADPH : NADP + : NDH : PC : PG : PGA : Pheo : PQ : PSI : PSII : RT : Rubisco : RuBP : SHAM : TAC : TAP : Trp : UV : Nicotinamide adénine dinucléotide, forme réduite Nicotinamide adénine dinucléotide, forme oxydée Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate Nucléotides pyridiniques, NAD et NADP Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate, forme réduite Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate, forme oxydée NAD(P)H déhydrogénase Plastocyanine Propyl gallate 3-phosphoglycérate Phéophytine Plastoquinone Photosystème I Photosystème II Résolu en temps (spectre d'émission où d'excitation RT) D-ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase D-ribulose-1,5-bisphosphate Acide salicyl hydroxamique ("Salicyl hydroxamic acid") Convertisseur temps-amplitude ("Time-to-amplitude converter") Tris-acétate-phosphate Tryptophane Ultra-violet

11 INTRODUCTION GENERALE

12 Introduction générale Les végétaux chlorophylliens ont un rôle primordial dans le développement de la vie sur terre, car, grâce à la photosynthèse, qui est le seul processus biologiquement important à utiliser et à transformer l'énergie lumineuse du soleil, ils réalisent la synthèse de composés organiques à haut potentiel énergétique, à partir de composés minéraux. Ce rôle fondamental de la photosynthèse explique l'importance des recherches qui lui sont consacrées et qui ont commencées dès le 18 éme siècle. Pour étudier la photosynthèse, la fluorescence est un outil puissant qui est largement utilisé, notamment parce qu'elle permet des mesures non-invasives en temps réel. Lorsqu'ils sont illuminés par une lumière UV, les végétaux émettent une fluorescence bleu-verte (FBV) et une fluorescence rouge. La fluorescence rouge, qui est émise par la chlorophylle (Chl), permet de mesurer et de quantifier l'activité photosynthétique. Cette fluorescence chlorophyllienne est étudiée depuis longtemps, et elle est actuellement très largement utilisée pour les recherches sur les végétaux et la photosynthèse. La FBV, bien que connue depuis longtemps, a été délaissée et n'est étudiée de façon systématique que depuis peu. Contrairement à la fluorescence rouge, qui ne provient que de la Chl, la FBV des végétaux est la somme des émissions de nombreux fluorophores. Parmi ces fluorophores le NADPH a une importance toute particulière puisqu'il participe activement à la photosynthèse. Le NADP est réduit puis oxydé lors de la photosynthèse, or seule sa forme réduite (NADPH) est fluorescente. La fluorescence du pool de NADP est donc directement liée à son état d'oxydoréduction, qui est lui-même directement relié au fonctionnement de la photosynthèse. C'est pourquoi la mesure de la fluorescence du NADPH est intéressante puisqu'elle permet le suivi en continu de façon non-invasive de l'état redox du NADP. La fluorescence chlorophyllienne nous renseigne sur l'ensemble du processus photosynthétique, mais elle dépend avant tout du fonctionnement du début de la chaîne de transport d'électrons photosynthétique. L'état redox du NADP et ses variations nous renseignent sur le fonctionnement de la fin de cette chaîne. La fluorescence du NADPH 3

13 est donc, dans de nombreux cas, une mesure complémentaire de la fluorescence chlorophyllienne, et il peut être très intéressant de les mesurer simultanément. Cependant, la mesure de la fluorescence du NADPH sur les végétaux se heurte à un certain nombre de difficultés : la présence, notamment dans l'épiderme des feuilles et les parois cellulaires, d'autres fluorophores émettant dans le bleu-vert rend généralement indétectable la fluorescence du NADPH sur les feuilles; la réabsorption de la FBV par les pigments photosynthétiques qui diminue l'intensité de la FBV et déforme son spectre d'émission; la liaison du NADPH avec les protéines qui, parce qu'elle augmente le rendement de fluorescence du NADPH, perturbe le rapport entre niveau de fluorescence et état redox du pool. La mesure de la fluorescence du NADPH est difficile sur les feuilles, mais elle devient plus aisée sur les chloroplastes isolés et les algues unicellulaires, sur lesquels nous avons principalement travaillé. De plus, l'utilisation de chloroplastes isolés, qui élimine les autres compartiments de la cellule végétale, facilite l'analyse de la fluorescence du NADPH en rapport avec la photosynthèse. Ce travail s'inscrit dans la poursuite de l'étude de la fluorescence du NADPH sur les chloroplastes isolés qui est un des thèmes de recherche du laboratoire et sur lequel un certain nombre de résultats avaient déjà été obtenus par Cerovic et al. (1993; 1994). L'objectif principal est de montrer la possibilité d'utiliser la mesure de la FBV comme une méthode de mesure continue, non-invasive et quantitative de l'état redox du NADP sur les chloroplastes isolés et éventuellement sur les feuilles. Le fait de travailler sur des chloroplastes isolés ne résout pas tous les problèmes puisque même dans ce cas NADPH n'est pas le seul fluorophore émettant dans le bleu-vert. Mais Cerovic et al. (1993) ont montré que les variations photo-induites de FBV, qui sont observées sur les chloroplastes isolés, sont dues uniquement au NADPH. C'est la raison pour laquelle nous nous sommes principalement intéressés à ces variations photo-induites, sachant par ailleurs que c'est lors des changements de climat lumineux (comme lors des transitions obscurité-lumière) que l'on obtient le plus de renseignements sur la photosynthèse. Pour résoudre les différents problèmes (notamment celui posé par la liaison de NADPH avec les protéines) qui restaient encore à éclaircir sur la fluorescence du 4

14 NADPH dans les chloroplastes isolés et particulièrement sur son utilisation comme indicateur de l'état redox du NADP, nous avons réalisé une étude spectrale et résolue en temps de la variation photo-induite de FBV dans les chloroplastes isolés. Pour cette étude nous avons été amené à utiliser deux types de chloroplastes isolés : des chloroplastes intacts et des chloroplastes reconstitués. Cette étude nous a aussi permis d'évaluer la contribution des flavines aux variations photo-induites de fluorescence verte dans les chloroplastes isolés. Par ailleurs, nous avons modélisé l'influence de la réabsorption de la FBV des chloroplastes isolés par les pigments photosynthétiques, pour retrouver le "vrai" spectre d'émission de cette FBV. Enfin, nous avons construit une nouvelle version d'un fluorimètre impulsionnel qui mesure simultanément la FBV et la fluorescence chlorophyllienne, et ce quelle que soit la lumière ambiante. Ce montage a notamment été utilisé pour étudier, grâce à la mesure des variations photo-induites du NAD(P)H, les mécanismes de régulation du métabolisme photosynthétique que sont la chlororespiration et le transport cyclique. 5

15 CHAPITRE I Introduction

16 I. Introduction I.1. La photosynthèse dans les chloroplastes La découverte de la photosynthèse est relativement ancienne puisqu'elle débute avec Priestley en 1772 et que dès la fin du 19 ème siècle son équation chimique générale a été déterminée : h 6H 2 O + 6CO 2 C 6 H 12 O 6 + 6O 2 (I.1) Lors de la photosynthèse, l'énergie lumineuse absorbée par les végétaux chlorophylliens est utilisée pour oxyder l'oxygène de l'eau (ce qui se traduit par une production d'o 2 ) et pour réduire le CO 2 en glucides. Chez les organismes photosynthétiques eucaryotes la photosynthèse à lieu dans des organites subcellulaires particulières : les chloroplastes (Fig. I.1). Les chloroplastes sont typiquement de forme sphérique aplatie d'un diamètre de l'ordre de 3 à 10 μm et d'une épaisseur de l'ordre de 1 à 2 μm (Lawlor, 1993). Ils sont séparés du reste de la cellule par une enveloppe composée de deux membranes. Une membranes extérieure, qui est totalement perméable à tous les ions et molécules ayant une masse molaire inférieure à 10 Figure I.1 : Représentation schématique d'un chloroplaste. D'après (Taiz et Zeiger, 1991). 9

17 kd (Heldt et Flügge, 1986), et une membrane intérieure, qui est très sélective et ne permet le passage que de certains composés; elle possède pour cela de nombreux complexes protéiques translocateurs. Les chloroplastes contiennent un système de membranes internes : les thylakoïdes. Les thylakoïdes sont interconnectés entre eux et se superposent les uns aux autres pour former des piles appelées grana. Les régions non empilées, plus en contacts avec le milieu extérieur, sont appelées stroma lamellae. Le milieu chloroplastique externe aux thylakoïdes et dans lequel ils baignent est le stroma, tandis que le milieu interne aux thylakoïdes est appelé lumen. La photosynthèse peut être décomposée en deux phases complémentaires qui se produisent simultanément. Une phase photochimique qui se produit principalement dans les thylakoïdes et conduit à la réduction du NADP grâce à l'énergie lumineuse. Une phase purement biochimique qui se produit dans le stroma et oxyde le NADPH pour fixer le CO 2. Cette séparation en deux phases est totalement artificielle, bien que classique, mais nous allons l'utiliser car elle met bien en avant le rôle de NADP. Figure I.2 : Transferts d'électrons et de protons dans la membrane thylakoïdale lors de la photosynthèse. D'après (Taiz et Zeiger, 1991) 10

18 I.1.1. Réduction photosynthétique du NADP Cette phase, qui a lieu principalement dans les thylakoïdes, est réalisée par quatre complexes enzymatiques transmembranaires : le photosystème II (PSII), le complexe cytochrome b 6 /f, le photosystème I (PSI) et l'atp-synthase (Fig. I.2). La formation de NADPH s'effectue grâce à l'absorption de la lumière au niveau des deux photosystèmes et à une chaîne de transport d'électrons impliquant PSI, PSII et complexe cytochrome b 6 /f. Les deux photosystèmes sont constitués de deux parties principales les antennes et le centre réactionnel. Les antennes sont des complexes pigments-protéines. Chez les végétaux supérieurs, les pigments présents dans les antennes sont des caroténoïdes et surtout des chlorophylles a et b. Ce sont ces pigments qui sont responsables de l'absorption de l'énergie lumineuse, cette énergie d'excitation est ensuite transférée d'une molécule de pigment à une autre dans les antennes suivant un processus de transfert nonradiatif souvent nommé transfert d'exciton (sur les transferts d'énergie d'excitation dans les antennes voir par ex. van Grondelle et Amesz, 1986). L'énergie d'excitation est finalement soit perdue (désexcitation thermique ou fluorescence), soit transmise au centre réactionnel. Cette énergie permet au centre réactionnel d'effectuer une séparation de charge (cf. Fig. I.3). La chaîne de transport d'électrons photosynthétique, qui suit les séparations de charge, est généralement représentée par un schéma en "Z" (Fig. I.3). Ce schéma traduit bien le transfert d'électrons entre les différents intermédiaires et le potentiel redox de ces intermédiaires. Au cours de ce transfert d'électrons, comme le montre bien la Fig. I.2, il y a une accumulation de protons dans le lumen et une perte de protons dans le stroma. Ce qui génère un gradient électrochimique de protons transmembranaire. Ce gradient électrochimique de protons transthylakoïdal est utilisé par l'atp-synthase comme source d'énergie pour la phosphorylation de l'adp en ATP, réaction qui dissipe le gradient de protons. 11

19 Figure I.3 : Schéma en "Z" du transport d'électrons photosynthétique. Les intermédiaires redox sont placés à leur potentiel redox standard (à ph 7). Le donneur primaire du PSII, P680, devient P680 * une fois excité, il transfère alors un électron à la phéophytine (Pheo), il est alors oxydé. P680 + (donneur primaire oxydé) est re-réduit par une tyrosine Y Z, elle même re-réduite par les électrons extraits de l'eau par le complexe de dégagement d'oxygène (composante du PSII) où à lieu la transformation de H 2 O en O 2 et H +. Pheo transfère son électron à une quinone Q A qui le transfère au site Q B. Q B est le site de fixation des plastoquinones (PQ) oxydées. Deux électrons sont nécessaires pour réduire une PQ qui est alors libérée dans la membrane thylakoïdale (Fig. I.2). Les PQ transfèrent leurs deux électrons au complexe cytochrome b 6 /f en deux étapes. Le complexe cytochrome b 6 /f contient une protéine de Rieske Fe-S, deux cytochromes b et un cytochrome f. Le complexe cytochrome b 6 /f transfère un électron à la plastocyanine (PC) qui à son tour réduit P A 0, le premier accepteur d'électron de P700 *, est une chlorophylle et le deuxième accepteur, A 1, est une phylloquinone. Trois protéines Fe-S (F X, F A, F B ) en séries sont les intermédiaires entre A 1 et la ferrédoxine (Fd) qui transfère son électron à la flavoprotéine ferrédoxine-nadp réductase (FNR). La présence d'un FAD dans la FNR permet d'accumuler les deux électrons qui sont nécessaires à la réduction de NADP + en NADPH. I.1.2. Oxydations photosynthétiques du NADP Durant cette phase le NADPH, mais aussi l'atp, produits par la phase photochimique sont utilisés par des protéines solubles du stroma pour assimiler le CO 2 au cours du cycle réductif du pentose phosphate (CRPP). Ce cycle est représenté Fig. I.4. Le CO 2 ainsi fixé est en partie stocké dans le chloroplaste (synthèse de l'amidon à partir du fructose 6-phosphate) et en partie exporté vers le reste de la cellule. En effet, le DHAP 12

20 Figure I.4 : Représentation des réactions enzymatiques du cycle réductif du pentose phosphate (CRPP). (1) : fixation du CO 2 au ribulose 1,5-bisphophate (RuBP) pour former deux 3-phosphoglycérates (PGA, noté 3-PGA dans ce schéma), catalysée par la Rubisco. (2) : phosphorylation du PGA par l'atp pour former 1,3-bisPGA, catalysée par la phosphoglycérokinase. (3) : réduction de 1,3-bisPGA en glycéraldéhyde 3-phosphate (3-PGald) par NADPH, catalysée par la NADP-glycéraldéhyde-3-phosphate déhydrogénase (GAPDH). (4) : isomérisation de 3-PGald pour former le dihydroxyacétone 3-phosphate (DHAP), catalysée par la triose-phosphate isomérase. (5) : association aldolique de DHAP et d'un 3-PGald pour former un fructose 1,6-bisphosphate, catalysée par une aldolase. (6) : Hydrolyse du phosphate en C-1 du fructose 1,6-bisphosphate pour former le fructose 6-phosphate, catalysée par la fructose-1,6- bisphosphate phosphatase. (7) : transfert de deux carbones du fructose 6-phosphate à un 3-PGald pour former le xylulose 5-phosphate et l'érythrose 4-phosphate, catalysée par une transketolase. (8) : association aldolique de l'érythrose 4-phosphate avec un DHAP pour former le sedoheptulose 1,7-bisphosphate, catalysée par l'aldolase. (9) : Hydrolyse du phosphate en C-1 du sedoheptulose 1,7-bisphosphate pour former le sedoheptulose 7-phosphate, catalysée par la sedoheptulose-1,7-bisphosphate phosphatase. (10) : transfert de deux carbones du sedoheptulose 7- phosphate à un 3-PGald pour former le ribose 5-phosphate et le xylulose 5-phosphate, catalysée par la transketolase. (11) : le xylulose 5-phosphate est isomérisé par la ribulose-5-phosphate épimérase pour former un ribulose 5- phosphate. (12) : un autre ribulose 5-phosphate est obtenu par l'isomérisation du ribose 5-phosphate, catalysée par la ribose-5-phosphate isomérase. (13) : le ribulose 5-phosphate est converti en RuBP par la ribulose-5-phosphate kinase. D'après (Salisbury et Ross, 1985). 13

21 et le glycéraldéhyde 3-phosphate sont exportés vers le reste de la cellule par le translocateur de phosphate (voir plus loin, section I.1.3.) situé dans la membrane intérieure des chloroplastes. Ils servent principalement à la synthèse du saccharose qui a lieu dans le cytosol, saccharose qui est exporté vers le reste de la plante. Il y a un autre aspect de la photosynthèse qui est intimement lié au CRPP, c'est la photorespiration. En effet, la Rubisco est une carboxylase mais aussi une oxygénase et elle catalyse l'oxydation du RuBP par l'o 2. Son affinité pour O 2 est nettement plus faible que son affinité pour le CO 2 mais, étant donné la faible concentration du CO 2 par rapport à celle de O 2 dans l'air, l'activité photorespiratoire n'est pas du tout négligeable. Le cycle photorespiratoire, dont une partie s'effectue hors du chloroplaste (péroxisome et mitochondrie), est une autre voie de consommation du NADPH (et de l'atp) mais qui ne permet pas la fixation de carbone, au contraire, et diminue donc le rendement de la photosynthèse. Certaines plantes ont développées un système permettant d'augmenter, dans les cellules où à lieu le CRPP, la concentration en CO 2 par rapport à celle obtenue par simple diffusion de l'air. Ces plantes sont appelées plantes C 4, tandis que celles ne possédant pas un tel système sont appelées plantes C 3. La photorespiration est donc très peu présente dans les plantes C 4. Pour pouvoir concentrer le CO 2, les plantes C 4 possèdent deux types de cellules photosynthétiques. Des cellules dites cellules du mésophylle, qui sont distribuées dans l'ensemble du mésophylle (partie interne d'une feuille comprise entre les deux épidermes) et qui concentrent le CO 2 sous forme d'acides à quatre carbones (acides C-4). Des cellules dites cellules de la gaines des vaisseaux conducteurs, qui comme leur nom l'indique sont situées dans la gaine des vaisseaux conducteurs qui sillonnent le mésophylle, et où a lieu le CRPP à partir du CO 2 relâché par les acides C-4. Il y a encore d'autres phénomènes impliqués dans le processus photosynthétique qui consomment le pouvoir réducteur produit par la phase photochimique. La ferrédoxine (Fd) réduite est utilisée pour réduire les plastoquinones (PQ) (voie ferrédoxine quinone réductase, FQR, dont nous parlerons plus en détail au chapitre IV) et pour réduire le nitrite et le sulfite. Le NADPH est utilisé pour réduire les PQ (voie NAD(P)H déhydrogénase, 14

22 NDH, dont nous parlerons plus en détail au chapitre IV) et pour la synthèse de certains composants chloroplastiques. Enfin, il existe un cycle eau-eau (pour un article de synthèse voir par ex. Asada et al., 1998). Dans ce cycle, les électrons obtenus par oxydation de l'eau au niveau du PSII ne servent pas à réduire le NADPH au niveau du PSI, mais ils sont transmis par le PSI à l'oxygène conduisant à la formation d'ions O 2 -. Un système complexe le "scavenging system" (système de neutralisation), qui consomme du NADPH, permet aux végétaux de transformer O 2 - en H 2 O. Les ions O 2 - sont très réactifs et très destructeurs, ils ne sont donc formés en quantité non négligeable que lorsque la photosynthèse est saturée et que le PSI ne peut donner ses électrons à personne d'autre. I.1.3. Interactions entre les chloroplastes et le reste de la cellule Les interactions entre les chloroplastes et le reste de la cellule sont multiples et sont réalisées par le transport dans les deux sens au travers de l'enveloppe chloroplastique de nombreux composés (Heldt et Flügge, 1986), dont ceux que nous avons évoqués plus haut. Dans cette section, nous apporterons des précisions uniquement sur certaines interactions entre les chloroplastes et le reste de la cellule qui sont particulièrement importantes pour la photosynthèse. Nous évoquerons premièrement les interactions qui s'opèrent via le translocateur de phosphate, puis, plus généralement, les interactions entre les chloroplastes et les mitochondries. Un schéma des échanges entre chloroplastes, cytosol et mitochondries que nous allons évoquer est présenté Fig. I.5. Le translocateur de phosphate, ou plus exactement le translocateur de phosphatetriose phosphate-phosphoglycolate, est une protéine transmembranaire située dans la membrane intérieure de l'enveloppe du chloroplaste où il représente la majorité des protéines transmembranaires. Il transporte, comme son nom l'indique, le phosphate (HPO 4 2- ), les trioses phosphate (DHAP et glycéraldéhyde 3-phosphate) et le PGA. Le transport se fait suivant un échange strict. L'échange DHAP/phosphate est le moyen d'exporter hors du chloroplaste le carbone fixé par la photosynthèse et de maintenir une concentration constante en phosphate dans le chloroplaste. L'échange DHAP (qui sort du 15

23 Chloroplaste Mitochondrie OAA OAA NADH MAL MAL NAD NADPH OAA OAA NAD(P)H NADP MAL PGA CRPP DHAP MAL ATP PGK ADP NAD(P) PGA NADPH NADH GP NAD DHAP NADP NAD CTE ATP NADH ADP NDX NADPH NADP Pi Pi translocteur d'atp-adp synthèse de saccharose ATP ADP Figure I.5 : Echanges entre chloroplaste, cytosol et mitochondrie. CRPP : cycle réductif du pentose phosphate; CTE : chaîne de transport d'électrons; GP : NADP-glycéraldéhyde-3-phosphate déhydrogénase; MAL : malate; NDX : NADPH déhydrogénase externe; OAA : oxaloacétate; PGK : phosphoglycérate kinase et NAD-glycéraldéhyde-3-phosphate déhydrogénase. Schéma élaboré à partir de (Hoefnagel et al., 1998). chloroplaste) PGA (qui entre) permet d'exporter (par transformation de DHAP en PGA dans le cytosol) l'atp et le NAD(P)H généré par la photosynthèse vers le cytosol. Ces échanges sont très importants pour la photosynthèse puisqu'ils permettent d'exporter les produits du CRPP et de maintenir à une concentration constante les pools de métabolites (notamment le phosphate) impliqué dans ce cycle. Ce transport a donc une influence directe sur la photosynthèse. La synthèse d'amidon (qui elle aussi recycle le phosphate) est assez lente et n'est pas capable en pratique de maintenir à elle seule une photosynthèse 16

24 optimale et la concentration en phosphate correspondante en cas de déficience de l'échange phosphate/trioses phosphate (Edwards et Walker, 1983). C'est le cas avec les chloroplastes isolés intacts, dans lesquels la photosynthèse est très dépendante de la concentration externe en phosphate qui a un optimum très pointu. Si la concentration en phosphate est faible la photosynthèse diminue très vite faute de phosphate, et si cette concentration est élevée les trioses phosphate nécessaires au fonctionnement du CRPP sont exportées hors du chloroplaste et la photosynthèse démarre très très lentement ou jamais (Walker, 1987). Les interactions entre chloroplastes et mitochondries sont importantes puisque photosynthèse et respiration sont interdépendantes. Ces interactions font l'objet d'un article de synthèse récent (Hoefnagel et al., 1998) dont nous reprendrons les principales conclusions. Par le passé, on pensait que la respiration était totalement inhibée à la lumière, probablement suite à la production d'atp photosynthétique. Ce point de vue est actuellement considéré comme trop simpliste et les données expérimentales suggèrent que l'activité mitochondriale continue à la lumière dans la plupart des cas. Les interactions entre mitochondries et chloroplastes se font par échanges de métabolites : ATP (énergie), NAD(P)H (pouvoir réducteur) et composés carbonés. Le translocateur ATP/ADP des mitochondries est très actif et exporte rapidement de l'atp. Ce n'est pas le cas dans les chloroplastes qui montrent une capacité à exporter l'atp bien plus faible que les mitochondries. Le NAD(P)H ne peut pas traverser les membranes des organites, il est donc transporté entre chloroplastes et mitochondries par des navettes. Plusieurs navettes assurent le transport du pouvoir réducteur équivalent entre chloroplastes et mitochondries (on a déjà évoqué plus haut la navette chloroplastique DHAP/PGA) mais la navette la plus importante est la navette malate/oxaloacétate (l'oxydation du malate en oxaloacétate réduit NAD(P) + en NAD(P)H). Le fonctionnement des mitochondries à la lumière semble avoir deux intérêts principaux pour la photosynthèse, en plus de leur rôle dans le cycle photorespiratoire. Premièrement, elles peuvent fournir aux chloroplastes des composés carbonés et de l'atp, dans certaines conditions il apparaît que la production d'atp mitochondriale est essentielle pour une photosynthèse optimale. Deuxièmement, les 17

25 mitochondries peuvent oxyder l'excès de pouvoir réducteur qui est produit par les chloroplastes à la lumière dans de nombreux cas. A l'obscurité, les mitochondries sont bien sûr les principales sources d'atp et les chloroplastes en ont besoin comme le reste de la cellule. De plus, l'importation de pouvoir réducteur depuis les mitochondries vers les chloroplastes peut être un moyen de conserver le pool de PQ partiellement réduit à l'obscurité (utile pour fournir des électrons au PSI au début d'une illumination) par l'intermédiaire d'une réduction non-photochimique des PQ par NAD(P)H (voir chapitre IV). I.2. Fluorescence des végétaux Le spectre d'émission de fluorescence sous excitation UV peut être considéré comme une signature complexe qui contient de nombreux enseignements sur la 500 Beta vulgaris L. Fluorescence (u.r.) Pisum sativum L Longueur d'onde (nm) Figure I.6 : Spectre d'émission de fluorescence de deux feuilles excitées dans l'uv. Il s'agit du spectre de la face adaxiale (supérieure) d'une feuille de pois (Pisum sativum L., trait continu) et d'une feuille de betterave (Beta vulgaris L., pointillés). Longueur d'onde d'excitation : 355 nm. D'après (Cerovic et al., 1999). 18

26 physiologie des plantes (c'est l'objet d'un article de synthèse récent, Cerovic et al., 1999). Sous une excitation UV, les végétaux émettent deux types de fluorescence qui sont fondamentalement différents mais complémentaires : une fluorescence bleu-verte (FBV) de 400 à 600 nm et une fluorescence rouge de 650 à 800 nm. Les intensités relatives de ces deux types de fluorescence dépendent notamment de l'espèce, de l'age et des conditions de culture passées et présentes. La Fig. I.6 illustre bien la variation de l'intensité relative des deux fluorescences en fonction de l'espèce végétale. Les feuilles de pois, dont les parois cellulaires sont connus pour ne pas être fluorescentes (Hartley et Harris, 1981), ont une FBV nettement plus faible que les feuilles de betterave, dont les parois cellulaires sont fluorescentes car elles contiennent de l'acide ferulique estérifié (Hartley et Harris, 1981). La fluorescence rouge des végétaux provient uniquement de la chlorophylle a, elle est donc aussi appelée fluorescence de la chlorophylle (Chl) ou fluorescence chlorophyllienne. En effet, les autres pigments (Chl b et caroténoïdes), présents dans les antennes des deux photosystèmes, et dont le spectre d'absorption est en partie complémentaire de celui de la Chl a (Fig. I.7), transfèrent l'énergie lumineuse qu'ils ont absorbée à la Chl a. Comme nous le verrons par la suite, la fluorescence de la Chl permet de mesurer le fonctionnement de l'appareil photosynthétique. Cette mesure étant, de plus, non-intrusive, il n'est pas étonnant qu'elle soit devenue une des méthodes d'analyse les plus utilisées dans les sciences végétales (Schreiber et Bilger, 1993). Au contraire de la fluorescence rouge, la FBV à une origine très hétérogène, de nombreux fluorophores dans différents compartiments de la feuille peuvent participer à la FBV. Elle est connu depuis longtemps (début du 20 ème siècle (Rost, 1995)), mais n'est véritablement explorée que depuis peu (Chappelle et al., 1984; Cerovic et al., 1999) et a donc été bien moins étudiée que la fluorescence de la Chl. I.2.1. Fluorescence de la chlorophylle Il existe de très nombreux articles de synthèse sur la fluorescence de la Chl en relation avec la photosynthèse (voir par ex. Briantais et al., 1986; Krause et Weis, 1991; 19

27 Coefficient d'absorption molaire (L mol -1 cm -1 ) x Chl a (abs.) Chl b (abs.) Lutéine (abs.) Chl a (fluo.) Fluorescence (r.u.) Longueur d'onde (nm) Figure I.7 : Spectres d'absorption et d'émission de fluorescence des pigments photosynthétiques. Seul le spectre d'émission de fluorescence de la Chl a est présenté, car la lutéine (comme les autres caroténoïdes présents dans des antennes) et la Chl b ne fluorescent pas in vivo. La lutéine est en solution dans l'éthanol. Les spectres d'absorption des autres caroténoïdes sont très proches de celui de la lutéine (Lichtenthaler, 1987). Chl a et Chl b sont en solution dans le méthanol. Pour le spectre d'émission de fluorescence, la concentration en Chl a était de 1 μm et la longueur d'onde d'excitation était 430 nm. D'après (Cerovic et al., 1999). Schreiber et Bilger, 1993) et nous rappelons simplement ici les principales caractéristiques de cette fluorescence et ses rapports avec la photosynthèse. La structure chimique de la Chl est représentée sur la Fig. I.8. Ce sont des molécules lipophiles d'une masse molaire d'environ 900 g/mol. Elles sont composées d'une "tête" de type chlorine contenant un atome de magnésium et d'une longue queue hydrophobe. L'absorption de la lumière, pour laquelle la présence d'un atome de magnésium est cruciale, et sa ré-émission par fluorescence sont réalisées par la "tête", où la délocalisation des électrons est importante. Les axes x et y représentent les directions de polarisation des principales transitions électroniques responsables de l'absorption de la lumière. Ces transitions sont nombreuses comme le montre le spectre d'absorption (Fig. I.7), mais quelle que soit la transition les électrons excités se retrouvent très rapidement 20

28 Figure I.8 : Structure chimique de la Chl a et b. D'après (Lawlor, 1993). sur le premier état singulet excité (qui correspond à la bande d'absorption dans le rouge) par conversion interne (Moya et al., 1986). Le premier état singulet excité est plus stable (temps de vie de fluorescence d'environ 6 ns (Seely et Connolly, 1986)), et c'est à partir de ce niveau que les électrons excités reviennent à l'état fondamental par émission de fluorescence ou bien par transfert d'énergie d'excitation vers d'autres molécules de Chl dans les antennes ou vers le centre réactionnel. C'est pourquoi le spectre d'émission de la Chl (Fig. I.7) ne comporte qu'une seule double bande d'émission dans le rouge. La Chl a en solution a un rendement de fluorescence important, environ 30 % (en solution dans l'éther) (Krause et Weis, 1991). In vivo la Chl se trouve dans les protéines antennes et elle est très concentrée (environ fois plus dans les chloroplastes que celle utilisée pour le spectre d'émission Fig. I.7), en conséquence les caractéristiques de sa fluorescence sont différentes. Comme on le voit Fig. I.5, la forme du spectre d'émission est différente : le pic à 670 nm devient in vivo un pic vers 685 nm et l'épaulement à 725 nm devient, in vivo, un 21

29 pic vers 735 nm. Ces modifications du spectre d'émission sont dues à une importante autoréabsorption. La Fig. I.7 montre bien, en effet, la grande superposition du spectre d'absorption et du spectre d'émission. In vivo, la position exacte des deux pics, ainsi que le rapport de leurs amplitudes dépend de la concentration en Chl (Lichtenthaler et Rinderle, 1988). Le rendement de fluorescence est bien plus faible in vivo, puisque plus de 90 % de l'énergie lumineuse absorbée est utilisée par la photochimie (Krause et Weis, 1991). La fluorescence ne représente au maximum qu'environ 3 % de l'énergie lumineuse absorbée lorsque la photosynthèse (photochimie) est saturée, et seulement environ 0,6 % lorsque la photochimie fonctionne de façon optimale (Krause et Weis, 1991). L'influence de l'environnement in vivo se traduit aussi par des modifications en ce qui concerne le temps de vie de fluorescence de la Chl a. Il n'y a plus un seul temps de vie de fluorescence mais au moins trois, qui sont fonction notamment de la protéine où se trouve la Chl (pour un article de synthèse sur ce sujet voir Moya et al., 1986). Le rendement de la fluorescence de la Chl in vivo n'est pas constant, c'est là la principale spécificité de la fluorescence chlorophyllienne in vivo : son rendement est variable et il est fonction de la lumière actinique et du fonctionnement de l'appareil photosynthétique. On appelle lumière actinique la lumière qui sert de substrat à la photosynthèse. C'est cette dépendance du rendement de la fluorescence de la Chl par rapport à la photosynthèse qui en fait un outil de choix pour l'étude des organismes photosynthétiques. La fluorescence chlorophyllienne mesurée vers 685 nm est émise principalement par les antennes du PSII et il n'y a qu'une contribution mineure des antennes du PSI (Krause et Weis, 1991). Le rendement de la fluorescence chlorophyllienne dépend donc essentiellement du PSII, et plus précisément de l'état d'oxydoréduction des Q A (Duysens et Sweers, 1963). En fait, en temps normal, comme Q A transfert ses électrons au pool de PQ, le rendement de la fluorescence chlorophyllienne dépend de l'état d'oxydoréduction du pool de PQ. La relation entre le rendement de la fluorescence chlorophyllienne et l'état redox des Q A n'est pas linéaire et s'explique par l'existence d'un équilibre entre les antennes, qui émettent la fluorescence, et le centre 22

30 réactionnel, pour qui la possibilité d'effectuer une séparation de charge dépend de la disponibilité (c est-à-dire son état redox) de l'accepteur Q A. L'équation générale de l'émission de fluorescence, F, peut s'écrire : F = I a k F k i k F = I a k F + k D + k T + k P (I.2) I a : flux lumineux absorbé k F : constante de désactivation radiative par la fluorescence k D : constante de désactivation par la dissipation thermique k T : constante de désactivation par le transfert d'excitation vers d'autres molécules, notamment vers les pigments des antennes du PSI k P : constante de désactivation par la conversion photochimique Le rendement quantique de fluorescence F et le rendement photochimique P sont alors donnés par : F = F I a = k F k F + k D + k T + k P (I.3) P = k P k F + k D + k T + k P (I.4) Soit Fo le rendement minimal de fluorescence, il apparaît lorsque tous les centres réactionnels sont disponibles pour la photochimie (Q A oxydé), on dit qu'ils sont ouverts. La capacité de la désactivation par la photochimie est alors maximale : k P >> k F + k D + k T. C'est le cas lorsque la lumière actinique est nulle. Soit FM le rendement maximal de fluorescence, il apparaît lorsque tous les centres réactionnels sont fermés (Q A réduit), la capacité de la désactivation par photochimie est nulle : k P = 0. C'est le cas lorsque la lumière actinique est suffisamment forte pour saturer complètement la photosynthèse. 23

31 En mesurant Fo et FM on peut calculer le rendement photochimique optimal. Il correspond à l'état où la désactivation thermique est constante et minimale. Les mécanismes photosynthétiques qui encouragent la désactivation thermiques ne se mettent complètement en place qu'après un certain temps d'exposition à la lumière actinique. P = F M F O FM = F M F O F M = F V F M (I.5) où F M est la fluorescence maximale, F O la fluorescence minimale et F V est la variation maximale de l'émission de fluorescence. En effet, en pratique il est plus facile de mesurer une intensité de fluorescence qu'un rendement, et on détermine P en mesurant F M et F O avec une intensité constante du faisceau excitateur de mesure. Cette mesure se fait généralement au cours d'une induction de fluorescence (ou effet Kautsky) comme l'illustre la Fig. I.9. Une telle mesure nécessite de disposer d'un faisceau de mesure de la fluorescence qui ne soit pas actinique, et d'une lumière actinique qui ne perturbe pas la mesure de fluorescence. L'aspect technique de cette mesure est traité à la section I Pour une plante dont la photosynthèse fonctionne bien une valeur de P d'environ 0,83 est typique (Björkman et Demmig, 1987). Comme le montre la Fig. I.9, P est mesuré lorsque la plante est à l'obscurité (photosynthèse inactive), mais lorsque la plante est à la lumière les processus de désactivation thermique, qui sont liés au fonctionnement de l'appareil photosynthétique, se mettent en place et le rendement photochimique est inférieur à P. Genty et al. (1989) ont montré qu'il était possible de mesurer le rendement photochimique effectif, c est-à-dire le rendement photochimique en présence de lumière actinique, lorsque la photosynthèse est activée et que les mécanismes photosynthétiques de désactivation thermique sont totalement activés. Pour cela, on mesure F (fluorescence à la lumière) et F M ' (fluorescence maximale à la lumière) comme indiqué sur la Fig. I.9. 24

32 Figure I.9 : Induction de la photosynthèse, mesure du rendement photochimique optimal et du rendement photochimique effectif. ML : début de la mesure, mise en marche du faisceau (non-actinique) de mesure de la fluorescence; SP : flash lumineux saturant ; AL : lumière actinique non-saturante; FR : lumière rouge lointain. D'après (Van Kooten et Snel, 1990). La lumière rouge lointain est absorbée préférentiellement par le PSI et excite donc très peu le PSII. Elle est utilisée ici pour drainer complètement les électrons du pool de PQ lors de l'extinction de la lumière actinique. Le niveau F 0 ' est alors inférieur à F 0 en raison des phénomènes de désactivation thermique qui sont encore actifs. Le rendement photochimique effectif est donné par : (F M ' F)/F M ' = F V '/F M ' (I.6) Ce paramètre F V '/F M ' permet de mesurer le rendement de la photosynthèse (Schreiber et Bilger, 1993), mais c'est d'abord une mesure du rendement quantique du flux d'électrons photosynthétiques du PSII. I.2.2. Fluorescence bleu-verte La FBV des végétaux peut se diviser en deux types de FBV suivant le type d'information qui peut en être obtenu. Le premier type de FBV provient essentiellement 25

33 des phénylpropanoïdes, composés liés aux parois cellulaires ou se trouvant dans les vacuoles des cellules de l'épiderme. Cette FBV est constante ou lentement (heures, jours) variable. Elle se mesure facilement et peut être mesurée à distance par des LIDAR (LIght Detection And Ranging) (Cerovic et al., 1999). Le second type de FBV est celle des nucléotides pyridiniques (NADH et NADPH, regroupés ensemble sous le sigle NAD(P)H), elle est bien plus directement reliée à la biochimie des plantes et en particulier à la photosynthèse. C'est à elle que nous nous intéressons dans ce travail. On peut aussi classer dans ce deuxième type de FBV la fluorescence des flavines qui est elle aussi reliée à la photosynthèse, mais elle ne participe qu'à la partie verte de la FBV et elle s'est avérée nettement plus faible que la fluorescence du NAD(P)H, tout au moins dans les chloroplastes, comme nous le verrons par la suite. Le premier type de FBV représente toujours la majeure partie de la FBV des feuilles. De nombreux composés sont potentiellement impliqués dans cette FBV, ils ont été récemment recensés dans un article de synthèse par Cerovic et al. (1999) et nous reprenons ici les principales conclusions de cette analyse. L'acide ferulique, un acide hydroxycinnamique qui se lie covalament aux polysaccharides des parois cellulaires dans l'épiderme et les veines des feuilles (Harris et Hartley, 1976), est considéré comme étant responsable de la majeure partie de la FBV des feuilles (Harris et Hartley, 1976; Morales et al., 1996; Lichtenthaler et Schweiger, 1998). Cependant, de nombreux autres produits du métabolisme secondaire des plantes peuvent contribuer de façon significative à cette FBV de premier type. Les composés suivants sont connus pour être présents dans les feuilles et sont cités par Wolfbeis (1985) comme étant fluorescent dans la partie bleu-verte du spectre : des acides hydroxycinnamiques (cafféique, férulique, sinapique), des chromones, des stilbènes (resvératrol), des coumarines (umbelliférone, esculétine, scopolétine), des furocoumarines (psoralène), des flavonols, des flavones (sauf les 5- hydroxyflavones), des isoflavones, des flavanones, des chalcones, des aurones, des acides phénoliques (salicylique, gentisique, ellagique), le pyridoxal-5'-phosphate, des ptérines (acide folique, dihydrofolate), des polyènes (phytofluène), des quinones (phyllohydroquinone), des alkaloïdes (berbérine, quinine, acide lysergique), et des 26

34 produits de dégradation (kynurénine, acide polyadenylique). La présence ou l'absence de ces composés dépend notamment de l'espèce végétale. De plus, même s'ils sont présents dans une feuille ces fluorophores ne contribueront pas forcément à la FBV de la feuille. Leur contribution dépendra de leur localisation dans la feuille, de leur concentration, et des autres composés absorbant la lumière UV excitatrice présents dans la feuille. Ainsi, la FBV des feuilles peut elle être nettement influencée par des composés absorbant l'uv mais non-fluorescents, tels que les deux principaux flavonols des feuilles la quercetine et le kaempferol (Ribéreau-Gayon, 1968), qui sont présents dans les vacuoles des cellules de l'épiderme (Harborne, 1988) ou dans la cuticule (Wollenweber et Dietz, 1981). Un des rôles essentiels de ces composés absorbant dans l'uv (qu'ils soient fluorescents ou non) et qui sont présents principalement dans les parties périphériques des feuilles, est la protection des feuilles, notamment de l'appareil photosynthétique, contre le rayonnement UV, qui du fait de son énergie importante est plus destructeur. Il n'est donc pas étonnant que la FBV des feuilles dépende, non seulement de l'espèce végétale, mais aussi de différents paramètres tels que : l'age, les déficiences minérales, le stress hydrique, la température et la présence de pathogènes (Cerovic et al., 1999). Par ailleurs, en cas d'excitation dans l'uv-b, la fluorescence des protéines peut participer à cette FBV du premier type, puisque la queue de leur spectre d'émission est encore substantielle après 400 nm (voir Fig. III.8). Les premières investigations sur la fluorescence du NAD(P)H in vivo sur des bactéries et des algues photosynthétiques (Duysens et Amesz, 1957; Duysens et Sweep, 1957; Olson et al., 1959; Olson et Amesz, 1960) date des années , et bien que les recherches sur les caractéristiques et le potentiel de ce signal aient continué dans le domaine de la biotechnologie (ex. Lidén et Niklasson, 1993; Kwong et Rao, 1994) et dans le domaine biomédical (ex. Wakita et al., 1995; Bigio et Mourant, 1997; French et al., 1998), la fluorescence du NAD(P)H dans les plantes a été négligée pendant longtemps. Ce sont les progrès dans les lasers UV et leur utilisation en télédétection de la fluorescence des plantes (Cerovic et al., 1999) qui ont motivé l'étude des fluorophores des feuilles excités dans l'uv, parmi lesquels NADPH a une importance toute particulière 27

35 étant donnée son rôle dans la photosynthèse. Cependant, les chloroplastes étant situés à l'intérieur des feuilles, les composés de l'épiderme des feuilles qui absorbent l'uv font un effet d'écran aux fluorophores des chloroplastes qui ne reçoivent généralement qu'une faible proportion de la lumière UV d'excitation. De plus, la FBV des chloroplastes est faible (par rapport à celle des feuilles); elle a même été décrite comme négligeable (Lang et al., 1992; Stober et al., 1994). Sa contribution à la FBV des feuilles a été estimée autour de 3 % dans les épinards (Cerovic et al., 1993) et nous l'estimons autour de 15 % dans les pois (Fig. III.3). Ainsi, dans la plupart des cas la fluorescence du NADPH est trop faible pour être détectée dans les feuilles (Broglia, 1993; Stober et al., 1994), les feuilles de pois cultivés sans lumière UV y font exception (Fig. III.3). La mesure de la fluorescence de NADPH n'est donc pas envisageable en télédétection. Par contre, les recherches sur la fluorescence du NADPH dans les chloroplastes isolés sont possibles (Broglia, 1993; Cerovic et al., 1993). Il est important de noter que la FBV des chloroplastes n'est pas due uniquement au NADPH. D'autres fluorophores potentiels comme des ptérines, des folates, des pyridoxines, des quinones et des kinurénines (Wolfbeis, 1985), qui sont connues pour être présents dans les chloroplastes, peuvent contribuer à la FBV des chloroplastes. Le NAD aussi est présent dans les chloroplastes, mais il semble que le pool de NAD soit toujours presque totalement oxydé (Heber et Santarius, 1965; Heineke et al., 1991), or la forme oxydée NAD + ne contribue pas à la FBV, puisque seule la forme réduite des nucléotides pyridiniques est fluorescente. Et enfin, une contribution des flavines dans la partie verte de la FBV doit aussi être considérée lors de l'analyse de la FBV des chloroplastes. Cependant, nous disposons d'un moyen de différencier la fluorescence du NADPH du reste de la FBV des chloroplastes, puisqu'il a été montré par Cerovic et al. (1993) que l'augmentation réversible de FBV induite par la lumière actinique dans les chloroplastes est due seulement au NADPH. L'étude de la fluorescence du NADPH au travers de cette augmentation photo-induite de FBV dans les chloroplastes, qui est un des principaux aspects de ce travail, est l'objet du chapitre III. Par ailleurs, il existe un phénomène important qui influence la FBV des chloroplastes, en diminuant son intensité et en déformant son spectre d'émission, c'est la réabsorption par les pigments 28

36 photosynthétiques. En effet, comme le montre la Fig. I.7, chlorophylles et caroténoïdes absorbent dans la partie bleu-verte du spectre et réabsorbent donc une grande une grande partie de la fluorescence du NADPH. I.3. Fluorescence du NAD(P)H et des flavines I.3.1. Fluorescence du NAD(P)H La Fig. I.10 montre la structure de la forme oxydée et de la forme réduite de NAD(P). C'est le groupement nicotinamide qui est responsable de l'émission de FBV, mais seule la forme réduite NAD(P)H émet une FBV, la forme oxydée n'est pas fluorescente. Les caractéristiques de la FBV de NADH et de NADPH semblent identiques d'après les mesures présentées sur ces deux coenzymes dans la littérature, ce qui n'est pas étonnant puisqu'il n'y a qu'une petite différence entre ces deux nucléotides dans la partie adénosine. Il n'est donc pas possible de les différencier par la fluorescence et nous décrirons donc les caractéristiques de la fluorescence des nucléotides pyridiniques Figure I.10 : Structure des formes oxydée et réduite de NAD et de NADP. D'après (Voet et Voet, 1990). 29

37 Coefficient d'absorption molaire (L mol -1 cm -1 ) x absorption émission excitation Fluorescence (r.u.) Longueur d'onde (nm) Figure I.11 : Spectre d'absorption, d'excitation et d'émission de fluorescence de NADPH. Les spectres ont été enregistrés sur une solution aqueuse (ph 7,9) de NADPH (12 μm pour les spectres de fluorescence). Le spectre d'excitation a été enregistré à une longueur d'onde d'émission de 440 nm et celui d'émission à une longueur d'onde d'excitation de 340 nm. (NAD(P)H). Sur la Fig. I.11 sont représentés les spectres d'absorption, d'excitation et d'émission de fluorescence de NAD(P)H. Le pic à 340 nm est dû à l'absorption par le groupement nicotinamide, et le pic à 260 nm est dû à l'absorption par le groupement adénine. En solution aqueuse, il existe un transfert d'énergie d'excitation non-radiatif entre le groupement adénine et le groupement nicotinamide (Weber, 1957; Weber, 1958; Velick, 1961; Scott et al., 1970; Salmon et Viallet, 1977), ce qui explique le pic à 260 nm du spectre d'excitation de fluorescence. Le rendement de ce transfert est de 34 % dans l'eau (Scott et al., 1970). Ce transfert n'est possible que pour la forme repliée de NAD(P)H, dans laquelle les groupements adénine et nicotinamide sont proches, mais n'a pas lieu dans la forme dépliée (Scott et al., 1970; Salmon et Viallet, 1977). Le transfert n'existe pas dans des solvants peu polaires dans lesquels la forme repliée est 30

38 vraisemblablement peu présente (Scott et al., 1970; Salmon et Viallet, 1977), tandis que dans l'eau l'équilibre entre les deux conformations est tel que 20 à 50 % des molécules adoptent la forme repliée à température ambiante (Couprie et al., 1994). Le spectre d'émission de fluorescence de NAD(P)H a un maximum vers 460 nm et son recouvrement avec le spectre d'absorption est donc faible. L'auto-réabsorption est donc nettement moins importante dans le cas de la fluorescence de NAD(P)H que dans celui de la fluorescence de la Chl. Un rendement quantique de fluorescence de 0,019 a été mesuré pour NADH dans l'eau à 25 C (Scott et al., 1970). La fluorescence du NAD(P)H comporte plusieurs composantes de temps de vie différents (ex. Lakowicz et al., 1992). Les résultats de l'analyse résolue en temps de la fluorescence de NADPH obtenus sur notre spectrofluorimètre sont présentés Table I.1. Ces résultats sont bien en accord avec ceux obtenus précédemment (Visser et VanHoek, 1981; Krishnamoorthy et al., 1987; Couprie et al., 1994; Ladokhin et Brand, 1995). Il n'y a pas vraiment de consensus sur l'origine de l'hétérogénéité du temps de vie des nucléotides pyridiniques (Ladokhin et Brand, 1995) et différentes hypothèses ont été proposées : la présence de différentes espèces fluorescentes (forme dépliée et forme repliée) (Brochon et al., 1976), une réaction réversible de l'état excité donnant un produit non-fluorescent Table I.1 : Caractéristiques temporelles de la fluorescence du NADPH. Moyennes et écarts types correspondants ont été obtenus à partir de l'analyse globale de 8 déclins de fluorescence mesurés sur une solution de NADPH (10 μm) dans le milieu général. Longueur d'onde d'excitation : 340 nm. Longueur d'onde d'émission : 456 nm. Pour plus de détails sur les conditions de mesure (spectrofluorimètre) et d'analyse voir le chapitre II. i et f i sont respectivement le temps de vie de fluorescence et la contribution relative à la fluorescence n totale de la composante i. f i est définit par f i = i i / i i où les i sont les facteurs préexponentiels relatifs. Le temps de vie moyen m est définit par m = f i i = i i=1 n n n 2 i / i i i=1 i=1 i=1 Composantes temporelles Temps très courte C1 courte C2 moyenne C3 de vie moyen (ns) f (%) (ns) f (%) (ns) f (%) m (ns) 0,15 43,1 ± 0,4 0,53 54,3 ± 0,4 2,9 2,6 ± 0,1 0,43 31

39 (Gafni et Brand, 1976) ou donnant un produit fluorescent (Ladokhin et Brand, 1995), et la formation d'un exciplex (conformation repliée et dépliée sont en équilibres à la fois à l'état fondamental et à l'état excité) (Visser et VanHoek, 1981). Pour NAD(P)H en solution aqueuse il semble qu'en tout cas il y ait bien une hétérogénéité de l'état fondamental (forme repliée et forme dépliée) (Couprie et al., 1994; Ladokhin et Brand, 1995). I Conséquences de la liaison avec les protéines Lorsqu'il se lie aux protéines NAD(P)H a une fluorescence dont les caractéristiques sont différentes de celle de NAD(P)H en solution aqueuse. Cette liaison se traduit par un déplacement du spectre d'émission d'environ 20 nm vers les courtes longueurs d'onde (Duysens et Kronenberg, 1957; Velick, 1961; Hsu et Lardy, 1967; Li et Lin, 1996). Elle se traduit aussi par une augmentation du rendement quantique et du temps de vie de fluorescence. Le facteur d'augmentation étant visiblement le même pour les deux paramètres (Scott et al., 1970). NAD(P)H lié aux protéines est 3-5 fois plus fluorescent (Duysens et Kronenberg, 1957; Langan, 1960; Scott et al., 1970) (des augmentations plus importantes ont été mesurées (Harvey et al., 1972)). Cette augmentation peut être encore plus grande dans le cas de complexes ternaires NAD(P)H-enzyme-substrat (Hsu et Lardy, 1967; Scott et al., 1970; Gafni et Brand, 1976). De même, la liaison de NAD(P)H avec les protéines accroît son temps de vie de fluorescence (Scott et al., 1970; Lakowicz et al., 1992; König et al., 1997), mais la valeur exacte du temps de vie dépend de la protéine et de la présence d'un troisième ligand (ex. Brochon et al., 1977; Baumgarten et Hönes, 1988). De plus, comme pour le NAD(P)H libre, la fluorescence du NAD(P)H lié aux protéines comporte plusieurs composantes temporelles de temps de vie différents (ex. Lakowicz et al., 1992). Les données de la littérature montrent qu'il y a essentiellement deux temps de vie pour NAD(P)H lié aux protéines : un vers 1-2 ns et un autre vers 3-6 ns (Brochon et al., 1976; Gafni et Brand, 1976; Brochon et al., 1977; Ladokhin et Brand, 1995; Kierdaszuk et al., 1996). Une partie des hypothèses envisagées pour expliquer l'existence de plusieurs temps de vie de fluorescence pour NAD(P)H, et que nous avons 32

40 énumérées dans le cas du NADP(H) libre, ont été formulées dans le but d'expliquer aussi l'hétérogénéité de temps de vie de fluorescence du NAD(P)H lié, sachant qu'avec NAD(P)H lié il n'y a pas d'équilibre entre conformation repliée et conformation dépliée. En effet, différentes techniques de mesures s'accordent sur le fait que NAD(P)H se lie aux protéines dans sa forme dépliée (Salmon et Viallet, 1977). Un des arguments menant à cette conclusion est la disparition du pic à 260 nm dans le spectre d'excitation de NAD(P)H lié (Velick, 1961; Salmon et Viallet, 1977). Il est généralement remplacé par un pic vers 290 nm qui correspond à l'absorption par les protéines et traduit donc un transfert d'énergie d'excitation des protéines vers le NAD(P)H lié (ce transfert est discuté plus en détail ultérieurement section III ). Il faut noter que dans la littérature on trouve le cas de protéines avec lesquelles la fluorescence de NAD(P)H n'augmente pas lorsqu'il se lie (Velick, 1958; Velick, 1961) ou lorsque cette liaison est non-spécifique (Weiner et al., 1972). I.3.2. Fluorescence des flavines La structure des trois principales flavines (riboflavine, FMN et FAD) sont présentées Fig. I.12. C'est le groupement isoalloxazine qui est responsable de la fluorescence verte des flavines et plus précisément sa forme oxydée, la forme réduite des flavines n'est pas fluorescente (Velick, 1961; Spencer et Weber, 1972). Les spectres d'absorption, d'émission et d'excitation de fluorescence des flavines sont présentés Fig. I.13 dans le cas de FAD. Les flavines ont trois pic d'absorption/excitation (vers 260 nm, 370 nm et 450 nm) et un pic d'émission vers 530 nm. Le groupement isoalloxazine est aussi responsable de l'absorption de la lumière. Dans le cas du FAD, il y a aussi une participation du groupement adénine au pic d'absorption à 260 nm mais, contrairement au NAD(P)H, il n'y a pas d'excitation de fluorescence par absorption de l'adénine (Velick, 1961). Riboflavine et FMN sont fortement fluorescents; le rendement quantique de fluorescence du FMN est d'environ 25 % (Velick, 1961). Le rendement quantique de fluorescence du FAD est environ un dixième de celui du FMN (Velick, 1961; Spencer et 33

41 Figure I.12 : Structure du FAD, du FMN et de la riboflavine (vitamine B2). D'après (Voet et Voet, 1990). Weber, 1972; Wolfbeis, 1985; Galland et Senger, 1988). La raison de cette forte baisse de fluorescence du FAD est l'existence d'une extinction de la fluorescence (ou "quenching") du groupement isoalloxazine par le groupement adénine (Velick, 1961; Spencer et Weber, 1972; Galland et Senger, 1988). Ce quenching est due à l'existence en solution aqueuse d'un complexe intramoléculaire entre l'adénine et l'isoalloxazine (Spencer et Weber, 1972). Ce complexe qui est non-fluorescent est en équilibre avec une forme dépliée du FAD (Spencer et Weber, 1972). Dans l'eau, les molécules de forme dépliée absorbent 18 % de la lumière absorbée et soit la ré-émettent par fluorescence, soit se transforment en complexe non-fluorescent alors qu'elles sont dans leur état excité (Spencer et Weber, 1972). Les flavines en solution ont un seul temps de vie de fluorescence : pour le FMN il 34

42 Coefficient d'absorption molaire (L mol -1 cm -1 ) x absorption émission excitation Fluorescence (r.u.) Longueur d'onde (nm) Figure I.13 : Spectre d'absorption, d'excitation et d'émission de fluorescence de FAD. Les spectres ont été enregistrés sur une solution de FAD (10 μm pour les spectres de fluorescence) dans l'eau. Le spectre d'excitation a été enregistré à une longueur d'onde d'émission de 530 nm et celui d'émission à une longueur d'onde d'excitation de 376 nm. vaut environ 4,7 ns (Wahl et al., 1974; Visser, 1984; Wolfbeis, 1985; Cerovic et al., 1994) ou un peu plus (Eweg et al., 1982; Galland et Senger, 1988; Schneckenburger et König, 1992) et pour le FAD il vaut environ 2,8 ns (Wahl et al., 1974; Visser, 1984; Cerovic et al., 1994). On peut remarquer que dans le cas du FAD certains auteurs ont trouvé en plus d'une composante principale vers 2,8 ns, une deuxième composante nettement minoritaire (Visser, 1984; Cerovic et al., 1994). Comme pour les nucléotides pyridiniques, la fluorescence des flavines est affectée par l'environnement moléculaire et notamment par la liaison avec les protéines. Dans le cas des flavines il y a une forte interaction entre les résidus aromatiques des protéines et le groupement isoalloxazine (Galland et Senger, 1988), qui se traduit par un fort quenching de la fluorescence et donc par une diminution du rendement et du temps de vie de fluorescence (Velick, 1961; Sarkar et al., 1982; Wolfbeis, 1985; Leenders et al., 1993; 35

43 Albani et al., 1999). Pour certaines flavoprotéines, cependant, ce quenching existe apparemment peu ou pas (Velick, 1961; Pollock et Lipson, 1985). I.4. Techniques expérimentales de mesure de la fluorescence I.4.1. Fluorimétrie impulsionnelle Les variations photo-induites de la fluorescence chlorophyllienne et de la FBV sont riches en informations sur la photosynthèse, mais leur mesure nécessite de séparer deux lumières : une lumière analytique qui induit le signal de fluorescence à mesurer sélectivement, qui doit être suffisamment faible pour ne générer qu'une fermeture négligeable des centres et ainsi ne pas influer sur le fonctionnement de la photosynthèse, et une lumière actinique qui est substrat pour la photosynthèse et dont les variations d'intensité sont responsables des changements du rendement de la fluorescence chlorophyllienne et des variations de la FBV. Les premiers fluorimètres conçut pour mesurer la fluorescence chlorophyllienne utilisaient une source de lumière unique servant de lumière analytique et de lumière actinique, la séparation du signal de fluorescence et de la lumière d'excitation étant obtenu par une séparation spectrale (en général un filtre bleu pour l'excitation et un filtre rouge pour l'émission) (pour un article de synthèse voir Schreiber, 1983). Le signal ainsi obtenu est intense, cependant ses variations ne traduisent pas directement les variations du rendement de fluorescence et cette méthode présentes aussi d'autres désavantages (Schreiber, 1986). La fluorimétrie impulsionnelle est, au contraire, parfaitement adaptée à ce type de mesure. Son utilisation pour la mesure de la fluorescence chlorophyllienne commence avec le fluorimètre de Duysens et Sweers (1963). Ce fluorimètre utilisait une lumière analytique modulée à 50 Hz par un "chopper" et grâce à une détection synchrone seul le signal de fluorescence pareillement modulé était amplifié et détecté. Sur un principe similaire Schreiber et son équipe (Schreiber, 1986; Schreiber et al., 1986) ont 36

44 développé un fluorimètre impulsionnel, le fluorimètre PAM (Pulse Amplitude Modulation), qui est devenu une référence, et qui est très largement utilisé par les physiologistes végétaux et les équipes travaillant sur la photosynthèse. Dans ce fluorimètre les impulsions de lumière analytique durent 1,2 μs avec des périodes comparativement longue (625 μs ou 1,25 ms) entre les impulsions. La détection sélective des seules impulsions de fluorescence induite par la lumière actinique est obtenue par une première étape d'amplification sélective des signaux haute fréquence (amplificateur passehaut), suivit par une deuxième étape d'amplification sélective des impulsions de fluorescence synchronisée avec la source de lumière analytique (pour plus de détail voir Schreiber, 1986). La lumière actinique est fournie par une simple source de lumière continue. Ce système à l'avantage d'avoir une très grande dynamique de mesure et un facteur de réjection de la lumière continue (lumière ambiante, lumière actinique, fluorescence continue) de 1/10 6 (Schreiber et Bilger, 1993), ce qui est meilleur que ce qu'il est possible d'obtenir avec une détection synchrone. Le fluorimètre impulsionnel que nous avons construit, et qui mesure simultanément la fluorescence chlorophyllienne et la FBV, est basé sur le même principe que le fluorimètre PAM, mais avec une technique de détection sélective des impulsions de fluorescente différente. La mesure est faite avec une seule impulsion et peut donc se faire à très basse fréquence. La détection est basée sur l'utilisation de la contre-réaction pour retrancher en permanence le signal intégré (signal continu) du signal total (signal continu plus signal impulsionnel), et ainsi seul le signal impulsionnel est amplifié. Les impulsions de fluorescence sont ensuite échantillonnées par synchronisation sur les impulsions de lumière analytique. I.4.2. Mesures de fluorescence résolue en temps et comptage de photo-électron unique corrélé en temps La fluorescence est la lumière émise lors de la désactivation radiative de molécules qui étaient dans un état électronique excité et qui reviennent à leur état fondamental. Cette désactivation s'effectue suivant une cinétique du premier ordre, c'est pourquoi, après une 37

45 impulsion de lumière excitatrice infiniment courte, l'intensité de fluorescence décroît en fonction du temps suivant une exponentielle décroissante. Le temps de vie de fluorescence est alors défini comme le temps nécessaire pour que l'intensité de fluorescence diminue d'un facteur 1/e. Il y a essentiellement deux types de méthodes utilisées pour mesurer les temps de vie de fluorescence, celles relatives aux mesures réalisées dans le domaine temporel et celles relatives aux mesures réalisées dans le domaine fréquentiel. Le principe de base des mesures temporelles consiste à exciter l'échantillon fluorescent avec une impulsion lumineuse de courte durée, le déclin de fluorescence (F(t)) correspondant est enregistré. Ce déclin est tel que : F(t) = A e - t (I.7) Où est le temps de vie de fluorescence et le facteur pré-exponentiel. Les techniques de mesure fréquentielle, ou fluorimétrie de phase, utilisent une lumière d'excitation modulée qui induit l'émission d'une fluorescence pareillement modulée, mais déphasée et d'une amplitude inférieure à cause du temps de vie de fluorescence. La mesure du déphasage et de la différence d'amplitude permettent de calculer facilement le temps de vie de fluorescence (pour plus de détail sur cette technique voir par ex. Lakowicz, 1991). Il y a essentiellement deux techniques de mesure temporelle utilisées pour enregistrer les déclins de fluorescence, une technique qui consiste à enregistrer l'intensité de fluorescence émise en fonction du temps après une impulsion de lumière d'excitation grâce à un détecteur rapide comme une "streak camera", et la technique du comptage de photoélectron unique corrélé en temps (CPUCT), que nous avons utilisé. Le grand avantage du CPUCT par rapport aux deux autres techniques (enregistrement de l'intensité de fluorescence en fonction du temps et fluorimétrie de phase) est le fait que l'on connaît ses propriétés statistiques, qui sont de type poissonien (l'émission des photo-électrons consécutive à l'arrivé des photons sur le détecteur suit la loi de Poisson (ex. O'Connor et Phillips, 1984). Cela implique notamment que la nature du bruit est connue et qu'il suffit d'augmenter la durée d'enregistrement pour augmenter le rapport signal sur bruit. Ces 38

46 connaissances sont très précieuses lors du traitement mathématique des déclins de fluorescence qui donne accès aux caractéristiques temporelles de la fluorescence. Le CPUCT permet ainsi l'analyse de déclins de fluorescence très complexes, ce qui n'est pas le cas de la mesure de l'intensité de fluorescence en fonction du temps, qui ne permet pas en général d'analyse au-delà de deux composantes temporelles (Lakowicz, 1991). La fluorimétrie de phase permet l'analyse de déclins de fluorescence complexes, mais cela nécessite la répétition de l'expérience à de nombreuses fréquences de modulation de la lumière d'excitation. Le désavantage majeur du CPUCT par rapport aux deux autres techniques de mesure de la fluorescence résolue en temps est sa lenteur, l'enregistrement d'un déclin de fluorescence par cette méthode nécessite généralement plusieurs minutes et ne permet donc que l'analyse résolue en temps d'échantillons dans un état stationnaire. C'est ainsi que, dans un certain nombre de cas, la fluorimétrie de phase, qui permet de mesurer les variations rapides de temps de vie de fluorescence, est complémentaire du CPUCT. Les déclins de fluorescence n'ont pas toujours la forme simple décrite dans l'équation I.7, souvent ils ne sont pas monoexponentiels. Le modèle qui est alors très généralement utilisé est le modèle multiexponentiel (équation I.8). En effet, lorsqu'il y a plusieurs fluorophores de temps de vie différents ou un fluorophore qui a plusieurs temps de vie, le déclin de fluorescence est la somme de ces émissions à différents temps de vie qui suivent chacune une loi exponentielle. De plus, le modèle multiexponentiel apparaît comme étant très puissant et capable de rendre compte de pratiquement tous les déclins de fluorescence (Lakowicz, 1991). F(t) = n i=1 A i e - t i (I.8) n est le nombre de composantes temporelles. A i et i sont respectivement le facteur préexponentiel et le temps de vie et de la composante i. On défini alors i le facteur préexponentiel relatif de la composante i, f i la contribution relative à la fluorescence totale de 39

47 la composante i, et m le temps de vie moyen, qui est la moyenne statistique du temps de vie sur l'ensemble du déclin de fluorescence. i = A i n A i i=1 f i = i i n i i i=1 (I.9) (I.10) m = 0 0 t F(t) dt F(t) dt n 2 n i i = f i i = i=1 n i=1 i i i=1 (I.11) Le CPUCT est une technique qui utilise la nature quantique de la lumière. En effet, elle est basée sur le principe que la probabilité de distribution d'un photon de fluorescence unique, après une impulsion de lumière d'excitation, décrit la distribution de l'intensité de fluorescence en fonction du temps de tous les photons émis après l'impulsion d'excitation. Principe qui découle du fait que la probabilité de détecter un photon unique est directement proportionnelle à l'intensité de l'émission. Le CPUCT implique donc de mesurer un seul photon au maximum par impulsion de lumière d'excitation, un très grand nombre d'impulsions (des millions) étant nécessaire pour obtenir un déclin de fluorescence. En pratique, on procède de la façon suivante. L'échantillon est excité par une lumière impulsionnelle de fréquence élevée et dont les impulsions sont brèves. A chaque impulsion on détecte au maximum un photon grâce à un photomultiplicateur, on détecte donc le premier photo-électron. L'intervalle de temps séparant l'arrivée de l'impulsion d'excitation sur l'échantillon de la détection du premier photo-électron correspondant est mesuré par un TAC (convertisseur temps-amplitude). Ces intervalles de temps sont ensuite comptabilisés dans un histogramme par un analyseur multicanal. En abscisse l'échelle des temps est divisée en un grand nombre de canaux. Lorsqu'un intervalle de 40

48 temps est mesuré on ajoute un dans le canal correspondant, et c'est donc un nombre d'événements (ou nombre de coups) qui est comptabilisé en ordonnée. Etant donnée la nature aléatoire de l'émission de photons qui succède à une excitation, l'histogramme obtenu représente le déclin de fluorescence (intensité de fluorescence en fonction du temps). Une condition essentielle pour que l'histogramme enregistré représente bien le déclin de fluorescence est que la probabilité que deux photons soient détectés en même temps par le photomultiplicateur soit négligeable. Cette probabilité est donnée par la formule suivante (I.12) (O'Connor et Phillips, 1984; Birch et Imhof, 1991). P n = mn e m n! (I.12) P n est la probabilité de détecter n photons par impulsion d'excitation et m est le nombre moyen de photons détectés par impulsion d'excitation. En général l'intensité de fluorescence reçut par le photomultiplicateur est réglée pour que le nombre de photons détectés par impulsion soit inférieur à 0,01 (O'Connor et Phillips, 1984; Birch et Imhof, 1991). Lors de l'enregistrement des déclins de fluorescence nous nous sommes placés dans des conditions telles que le nombre de photons détectés par impulsion soit inférieur à 0,001. Ce qui fait une probabilité de détecter deux photons par impulsion de Etant donné le faible nombre de photons détectés par impulsion et pour ne pas faire fonctionner le TAC inutilement, c'est en fait le premier photo-électron qui déclenche le TAC et non le signal de synchronisation émis à chaque impulsion d'excitation, ce dernier signal est retardé et c'est lui qui arrête le TAC. On ne mesure donc pas l'intervalle de temps entre l'impulsion d'excitation et le premier photo-électron correspondant, mais le temps complémentaire par rapport au retard, ce qui revient exactement au même à condition de retourner l'histogramme obtenu. En fait, en pratique on n obtient pas le déclin F(t) comme décrit dans l'équation I.8, mais un déclin expérimental F ex (t), qui est la convolution de F(t) avec une fonction instrumentale G(t) (équation I.13). G(t) représente la mesure de la forme de l'impulsion d'excitation. 41

49 Intensité Réponse instrumentale G(t) (mesurée) Déclin de fluorescence F(t) (inconnu) Déclin de fluorescence expérimental Fex(t) (mesuré) Temps F ex (t) = F(t) G(t) (I.13) C'est la conséquence du fait que les impulsions d'excitation ne sont pas infiniment courtes et qu'alors les molécules excitées par le début de l'impulsion d'excitation émettent suivant le déclin de fluorescence pendant que d'autres molécules sont excitées par la fin de l'impulsion d'excitation. Il est donc nécessaire de mesurer G(t) dans des conditions aussi proches que possible de celles où le déclin de fluorescence F ex (t) a été enregistré. Il suffit ensuite de déconvoluer F ex (t) pour obtenir F(t), qui peut alors être analysé pour identifier les différentes composantes temporelles qui le composent. Cette dernière étape est une étape de calcul mathématique dans laquelle la nature intrinsèquement numérique du CPUCT est un grand avantage. En effet, dans ces conditions dans chaque canal la probabilité d'observer un nombre de coup donné suit la loi de Poisson (O'Connor et Phillips, 1984; Birch et Imhof, 1991). Suivant cette loi l'écart type dans chaque canal, qui représente le bruit de mesure dans ce canal est tel que : = N (I.14) N étant le nombre de coups total dans le canal. 42

50 Un ajustement précis est nécessaire pour déterminer les composantes temporelles de F(t), qui est ajusté suivant le modèle multiexponentiel (équation I.8). Or lorsqu'on réalise un ajustement précis il est nettement préférable de pondérer les données expérimentales suivant la nature statistique du processus de mesure, cela permet de donner à chaque mesure (en l'occurrence ici à chaque canal) le même poids dans l'ajustement. Ainsi pour le CPUCT c'est immédiat et la pondération de chaque canal est N. Cela explique aussi pourquoi pour augmenter le rapport signal sur bruit, il suffit d'augmenter le nombre de coups, c est-à-dire de compter plus longtemps. En définitive, de nombreux facteurs contribuent à l'incertitude des temps de vie de fluorescence qui sont obtenus par CPUCT (O'Connor et Phillips, 1984), et c'est pourquoi il n'est pas rare de ne pas trouver un parfait accord entre les différentes données publiées (Cline Love et Shaver, 1976). 43

51 CHAPITRE II Matériels, méthodes et montages expérimentaux

52 II. Matériels, méthodes et montages expérimentaux II.1. Préparation des échantillons II.1.1. Culture des plantes et préparation des mésophylles II Culture de pois pour l'extraction de chloroplastes Pour chaque extraction de chloroplastes, une boîte (250 g) de graines de pois (Pisum Sativum L., Petit provençal, nain à grain rond, Vilmorin, France) a été utilisée. Les graines étaient étalées en monocouche dans une cuvette puis immergées dans environ 2,5 cm d'eau durant une vingtaine d'heures, afin de les réhydrater. Elles étaient ensuite triées pour éliminer les graines non-réhydratées et les mauvaises graines (graines pourries ou cassées), puis placées dans un bac (42,5 cm x 27,5 cm, hauteur 7 cm) contenant de la vermiculite saturée en eau sur une hauteur d'environ 6 cm, elles étaient réparties le plus uniformément possible sur toute la surface, puis recouvertes par 0,5 cm de vermiculite humide. Le semis était alors placé à l'obscurité (bac recouvert de papier aluminium) durant trois jours à une température variant de 17 à 23 C, afin de faire germer les graines. Après germination, les pois étaient découverts et placés dans une chambre de culture (chambre de culture de la serre du campus de l'université Paris-Sud, Orsay, France), où les conditions de culture sont contrôlées : - photopériode : 16 heures d'éclairement, 8 heures d'obscurité. - éclairage : DFPP environ 350 μmol photon m -2 s température : 21 C en phase d'éclairement et 16 C à l obscurité. - humidité relative : 80 %. Les pois étaient arrosés à l'eau quasi quotidiennement pour maintenir la vermiculite à une humidité maximale. On peut noter que les cultures s'effectuaient sans aucun apport en sels minéraux, la graine possédant les réserves suffisantes pour assurer le développement des plantes durant au moins les dix premiers jours de culture. Cela permet d'avoir une très 47

53 bonne reproductibilité des cultures et donc des chloroplastes qui en sont extraits. Les jeunes pousses de pois (8-10 jours) étaient utilisées pour les extractions de chloroplastes après avoir été mises à l'obscurité, durant 20 heures environ, afin que le maximum d amidon, stocké au cours de la croissance, soit consommé. L utilisation de plantes très jeunes est la garantie d'une meilleure activité (Robinson et Wiskich, 1976), et les substances qui interfèrent avec les chloroplastes y sont moins présentes (Walker et al., 1987). C'est le cas notamment des polyphénols, qui présents dans la vacuole et la paroi des cellules, sont libérés lors de l'extraction et provoquent des réactions de polymérisation avec les protéines, dont la fonctionnalité se trouve alors altérée (Walker, 1987). II Culture de pois pour l'élaboration de mésophylles Nous avons utilisé des mutants Argenteum de pois (Pisum sativum) (Hoch et al., 1980). Après avoir trempé dans l'eau pendant 5-6 heures, les graines ont été mises à germer à l'obscurité entre deux doubles épaisseurs de papier filtre imbibées d'eau, pendant trois jours et demi. Chaque graine germée est plantée dans un pot individuel de terreau placé en chambre de culture dans des conditions identiques à celles décrites à la section précédente. Les plants sont arrosés régulièrement à l'eau et avec de la solution nutritive (Hydrokani C 2 à 2 %o v/v, Hydro Agri Spécialités, Neuilly-sur-Seine, France, uniquement le dixième jour après semis). Pour faire les mésophylles nous avons utilisé les septième et huitième feuilles le 34 ème jour après semis. Pour obtenir des mésophylles (feuilles sans épiderme) la technique est assez simple, puisqu'il suffit d'enlever l'épiderme, mais nécessite une certaine pratique puisqu'il faut enlever l'épiderme sur une surface assez grande (disque de diamètre 14 mm) pour faire les mesures de fluorescence. Seuls ces mutants Argenteum de pois permettent de réaliser des mésophylles de pois, car il est impossible d'enlever l'épiderme des feuilles de pois sauvages sur une grande surface. Dans le cas des mutants Argenteum, l'épiderme est peu lié au reste de la feuille puisqu'il existe de très larges poches d'air entre l'épiderme et le parenchyme palissadique, ce qui explique l'aspect argenté des feuilles (Hoch et al., 48

54 1980). Une fois obtenus, les mésophylles sont conservés immergés dans l'eau (pour limiter toute oxydation et éviter le dessèchement) jusqu'au moment de la mesure. II.1.2. Isolation des chloroplastes II Chloroplastes isolés intacts Les chloroplastes isolés intacts de pois sont préparés suivant la méthode de Cerovic et Plesnicar (1984). Un milieu dit "milieu général" contenant 330 mm de sorbitol, 10 mm de KCl, 1 mm d'edta et 50 mm de tampon Hepes, ajusté à ph 7,9 avec KOH, préparé à des concentrations doubles, est à la base de tous les autres milieux utilisés pour les chloroplastes en solution. Les jeunes pousses de pois sont tout d abord illuminées (DFPP : 700 μmol photon m -2 s -1 ) pendant 30 minutes environ, afin d'activer complètement la photosynthèse. On récolte ensuite aux ciseaux environ 50 g de feuilles en évitant au maximum de cueillir trop de morceaux de tiges en même temps. La lumière actinique reste allumée au-dessus des pois pendant toute la durée de la récolte. Dés qu'elles sont cueillies, les feuilles sont finement coupées et placées dans un bêcher rempli d eau et de glace pilée. Le fait de plonger les morceaux de feuilles dans de l'eau avoisinant les 0 C immédiatement après la récolte permet de figer les chloroplastes dans un état où les pools de métabolites impliqués dans le processus photosynthétique sont à un niveau élevé. Une fois les 50 g récoltés, les feuilles sont essorées, puis placées dans une cuve contenant 200 ml de milieu d'isolation (milieu général dilué 25 fois contenant 330 mm de sorbitol) à l'état de glace fondante. Le contenu de la cuve est broyé (Polytron, PT 10-35, boîtier PCU- 2, Kinematica, Suisse) très rapidement mais assez finement. Le broyat est filtré au travers d'un sandwich composé de quatre couches de gaze, une couche de coton et quatre couches de gaze, puis il est réparti dans quatre tubes en verre, qui sont placés dans la centrifugeuse (Eppendorf 5403, rotor 16A4-44, Roucaire, Courtaboeuf, France) pendant 55 s à 2600 x g et à 4 C. Les quatre culots sont resuspendus dans le milieu d'isolation à l'aide d'un 49

55 pinceau fin. Environ 80 ml de milieu d'isolation sont ajoutés à l'ensemble des quatre culots, puis le tout est réparti équitablement dans deux des tubes en verre qui sont replacés dans la centrifugeuse pendant 50 s à 2600 x g et à 4 C. Les deux culots sont resuspendus comme précédemment mais dans un volume minimum (généralement autour de 0,5 ml) de milieu de resuspension (milieu général contenant 1 mm MnCl 2, 1 mm MgCl 2 et 0,2 mm KH 2 PO 4 ). Durant les deux resuspensions les tubes en verre sont maintenus en permanence dans la glace. Les deux derniers culots, une fois resuspendus, sont rassemblés et constituent la solution stock de chloroplastes intacts, ce stock est conservé, jusqu'à son utilisation, dans un tube de verre fermé, à l'obscurité et dans la glace. Les chloroplastes isolés intacts sont quantifiés dans la solution stock en mesurant le volume total et la concentration en Chl. La concentration en Chl est mesurée par une méthode spectrophotométrique (Bruinsma, 1961). La Chl de 25 μl de solution stock de chloroplastes isolés intacts est extraite dans 10 ml d'une solution acétone à 80 % (v/v) et eau. Après filtration sur papier filtre, le spectre d'absorption de la Chl dans l'acétone à 80 % est enregistré. On obtient la concentration en Chl total (Chl a plus Chl b), C chl (en g/l), suivant la formule : C chl = (A 652 A 720 )/36 (II.1) Où A 652 est l'absorption mesurée à 652 nm (point isosbestique pour la Chl a et la Chl b) et A 720 celle mesurée à 720 nm (la Chl n'absorbe plus à cette longueur d'onde). Pour tester les chloroplastes isolés intacts et vérifier ainsi que l'isolation s'est déroulée correctement, l'activité photosynthétique et le taux de chloroplastes intacts sont mesurés (voir section II.2.). Quelques rares expériences présentées dans ce travail ont été réalisées sur des chloroplastes d'épinard (Spinacia oleracea L., Wobli). La procédure d'isolation des chloroplastes intacts d'épinard est la même que celle décrite ci-dessus pour les pois à quelques petites différences près. Les feuilles d'épinard ont été achetées au marché juste 50

56 avant l'isolation. Après avoir nettoyé les feuilles à l'eau et leur avoir enlevé la tige centrale, on les dispose uniformément à la surface d'une cuvette d'eau et on les illumine comme les jeunes pousses de pois. Le reste de l'isolation est identique à celle des chloroplastes de pois. II Chloroplastes reconstitués Les chloroplastes reconstitués sont obtenus en mélangeant des thylakoïdes et du stroma, qui ont été isolés séparément. En pratique, on obtient pas le stroma isolé, mais un extrait chloroplastique (CE pour "chloroplast extract") qui est du stroma un peu dilué dans le milieu qui a servi à casser les chloroplastes intacts. Le CE a été obtenu suivant la méthode décrite par Lilley et Walker (1974) mais avec quelques modifications. Le CE est isolé à partir de chloroplastes isolés intacts lors de la préparation de ces derniers. Pour la seconde centrifugation, les chloroplastes ne sont pas répartis équitablement entre les deux tubes en verre, mais distribués en 3/4 et 1/4. Après la seconde centrifugation, le culot du tube contenant les 3/4 des chloroplastes est resuspendu dans 1 ml d'une solution hypo-osmotique (milieu général dilué 25 fois) contenant 5 mm MgCl 2 et 3 mm 1,4-dithiothreitol (Fluka, St Quentin Fallavier, France). Après environ une minute (pour permettre la rupture de l'enveloppe chloroplastique), la suspension est centrifugée pendant 10 min à x g et à 4 C. Le surnageant ne contient pas de Chl, c'est le CE, il est récupéré et conservé à -80 C. La concentration en stroma du CE est quantifiée en concentration de Chl équivalente. Pour la calculer on mesure le volume de CE récupéré et la quantité de Chl présente dans le culot (mesure du volume du culot et détermination de sa concentration en Chl par spectrophotométrie). Les chloroplastes reconstitués ont été préparés en mélangeant dans la cuve de mesure des thylakoïdes (37 μg Chl/ml, concentration finale) et 10 fois plus de CE (l'équivalent de 370 μg Chl/ml de stroma) dans une solution de milieu général contenant 5 mm MgCl 2, 10 mm KHCO 3, 4 mm KH 2 PO 4 et 1 mm 1,4-dithiothreitol. Des chloroplastes cassés (chloroplastes intacts qui sont cassés mais non lavés, chloroplastes de 51

57 type D (Hall, 1972)) ont été utilisés comme source de thylakoïdes, ils étaient obtenus en congelant des chloroplastes isolés intacts à -80 C immédiatement après leur isolation et en les décongelant juste avant la préparation des chloroplastes reconstitués. La mesure du taux de chloroplastes intact (voir section II.2.3.) sur des chloroplastes ainsi cassés par congélation a confirmé la rupture complète de l'enveloppe chloroplastique. Pour vérifier que la congélation du CE et des chloroplastes intacts qui servent à la préparation des chloroplastes reconstitués n'a pas affecté la chaîne de transport d'électrons photosynthétique, nous avons comparé les variations photo-induites de fluorescence chlorophyllienne et de FBV de deux préparations de chloroplastes reconstitués : une préparation réalisée à partir de CE et de chloroplastes intacts congelés, et une préparation réalisée à partir de chloroplastes intacts (cassés par choc hypo-osmotique) et de CE n'ayant jamais été congelés. Les variations photo-induites de fluorescence chlorophyllienne et de FBV en réponse aussi bien à un flash (DFPP : 380 μmol photons m -2 s -1 pendant 2 s) qu'à une lumière actinique continue (DFPP : 50 μmol photons m -2 s -1 ) sont quasiment identiques pour les deux préparations de chloroplastes reconstitués. On peut donc utiliser sans problème du CE et des chloroplastes intacts congelés pour préparer nos chloroplastes reconstitués. Par ailleurs, nous avons mesuré l activité photosynthétique (voir section II.2.2.) de nos chloroplastes reconstitués en enregistrant leur vitesse de dégagement d'oxygène à la lumière (DFPP : 150 μmol photons m -2 s -1 ). Une vitesse inférieure à 10 μmol O 2 (mg Chl) -1 h -1 a été obtenue, le flux d'électrons photosynthétique est donc faible dans les chloroplastes reconstitués. Cela est très vraisemblablement dû à la dilution des composés du stroma dans les chloroplastes reconstitués par rapport aux chloroplastes intacts, puisqu'il est tout à fait possible d'obtenir des vitesses de dégagement d'oxygène (et donc de fixation du CO 2 ) importantes avec des chloroplastes reconstitués en leur ajoutant certains intermédiaires et cofacteurs (ex. Lilley et Walker, 1974). Nous n'avons pas remédié à la faible vitesse de dégagement d'oxygène de nos chloroplastes reconstitués car c'était un avantage pour les mesures de fluorescence résolue en temps qui sont longues (au moins 10 min par déclins de fluorescence). En effet, avec les chloroplastes isolés en 52

58 solution les quantités des composés du milieu utilisés par la photosynthèse sont définies au départ, leurs concentrations évolueront donc d'autant plus rapidement que la photosynthèse est importante, or ces concentrations (notamment celle du phosphate) influencent le fonctionnement du processus photosynthétique; une faible vitesse d'assimilation du CO 2 permet donc de garder les chloroplastes dans le même "état" pendant bien plus longtemps. II Thylakoïdes lavés Les fragments de thylakoïdes lavés (chloroplastes de type F (Hall, 1972)) ont été préparés à partir du surnageant de la deuxième centrifugation réalisée lors de la préparation de chloroplastes isolés intacts. Ce surnageant est centrifugé à 4100 x g pendant 4 min. Le culot est resuspendu dans l'eau pour faire éclater l'enveloppe chloroplastique par choc hypo-osmotique, puis on lui ajoute du milieu général en concentration double afin de le mettre finalement en solution dans 40 ml de milieu général. Cette solution est centrifugée à 4100 x g pendant 10 min. Le nouveau culot est resuspendu dans le milieu de resuspension. Ces fragments de thylakoïdes sont conservés à -20 C. Avant leur utilisation, ils ont été chauffés à 100 C pendant 10 min et homogénéisés par sonication (5-6 impulsions à la position n 3 d'un VC250 sonicator, Sonics & Materials, Danbury, Connecticut, USA). La raison du traitement à température élevée est la suivante : les fragments de thylakoïdes lavés ont été utilisés en solution avec du NADPH (voir section III.7.), or, sans le traitement à 100 C, ils oxydaient le NADPH (activité diaphorase) de façon lente mais permanente ce qui était incompatible avec les mesures entreprises. 53

59 II.1.3. Les algues Chlamydomonas reinhardtii : mutations, culture et préparation des échantillons Les micro-algues Chlamydomonas reinhardtii ont été cultivées sur un milieu trisacétate-phosphate (TAP; Harris, 1989) dans des erlenmeyers de 500 ml. Les algues ont été maintenues à 25 C, agitées en permanence et soumises à une faible illumination (environ 1 μmol photons m -2 s -1 ). La lignée sauvage que nous avons utilisée est une lignée isogénique à la lignée 137c (Harris, 1989). Le mutant sans PSI que nous avons utilisé (lignée psaa ) a été fabriqué à partir de cette lignée sauvage par suppression du gène psaa (Fisher et al., 1996). Le mutant sans PSI et sans complexe cytochrome b 6 /f (lignée psaa peta ) a été obtenu en transformant psaa avec un plasmide pour supprimer le gène peta (Kuras et Wollman, 1994). Les mesures ont toujours été réalisées sur des algues prélevées pendant la phase exponentielle de croissance. Après prélèvement, les algues ont été centrifugées à faible vitesse, puis lavées et resuspendues soit dans un milieu minimum (Harris, 1989) (identique au milieu TAP mais sans acétate), soit dans un tampon Hepes (40 mm, ajusté à ph = 7,2 avec KOH). Les mesures ont été effectuées soit sur des ASS (Algues sur Support Solide), soit sur des algues en solution dans le milieu de resuspension en cuves de mesure carrées standard en quartz de 1 cm de chemin optique (101-QS, Hellma, Paris, France). Les solutions d'algues avaient une concentration d'environ 50 μg Chl/ml et étaient agitées en permanence pendant la mesure. Pour réaliser les ASS, les algues sont piégées jusqu'à saturation sur un filtre de micro-fibres de verre (AP40, Millipore, Saint-Quentin-Yvelines, France), le contenu surfacique est alors généralement d'environ 10 μg Chl cm

60 II.2. Mesure de l'activité photosynthétique et du taux de chloroplastes intacts avec une électrode à oxygène II.2.1. Principe de fonctionnement de l'électrode à oxygène Pour mesurer l'activité photosynthétique des végétaux, il est bien sûr possible de mesurer le CO 2 fixé, mais une autre technique classique, que nous avons utilisée pour les chloroplastes en solution, consiste à mesurer l'oxygène dégagé, ce qui est équivalent (Edwards et Walker, 1983). C'est une mesure par polarographie sur une électrode de type "Clark". La méthode est décrite brièvement ci-dessous, mais pour plus de précisions sur le principe de mesure et sur la mesure de l'activité photosynthétique par cette méthode on se reportera à Walker (1987). Les mesures ont été réalisées en phase aqueuse avec une électrode appropriée (DW1 et sa boîte de contrôle CB1D, Hansatech, King's Lynn, UK) dans laquelle la solution est agitée en permanence. Le principe de mesure est illustré sur la Fig. II.1. La cathode qui est en contact avec la solution de chloroplastes est protégée par une membrane très fine en téflon perméable à O 2. Le pont entre les deux électrodes est obtenu par une feuille de papier à cigarette imbibé d'une solution saturée en KCl. Lorsqu'une différence de potentiel suffisante ( mv) est appliquée entre les deux Figure II.1 : Représentation schématique du fonctionnement d'une électrode à oxygène. D'après (Walker, 1987). 55

61 électrodes, O 2 est réduit en OH - en deux étapes à la surface en platine de la cathode. Le courant électrique qui en résulte est donc directement proportionnel à l'oxygène consommé au niveau de la cathode et c'est une tension proportionnelle à ce courant qui est mesurée. II.2.2. Mesure de l'activité photosynthétique Une solution de chloroplastes (30 μg Chl/ml) dans le milieu général contenant 10 mm KHCO 3, 1 mm ATP, 5 mm K 4 P 2 O 7, 0,2 mm KH 2 PO 4 et 1000 unités/ml de catalase (EC , Sigma, St Quentin Fallavier, France) est placée dans l'électrode à oxygène. Cette solution est en grande partie débarrassée de l'oxygène qu'elle contient par dégazage à l'azote, puis elle est illuminée (DFPP : 1500 μmol photons m -2 s -1 ) et l'oxygène dégagé par la photosynthèse est mesuré. Les vitesses de dégagement d'oxygène obtenues avec les chloroplastes isolés intacts se situaient généralement autour de 100 μmol O 2 (mg Chl) -1 h -1. II.2.3. Mesure du taux de chloroplastes intacts Pour mesurer le taux de chloroplastes intacts on utilise la technique de pénétration du ferricyanure (Walker et al., 1987), dans laquelle on compare le dégagement d'oxygène d'une solution de chloroplastes isolés intacts avec la même solution de chloroplastes cassés par choc hypo-osmotique. Cette technique est basée sur le fait que le ferricyanure accepte les électrons du PSI, mais uniquement lorsque les chloroplastes sont cassés, car il ne traverse pas l'enveloppe chloroplastique. Pour cette mesure, le dégagement d'oxygène ne reflète plus la fixation du CO 2. En effet, la mesure a lieu en présence de lumière actinique et la chaîne de transport d'électron fonctionne normalement (d où le dégagement d'oxygène), cependant, l'accepteur d'électrons en fin de chaîne n'est pas NADP + mais Fe(CN) 3-6, il n'y a donc pas de fixation de CO 2. De plus, un découplant (NH 4 Cl) est ajouté à la solution pour empêcher l'établissement d'un gradient de protons 56

62 transthylakoïdal, qui ralentirait la chaîne de transport d'électrons. Effectivement, l'atp n'étant pas consommé pour fixer le CO 2, les ATP-synthases sont peu actives et ne dissipent pas le gradient de protons. La mesure est réalisée dans des conditions identiques sur les chloroplastes intacts et sur les mêmes chloroplastes cassés : les chloroplastes sont en solution dans le milieu général contenant 5 mm MgCl 2, 2,5 mm K 3 [Fe(CN) 6 ], 5 mm NH 4 Cl, 10 mm DL-glycéraldéhyde et 1000 unités/ml de catalase, et la DFPP de la lumière actinique vaut 1500 μmol photons m -2 s -1. Le taux de chloroplastes intacts se calcule facilement, il est égal à (V C -V I )/V C, avec V C la vitesse de dégagement d'oxygène des chloroplastes cassés et V I celle des chloroplastes intacts. Pour les chloroplastes isolés intacts utilisés dans ce travail nous avons mesuré des taux de chloroplastes intacts compris entre 80 et 95 %. II.3. Montages expérimentaux II.3.1. Le spectrofluorimètre FLU3 de Super-ACO II Description du montage expérimental Un schéma du spectrofluorimètre installé sur la ligne SA4 de l'anneau de stockage Super-ACO est présenté Fig. II.2. Les différents éléments du montage sont reliés à un ordinateur qui contrôle l'ensemble du montage et l'acquisition des données. II Source de lumière : le rayonnement synchrotron Ce spectrofluorimètre utilise comme source de lumière le rayonnement synchrotron fournit par la ligne SA4 de l'anneau de stockage Super-ACO (Orsay, France). Le rayonnement synchrotron est la lumière émise par des particules chargées (positrons dans le cas de Super-ACO) se déplaçant à des vitesses extrêmement proches de celle de la 57

63 Aimant S4 Photodiode rapide Double monochromateur d'excitation Roue à filtres Obturateur Miroirs de redressement de l'image Filtre neutre variable Echantillon Mur protecteur Diode laser FLUOMARQDT programe de reconvolution itérative Ligne à retard Microordinateur Discriminateur stop start Discriminateur TAC Time Amplitude Converter Carte d'acquisition multicanal Photodiode de référence Azote liquide Monochromateur d'émission Filtre Photomultiplicateur rapide Figure II.2 : Représentation schématique du spectrofluorimètre FLU3 installé sur la ligne SA4 de l'anneau de stockage Super ACO. 58

64 lumière (à 10-9 près) et soumisent à une décélération (comme c'est le cas dans les aimants de courbure des anneaux de stockage). Pour compenser cette perte d'énergie et maintenir constante la vitesse des particules, les anneaux de stockage possèdent une cavité radiofréquence pour accélérer les particules. En raison des effets relativistes, le rayonnement électromagnétique est émis en totalité en avant et tangentiellement à la trajectoire dans un cône d'angle faible. Ce qui permet de collecter tout le rayonnement émis par une portion d'orbite au travers de fenêtres pratiquées dans les aimants de courbure de l'anneau. Les caractéristiques de ce rayonnement dépendent de l'énergie des particules (800 MeV pour Super-ACO) et du rayon de la trajectoire. Les particules sont rassemblées en paquets de faible longueur et la lumière obtenue est la somme des émissions de chaque particule. On obtient donc en fait des impulsions de lumière qui correspondent aux passages des paquets de particules devant la fenêtre. L'intensité de lumière émise à chaque impulsion varie très peu d'une impulsion à l'autre car elle dépend uniquement du nombre de particule dans le paquet (de l'ordre de ) qui est quasiment constant d'une impulsion à l'autre. La fréquence de ces impulsions est directement liée à la longueur de la trajectoire dans l'anneau de stockage (circonférence de Super-ACO 72 m). Nous avons utilisé Super-ACO en mode deux paquets ce qui correspond à une fréquence des impulsions de 8,3 MHz. Une autre caractéristique particulière du rayonnement synchrotron est son spectre très large et continue, qui est une des conséquences de l'effet Doppler relativiste. Dans le cas de Super- ACO, le spectre s'étend continûment des rayons X mous à l'infrarouge (IR) lointain. Sur la ligne SA4 deux fenêtres (une en quartz et une en saphir) sont installées au niveau de la sortie de lumière sur l'anneau de stockage, ce qui a pour conséquence de limiter le spectre de l'uv à l'ir. En pratique sur ce spectrofluorimètre seule la partie UV-visible (200 à 800 nm) est utilisée. Par ailleurs, la structure temporelle des impulsions de lumière synchrotron est indépendante de la longueur d'onde, puisque cette structure est le résultat du passage devant la fenêtre des paquets de particules qui émettent à toutes les longueurs d'onde simultanément. Cependant, la durée des impulsions est lentement variable (elle baisse continûment entre deux injections de particules dans l'anneau) mais elle est en moyenne de 600 ps. 59

65 Le faisceau est réfléchi et focalisé par deux miroirs (aluminisé-uv) sur l'entrée du spectrofluorimètre proprement dit. II Différents éléments permettant de définir les caractéristiques du faisceau d'excitation Le faisceau est focalisé sur l'entrée d'un double monochromateur (H10 D UV, Jobin-Yvon, Longjumeau, France) qui sélectionne la longueur d'onde d'excitation. Ce double monochromateur a été utilisé, soit avec des fentes de 1 mm (4 nm de bande passante) pour l'enregistrement de spectres et de déclins de fluorescence, soit avec des fentes de 2 mm (8 nm de bande passante) pour l'enregistrement des déclins de fluorescence lorsque l'intensité de fluorescence était faible. A la sortie du double monochromateur une roue à filtres permet, si nécessaire, d'atténuer le faisceau d'excitation grâce à l'un de ses trois filtres neutres (DO :1, 2 et 3, respectivement 03FNG057, 03FNG065 et 03FNG069, Melles Griot, Magny les hameaux, France). Quatre miroirs (aluminisé-uv) successifs permettent : de focaliser le faisceau; de tourner de 90 l'image de la fenêtre de sortie de l'anneau (un rectangle horizontal), un faisceau d'excitation de forme rectangulaire verticale est plus adapté à nos échantillons et à la fente d'entrée du monochromateur d'émission; et d'amener ce faisceau sur l'échantillon. En fait, contrairement à ce qui est représenté sur le schéma (Fig. II.2), le faisceau n'est pas focalisé sur l'échantillon mais un peu avant, ce qui permet d'exciter une surface plus importante de l'échantillon avec une intensité par unité de surface plus faible. Sur le trajet du faisceau entre les miroirs un filtre neutre variable (en quartz, DO variable continûment de 0 à 3, Evap MTO, Dourdan, France) permet d'atténuer avec précision, quand nécessaire. Juste avant le dernier miroir précédant l'échantillon, une lame de quartz (épaisseur 1,2 mm) permet d'envoyer une faible fraction du faisceau d'excitation vers une cuve de rhodamine B (3 g/l dans l'éthylène glycol, Fluka). La mesure de la fluorescence émise par la rhodamine sert de référence de l'intensité du faisceau d'excitation (le principe est décrit un peu plus loin, section II ), référence qui est nécessaire pour la correction des 60

66 spectres. Cette mesure est réalisée par une photodiode amplifiée (HUV 4000B, EGG, Evry, France) placée derrière un filtre passe-haut (RG 630, Schott, Clichy, France) et suivie d'un voltmètre numérique (3455A, Hewlett Packard, Les Ulis, France) connecté à l'ordinateur. II Echantillons et lumière actinique La plupart de nos échantillons (feuilles, mésophylles, solutions de chloroplastes concentrées) imposent une géométrie face-avant (excitation et émission sur la même face de l'échantillon). L'excitation se fait à environ 45 de la face avant de l'échantillon et la collection de la fluorescence émise s'effectue normalement par rapport à cette même surface. Différents porte-échantillons interchangeables et adaptés aux différents types d'échantillons ont été construits. La très grande majorité des mesures réalisées sur des solutions de chloroplastes, aussi bien intacts que reconstitués, l'ont été sur des cuves de mesure carrées standards en quartz de 1 cm de chemin optique (101-QS, Hellma) agitées en permanence grâce à un barreau magnétique. Les feuilles et les mésophylles étaient, quant à eux, placés dans un porte-échantillon cylindrique, plaqués contre une surface en acier inoxydable. Un joint torique les séparait de la fenêtre en quartz (202-QS, Hellma) servant de face avant, permettant la circulation de l'air ou de l'azote au niveau de la surface de l'échantillon où avait lieu la mesure. Dans tous les cas le porte-échantillon était muni d'un système de circulation permettant de maintenir l'échantillon à une température constante (20 C dans toutes les expériences décrites par la suite) grâce à un bain thermostaté (F6, Haake, Karlsruhe, Allemagne). La défocalisation du faisceau d'excitation au niveau de l'échantillon permet d'avoir une intensité de lumière assez faible par unité de surface, et donc un faisceau nonactinique, tout en ayant une intensité de fluorescence suffisante puisqu'elle provient d'une surface importante de l'échantillon. L'illumination actinique (DFPP : 50 μmol photons m - 2 s -1 ) était assurée, via une fibre optique liquide (série 300, Lumatec, Munich, Allemagne), par une diode laser (656 nm, Philips, Eindhoven, Hollande). 61

67 II Collection et détection de la fluorescence La fluorescence émise par l'échantillon est collectée par une lentille biconvexe ( = 60 mm, focale = 80 mm, Melles Griot), cette lentille fait l'image de l'échantillon sur la fente d'entrée du monochromateur d'émission (9 nm de bande passante, HL 300, Jobin- Yvon), qui définit la longueur d'onde d'émission à laquelle est mesurée la fluorescence. Ce monochromateur est protégé par un ou plusieurs filtres qui permettent de renforcer la réjection de la lumière ayant une longueur d'onde hors du domaine spectral considéré pour la mesure. On limite ainsi la diffusion de lumière parasite dans le monochromateur et surtout, on supprime la contamination de la mesure par la lumière diffusée par l'échantillon à la longueur d'onde d'excitation, qui est généralement susceptible d'être transmise par le monochromateur au deuxième ordre de diffraction. Dans ce but, différents filtres anti-uv ou passe-hauts (KV 370, KV 389, KV 399 et KV 500, Schott) ont été utilisés en fonction des besoins. Par ailleurs, les filtres placés devant le monochromateur d'émission ont en plus été choisis de manière à empêcher la contamination de la mesure par la lumière actinique. Dans ce but, nous avons utilisé : un filtre en verre bleu (CS 4-96, Corning, ARIES, Chatillon, France) pour les spectres d'émission, un filtre interférentiel large bande (450WB80, 450 nm, T = 80 %, LMH = 72 nm, Omega, Brattleboro, USA) pour les spectres d'excitation et les déclins de fluorescence enregistrés à une longueur d'onde d'émission de 456 nm, et le filtre en verre bleu (CS 4-96) combiné avec un filtre passe-haut (KV500) pour les mesures à une longueur d'onde d'excitation/émission de 450/550 nm. Après le monochromateur d'émission, la fluorescence est détectée par un photomultiplicateur rapide (1,8 ns de temps de monté, 2254QB, Philips, Issy-les- Moulineaux, France) qui fonctionne en comptage de photo-électron unique. Pour être sûr de mesurer correctement en comptage de photo-électron unique, nous utilisons le critère habituel : un taux de comptage (nombre de photo-électrons par seconde) inférieur ou égal à 1 % de la fréquence des impulsions de la source de lumière (Birch et Imhof, 1991), soit dans notre cas un taux de comptage maximal de photo-électrons/s. Pour avoir un 62

68 bruit thermique suffisamment faible (de l'ordre de 10 photo-électrons/s) le photomultiplicateur est refroidi à -40 C par une circulation d'azote gazeux tout juste évaporé d'un réservoir d'azote liquide. Chaque photo-électron déclenche un discriminateur (7174, Enertec, Strasbourg, France) qui envoi un signal. Ces signaux sont comptabilisés par une échelle de comptage (2071A, Canberra Electronique, Savigny-le-temple, France) pendant 1 s pour chaque mesure. Le taux de comptage qui est une mesure de l'intensité de fluorescence est ensuite transmis à l'ordinateur via le bus GPIB. II Version précédente de ce montage utilisée dans quelques expériences Certaines expériences présentées par la suite ont été réalisées sur la version précédente de ce montage dont les principales différences avec le montage décrit ci-dessus sont les suivantes. Le faisceau d'excitation avait un angle d'incidence par rapport à la face avant de l'échantillon de 30. Ce faisceau d'excitation était focalisé sur l'échantillon, ce qui permettait d'avoir une intensité de fluorescence un peu plus élevée, mais avec un faisceau d'excitation pouvant être un peu actinique sur certain échantillons (chloroplastes en solution). Enfin, l'analyseur multicanal était un NS575 (Tracor, Paris, France) permettant de couvrir une fenêtre de 42 ns avec 512 canaux, soit 0,082 ns par canal. II Mesures spectrales Ce montage permet d'enregistrer des spectres d'excitation et d'émission de fluorescence corrigés, de 230 à 600 nm (excitation) et de 350 à 600 nm (émission, jusqu'à 800 nm mais sans correction). L'intensité du rayonnement synchrotron n'étant pas constante (elle baisse lentement mais continûment avec le temps), chaque spectre est obtenu par un certain nombre de balayages "aller/retour". Chaque "aller/retour" est l'addition des mesures faites lors d'un balayage en longueur d'onde croissante avec les mêmes mesures faites lors d'un balayage décroissant en longueur d'onde. Pour les spectres 63

69 d'excitation et d'émission de fluorescence nous avons réalisé généralement 2-3 "aller/retour". Mettant à profit la géométrie face-avant de ce montage, nous l'avons adapté pour mesurer des spectres de réflectance. Pour cela les deux monochromateurs sont calés sur la même longueur d'onde et balayent en même temps. On enregistre le spectre de l'échantillon (un "aller/retour"), puis on remplace l'échantillon par une référence (standard de réflectance, derrière une fenêtre de quartz identique à celle de l'échantillon). Le standard de réflectance était un diffuseur parfait (100 % de réflectance sur le domaine spectral qui nous intéresse) qui peut être considéré comme lambertien. En divisant le spectre de l'échantillon par celui de la référence, on obtient le spectre de réflectance. Cette mesure nous donne un spectre de la réflectance diffuse (la réflectance spéculaire n'est pas mesurée) de l'échantillon à condition de considérer l'échantillon comme un diffuseur isotrope, ce qui n'est sans doute pas trop faux pour une solution de chloroplastes mais n'est généralement pas vrai pour une feuille (Guyot, 1989). II Correction des spectres d'excitation de fluorescence La mesure simultanée de la fluorescence de la cuve de rhodamine B, qui est en concentration telle qu'elle se comporte comme un compteur de photon (tous les photons sont absorbés et ré-émis par fluorescence), permet de corriger les spectres d'excitation des variations (notamment spectrales) du faisceau d'excitation (voir Miller, 1981). De plus, pour corriger les petites déformations restant après la correction par la mesure simultanée de la fluorescence de la rhodamine (qui sont induites par le fait que la mesure de référence n'est pas faite exactement à l'emplacement de l'échantillon), on multiplie le spectre d'excitation par un deuxième facteur, qui est le rapport du spectre d'excitation d'une cuve de rhodamine B (identique à celle qui sert de référence et placée dans le porte-échantillon) sur le spectre de référence enregistré simultanément. 64

70 II Correction des spectres d'émission de fluorescence Pour corriger les spectres d'émission de fluorescence des déformations induites par la réponse instrumentale du montage (notamment la réponse spectrale du photomultiplicateur), nous avons utilisé le sulfate de quinine comme standard (Miller, 1981). Un facteur de correction a été calculé à partir du spectre d'une solution de sulfate de quinine (Fluka), 1,28 μm dans l'acide perchlorique (HClO 4 ) 0,1 M, mesuré sur notre montage et du vrai spectre d'émission de fluorescence d'une telle solution (Velapoldi et Mielenz, 1980). II Evaluation du rapport signal/bruit en utilisant le Raman de l'eau Nous avons évalué le bruit de mesure de ce spectrofluorimètre grâce à une méthode courante (Miller, 1981) se basant sur le pic de diffusion Raman de l'eau. Pour cela nous avons enregistré le pic de diffusion Raman d'une eau parfaitement pure (eau HPLC, Sigma), dans une cuve en quartz habituelle (1 cm de chemin optique) parfaitement propre, à une longueur d'onde d'excitation de 350 nm et dans les conditions où sont Signal Raman (u.r.) Longueur d'onde (nm) Figure II.3 : Pic de diffusion Raman de l'eau à une longueur d'onde d'excitation de 350 nm. Ce spectre est corrigé pour la réponse instrumentale comme un spectre d'émission de fluorescence 65

71 enregistrés les spectres de fluorescence (fentes de 1 mm sur le monochromateur d'excitation, trois "aller/retour") (Fig. II.3). A partir de la Fig. II.3 on peut déterminer le rapport signal/bruit, il vaut 548. Le signal Raman est mesuré à 397 nm (la bande Raman de l'eau étant à 3382 cm -1 de l'excitation), ce qui correspond bien au maximum. Le bruit est obtenu en calculant l'écart type du signal mesuré entre 425 et 460 nm. II Mesure de déclins de fluorescence et de spectres résolus en temps Ce montage permet de mesurer la fluorescence résolue en temps puisqu'il permet d'enregistrer les déclins de fluorescence par la technique du comptage de photo-électron unique corrélé en temps. Pour cela un certain nombre d'éléments supplémentaires à ceux décrits précédemment sont utilisés. Parallèlement au signal envoyé à l'échelle de comptage, le discriminateur connecté au photomultiplicateur envoi un signal de "start" (déclenchement) au TAC (convertisseur temps-amplitude, 566, Ortec, Colombes, France). Par ailleurs, juste avant l'entrée du monochromateur d'excitation il y a une lame de quartz (épaisseur 1,2 mm) qui envoi une faible fraction du faisceau sur une photodiode rapide (S4753, Hamamatsu, Massy, France). Le signal de la photodiode est retardé par une ligne à retard (type 701, Borer, Solothurn, Suisse) avant d'être envoyé sur un discriminateur identique à celui placé à la sortie du photomultiplicateur. Ce deuxième discriminateur fournit alors au TAC un signal de "stop". Le temps écoulé entre "start" et "stop", mesuré par le TAC, est envoyé à l'analyseur multicanal qui est une carte d'acquisition (Accuspec Nai, Canberra Electronique) installée dans l'ordinateur. L'histogramme des événements enregistrés par l'analyseur multicanal est une mesure du déclin de fluorescence. Ces histogrammes ont été enregistrés jusqu'à ce qu'un total de un million (en général) de coups soit accumulé. Une fenêtre de 78 ns est couverte par 2048 canaux à 0,038 ns par canal. L'histogramme de la fonction instrumentale est enregistré de façon identique, mais en plaçant le monochromateur d'excitation à la longueur d'onde d'émission et en utilisant la lumière diffusée par l'échantillon. Les filtres neutres de la roue à filtres et le filtre neutre variable permettent d'ajuster l'intensité du faisceau pour avoir, lors de l'enregistrement de 66

72 la fonction instrumentale, un taux de comptage équivalent à celui utilisé lors de l'enregistrement du déclin de fluorescence. Le pic de la fonction instrumentale représente la mesure des impulsions de lumière excitatrice, et sa largeur à mi-hauteur diminue donc avec le temps entre deux injections. Elle varie d'environ 800 ps au début à environ 700 ps à la fin. Le pic de la fonction instrumentale est donc un peu plus large que les impulsions lumineuses délivrées par l'anneau de stockage, cet élargissement est dû essentiellement au "jitter" ou TTS ("Transit Time Spread") du photomultiplicateur qui est de l'ordre de 300 à 400 ps. Il ne dépend pas de la longueur d'onde d'émission, puisque l'effet de couleur est très faible sur ce type de photomultiplicateur. Pour réaliser les spectres résolus en temps, des déclins de fluorescence sont enregistrés à différentes longueurs d'onde d'excitation ou d'émission et le spectre d'excitation ou d'émission correspondant est mesuré. Une analyse individuelle de chacun de ces déclins de fluorescence est réalisée, puis une analyse globale (même temps de vie pour tous les déclins) sur l'ensemble des déclins d'un spectre est réalisée. A partir de l'analyse globale on obtient, pour chaque longueur d'onde où un déclin a été enregistré, la contribution relative de chacune des composantes temporelles à la fluorescence totale. Il ne reste plus, pour avoir le spectre d'une composante temporelle, qu'à multiplier longueur d'onde par longueur d'onde la contribution relative de cette composante avec l'intensité de fluorescence mesurée lors de l'enregistrement du spectre. II Mesure expérimentale de la résolution temporelle Pour déterminer la résolution sur les valeurs de temps de vie de fluorescence mesurées avec ce montage, nous avons appliqué la déconvolution et l'analyse par moindre carrés non pas à un déclin de fluorescence et à une fonction instrumentale enregistrés l'un après l'autre comme c'est le cas habituellement, mais à deux fonctions instrumentales enregistrées l'une après l'autre. Le "temps de vie de fluorescence" obtenu lors de analyse de ces deux fonctions instrumentales, qui sont identiques aux erreurs de mesure près, nous 67

73 donne une estimation expérimentale de la résolution temporelle. Cette méthode nous donne en moyenne une résolution temporelle de 0,04 ns. II Obtention des paramètres temporels de la fluorescence à partir des déclins expérimentaux Une fois que le déclin de fluorescence expérimental F ex (t) et la fonction instrumentale correspondante G(t) ont été enregistrés, une analyse mathématique est nécessaire pour extraire les paramètres temporels de la fluorescence : nombre de composantes temporelles, temps de vie et contribution relative de chacune des composantes. L'utilisation d'une méthode numérique est nécessaire puisque le déclin de fluorescence F(t) est considéré comme une somme d'exponentielles décroissantes (équation I.8). Différentes méthodes d'analyses peuvent être employées pour cela. Nous avons utilisé une méthode de minimisation des moindres carrés basée sur l'algorithme de Marquardt. Sur quelques déclins une analyse par la méthode du maximum d'entropie a aussi été réalisée en complément. II Méthode des moindres carrés non-linéaires La minimisation des moindres carrés est une des méthodes les plus utilisées pour analyser les déclins de fluorescence, pour des ouvrages de synthèse voir par exemple O'Connor et Phillips (1984) et Lakowicz (1991). Nous avons utilisé un logiciel (Fluomarqdt.II) développé au laboratoire par Ismaël Moya. Il est construit autour d'une version modifiée de l'algorithme de Marquardt (Nash, 1990), qui permet de déterminer les paramètres d'une fonction d'ajustement non linéaire en minimisant la somme des carrés de la différence entre cette fonction et les valeurs expérimentales correspondantes. Le programme fonctionne par itérations successives jusqu'à l'obtention du meilleur ajustement de la fonction F(t) avec les données expérimentales. Pour la première étape, une valeur initiale est proposée pour chaque 68

74 paramètre de F(t). Plus précisément, il faut entrer le nombre de composantes et les temps de vie correspondants, les facteurs pré-exponentiels sont déterminés par le programme en fonction des temps de vie et des données expérimentales (les équations sont linéaires donc l'ajustement est facile). F cal (t), une fonction d'ajustement du déclin expérimental F ex (t) est alors calculée : F cal (t) = F(t) G(t) = 0 t F(u) G(t - u) du (II.2) F cal (t) est comparée à F ex (t) en calculant le 2 réduit correspondant : p 2 = 1 p - v +1 i = 1 F ex (t i ) - F cal (t i ) F ex (t i ) 2 (II.3) p est le nombre de point du déclin expérimental, c est-à-dire le nombre de canaux utilisés pour enregistrer l'histogramme. v est le nombre de paramètres variables de la fonction d'ajustement, il est donc égal à deux fois le nombre de composantes. t i est le temps correspondant au canal i. La différence entre fonction expérimentale et fonction d'ajustement est pondérée par le bruit de la mesure dans chaque canal qui dans le cas du CPUCT est connu et vaut F ex (t i ). Pour un nombre de composantes donné, la valeur des autres paramètres (temps de vie et facteurs pré-exponentiels) est changée à chaque itération et une nouvelle fonction F cal (t) est calculée jusqu à ce que le 2 atteigne un minimum. La recherche de ce minimum est réalisée par l'algorithme de Marquardt qui calcul un vecteur d'amélioration des paramètres de la fonction d'ajustement à partir de la forme de l'hypersurface du 2 autour de la valeur présente de ces paramètres. Le succès de l'ajustement est évalué par la valeur du 2 réduit, qui doit être proche de 1 (O'Connor et Phillips, 1984), et par le tracé du résidu pondéré r(t i ), qui doit être faible et aléatoirement réparti tout au long du déclin. r(t i ) = F ex(t i ) - F cal (t i ) F ex (t i ) (II.4) 69

75 Un exemple de déclin de fluorescence enregistré sur notre spectrofluorimètre tel que le présente Fluomarqdt après analyse (avec le résidu) est présenté Fig. II.4. Avec l'algorithme de Marquardt, il est possible de s'arrêter à un minimum local, il faut donc rester sceptique et essayer différentes valeurs initiales des paramètres pour tester différents chemin de minimisation. Le nombre de composantes temporelles (n) adéquat est déterminé en effectuant des analyses successives du déclin de fluorescence avec des valeurs croissantes de n, jusqu'à ce que l'ajustement ne soit plus amélioré. Un autre critère est utilisé pour déterminer le nombres de composantes : un déclin est simulé à partir de la fonction d'ajustement à laquelle on ajoute un bruit poissonien, puis on compare le résultat de l'analyse réalisé sur ce déclin simulé avec les paramètres initiaux. On vérifie ainsi si une des composantes n'est pas due seulement au bruit de la mesure. Le programme Fluomarqdt offre non seulement la possibilité d'effectuer l'analyse individuelle d'un seul déclin de fluorescence, mais aussi la possibilité d'effectuer l'analyse globale de plusieurs déclins. Pour un article de synthèse sur l'analyse globale des déclin de fluorescence voir Beechem et al. (1991). L'analyse globale permet d'analyser simultanément plusieurs déclins de fluorescence avec un nombre de composantes et des temps de vie de fluorescence communs à tous les déclins, les contributions relatives des composantes étant indépendantes pour chaque déclin. L'analyse globale fonctionne comme l'analyse individuelle décrite précédemment, mais le critère de minimisation est cette fois un 2 réduit global, qui est la moyenne des 2 réduits de tous les déclins analysés. Cette possibilité a été prévue au départ pour pouvoir réaliser des spectres résolus en temps, mais nous l'avons utilisé aussi pour les analyses de déclins à longueurs d'onde fixes et tous les résultats présentés par la suite ont été obtenus par analyse globale. Nous avons systématiquement effectué une analyse individuelle de tous les déclins avant de faire l'analyse globale, notamment pour vérifier l'absence de problème de mesure pour chaque déclin. De plus, l'avantage qui est souvent mis en avant en ce qui concerne l'analyse globale est que les paramètres d'ajustement peuvent être obtenus avec une incertitude bien moindre qu'avec une analyse individuelle, car l'hypersurface du 2 est 70

76 Nombre de coups déclin de fluorescence fonction instrumentale ns 4 Temps (ns) 2 = 1, ns Temps (ns) Figure II.4 : Déclin de fluorescence de chloroplastes reconstitués à l'obscurité analysé avec cinq composantes temporelles, tracé du résidu pondéré et 2 correspondants. La fonction d'ajustement n'est pas visible car complètement masquée par le déclin de fluorescence expérimental. Longueur d'onde d'excitation : 350 nm. Longueur d'onde d'émission : 456 nm. généralement bien mieux définie pour l'analyse globale que pour l'analyse individuelle (Beechem et al., 1991). 71

77 II Méthode du maximum d'entropie Nous rappellerons seulement brièvement le principe de l'analyse des déclins de fluorescence par la méthode du maximum d'entropie, pour un article de synthèse voir Brochon (1994). Dans cette méthode, on modélise le déclin de fluorescence F(t) par une distribution continue d'exponentielles décroissantes suivant l'équation II.5 : F(t) = 0 A( ) e - t d (II.5) A( ) est la valeur du facteur pré-exponentiel associé au temps. Comme précédemment le déclin expérimental F ex (t) est ajusté par la fonction F cal (t) qui est la convolution de F(t) avec la fonction instrumentale G(t), mais il n'y a plus qu'un seul paramètre variable c'est la distribution A( ). Le degré de structure de A( ) est quantifié par une fonction entropique S[A( )] : SA( ) = 0 A( ) - m( ) - A( ) log A( ) m( ) d (II.6) m ( ) est un modèle initial de la distribution A( ) qui dans notre cas était uniforme. Le programme optimise A( ) suivant deux critères qui sont considérés simultanément : maximisation de l'entropie S[A( )] et minimisation du 2 réduit (équation II.3). Comme précédemment la qualité de l'ajustement est évalué par la valeur du 2 réduit et par le tracé du résidu pondéré r(t i ) (équation II.4). Les temps de vie et les facteurs pré-exponentiels relatifs des composantes temporelles, qui sont discrets, sont obtenus à partir de la distribution A( ) en calculant respectivement le centre de gravité et la surface relative des différents pics de A( ). 72

78 II Conditions d'utilisation de la diode laser comme lumière actinique Pour pouvoir faire des mesures de fluorescence correctes en présence de lumière actinique sur ce spectrofluorimètre, il était nécessaire d'avoir une source de lumière actinique à une longueur d'onde située hors du domaine de longueur d'onde d'émission. En effet, il est alors possible de filtrer spectralement la lumière actinique diffusée par l'échantillon et de l'empêcher ainsi de contaminer la mesure de fluorescence. Les Fig. II.5 et II.6 montrent bien que les conditions de mesures utilisées sont bien adaptées et garantissent des mesures de fluorescence non contaminées par la lumière actinique. Ces deux figures ont été obtenues avec comme échantillon le standard de réflectance derrière une fenêtre de quartz, sans faisceau d'excitation et sans corrections spectrales. Le standard de réflectance est un diffuseur parfait dans le domaine spectrale qui nous intéresse, tandis que la réflectance de nos échantillons n'est au maximum que de quelques %. La contamination de la mesure de fluorescence de ces échantillons par la lumière actinique ne 20 Obscurité Signal du photomultiplicateur (coups/s) Lumière Longueur d'onde (nm) Figure II.5 : Enregistrement du signal du photomultiplicateur dans les conditions d'un spectre d'excitation en présence et en absence de lumière actinique sans faisceau d'excitation. Un diffuseur (standard de réflectance) est mis à la place de l'échantillon et la correction spectrale n'est pas appliquée. 73

79 30 Signal du photomultiplicateur (coups/s) Lumière Obscurité Longueur d'onde (nm) Figure II.6 : Enregistrement du signal du photomultiplicateur dans les conditions d'un spectre d'émission en présence et en absence de lumière actinique sans faisceau d'excitation. Un diffuseur (standard de réflectance) est mis à la place de l'échantillon et la correction spectrale n'est pas appliquée. peut donc qu'être inférieure à ce qui a été obtenu Fig. II.5 et II.6. A part un pic vers 520 nm sur la Fig. II.6, il n'y a pas d'augmentation du signal lorsque la lumière actinique est allumée et on a dans les deux cas (obscurité et lumière) un bruit de l'ordre de 10 coups/s. Le pic à 520 nm culmine à 30 coups/s ce qui fait une très faible contamination de la mesure par la lumière actinique que nous avons négligée, d'autant plus qu'elle est plus faible avec nos échantillons dont la réflectance est bien inférieure à celle du standard de réflectance. II Etude de l'influence combinée de la photosélection et du mouvement des molécules sur les déclins de fluorescence enregistrés avec le montage FLU3 Les effets de la polarisation de la lumière en spectrofluorimétrie, qui concernent notamment les mesures de fluorescence résolue en temps, sont bien connus et sont même 74

80 mis à profits dans les mesures d'anisotropie de fluorescence (voir par ex. O'Connor et Phillips, 1984; Valeur, 1993). Ces effets proviennent de la photosélection d'une partie des molécules de l'échantillon, c est-à-dire l'excitation préférentielle des molécules ayant une orientation spécifique par rapport à la polarisation de la lumière excitatrice. Cette photosélection associée aux mouvements, au cours de la mesure, des molécules excitées peut influencer les mesures de temps de vie de fluorescence (Spencer et Weber, 1970). Prenons le cas simple d'une lumière d'excitation polarisée linéairement, elle va exciter préférentiellement les molécules dont le moment d'absorption a la même direction que sa direction de polarisation. Ces molécules excitées vont ré-émettre, après un certain temps caractérisé par f le temps de vie de fluorescence, une fluorescence polarisée parallèlement à leurs moments d'émission. Entre l'absorption et l'émission, les molécules photosélectionnées ont eut le temps de bouger, notamment d'effectuer un mouvement de rotation caractérisé par r le temps de relaxation rotationelle, qui dépend essentiellement de la taille et de la forme des molécules ainsi que de la viscosité du milieu. Pour un ensemble de molécules identiques photosélectionnées au même moment, la polarisation de la fluorescence émise peut donc être différente suivant que la molécule émet plus ou moins rapidement après l'excitation. Dans ce cas, lors de l'enregistrement du déclin de fluorescence les photons comptabilisés aux temps courts n'ont pas la même polarisation que ceux comptabilisés aux temps longs. Ce qui induit une déformation artificielle du déclins puisque les éléments d'optique (notamment le réseau du monochromateur) ont une transmission qui dépend de façon significative de la polarisation de la lumière. En fait, trois cas sont à considérer : - f << r : les molécules n'ont pas le temps de tourner entre l'absorption et l'émission de fluorescence, toutes les molécules fluorescent avec la même polarisation. Il n'y a donc pas d'influence sur la mesure du temps de vie de fluorescence. - f >> r : les molécules ont eut amplement le temps de tourner entre l'absorption et l'émission, les moments d'émissions sont répartis uniformément dans toutes les directions pendant toute la durée de l'émission de fluorescence. Il n'y a donc pas d'influence sur la mesure du temps de vie de fluorescence. 75

81 - f r : c'est le cas intermédiaire et c'est dans ce cas qu'il y a une influence de la photosélection et du mouvement des molécules sur la mesure du temps de vie de fluorescence. Du point de vue expérimentale il existe plusieurs possibilités d'éliminer ces effets indésirables de la photosélection, elles sont discutées de façon très complète par Mielenz et al. (1976). La méthode sans doute la plus utilisée et dont nous nous servirons par la suite a été introduite par Spencer et Weber (1970) pour les mesures de temps de vie de fluorescence. Elle consiste à placer juste avant l'échantillon un polariseur pour avoir un faisceau d'excitation polarisé verticalement et à placer juste après l'échantillon un polariseur à l'angle dit "magique" (à 54,75, ou 125,25, par rapport à la verticale). Cet angle a la particularité de rendre l'intensité de fluorescence mesurée après le polariseur d'émission totalement indépendante de l'anisotropie de fluorescence (Mielenz et al., 1976) et donc totalement indépendante de la photosélection et du mouvement des molécules. Le spectrofluorimètre FLU3 ne possède pas de système de polariseurs permettant d'éliminer les effets indésirables de la photosélection. Il y a deux raisons à cet état de fait. Premièrement, ce montage a été construit à l'origine pour mesurer la fluorescence résolue en temps de la Chl in vivo, pour laquelle les problèmes liés à la photosélection ne se posent pas. Les molécules de Chl excitées transfèrent l'énergie d'excitation (transfert nonradiatif de type Förster) à d'autres molécules de Chl au sein des antennes et il y a de nombreux transferts entre l'absorption et l'émission de fluorescence, ce qui fait disparaître totalement la photosélection. Deuxièmement, la FBV des chloroplastes en solution est faible, et la présence de polariseurs dans le trajet optique aussi bien à l'excitation qu'à l'émission diminue de façon importante la fluorescence, aussi l'ajout de polariseurs dans le montage FLU3 aurait rendu impossible une mesure correcte de la FBV des chloroplastes en solution. Cependant, une perturbation des mesures de FBV résolues en temps n'est pas pour nous un obstacles forcément insurmontable puisque nous ne cherchions pas à déterminer précisément le temps de vie de fluorescence d'un fluorophore donné. Néanmoins, il était nécessaire d'évaluer quels étaient les effets induits par la 76

82 photosélection sur nos mesures de fluorescence résolue en temps, notamment concernant la fluorescence du NADPH qui nous intéresse au premier plan. II Estimation du temps de relaxation rotationelle du NADPH libre et du NADPH lié aux protéines Pour savoir si la photosélection et la rotation des molécules de NADPH dans nos échantillons sont susceptibles d'affecter la mesure du temps de vie de fluorescence de NADPH, il nous faut comparer le temps de relaxation rotationelle r du NADPH dans les chloroplastes avec son temps de vie de fluorescence (temps de vie moyen m ), puisque seul le cas où ces deux temps sont proches est susceptible de poser des problèmes. Pour cela nous avons estimé r pour le NADPH libre et pour le NADPH lié aux principales protéines du chloroplastes susceptibles de faire cette liaison. Nous avons utilisé la loi de Debye-Stockes-Einstein : r = V k T (II.7) Où est la viscosité (viscosité absolue) du milieu, V est le volume de la molécule, T la température et k la constante de Boltzmann. Cette formule permet de déterminer simplement le r d'une molécule dans un milieu donné, mais implique que cette molécule soit de forme sphérique. Nous ferons donc l'approximation que NADPH et les protéines auxquelles il se lie sont sphériques, ce qui n'est bien sûr pas totalement rigoureux mais permet de calculer approximativement le r. On ne connaît pas la viscosité du stroma dans les chloroplastes intacts, mais nous l'avons mesurée pour une solution de chloroplastes reconstitués (voir Annexe A). Elle est nécessairement plus élevée pour le stroma dans les chloroplastes intacts, mais vraisemblablement pas beaucoup plus élevée puisque l'osmolarité est la même que celle d'une solution de chloroplastes reconstitués. La température étant fixée à 20 C (température à laquelle ont été effectuées toutes les mesures de fluorescence résolues en 77

83 temps), il ne nous manque plus qu'une estimation du volume. Pour NADPH libre nous avons pris le volume de NADH : 1000 Å 3, volume hydrodynamique moyen (Couprie et al., 1994). Pour NADPH lié nous avons pris le volume des protéines auxquelles il se lie en négligeant le volume de NADPH. Les volumes des protéines ont été estimés à partir de leurs masses molaires (voir Annexe B). Les temps de relaxation rotationelle ( r ) dans une solution de chloroplastes reconstitués calculés suivant la formule II.7, pour NADPH libre et pour NADPH lié aux principales protéines susceptibles de lier ce cofacteur dans les chloroplastes, sont présentés Table II.1. On constate que le r est toujours nettement plus grand que le temps de vie de fluorescence pour NADPH lié aux principales protéines susceptibles d'effectuer cette liaison. On en déduit que l'influence de la photosélection sur la mesure du temps de vie de fluorescence de NADPH lié est très faible et peut vraisemblablement être négligée (ce que nous ferons par la suite). Par la même occasion, on en déduit qu'il est raisonnable de négliger l'influence de la photosélection sur la mesure du temps de vie de fluorescence des protéines qui, encore une fois, est généralement faible (environ 2,8 ns, temps de vie moyen pour FNR et Rubisco, Table III.5) devant les temps de relaxation rotationelle. Par contre, en ce qui concerne le NADPH libre, le temps de vie de fluorescence (environ 0,4 ns, temps de vie moyen) et le temps de relaxation rotationelle sont proches, la mesure du temps de vie de fluorescence de NADPH libre doit donc être Table II.1 : Estimation du temps de relaxation rotationelle ( r ) pour NADPH libre et lié à différentes protéines dans une solution de chloroplastes reconstitués. Les valeurs de r ont été calculées grâce à la formule II.7. Les volumes des protéines sont estimés à partir de leurs masses molaires comme décrit Annexe B. Masse molaire pour les protéines (kd) Volume (Å 3 ) Temps de relaxation rotationelle (ns) NADPH (libre) ,31 FNR 38 6, Rubisco 550 9, MDH 41 6, GAPDH 160 2, GR 114 1, MDHAR 47 7,

84 influencée par la photosélection. Cependant, dans le cas de NADPH seul en solution, nous ne sommes pas handicapés par une trop faible intensité de fluorescence. Aussi, pour évaluer les conséquences de la photosélection sur les mesures de temps de vie de fluorescence, nous avons comparé les résultats des déclins de fluorescence obtenus lorsque les effets de la photosélection sont présents et lorsqu'ils sont éliminés par la méthode des deux polariseurs croisés à l'angle "magique". Plus précisément, nous avons placé un polariseur vertical dans le chemin optique juste avant l'échantillon. Des déclins de fluorescence d'une solution de NADPH (10 μm) dans le milieu général (viscosité de 1,20 cp, voisine de celle d'une solution de chloroplastes reconstitués) ont été enregistrés, d'une part juste avec le polariseur à l'excitation, et d'autre part avec en plus un polariseur positionné à l'angle "magique" par rapport à la verticale et placé juste après la lentille de collection. Les résultats de l'analyse de ces déclins sont présentés Table II.2. Les résultats obtenus dans les deux situations sont effectivement différents, on constate en effet une augmentation des temps de vie des trois composantes et une augmentation du temps de vie moyen. Par contre, les contributions relatives de chacune des trois composantes à la fluorescence totale restent les mêmes dans les deux situations. On peut conclure qu'il y a bien dans notre situation une influence de la photosélection sur la mesure du temps de vie de fluorescence de NADPH libre, mais, comme le montre la Table II.2, cette influence est très faible et n'est pas du tout de nature à perturber les analyses que nous voulons effectuer. En effet, nous ne cherchons pas à déterminer précisément les caractéristiques temporelles de la fluorescence de NADPH, mais à étudier à l'aide de la résolution temporelle les variations photo-induites de la fluorescence du NADPH dans les chloroplastes. De plus, cette influence est sans doute encore plus faible lorsqu'il n'y a pas de polariseur vertical avant l'échantillon (ce qui est le cas des mesures effectuées par la suite), puisque le faisceau d'excitation est naturellement polarisé principalement verticalement mais pas exclusivement. C'est pourquoi par la suite nous allons négliger l'influence de la photosélection sur les mesures de temps de vie de fluorescence de NADPH libre dans nos échantillons. Nous utiliserons pour NADPH libre les caractéristiques temporelles de la fluorescence obtenues dans le cas sans polariseur à 79

85 Table II.2 : Comparaison des résultats de l'analyse de déclins de fluorescence de NADPH enregistrés en absence et en présence d'un polariseur à l'angle "magique" (54,75 ) à l'émission. Moyennes et écarts types correspondants (entre parenthèses) obtenus à partir de l'analyse globale de 8 déclins dans chacune des deux situations. NADPH (10 μm) était en solution dans le milieu général. Longueur d'onde d'excitation : 340 nm. Longueur d'onde d'émission : 456 nm. i et f i sont respectivement le temps de vie de fluorescence et la contribution relative à la fluorescence totale de n la composante i. f i est définie par f i = i i / i i, on rappelle que les i sont les facteurs pré-exponentiels i=1 n n n relatifs. Le temps de vie moyen m est défini par m = f i i = i 2 i / i i i=1 i=1 i=1 très courte C1 Sans polariseur à l'émission 0,15 43,1 (0,4) Avec un polariseur à l'angle "magique" à l'émission Composantes temporelles courte C2 moyenne C3 Temps de vie moyen (ns) f (%) (ns) f (%) (ns) f (%) m (ns) 0,19 42,1 (0,9) 0,53 54,3 (0,4) 0,55 55,3 (0,9) 2,9 2,6 (0,1) 3,3 2,6 (0,1) 0,43 0,47 l'émission, puisque c'est ces caractéristiques temporelles que l'on s'attend à retrouver dans une solution de chloroplastes, où la mesure est faite sans polariseurs. II Estimation expérimentale de l'influence de la photosélection sur les mesures de temps de vie de fluorescence dans le cas des principaux types d'échantillons utilisés. Dans la section précédente, nous nous sommes attachés uniquement à la fluorescence du NADPH qui nous intéresse en premier lieu. Mais, comme le NADPH n'est pas le seul fluorophore responsable de la FBV des chloroplastes et encore moins des mésophylles et des feuilles, nous avons fait, lorsque cela était possible, des mesures comparatives de déclins de fluorescence sur nos différents échantillons avec et sans la 80

86 possible influence de la photosélection, dans le but d'évaluer cette influence. Pour cela nous avons procédé exactement comme précédemment pour NADPH en solution, un polariseur positionné verticalement à l'excitation et un polariseur à l'angle "magique" par rapport à la vertical, présent ou non à l'émission. Dans le cas des mésophylles, la fluorescence est importante et on peut parfaitement enregistrer des déclins de fluorescence dans des conditions tout à fait convenables même en présence des deux polariseurs. Pour cette expérience nous avons utilisé des mésophylles d'épinard, bien que par la suite nous ferrons les mesures sur des mésophylles de pois, car ils sont bien plus faciles à obtenir que les mésophylles de pois, qui nécessitent la culture de mutants. Les résultats de l'analyse des déclins de fluorescence en présence et en absence de l'influence de la photosélection sont présentés Table II.3. Nous avons retenu l'analyse avec cinq composantes temporelles, bien que l'analyse avec quatre composantes donne des résultats presque aussi bons, pour être homogène avec les expériences réalisées sur mésophylles de pois qui ont été analysées avec cinq composantes (voir section III.5.). On constate que l'analyse des déclins de fluorescence enregistrés dans les deux situations Table II.3 : Comparaison des résultats de l'analyse de déclins de fluorescence de mésophylles d'épinard enregistrés en absence et en présence d'un polariseur à l'angle "magique" (54,75 ) à l'émission. Moyennes et écarts types correspondants (entre parenthèses) obtenus à partir de l'analyse globale de 3 déclins dans chacune des deux situations. Les mésophylles d'épinard ont été obtenus en enlevant l'épiderme sur des feuilles d'épinard identiques à celles utilisées pour isoler des chloroplastes (voir section II ). Longueur d'onde d'excitation : 352 nm. Longueur d'onde d'émission : 458 nm. Composantes temporelles Temps très courte C1 courte C2 moyenne C3 longue C4 très longue C5 de vie moyen (ns) f (%) (ns) f (%) f (%) f (%) f (%) m (ns) Sans polariseur à l'émission 0,10 38,0 0,48 17,4 1,3 13,4 3,8 19,1 8,6 12,1 2,06 (0,8) (0,6) (0,3) (0,5) (0,1) (0,02) Avec un polari- 0,09 30,4 0,39 18,7 1,2 16,6 3,8 20,3 8,5 14,0 2,26 seur à l'angle (0,6) (0,9) (0,5) (0,6) (0,3) (0,04) "magique" à l'émission 81

87 donne des résultats un peu différents, ce qui montre que la photosélection à une influence certaine sur les mesures de fluorescence résolue en temps sur les mésophylles. Cependant, à part le temps de vie de fluorescence de la composante courte (C2) qui est un petit peu allongé par l'effet de la photosélection, les temps de vie des autres composantes ne sont pas affectés et seules les contributions relatives des composantes à la fluorescence totale sont affectées. Ces effets de la photosélection ne sont donc pas trop gênants pour nous. Dans le cas des chloroplastes en solution, la FBV est trop faible pour enregistrer les déclins de fluorescence en présence des deux polariseurs. Cependant, avec des chloroplastes reconstitués excités à 290 nm on arrive tout juste à faire cette mesure (Table II.4). On voit que les caractéristiques temporelles obtenues en présence ou absence des effets de la photosélection sont vraiment très peu différentes, on peut donc légitimement négliger dans ce cas l'influence de la photosélection. Ce qui est en accord avec les estimations de la Table II.1, puisque sur les chloroplastes en solution avec une excitation à 290 nm et une détection à 456 nm la fluorescence provient en grande majorité des protéines. Ces différentes considérations permettent de conclure que l'influence de la Table II.4 : Comparaison des résultats de l'analyse de déclins de fluorescence de chloroplastes reconstitués enregistrés en absence et en présence d'un polariseur à l'angle "magique" (54,75 ) à l'émission. Moyennes et écarts types correspondants (entre parenthèses) obtenus à partir de l'analyse globale de 7 déclins dans chacune des deux situations. Longueur d'onde d'excitation : 290 nm. Longueur d'onde d'émission : 456 nm. Composantes temporelles Temps courte C'1 moyenne C'2 longue C'3 de vie moyen (ns) f (%) (ns) f (%) (ns) f (%) m (ns) Sans polariseur à l'émission 0,63 6,7 2,9 34,9 6,6 58,4 4,94 (0,1) (0,6) (0,5) (0,02) Avec un polariseur à l'angle "magique" à 0,61 6,0 2,8 32,4 6,5 61,6 4,98 l'émission (0,3) (0,7) (0,5) (0,01) 82

88 photosélection existe pour certains fluorophores dans nos échantillons, mais que cette influence est faible et modifie peu la structure temporelle de la FBV. Pour la suite, les mesures de déclins de fluorescence ont donc été réalisées sans polariseurs (ni à l'excitation, ni à l'émission) et les effets de la combinaison de la photosélection et de la rotation des fluorophores ont été négligés. II.3.2. Le fluorimètre impulsionnel UV-PAM II Description du montage expérimental Un schéma de ce fluorimètre impulsionnel est présenté Fig. II.7. Comme on le voit sur ce schéma les différents éléments du montage sont reliés à un ordinateur qui contrôle l'ensemble du montage et réalise l'acquisition des données. Ce montage est une nouvelle version du fluorimètre impulsionnel permettant de mesurer simultanément la fluorescence rouge et la FBV. La première version de ce montage est décrite en détail dans Cerovic et al. (1993), et quelques expériences présentées par la suite ont été réalisées sur cette première version. Nous avons construit ce nouveau montage pour remplacer l'ancien dans l'optique d'améliorer le rapport signal sur bruit mais surtout de remplacer la source de lumière, un laser à azote, par une lampe flash xénon. Les raisons de ce changement de source étaient : les variations d'intensité importante du laser (20 %), sa durée de vie assez faible et la largeur de ses impulsions de lumière (3 ns) qui imposait l'utilisation d'une électronique de détection rapide et donc bruyante. Bien que le principe et la technique de mesure soient identiques, ce changement de source a imposé des changements importants de l'optique et surtout de l'électronique de détection. 83

89 Echantilloneurbloqueur Contrôle et acquisition D3 des données F1 F2 O F4 L2 D1 F'7 L5 F6 F5 F9 L4 F8 F7 D2 lampe S L1 F3 B L3 LED Bain Commande Thermostaté LED Echantillon Figure II.7 : Représentation schématique du fluorimètre impulsionnel UV-PAM. II La source de lumière et les différents éléments qui définissent le faisceau d'excitation La source lumineuse de ce fluorimètre est une lampe flash xénon (L4633, Hamamatsu) qui fournie des impulsions assez intenses avec une LMH d'environ 1 μs (Fig. II.8). Les variations de l'intensité lumineuse émise par cette lampe pic-à-pic sont inférieures à 5 % du signal total, et augmentent peu avec le temps d'utilisation de la lampe (d'après la documentation technique de la lampe flash xénon L4633). Pour filtrer la lumière émise par la lampe sur un domaine spectral allant de 250 à plus de 800 nm et ne retenir qu'une bande étroite autour de 340 nm, une combinaison de trois filtres est utilisée. Cela s'est avéré nécessaire pour éliminer complètement la partie visible de la lumière d'excitation, qui autrement contaminerait les mesures de fluorescence. Un filtre UV (F1, 84

90 Figure II.8 : Enregistrement des impulsions lumineuses délivrées par la lampe flash xénon L4633 (high-power xenon flash lamp) comparées à celles délivrées pour la même puissance fournit par une lampe xénon conventionnelle (conventional xenon flash lamp). Extrait de la documentation technique de la lampe flash xénon L4633. max = 340 nm, T 70%, LMH = 70 nm, DUG11, Schott) est placé devant la lampe xénon, puis un filtre dichroïque réfléchissant l'uv (F2, XB06 350WB80, Omega) est utilisé en réflexion, et enfin un filtre interférentiel centré à 340 nm (F3, T = 33 %, LMH = 10 nm, 03FIU008, Melles Griot) est placé après l'obturateur (O) et une lentille en quartz (L1), qui refocalise le faisceau excitateur. Grâce à une lamelle de microscope (B, épaisseur 0,15 mm, Esco, Erie Scientific, Portsmouth, USA) une petite partie du faisceau d'excitation est déviée vers le détecteur de référence (D1, détecteur à photodiode) qui enregistre l'intensité lumineuse d'excitation et ses variations. Une lentille de quartz (L2) permet de focaliser la totalité de la lumière prélevée sur le faisceau d'excitation sur ce détecteur, qui est protégé par un filtre neutre (F4, XB27 550ND3.0, Omega). Après avoir été réfléchi par un filtre dichroïque UV réfléchissant (F5, 420DCLP, Omega), le faisceau d'excitation est focalisé sur l'échantillon par la lentille asphérique de collection (L3, = 60 mm, focale = 39 mm, 01LAG017, Melles Griot). 85

91 II Echantillons et illumination actinique Comme pour le spectrofluorimètre, et pour les mêmes raisons, c'est une géométrie face-avant qui a été choisie pour ce montage. Différents porte-échantillons interchangeables et adaptés aux différents types d'échantillons ont été prévus. Une grande majorité des mesures réalisées sur des solutions (chloroplastes, thylakoïdes ou algues) l'ont été sur des cuves de mesure carrées standards en quartz de 1 cm de chemin optique (101-QS, Hellma); ces solutions étant agitées grâce à un barreau magnétique. Lorsqu'une agitation permanente n'était pas obligatoire pour des raisons de sédimentation des échantillons ou d'ajouts pendant la mesure, l'agitation était arrêtée durant de courtes périodes pour effectuer les mesures de fluorescence. En effet, l'agitation permanente avait généralement tendance à augmenter le bruit de la mesure en amenant transitoirement dans le faisceau de mesure des micro-agrégats de chloroplastes, thylakoïdes ou algues, ou des impuretés fluorescentes (poussières). Les feuilles et les mésophylles étaient, quant à eux, placés dans le même porte-échantillon que celui utilisé sur le spectrofluorimètre. Les ASS étaient placées, elles aussi, dans un porte-échantillon cylindrique et plaquées contre une surface en acier inoxydable, mais il n'y avait pas de fenêtre de quartz devant. On évite ainsi tout risque d'anoxie des algues sans que soit nécessaire une circulation d'air devant l'échantillon. Pour prévenir le dessèchement des ASS, une rondelle de filtre en microfibres de verre (AP40, Millipore, Saint Quentin, France), totalement imbibée de la solution utilisée pour resuspendre les algues lors de la préparation de l'ass, est disposée entre l'ass et la surface en acier inoxydable. Dans tous les cas, le porte-échantillon était muni d'un système de circulation permettant de maintenir l'échantillon à une température constante (20 C dans toutes les expériences sauf celles sur les algues Chlamydomonas reinhardtii où la température était fixée à 25 C) grâce à un bain thermostaté (F3-K, Haake). Deux sources de lumière actinique continues indépendantes (pouvant donc fonctionner seules ou ensemble) ont été installées sur ce montage : une batterie de 12 diodes électroluminescentes rouges (LED, HLMP-8150, Hewlett Packard) fournissant au 86

92 niveau de l'échantillon une DFPP ajustable de 0 à 90 μmol photon m -2 s -1 ; et une lampe (S, KL1500 electronic et son filtre rouge, Schott) fournissant au travers de son guide optique une lumière rouge saturante généralement utilisée sur de courtes périodes de 2 s. II Collection et détection de la fluorescence La fluorescence émise par l'échantillon est collectée par la lentille L3, puis traverse le filtre dichroïque F5. La fluorescence rouge et la FBV sont ensuite séparées par un filtre dichroïque adapté (F6, DCrouge, Balzers, Meudon, France), la fluorescence rouge étant réfléchie et la FBV transmise. La fluorescence rouge est focalisée par une lentille (L4) sur le détecteur "rouge" (D2, détecteur à photodiode) qui est protégé par une combinaison de deux filtres. Un filtre anti-uv (F7, KV 408, Schott) et un filtre interférentiel de bande assez large centré à 682 nm (F8, T = 85 %, LMH = 22 nm, 682DF22 EM XF47, Omega). La FBV est focalisée par une lentille (L5) sur le détecteur "bleu" (D3, détecteur à photomultiplicateur) qui est protégé par une combinaison de deux filtres. Un filtre anti- UV (F'7, KV 408) et un filtre en verre bleu (F9, CS 4-96). Chacun des trois détecteurs fournit un signal impulsionnel, à chaque impulsion de lumière excitatrice émise par la lampe xénon correspond une impulsion de fluorescence qui est captée et transmise par les détecteurs. Ces signaux sont envoyés à l'échantillonneur-bloqueur, en fait il y a un échantillonneur-bloqueur (E/B, AD585, Analog Devices, Radiospares, Beauvais, France) pour chaque signal. Chaque échantillonneur-bloqueur comprend en plus de l'e/b proprement dit deux multivibrateurs monostables (M1 et M2, SN74LS221N, Motorola, Radiospares) en série qui commandent le déclenchement des fonctions échantillonnage et "blocage" de l'e/b. Le fonctionnement, qui est partiellement représenté sur le chronogramme Fig. II.9, est le suivant. Chacune des décharges de la lampe xénon, qui fournissent les impulsions lumineuses, est déclenchée par un signal envoyé par l'ordinateur, mais il y a un décalage variable ("jitter") entre ce signal et l'impulsion lumineuse, il n'était donc pas possible d'utiliser ce signal de l'ordinateur pour synchroniser la détection (échantillonneur-bloqueurs et carte 87

93 signal de synchronisation de la lampe xénon 0 Sortie détecteur Vs M1 M2 Vs E/B T0 T1 T2 Temps Figure II.9 : Chronogramme du fonctionnement des mesures sur le fluorimètre impulsionnel UV-PAM. Ce chronogramme illustre le fonctionnement des mesures réalisées avec les détecteurs à photodiode. Pour les mesures effectuées avec le détecteur à photomultiplicateur le fonctionnement est un tout petit peu différent (voir section II ). d'acquisition). Un signal de synchronisation parfaitement synchronisé aux impulsions de la lumière d'excitation est généré par couplage inductif avec la décharge du condensateur qui alimente la lampe xénon. Ce signal déclenche M1 à T 0. M1 est réglé pour déclencher M2 par un front descendant à T 1, qui correspond exactement au pic de l'impulsion de 88

94 fluorescence fournie par le détecteur. Les détecteurs à photodiodes fournissent des signaux négatifs en raison de leur électronique interne. L'E/B qui suivait le signal fournit par le détecteur jusqu'à T 1 est déclenché par M2 et conserve la valeur du pic du signal fourni par le détecteur (Vs) jusqu'à T 2, c est-à-dire tant que M2 est à un niveau haut. La mesure de Vs est une mesure de l'intensité de fluorescence émise par l'échantillon. La sortie de l E/B est envoyée sur une carte de conversion analogique/numérique (AD 200, 12 bits, Infotek, Anaheim, USA) placée dans l'ordinateur, déclenchée par le signal de synchronisation de la lampe xénon et qui, entre T 1 et T 2, enregistre successivement les différents signaux en les convertissant. Le signal de fluorescence rouge (fournit par D2) et celui de FBV (fournit par D3) sont divisés par le signal de référence (fournit par D1) pour corriger ces signaux de fluorescence des fluctuations d'intensité de la lampe xénon. Ce système fonctionne à une fréquence de mesure maximale de 21 Hz, mais nous l'avons utilisé à une fréquence de 3,3 Hz (en moyennant 5 mesures ensemble) pour les ASS et de 10 Hz (en moyennant 15 mesures ensemble) pour les chloroplastes et les algues en solution, ce qui fait finalement une fréquence effective de mesure de 0,67 Hz dans tous les cas. II Quelques caractéristiques du montage expérimental II Les détecteurs et les techniques utilisées pour rendre la détection insensible à la lumière continue II Les détecteurs à photodiode Les détecteurs à photodiode utilisés sur le fluorimètre impulsionnel UV-PAM restituent un signal impulsionnel proportionnel aux impulsions de fluorescence, et ce quelle que soit la lumière continue qui les illumine, que cette lumière soit de la fluorescence continue ou de la lumière actinique diffusée. Cette réjection de toute lumière continue est obtenue par l'étage d'amplification placé derrière la photodiode, et qui 89

95 amplifie sélectivement le signal impulsionnel. Le schéma électronique de ces détecteurs est représenté Fig. II.10. La photodiode est une photodiode PIN rapide (S , Hamamatsu) et les amplificateurs opérationnels utilisés sont des OP27 et OP37 (Analog Devices, Radiospares). Le signal délivré par la photodiode (point A) est amplifié par un amplificateur rapide de grand gain (Aop2 de gain G = 11 V/μA). Après intégration avec une grande constante de temps (Aop1, = R2 C1 = 10 ms), ce signal amplifié est soustrait au signal de la photodiode (point A), de sorte qu'en définitive seuls les signaux impulsionnels sont amplifiés. L amplificateur opérationnel Aop4 est monté en étage suiveur pour "isoler" la sortie impulsionnelle. L amplificateur opérationnel Aop3 est monté en intégrateur, avec une relativement grande constante de temps ( = R5 C2 = 100 μs), et la contre-réaction à travers la résistance R6 permet de stabiliser le potentiel au point A, et de limiter ainsi les effets de dissymétrie de Aop2. En effet, R6 est virtuellement connectée à la masse (entrée non-inverseuse de Aop3), et les valeurs de R6 et R5 sont telles que le potentiel au point A se trouve proche de zéro (masse virtuelle). Par ailleurs, ces détecteurs fournissent aussi une mesure de la lumière continue (non-modulée) reçut par la photodiode, mais qui n'est pas utilisée sur ce fluorimètre. En Sortie continue OP27 15 Aop3 +15 Aop5 + OP27 15 C2 R9 +15 (A) R5 R6 R8 C3 (B) R Aop2 OP37 R4 15 R OP27 Aop1 15 C1 R3 R2 Figure II.10 : Schéma électronique des détecteurs à photodiode. +15 Sortie impulsionnelle + OP27 Aop4 15 R1 = R5 = 1 M R2 = R6 = 100 K R3 = 100 R4 = R7 = 1 K R8 = R9 = 10 K C1 = C3 = 100 nf C2 = 100 pf

96 effet, les sorties des deux intégrateurs Aop1 et Aop3 sont sommées (en valeur absolue) ce qui permet la mesure de la lumière continue avec une sortie à faible impédance (Aop5). II Le détecteur à photomultiplicateur Pour mesurer la très faible FBV des chloroplastes, qu'il était difficile de mesurer avec un détecteur à photodiode, nous avons construit un détecteur différent utilisant un photomultiplicateur. L'utilisation d'un photomultiplicateur plutôt qu'une photodiode permet d'avoir un gain nettement plus grand et simplement variable, et d'améliorer le rapport signal/bruit. Par contre, avec les feuilles, la FBV étant nettement plus importante, il est possible d'utiliser un détecteur à photodiode, mais cela n'a pas été le cas pour les expériences présentées dans ce travail. Avec un photomultiplicateur, on dispose d'une dynamique nettement moins grande qu'avec une photodiode et, de plus, ils sont plus fragiles et craignent une lumière trop forte (dépassant le seuil de saturation). Dans ces conditions, il fallait opérer différemment pour rendre le détecteur insensible à la lumière continue et protéger aussi le photomultiplicateur d'une trop grande illumination. Ce détecteur a été construit autour d'un photomultiplicateur R5600U-01 (Hamamatsu) qui n'est alimenté par la haute tension que pendant une fenêtre de 20 μs par période de mesure, le photomultiplicateur n'est donc opérationnel que pendant ces 20 μs (un schéma électronique détaillé du détecteur à photomultiplicateur est présenté Annexe C). La fenêtre de 20 μs englobe bien sûr l'impulsion de fluorescence, elle est réalisée par un multivibrateur monostable (SN74LS221N, Motorola, Radiospares) qui est déclenché par le signal de déclenchement de la lampe xénon fourni par l'ordinateur. Il y a un "jitter" entre ce signal et l'impulsion de lumière d'excitation mais la fenêtre de 20 μs est suffisamment large et elle est placée de telle manière que l'impulsion de fluorescence arrive toujours sur le photomultiplicateur dans cette fenêtre de temps. Par ailleurs, puisqu'on ne peut pas éliminer la partie continue du signal, comme on le fait avec les détecteurs à photodiode, on mesure cette partie continue pour la soustraire au signal, qui est mesuré au pic de l'impulsion de fluorescence. 91

97 La Fig. II.11 montre le signal de sortie du détecteur à photomultiplicateur et illustre la prise de mesure. La fenêtre de mesure de 20 μs est comprise entre T i et T f. Le signal total (V's) est mesuré à T 1 de la même façon que dans le cas des détecteurs à photodiode, si ce n'est que le signal de sortie du détecteur est positif, mais cela n'influe en rien sur la mesure. Le signal continu (Vc) est mesuré à T' 0 suivant la technique décrite section II sauf que dans ce cas ce n'est pas le signal de synchronisation de la lampe xénon qui déclenche le premier monostable M1 (il arrive trop tard), mais le signal de déclenchement de la lampe xénon fourni par l'ordinateur. T' 0 a été choisit pour que le "jitter" de la lampe xénon, qui se traduit par un déplacement de l'impulsion de fluorescence dans la fenêtre de mesure, ne perturbe pas la mesure du signal continu (Vc). Le signal impulsionnel est obtenu par différence (V's - Vc), cette opération étant réalisée par le programme d'acquisition après numérisation des deux valeurs mesurées. Cette technique de mesure du signal impulsionnel de FBV induit par les impulsions de la lampe xénon fonctionne très bien, mais impose certaines limites : la lumière actinique continue qui éclaire l'échantillon ne peut pas être trop forte, sinon le V's Sortie détecteur Vc 0 Ti T'0 T1 Tf Temps Figure II.11 : Représentation schématisée du signal de sortie du détecteur à photomultiplicateur. T i et T f : respectivement début et fin de la fenêtre de mesure de 20 μs. T' 0 : moment de la mesure du signal continu (Vc).T 1 : moment de la mesure du signal total (V's), partie impulsionnelle plus partie continue. 92

98 photomultiplicateur est saturé et on ne peut plus mesurer. Cependant, en utilisant de la lumière actinique rouge (lampe S, Fig. II.7) on peut monter jusqu'à environ 1000 μmol photon m -2 s -1, ce qui est largement suffisant puisque totalement saturant pour nos échantillons. II Rapport signal/bruit et fluorescence non-spécifique du montage Différents éléments d'optique, à cause de leur composition ou de la poussière qui se dépose dessus, contribuent à une FBV propre au montage. Cette FBV est constante mais assez importante par rapport à la FBV des chloroplastes à qui elle fait donc un piédestal. La FBV du montage est donc systématiquement estimée et soustraite du signal pour ne garder que le signal propre aux échantillons. Dans les cas où l'échantillon est une feuille, un mésophylle ou un ASS, cette estimation est assez facile puisque le porteéchantillon est facilement amovible et qu'il n'y a rien derrière. La mesure de la FBV du montage est donc faite ainsi en enlevant le porte-échantillon et en laissant le faisceau d'excitation se perdre dans la pièce plongée dans l'obscurité. Dans le cas où l'échantillon est une solution en cuve de mesure standard, le porte-échantillon n'est pas facilement amovible et nous avons utilisé une cuve de mesure noire ( QS, Hellma) dont la surface absorbante est utilisée comme face avant pour absorber tout le faisceau d'excitation. Ce problème ne se pose pas pour la fluorescence rouge, car il n'y a pas de fluorescence rouge propre au montage. Par ailleurs nous avons estimé le rapport signal/bruit pour la mesure de la FBV des solutions de chloroplastes. Pour cela, nous avons utilisé comme fluorophore bleu-vert un filtre anti-uv fluorescent (WG335, Schott) en atténuant sa fluorescence pour avoir un signal comparable à celui de la FBV des chloroplastes. On obtient un rapport signal/bruit de 300 ce qui est bon, mais lorsque la FBV non-spécifique du montage est soustraite du signal le rapport signal/bruit n'est plus que de

99 II Forme des bandes spectrales de détection de la fluorescence bleu-verte et de la fluorescence rouge Les bandes spectrales de détection de la FBV et de la fluorescence rouge sont définies par les filtres placés devant les détecteurs. Les filtres dichroïques F5 et F6 ont une influence négligeable sur la forme des bandes spectrales de détections des deux fluorescences, nous n'en avons donc pas tenu compte lors de la détermination de ces bandes. La Fig. II.12 montre la forme de la bande spectrale de détection de la FBV obtenue en multipliant les transmittances des filtres F'7 et F9 et celle de la bande spectrale de détection de la fluorescence rouge obtenue en multipliant les transmittances des filtres F7 et F8. Si les filtres dichroïques F5 et F6 n'influent pas sur la forme des bandes spectrales de détection des deux fluorescences, ils contribuent à diminuer légèrement l'intensité de fluorescence mesurée puisque leur transmittance n'est jamais de 100 %, contribution qui n'apparaît nullement sur la Fig. II Transmittance (%) Fluorescence (u.r.) Longueur d'onde (nm) Figure II.12 : Forme des bandes spectrales de détection de la FBV (pointillés longs) et de la fluorescence rouge (trait continu) comparées au spectre d'émission de fluorescence d'une feuille de pois (pointillés courts, repris de la Fig. I.6). La bande spectrale de détection de la FBV a été obtenue en multipliant les transmittances des filtres F'7 et F9 et celle de la fluorescence rouge en multipliant 94 les transmittances des filtres F7 et F8. Longueur d'onde d'excitation pour le spectre d'émission : 355 nm.

100 II Vérification de la linéarité de la réponse du détecteur à photomultiplicateur Dans les expériences de la section III.7. nous nous sommes intéressés à la relation linéaire entre la concentration en NADPH et sa fluorescence. Pour être sûr de ne pas induire dans les mesures des erreurs provenant du montage, nous avons vérifié que la réponse du détecteur mesurant la FBV était parfaitement linéaire dans le domaine de fluorescence où nous travaillons. Pour cela nous avons mesuré la fluorescence d un échantillon solide, dont le rendement quantique de fluorescence est constant (filtre WG335, Schott), lorsque sont placés successivement devant le photomultiplicateur différents filtres neutres (filtres de la série XB, Omega), dont la transmittance a été préalablement mesurée avec précision. La transmittance totale a été calculée à partir des spectres de transmittance des différents filtres neutres, et en tenant compte de la bande 1 Fluorescence bleu-verte (u.r.) 0,8 0,6 0,4 0, Transmittance totale des filtres neutres placés devant le détecteur (%) Figure II.13 : Mesure de la FBV en fonction de la transmittance totale des filtres neutres placés devant le détecteur. La courbe en trait continu est l'ajustement linéaire de l'ensemble des points expérimentaux, le coefficient de corrélation de cet ajustement linéaire est R =

101 spectrale de détection de la FBV. Le résultat de ces mesures est présenté Fig. II.13. Cette figure, notamment l'ajustement linéaire (coefficient de corrélation R = 0,9997), montre bien que la réponse du détecteur qui mesure la FBV est bien parfaitement linéaire dans notre domaine de travail. II Etude de la fluorescence du milieu général à l'aide du fluorimètre impulsionnel Pour des raisons que nous développerons par la suite (section III.2.2.) il était nécessaire de réduire au minimum la fluorescence du milieu dans lequel les chloroplastes sont mis en solution, car le milieu général lui-même lorsqu'il est éclairé par une lumière UV émet de la FBV. Cette fluorescence est faible mais vraisemblablement pas totalement négligeable devant la FBV des chloroplastes. Il est malheureusement impossible d'évaluer précisément la contribution du milieu à la FBV d'une solution de chloroplastes; on ne peut pas se baser sur la mesure de FBV du milieu seul car les chloroplastes, lorsqu'ils sont présents, font écran aux molécules fluorescentes du milieu en absorbant la quasi totalité de la lumière excitatrice. Nous avons voulu réduire au maximum la FBV propre du milieu. Pour déterminer si elle provenait d'un composé particulier (ou d'une impureté présente avec ce composé), nous avons mesuré la FBV de chaque composé du milieu. Ces mesures nous ont appris qu'aucun composé du milieu en particulier n'est responsable de la FBV du milieu, mais que chacun de ces composés seul en solution, à la même concentration que dans le milieu, émet une faible FBV et apporte ainsi sa petite contribution à la FBV du milieu. Dans ce cas, il n'y a pas de solution radicale pour éliminer la FBV du milieu, puisqu'il ne suffit pas de remplacer un des composants du milieu. Par contre, nous avons accru les précautions prises lors de la préparation du milieu (travail sous hotte à flux laminaire, pesées avec des récipients couverts...) pour éviter au maximum la contamination du milieu par les poussières ambiantes. La poussière en général émet en effet une fluorescence bleue assez intense sous excitation UV. En prenant de telles précautions dans la préparation du milieu nous avons réduit de moitié la FBV du milieu. 96

102 CHAPITRE III La fluorescence bleu-verte et ses variations photo-induites dans les chloroplastes

103 III. La fluorescence bleu-verte et ses variations photo-induites dans les chloroplastes III.1. Introduction Lorsque des chloroplastes isolés sont éclairés avec une lumière actinique, on observe une augmentation réversible de leur FBV. L'explication la plus logique est la suivante : la lumière actinique entraîne la mise en marche de la photosynthèse au cours de laquelle le pool de NADP est réduit par le PSI. L'augmentation de concentration en NADPH se traduit par une augmentation de la FBV. Cependant, NADPH n'est pas le seul fluorophore bleu-vert présent dans les chloroplastes. Pour vérifier qu'il est bien à l'origine des variations photo-induites de FBV et qu'il en est le seul responsable Cerovic et al. (1993) ont réalisé les expériences présentées Fig. III.1. La comparaison des deux courbes de la Fig. III.1A montre que l'augmentation photo-induite de FBV observée sur chloroplastes intacts disparaît totalement pour des chloroplastes cassés et lavés. Cette fluorescence variable est donc dépendante d'un composé du stroma soluble en solution aqueuse. De plus, l'addition de NADP + (25 μm concentration finale) aux chloroplastes cassés et lavés permet de retrouver une augmentation photo-induite de FBV (Fig. III.1C) ayant une amplitude équivalente à celle des chloroplastes intacts. Le signal de fluorescence rouge correspondant (Fig. III.1D) est identique dans les deux conditions, dans les deux cas il n'y a pas de flux d'électrons photosynthétique, car, même en présence de NADP +, celui-ci est totalement réduit très rapidement et il n'y a rien pour le réoxyder. La concentration du NADP + ajouté correspond à la concentration de NADP qu'on obtiendrait en cassant la même quantité de chloroplastes dans la cuve de mesure. Calcul basé sur une concentration de NADP dans le chloroplaste de 0,9 mm (Takahama et al., 1981), un volume de stroma dans le chloroplaste de 25 μl/mg Chl et une masse molaire de la Chl de 900 g/mol. Par ailleurs, ces résultats indiquent nettement que les variations photo-induites de FBV sont très certainement dépendantes du PSI. Premièrement, la présence de magnésium (5 mm) dans le milieu pendant et après la rupture des 99

104 0.20 fluorescence bleue (V) A intacts cassés C + NADP + cassés - NADP B D fluorescence rouge (V) cassés intacts - NADP + + NADP + cassés temps (s) temps (s) Figure III.1 : Comparaison des variations photo-induites de fluorescence bleue (A et C) et rouge (B et D) entre des chloroplastes intacts (trait continu) et des chloroplastes cassés (pointillés). Les chloroplastes intacts et cassés dont la concentration est de 1,1 mg Chl/ml (11 μg Chl/cm 2, cuve fine de 0,1 mm de chemin optique) ont été illuminés comme suit : après 30 s, une impulsion de 2s de lumière blanche (DFPP : 650 μmol photons m -2 s -1 ); de 120 s à 360 s, lumière actinique continue rouge (DFPP : 165 μmol photons m -2 s -1 ); au temps 480 s, une impulsion de 2s de lumière rouge lointain (22 W m -2 ), et au temps 540 s une impulsion de 2s de lumière blanche. En A et B les chloroplastes intacts et cassés étaient en solution dans le milieu de resuspension. En C et D les chloroplastes ont été cassés dans le milieu de resuspension contenant seulement 5 mm MgCl 2 (- NADP + ), ou contenant 5 mm MgCl 2, 10 μm ferrédoxine et 25 μm NADP + (+ NADP + ). D'après (Cerovic et al., 1993). chloroplastes préserve la fluorescence rouge variable (Fig. III.1B et D) qui dépend essentiellement du PSII, mais ne préserve pas du tout la fluorescence variable bleue (Fig. III.1C). Et surtout, deuxièmement, une augmentation photo-induite de FBV identique a été obtenue avec une lumière actinique rouge lointain et avec une lumière actinique blanche (les deux derniers flash Fig. III.1A et C), or seul le PSI est sensible au rouge lointain, le 100

105 PSII ne réagit pas à ces longueurs d'onde, comme le montre bien les Fig. III.1B et III.1D. Dans cet article, Cerovic et al. (1993) ont aussi étudié les variations photo-induites de FBV des chloroplastes dans différentes conditions de fonctionnement de la photosynthèse. Il en ressort que l'augmentation photo-induite de FBV des chloroplastes est saturée par une faible intensité de lumière, une DFPP de 12 μmol photons m -2 s -1 semble suffisante. De plus, il apparaît que c'est dans les conditions où le métabolisme de carbone fonctionne au ralenti ou est bloqué (inhibition du CAT par le DL-glycéraldéhyde) que cette augmentation photo-induite est la plus importante. Au contraire, l'ajout de DHAP provoque une réduction des chloroplastes et l'augmentation photo-induite de FBV devient très faible. L'ajout de PGA et celui d'oxaloacétate, qui devraient plutôt oxyder les chloroplastes, n'ont que peu d'effet sur l'augmentation photo-induite de FBV. Le fait que les variations photo-induites de la FBV des chloroplastes soient complètement dépendantes du NADPH a ouvert la voie à l'utilisation de la FBV pour le suivi continu et non-invasif des changements photo-induits de l'état redox du NADP dans les chloroplastes. Cependant, une question reste en suspend : la liaison du NADPH avec les protéines contribue-t-elle à la FBV variable photo-induite des chloroplastes? En effet, dans les chloroplastes une partie importante du NADP est liée aux protéines (Ashton, 1982; Usuda, 1988), et la liaison de NADPH avec les protéines augmente son rendement de fluorescence. Ainsi, la liaison de NADPH avec les protéines peut induire une augmentation de FBV sans que l'état redox du pool de NADP ait changé. Par ailleurs, les flavines sont susceptibles d'apporter une contribution dans le vert aux variations photoinduites de FBV des chloroplastes, qu'il convient d'évaluer. Pour répondre à ces questions nous avons réalisé une analyse spectrale et résolue en temps de la FBV des chloroplastes, à l'obscurité et à la lumière, qui représente la plus grande partie de ce chapitre. Grâce à cette analyse, nous avons la possibilité de séparer les différentes contributions (NADPH libre, NADPH lié, flavines) à la FBV variable photoinduite des chloroplastes. 101

106 III.2. Variations photo-induites de fluorescence bleu-verte III.2.1. Dépendance de la fluorescence bleu-verte variable par rapport au PSI En comparant des mutants de Chlamydomonas reinhardtii dont le PSI a été rendu complètement non-fonctionnel par délétion d'un gène (voir section II.1.3.) aux algues sauvages, on a pu confirmer que l'augmentation photo-induite de FBV est totalement dépendante du PSI (Fig. III.2). En effet, alors qu'avec les algues sauvages on observe une augmentation photo-induite très nette de FBV (Fig. III.2A), avec les mutants cette variation a disparu (Fig. III.2B). Il y a cependant, comme le montre bien la Fig. III.2B, une toute petite augmentation de la FBV à la lumière pour les mutants, ce phénomène est A B 0.55 Fluorescence rouge (u.r.) Fluorescence bleue (u.r.) Temps (s) Temps (s) Figure III.2 : Comparaison des variations photo-induites de FBV (trait continu) et de fluorescence rouge (pointillés) entre : A) des algues Chlamydomonas reinhardtii sauvages et B) des mutants sans PSI (psaa ). Les algues ont été déposées sur support solide (ASS) à un contenu surfacique en Chl de 5 μg Chl/cm 2 pour les sauvages et de 4,5 μg Chl/cm 2 pour les mutants. Les flèches indiquent le moment où la lumière actinique (DFPP : 50 μmol photons m -2 s -1 ) a été allumée ou éteinte. La flèche brisée indique le moment ou un flash (2s) de lumière actinique saturante a été utilisé (DFPP : 300 μmol photons m -2 s -1 ). 102

107 étudié et expliqué en détail dans la section IV.1.. La fluorescence chlorophyllienne atteste bien de la non-fonctionnalité du transport d'électron photosynthétique auquel on s'attend pour des mutants sans PSI, elle atteint un niveau presque maximal (Q A fortement réduit) à faible intensité de lumière, ce qui n'est pas le cas avec les algues sauvages. Le paramètre F V '/F M ', que l'on peut calculer grâce au flash de lumière saturante, quantifie bien ce phénomène. On obtient 0,45 pour les algues sauvages et 0,05 pour les mutants. Le fait que ce facteur ne soit pas complètement nul pour les algues mutantes, et donc qu'il existe un transport d'électron résiduel au niveau du PSII, est lié à l'augmentation photo-induite résiduelle de FBV (voir section IV.1.). NADPH est le seul fluorophore bleu-vert dont la concentration est directement dépendante du fonctionnement du PSI. On a ainsi avec ces mutants de Chlamydomonas une deuxième expérience indépendante qui montre, comme celle de la Fig. III.1, que seul le NADPH est responsable de l'augmentation photo-induite de FBV observée sur les chloroplastes. III.2.2. Feuilles, mésophylles et chloroplastes Pour réaliser l'analyse résolue en temps de l'augmentation photo-induite de FBV, il faut enregistrer les déclins de fluorescence à l'obscurité et à la lumière, puis comparer les résultats obtenus dans ces deux conditions. Or, un certain nombre de fluorophores bleus sont présents dans les feuilles, les mésophylles et les chloroplastes. Ainsi, à l'obscurité la FBV provient de différent fluorophores, dont la plupart ne sont pas affectés par la lumière actinique. De plus, il peut y avoir une faible fluorescence non-spécifique provenant du montage lui-même. Cette fluorescence à l'obscurité reste la même en présence de lumière actinique, et la FBV à la lumière est donc la somme de cette fluorescence à l'obscurité et de la fluorescence photo-induite provenant de NADPH. Pour que les résultats des déclins de fluorescence à la lumière reflètent, au moins dans une large part, les caractéristiques temporelles de la FBV photo-induite, il était nécessaire que l'intensité de cette fluorescence photo-induite soit substantielle comparée à la FBV à l'obscurité. Pour 103

108 déterminer l'échantillon le mieux approprié à l'analyse résolue en temps, nous avons comparé les variations photo-induites de FBV sur feuille, mésophylle et chloroplastes de pois (Fig. III.3). Il est sûr que les feuilles et les mésophylles sont des échantillons nettement plus simples à obtenir et moins fragiles que les chloroplastes, mais comme le montre la Fig. III.3 la proportion de FBV photo-induite dans la fluorescence totale est plus faible que dans le cas des chloroplastes. A partir des courbes de la Fig. III.3, on peut calculer le pourcentage que représente l'augmentation photo-induite de FBV par rapport à la FBV totale à la lumière. On trouve environ 5,6 % pour la feuille, 4,9 % pour le mésophylle et 26,6 % pour les chloroplastes. Cette différence entre les trois échantillons s'explique aisément. Elle est due principalement à l'amplitude de la FBV à l'obscurité puisque la variable photo-induite du mésophylle est même supérieure à celle de la feuille et des chloroplastes. Cette FBV à l'obscurité est plus faible pour les chloroplastes car ils Feuille A Mesophylle B Chloroplastes isolés intacts C Fluorescence bleue (u.r.) Temps (s) Temps (s) Temps (s) Figure III.3 : Comparaison entre les variations photo-induites de FBV d'une feuille (A), d'un mésophylle (B) et de chloroplastes isolés intacts (C) de pois. La feuille a été mesurée coté abaxiale. Les chloroplastes étaient en solution dans le milieu général à une concentration de 40 μg Chl/ml. Les flèches indiquent le moment où la lumière actinique (DFPP : 50 μmol photons m -2 s -1 pour les chloroplastes et 65 μmol photons m -2 s -1 pour la feuille et le mésophylle) a été allumée ou éteinte. Pour la feuille et le mésophylle, les flèches indiquent aussi des changements d'atmosphère dans la chambre de mesure : air ambiant à l'obscurité et azote à la lumière. 104

109 contiennent moins de fluorophores bleus (autre que NADPH) que les feuilles et les mésophylles. Elle est plus importante pour le mésophylle que pour la feuille car l'épiderme des feuilles de pois contient peu de fluorophores mais absorbe les UV de façon conséquente (Shimazaki et al., 1988). La présence d'épiderme diminue l'intensité du faisceau qui excite les fluorophores du mésophylle et la fluorescence diminue. Les variations photo-induites de FBV sur feuille et mésophylle présentées dans la Fig. III.3 sont en fait des variations de FBV entre obscurité/air et lumière/azote. En effet, une atmosphère d'azote bloque, mais de façon totalement réversible, les principales voies de réoxydation du NADPH (photosynthèse, photorespiration, respiration) et on a ainsi une variable un peu plus importante que lors d'une simple transition obscurité-lumière. L'utilisation de chloroplastes isolés pour étudier et caractériser l'augmentation photoinduite de FBV a un autre intérêt, celui de travailler avec des échantillons physiologiquement plus simples (cela élimine notamment les interactions entre chloroplastes et mitochondries), et sur lesquels nous avons des possibilités de contrôle importantes par la maîtrise du milieu extérieur. Cependant, bien que largement plus important avec des chloroplastes isolés qu'avec des feuilles ou des mésophylles, le rapport entre l'augmentation photo-induite de FBV et la FBV totale à la lumière reste insuffisant pour faire une analyse résolue en temps correcte de cette fluorescence variable. D'autre part, la Fig. III.3 montre clairement qu'il est possible, avec un montage suffisamment sensible, d'observer une augmentation photo-induite de FBV et donc la fluorescence du NADPH sur des mésophylles et des feuilles. Il faut noter cependant qu'il s'agit d'une feuille de pois qui a été cultivée en chambre de culture sous une lumière qui ne contenait pas d'uv. Les feuilles de pois ont une FBV faible (Fig. I.6, p. 18) par rapport aux autres espèces, notamment parce qu'elles ne contiennent pas d'acide férulique (Bate- Smith, 1962). De plus, une culture sans UV conduit à une synthèse nettement moins importante, qu'en lumière naturelle, des composés aromatiques qui absorbent le rayonnement UV et protègent les chloroplastes de ces photons d'énergie élevée (Stober et Lichtenthaler, 1993). La mesure de la fluorescence du NADPH est beaucoup plus difficile 105

110 et généralement impossible sur la plupart des espèces cultivées en conditions naturelles. L'utilisation de mésophylles est certainement mieux adaptée pour observer la fluorescence du NADPH, puisque c'est l'épiderme des feuilles qui contient la majorité des composés qui absorbent le rayonnement UV. La Fig. III.3 montre bien d'ailleurs qu'en absolu la variation photo-induite est plus importante sur le mésophylle que sur la feuille. Néanmoins, il n'est pas toujours facile de préparer des mésophylles et assez peu d'espèces le permettent. III.2.3. Chloroplastes intacts et chloroplastes reconstitués Dans un premier temps, nous avons essayé avec des chloroplastes isolés intacts en solution ou déposés sur des filtres de cellulose (chloroplastes sur support solide (Cerovic et al., 1987; Cerovic et al., 1991)) d'augmenter la proportion de FBV variable photoinduite, en faisant varier différents paramètres et constituants du milieu : intensité et durée F/F (%) Concentration de chloroplastes (μg Chl/ml) Figure III.4 : Mesure du pourcentage de FBV photo-induite par rapport à la FBV totale à la lumière en fonction de la concentration en chloroplastes isolés intacts. Les chloroplastes étaient en solution dans le milieu général seul. La lumière actinique avait une DFPP de 50 μmol photons m -2 s

111 de la lumière actinique, teneur en phosphate (KH 2 PO 4 ) et en PGA, présence ou non d'ascorbate et d'atp. Même s'il y a des variations entre ces différentes conditions, aucune ne permet d'accroître significativement la FBV variable obtenue dans les conditions de la Fig. III.3. Le seul paramètre qui donne quelques résultats dans ce sens est la concentration en chloroplastes intacts dans la solution. Comme on le voit Fig. III.4, lorsque la concentration en chloroplastes intacts augmente la proportion de FBV variable photoinduite dans la FBV totale augmente, puis reste constante à partir d'une concentration en chloroplaste au alentour de 60 μg Chl/ml. Plusieurs phénomènes se conjuguent pour expliquer cette courbe. Avec l'augmentation de la concentration en chloroplastes la FBV diminue car l'absorption du faisceau d'excitation par la chlorophylle augmente, la concentration en NADP augmente dans la cuve de mesure et enfin la réabsorption de la FBV par les pigments photosynthétiques augmente, puisque leur concentration augmente. Malheureusement, même aux fortes concentrations en chloroplastes le rapport entre l'augmentation photo-induite de FBV et la FBV totale à la lumière reste insuffisant. Pour surmonter cette difficulté, nous avons opté pour l'utilisation de chloroplastes reconstitués (voir section II ). Les chloroplastes reconstitués sont très similaires aux chloroplastes intacts, mais permettent d'augmenter le rapport stroma/thylakoïdes. Cela se traduit par une augmentation de la FBV photo-induite (Fig. III.5), puisqu'il y a plus de NADP pour la même concentration en Chl (donc environ la même réabsorption de la FBV). Ainsi, en toute logique, la proportion de FBV photo-induite dans la FBV totale à la lumière augmente avec le rapport CE/thylakoïdes utilisé pour préparer les chloroplastes reconstitués. Cependant, étant donné le travail nécessaire pour obtenir le CE, les faibles quantités de CE obtenues à chaque isolation et la quantité importante utilisée pour chaque échantillon (la hauteur du faisceau de mesure du spectrofluorimètre implique un volume d'échantillon de 2,7 ml), nous avons opté pour l'utilisation de quantité de CE correspondant à un rapport stroma/thylakoïdes 11 fois supérieur à ce qu'il est dans les chloroplastes intacts. Dans ces conditions la FBV photo-induite des chloroplastes reconstitués représente environ la moitié de leur FBV totale à la lumière (Fig. III.5). 107

112 Fluorescence (u.r.) Chloroplastes reconstitués 500 Chloroplastes intacts lumière obscurité Temps (s) Figure III.5 : Fluorescence bleue de chloroplastes intacts et reconstitués lors d'une transition obscurité-lumière. Mesures effectuées sur le spectrofluorimètre à une longueur d'onde d'excitation de 350 nm (chloroplastes intacts) ou 340 nm (chloroplastes reconstitués), et à une longueur d'onde d'émission de 458 nm. Les chloroplastes intacts (50 μg Chl/ml) sont en solution dans un milieu général contenant 10 mm KHCO 3 et 0,2 mm KH 2 PO 4. Les flèches indiquent le moment ou la lumière actinique (DFPP : 50 μmol photons m -2 s -1 ) a été allumée ou éteinte. On peut remarquer que sur la Fig. III.5 dans le cas des chloroplastes intacts la FBV photo-induite représente environ 1/3 de la FBV totale à la lumière, ce qui est légèrement supérieur à la proportion obtenue précédemment (Fig. III.4). Cette dernière mesure a été effectuée sur le spectrofluorimètre, et est d'ailleurs plus importante pour nous puisque c'est sur ce montage que nous avons réalisé les déclins de fluorescence nécessaires à l'analyse résolue en temps, tandis que la mesure de la Fig. III.4 a été réalisée sur le fluorimètre impulsionnel. Cette différence s'explique pour deux raisons. Premièrement, sur le fluorimètre impulsionnel il y a une FBV parasite importante provenant du montage luimême que l'on estime, mais qui est peut-être un peu sous évaluée ce qui augmenterait 108

113 artificiellement la FBV à l'obscurité. Deuxièmement, sur le fluorimètre impulsionnel la FBV est mesurée avec une bande spectrale relativement large, tandis qu'elle est beaucoup plus étroite dans le cas de la Fig. III.5 et qu'elle est centrée sur le maximum d'émission du NADPH, donc là où la FBV photo-induite est la plus importante. III.3. Analyse spectrale et résolue en temps des variations photo-induites de la fluorescence bleu-verte dans les chloroplastes reconstitués III.3.1. Analyse temporelle au maximum d'excitation et d'émission du NADPH Plusieurs composantes temporelles sont nécessaires pour décrire les déclins de fluorescence réalisés sur chloroplastes reconstitués. Avec la méthode des moindres carrés le nombre de composantes est un paramètre fixé au début de l'analyse par l'utilisateur, et c'est en augmentant progressivement ce paramètre que l'on détermine le bon nombre de composantes. Dans le cas des chloroplastes reconstitués nous avons trouvé qu'il fallait cinq composantes temporelles, mais l'utilisation de quatre composantes donne aussi de très bons résultats, à peine moins bon qu'avec cinq composantes, il était donc difficile de trancher entre les deux. Pour vérifier la présence de cinq composantes temporelles, nous avons utilisé une méthode indépendante : la méthode du maximum d'entropie. Avec cette méthode le nombre de composantes est un paramètre libre, déterminé automatiquement au cours de l'analyse. Nous avons analysé une partie des déclins de fluorescence avec la méthode du maximum d'entropie (déclins à l'obscurité enregistrés avec une longueur d'onde d'excitation comprise entre 340 et 350 nm, et une longueur d'onde d'émission de 456 nm), et nous avons obtenu les résultats présentés Table III.1, qui confirment bien la présence de cinq composantes. Ces résultats sont très proches de ceux obtenus par la méthode des moindres carrés (Table III.1). Il y a bien sûr quelques différences, notamment les valeurs des coefficients pré-exponentiels relatifs, mais elles ne sont pas vraiment significatives. 109

114 Table III.1 : Comparaison de l'analyse résolue en temps de la fluorescence bleue de chloroplastes reconstitués à l'obscurité par la méthode des moindres carrés et par la méthode du maximum d'entropie. Moyennes et écarts types correspondants (entre parenthèses) obtenus à partir de l'analyse de 5 déclins de fluorescence par la méthode du maximum d'entropie, et à partir de l'analyse globale de 9 déclins de fluorescence par la méthode des moindres carrés. Longueur d'onde d'excitation comprise entre 340 et 350 nm. Longueur d'onde d'émission : 456 nm. n i et i sont respectivement le temps de vie de fluorescence et le facteur pré-exponentiel relatif ( i = 1) de la i=1 n n composante i. Le temps de vie moyen m est défini par m = i 2 i / i i i=1 i=1 Moindres carrés (global) Maximu m Composantes temporelles Temps très courte C1 courte C2 moyenne C3 longue C4 très longue C5 de vie moyen (ns) (%) (ns) (%) (ns) (%) (ns) (%) (ns) (%) m (ns) 0,17 53,7 0,64 25,5 1,5 14,9 4,0 4,9 11 1,0 (8,1) (5,8) (3,2) (1,0) (0,4) 0,19 56,5 0,71 (0,04) (4,9) (0,05) 27,8 1,7 11,2 4,4 (5,1) (0,4) (3,3) (0,4) 3,7 12 0,8 (0,9) (2) (0,4) 3,16 (0,46) 3,05 (0,35) Etant donnée la complexité de la FBV des chloroplastes, qui provient de différents fluorophores, il est raisonnable de considérer que chacune des cinq composantes provient des contributions de différents fluorophores. Ainsi, on peut dire que chaque composante temporelle représente une famille de fluorophores ayant des temps de vie voisins. Il n'est donc pas possible d'assigner à une composante temporelle un fluorophore particulier. Cependant, lorsque le(s) temps de vie d'un fluorophore est (sont) connu(s) par ailleurs, on peut dire à quelle(s) composante(s) il participe. Fort de ces considérations, on peut comparer les temps de vie et les contributions relatives de ces cinq composantes pour des échantillons différents ou dans différentes conditions physiologiques. Pour obtenir les caractéristiques temporelles de la FBV photo-induite des chloroplastes reconstitués nous avons réalisé des déclins de fluorescence à l'obscurité et à la lumière. Notre première préoccupation concerne l'éventuelle variation du temps de vie de chacune des composantes entre ces deux conditions. Nous avons donc analysé 110

115 séparément les déclins à l'obscurité et ceux à la lumière, et comparé les temps de vie obtenus (Table III.2). On constate que les différences sont très faibles, la plus notable concerne le temps de vie 2, mais dans tous les cas la différence n'est pas significative et on peut donc considérer que le temps de vie de chaque composante est le même à l'obscurité et à la lumière. Cela permet d'analyser simultanément en analyse globale, donc avec les mêmes temps de vie, les déclins à l'obscurité et ceux à la lumière. Les variations des intensités relatives entre ces deux conditions ne sont alors plus déformées par les petites variations non significatives des temps de vie. Table III.2 : Comparaison des temps de vie ( i ) de la fluorescence bleue des chloroplastes reconstitués entre l'obscurité et la lumière. Résultats obtenus par analyse globale de 9 déclins de fluorescence dans chacune des deux conditions. Les déclins ont été réalisés par paires (un déclin à l'obscurité immédiatement suivi d'un déclin à la lumière) sur plusieurs échantillons. Longueur d'onde d'excitation comprise entre 340 et 350 nm. Longueur d'onde d'émission : 456 nm. Lumière actinique : DFPP = 50 μmol photons m -2 s -1. très court 1 (ns) court 2 (ns) Temps de vie de fluorescence moyen 3 (ns) long 4 (ns) très long 5 (ns) Obscurité 0,17 0,64 1,46 3,96 11,27 Lumière 0,16 0,56 1,51 4,04 11,28 Sur la Fig. III.6 est présentée la répartition de la FBV des chloroplastes reconstitués entre les cinq composantes temporelles à l'obscurité et à la lumière. On constate que les quatre premières composantes (C1, C2, C3, C4) sont impliquées dans la variation photo-induite de FBV, tandis que la composante très longue (C5) ne l'est pas du tout. Ainsi, la fluorescence de NADPH, qui est responsable de cette variation photoinduite, participe aux composantes C1, C2, C3 et C4. Le NAD(P)H, aussi bien libre que lié aux protéines, a plusieurs temps de vie de fluorescence. Les résultats de l'analyse résolue en temps de la fluorescence du NADPH libre obtenus avec notre spectrofluorimètre sont repris Table III.3. On en déduit que le NADPH libre participe à la composante très courte (C1) et à la composante courte (C2). D'après la littérature il y a 111

116 Obscurité Lumière 1 8 Fluorescence (u.r.) C1 très courte (0.16 ns) C2 courte (0.52 ns) C3 moyenne (1.3 ns) C4 longue (3.8 ns) C5 très longue (11 ns) Figure III.6 : Répartition de la fluorescence bleue des chloroplastes reconstitués entre les cinq composantes temporelles, à l'obscurité et à la lumière. Les caractéristiques temporelles de la fluorescence ont été obtenues par analyse globale de 18 déclins de fluorescence (9 à l'obscurité et 9 à la lumière) et les barres d'erreur sont les écarts types calculés sur les 9 déclins dans chacune des deux conditions. Longueur d'onde d'excitation : entre 340 et 350 nm. Longueur d'onde d'émission : 456 nm. Lumière actinique : DFPP = 50 μmol photons m -2 s essentiellement deux temps de vie de fluorescence pour NAD(P)H lié aux protéines : un aux alentours de 1-2 ns et l'autre aux alentours de 3-6 ns (voir section I ). On en déduit que le NADPH lié participe à la composante moyenne (C3) et à la composante longue (C4). Il est certain que la réduction de NADP + en NADPH par la photosynthèse à la lumière joue un rôle prépondérant dans l'augmentation photo-induite de FBV dans les 112

117 Table III.3 : Caractéristiques temporelles de la fluorescence bleue des chloroplastes reconstitués et de NADPH. Moyennes et écarts types correspondants (entre parenthèses) obtenus à partir de 8 ou 9 déclins de fluorescence. Résultats de l'analyse globale de 8 déclins pour NADPH et de 18 déclins (9 à l'obscurité et 9 à la lumière) pour les chloroplastes reconstitués. Une solution de NADPH (10 μm) dans le milieu général a été utilisée pour les mesures sur le cofacteur seul. Longueur d'onde d'émission : 456 nm. Longueur d'onde d'excitation : 340 nm pour NADPH et comprise entre 340 et 350 nm pour les chloroplastes reconstitués. Lumière actinique : DFPP = 50 μmol photons m - 2 s -1. i et f i sont respectivement le temps de vie de fluorescence et la contribution relative à la fluorescence totale de la n composante i. f i est définie par f i = i i / i i, on rappelle que les i sont les facteurs pré-exponentiels relatifs. Le i=1 n n n temps de vie moyen m est défini par m = f i i = i 2 i / i i i=1 i=1 i=1 très courte C1 courte C2 Composantes temporelles moyenne C3 longue C4 très longue C5 Temps de vie moyen (ns) f (%) (ns) f (%) (ns) f (%) (ns) f (%) (ns) f (%) m (ns) NADPH 0,15 43,1 (0,4) 0,53 54,3 (0,4) 2,9 2,6 (0,1) Chloroplaste s 0,16 0,52 1,3 3,8 11 Obscurité 9,7 18,6 31,2 25,3 (2,9) (4,2) (2,7) (2,0) Lumière 12,1 22,5 31,9 24,7 (1,2) (5,5) (2,1) (2,2) 15,2 (3,9) 8,8 (2,8) 0,43 3,15 (0,46) 2,46 (0,37) chloroplastes. Mais, étant donné que le rendement de fluorescence du NADPH augmente lorsqu'il se lie à des protéines, une augmentation photo-induite du rapport NADPH lié sur NADPH libre contribuerait aussi à l'augmentation photo-induite de FBV dans les chloroplastes. Si c'était le cas, nous devrions observer à la lumière une augmentation du temps de vie de fluorescence moyen et surtout une augmentation des intensités relatives des composantes C3 et C4 au détriment des composantes C1 et C2. Cependant, comme le montre la Table III.3, il n'y a pas de variations significatives des intensités relatives des quatre premières composantes (C1 à C4). Cela est encore plus net lorsqu'on regarde les 113

118 Table III.4 : Contributions relatives à la fluorescence totale des quatre premières composantes (C1, C2, C3, C4) recalculés à partir des résultats de la Table III.3 en ne tenant compte que de la fluorescence de ces quatre premières composantes. Les écarts types correspondants (entre parenthèses) ont été multipliés par le même facteur. Contributions relatives recalculées composante composante composante composante très courte f 1 (%) courte f 2 (%) moyenne f 3 (%) longue f 4 (%) Obscurité 11,5 21,9 36,8 29,8 (3,4) (4,9) (3,2) (2,3) Lumière 13,3 24,6 35,0 27,1 (1,3) (6,0) (2,3) (2,4) intensités relatives de ces quatre premières composantes recalculées après élimination de la contribution de la composante C5, à laquelle la fluorescence de NADPH ne participe pas (Table III.4). La baisse du temps de vie moyen à la lumière vient du fait que l'intensité de fluorescence de la composante C5 à la lumière reste la même qu'à l'obscurité tandis que celle des quatre autres composantes augmente, ce qui se traduit par une baisse de la contribution relative de la composante C5. On conclut qu'il n'y a pas de variation photoinduite significative de la proportion de NADPH lié dans les chloroplastes reconstitués, et donc, que l'augmentation photo-induite de FBV est due en totalité à la réduction du NADP par la photosynthèse. III.3.2. Spectre d'excitation résolu en temps Nous avons réalisé un spectre d'excitation RT (résolu en temps) de la FBV des chloroplastes reconstitués à l'obscurité et à la lumière (Fig. III.7). Le spectre de la fluorescence totale montre deux pics : un pic important à 286 nm et un pic autour de 340 nm, correspondant au maximum d'excitation du NADPH et qui est nettement plus important à la lumière qu'à l'obscurité. Le pic à 286 nm est situé au maximum d'excitation 114

119 des protéines (Wolfbeis, 1985). Il y a une quantité importante de protéines dans les chloroplastes (environ 15 mg de protéines par mg Chl (Lawlor, 1993)), ainsi la contribution de la queue de l'émission de fluorescence des protéines à 456 nm est encore importante et explique l'importance de ce pic. La Fig. III.8 montre cette queue de l'émission des protéines dans le cas de la Rubisco, qui est la principale protéine des 200 obscurité lumière Fluorescence totale C1 composante très courte 0.10 ns Fluorescence (u.r.) C2 composante courte 0.64 ns C3 composante moyenne 2.1 ns Fluorescence (u.r.) C4 composante longue 5.6 ns obscurité lumière C5 composante très longue 11 ns Longueur d'onde (nm) Figure III.7 : Spectre d'excitation RT de chloroplastes reconstitués à l'obscurité et à la lumière. DFPP de la lumière actinique 50 μmol photons m -2 s -1. Longueur d'onde d'émission : 456 nm. 115

120 Fluorescence (u.r.) Longueur d'onde (nm) Figure III.8 : Spectre d'émission de fluorescence de la Rubisco. Concentration de la Rubisco (sites actifs) : 148 μm. Longueur d'onde d'excitation : 280 nm. chloroplastes (50 % du total des protéines solubles dans les feuilles vertes (Hartman et Harpel, 1994), et donc encore plus dans les chloroplastes). De plus, ce sont les composantes C3 et C4 qui sont très majoritairement à l'origine du pic à 286 nm (Fig. III.7) et leurs temps de vie sont en accords avec une origine protéique pour ce pic. On le vérifie en comparant les paramètres temporels de la fluorescence des chloroplastes reconstitués excités dans la bande d'absorption des protéines et de deux protéines isolées parmi les plus présentes dans les chloroplastes FNR et Rubisco (Table III.5). A ces longueurs d'onde d'excitation on obtient une très bonne analyse résolue en temps de la fluorescence des chloroplastes reconstitués avec seulement trois composantes. Les trois temps de vie ainsi obtenus sont proches de ceux de la FNR et de la Rubisco isolées. Cependant, les composantes sont loin d'être identiques, sans doute à cause de la contribution faible mais significative d'un (ou plusieurs) fluorophore(s) à ce pic (entre autres NADPH, voir section III ). 116

121 Table III.5 : Caractéristiques temporelles de la fluorescence de la FNR, de la Rubisco et des chloroplastes reconstitués excitée dans la bande d'absorption des protéines. Moyennes et écarts types correspondants (entre parenthèses, si disponibles) obtenus à partir de 10 (chloroplastes reconstitués) ou 6 (FNR) déclins de fluorescence. Résultats d'une analyse globale réalisée dans chaque cas. La FNR (12 μm) et la Rubisco (58 μm sites actifs) étaient en solution dans le milieu général. Longueur Longueur Composantes temporelles Temps d'onde d'excitation d'onde d'émission courte C'1 moyenne C'2 longue C'3 de vie moyen (nm) (nm) (ns) f (%) (ns) f (%) (ns) f (%) m (ns) Chloroplaste s reconstitués ,56 6,2 (1,2) 2,6 33,3 (2,2) 6,5 60,5 (2,8) 4,8 (0,1) FNR ,46 12,2 2,1 64,3 5,7 23,5 2,7 (0,4) (0,5) (0,2) Rubisco ,49 13,2 2,0 44,5 4,7 42,3 2,9 Les temps de vie des cinq composantes du spectre RT (Fig. III.7) sont un peu différents de ceux obtenus lors de l analyse temporelle à longueurs d'ondes fixes (Table III.3). C'est la conséquence de l'analyse globale de tous les déclins du spectre. En effet, les temps de vie de fluorescence ne sont pas exactement les mêmes à toutes les longueurs d'onde d'excitation (comparer par exemple les Tables III.3 et III.5), à cause de la présence de différents fluorophores, notamment les protéines aux courtes longueurs d'onde. En soustrayant le spectre RT à l'obscurité de celui à la lumière, on obtient le spectre d'excitation RT de la variation photo-induite de FBV des chloroplastes reconstitués (Fig. III.9). Le spectre de différence de la fluorescence totale possède deux pics, un à 340 nm qui correspond au maximum d'excitation de NADPH et un à 286 nm. Ce pic à 286 nm peut s'expliquer par un transfert d'énergie des protéines vers NADPH (voir plus bas, section III ). Les différentes contributions des cinq composantes au pic à 340 nm sont tout à fait en accord avec les résultats de l'analyse temporelle à longueurs d'ondes fixes (Fig. III.6). La composante très longue (C5) ne montre aucune participation significative à la variation photo-induite de FBV sur l'ensemble du spectre, ce qui confirme la non-participation de la fluorescence du NADPH à cette composante. Les composantes C1 et C2 ne participent pas au pic à 286 nm, qui provient uniquement 117

122 Fluorescence totale (lum. - obsc.) C1 composante très courte 0.10 ns Fluorescence (u.r.) C2 composante courte 0.64 ns C3 composante moyenne 2.1 ns Fluorescence (u.r.) C4 composante longue 5.6 ns C5 composante très longue 11 ns Longueur d'onde (nm) Figure III.9 : Spectre d'excitation RT de la variation photo-induite de fluorescence des chloroplastes reconstitués. Obtenu à partir des spectre d'excitation RT présentés Fig. III.7 en soustrayant le spectre à l'obscurité de celui à la lumière pour chaque composante. des composantes C3 et C4. Cependant, on pourrait s'attendre à une contribution des deux composantes courtes (C1 et C2) dans la partie courtes longueurs d'onde avec un maximum vers 260 nm. En effet, la fluorescence du NADPH libre participe à ces deux composantes et NAD(P)H libre en solution aqueuse possède un maximum d'excitation à 260 nm (Fig. I.11, p. 30). Seule une très faible augmentation peut être observée vers 260 nm pour la 118

123 composante C2 sur la Fig. III.9. En fait, cette absence d'un pic à 260 nm n'est pas surprenante puisque dans les suspensions de chloroplastes de nombreux composés absorbent à 260 nm, notamment les protéines qui représentent environ 60 % de la masse sèche des chloroplastes intacts (Lawlor, 1993), et font ainsi écran à l'excitation du NADPH à 260 nm. III Transfert d'énergie des protéines vers NADPH La présence d'un transfert d'énergie entre les protéines et NADPH est nécessaire pour expliquer le pic à 286 nm du spectre de différence (Fig. III.9). En effet, puisqu'il s'agit d'un spectre de différence entre lumière et obscurité, NADPH est le seul fluorophore impliqué dans ce spectre, mais il ne possède pas de pic d'absorption à 286 nm. Par ailleurs, ce pic ne peut pas être le pic d'excitation à 260 nm du NADPH libre, déplacé vers de plus grandes longueurs d'onde pour une raison inconnue, puisqu'il n'apparaît pas dans le spectre de différence des composantes C1 et C2. Ce pic à 286 nm correspond à l'absorption des protéines et plus précisément au maximum des résidus tryptophane (Trp) (Wolfbeis, 1985). Ce transfert a donc très probablement lieu entre les résidus Trp et NADPH. Ce transfert d'énergie peut être de type non-radiatif, transfert d'énergie par résonance de type Förster (pour une description théorique voir par exemple Turro, 1967; Stryer, 1978; van Grondelle et Amesz, 1986; Valeur, 1993), ou de type radiatif, NADPH réabsorbant la fluorescence émise par les protéines à 350 nm, ou un mélange de ces deux types. Un transfert d'énergie de type Förster implique notamment une distance très courte entre le donneur et l'accepteur (au maximum environ 80 Å (Valeur, 1993)), il ne peut donc se produire que vers NAD(P)H lié. Ce type de transfert est connu pour se produire entre résidus Trp et NAD(P)H lié (Velick, 1961), il a été observé avec plusieurs protéines (Harvey et al., 1972; Brochon et al., 1976; Torikata et al., 1979; Kierdaszuk et al., 1996), et même utilisé pour déterminer des distances dans les protéines (Li et Lin, 1996). Un éventuel transfert radiatif ferait intervenir aussi principalement les résidus Trp, puisque la fluorescence des autres acides 119

124 aminés est généralement négligeable devant celle des Trp (Wolfbeis, 1985). Un recouvrement entre le spectre d'émission du donneur et le spectre d'absorption de l'accepteur est nécessaire pour ces deux types de transfert, dans le cas d'un transfert des Trp vers NAD(P)H ce recouvrement est très bon. Grâce au temps de vie de fluorescence on peut espérer différentier ces deux types de transfert. Le transfert non-radiatif est une des voies de désexcitation de l'état excité du donneur et il est donc en compétition avec les autres voies de désexcitation de cet état excité, notamment la fluorescence. Ainsi pour être réellement efficace (et donc non négligeable) ce transfert doit être plus rapide que la fluorescence (temps de vie moyen autour de 2,8 ns, Table III.5). Dans le cas d'un transfert radiatif, l'émission de fluorescence par le donneur est suivie par une réabsorption et une ré-émission par l'accepteur, le temps de vie de fluorescence est donc la somme des temps de vie du donneur (Trp) et de l'accepteur (NADPH). On en déduit que dans le cas de la composante C3 son temps de vie (2,1 ns) est trop court pour que son pic à 286 nm provienne d'un transfert radiatif. Ainsi une partie au moins du transfert entre les protéines et NADPH est de type non-radiatif. Le pic à 340 nm dans le spectre de différence de la composante C4 nous indique qu'une partie du NADPH lié aux protéines fluoresce avec un temps de vie long (5,6 ns). Donc très vraisemblablement le transfert d'énergie non-radiatif est responsable d'au moins une partie du pic à 286 nm de la composante C4. On voit très bien (Fig. III.9) que les rapports entre les pics à 286 et à 340 nm sont nettement différents pour les composantes C3 et C4, ce qui semble incompatible avec un transfert d'énergie de type non-radiatif seulement. En effet, pour chacune des composantes C3 ou C4 les molécules de NADPH excitées directement (à 340 nm) ou par un transfert d'énergie par résonance (à 286 nm) devraient être les mêmes, puisque ce transfert est rapide et que le temps de vie de fluorescence, même s'il y a eu transfert, est principalement celui du NADPH lié. Or, dans le cas de la composante C3, où seul le transfert non-radiatif est impliqué, le rendement de fluorescence dans le spectre de différence est quasiment identique lorsqu'il y a eu transfert (pic à 286 nm) et lorsque l'excitation est directe (pic à 340 nm). Ainsi, dans le cas de la composante C4, les deux pics (286 et 340 nm) devraient avoir à peu près la même hauteur si seul le transfert non-radiatif intervenait. Au contraire, 120

125 le pic à 286 nm est largement plus grand que celui à 340 nm, ce qui indique la participation du transfert radiatif, qui est envisageable ici puisque le temps de vie de la composante C4 est suffisamment long. Avec le transfert radiatif, l'accepteur peut être aussi bien le NADPH libre que le NADPH lié, ainsi, après transfert la fluorescence du NADPH libre participe à la composante C4 à cause du temps de vie de fluorescence des protéines, mais sous excitation directe elle se retrouve dans les composantes C1 et C2 et ne participe donc pas au pic à 340 nm de la composante C4. La présence d'un transfert d'énergie par résonance entre les protéines et le NADPH lié dans les composantes C3 et C4 apporte la confirmation que la fluorescence du NADPH lié se retrouve dans ces deux composantes. On confirme ainsi la conclusion obtenue avec l'analyse temporelle à longueurs d'onde fixes (Table III.3) qu'il n'y a pas de variation photo-induite significative du rapport NADPH lié sur NADPH libre dans les chloroplastes reconstitués, et donc, que l'augmentation photo-induite de FBV est due en totalité à la réduction du NADP par la photosynthèse. III.3.3. Spectre d'émission résolu en temps. Le spectre d'émission RT de la FBV des chloroplastes reconstitués a été réalisé à l'obscurité et à la lumière (Fig. III.10). Les temps de vie de fluorescence des cinq composantes sont quasiment les mêmes que ceux obtenus avec l'analyse temporelle à longueurs d'onde fixes (Table III.3). Il n'y a donc pas de fluorophore émettant fortement dans le reste du spectre (partie verte) avec un temps de vie très différent de ceux obtenus à 456 nm. Les spectres de fluorescence totale à l'obscurité et à la lumière sont clairement différents. Cela est dû au fait que l'augmentation photo-induite de FBV est plus importante dans le bleu que dans le vert. C'est la conséquence directe du maximum d'émission de la fluorescence bleue de NAD(P)H : 460 nm pour NADPH libre et autour de 440 nm pour NAD(P)H lié aux protéines. Cependant, il y a un pic important vers 520 nm, aussi bien à l'obscurité qu'à la lumière. L'explication avancée jusqu'à présent était que ce pic soit la 121

126 Fluorescence totale C1 composante très courte 0.10 ns obscurité lumière Fluorescence (u.r.) C2 composante courte 0.47 ns C3 composante moyenne 1.4 ns Fluorescence (u.r.) C4 composante longue 3.8 ns C5 composante très longue 10 ns obscurité lumière Longueur d'onde (nm) Figure III.10 : Spectre d'émission RT de chloroplastes reconstitués à l'obscurité et à la lumière. DFPP de la lumière actinique : 50 μmol photons m -2 s -1. Longueur d'onde d'excitation : 350 nm. conséquence de la réabsorption de la FBV par les pigments photosynthétiques (Cerovic et al., 1998), qui est plus grande dans la partie bleue que dans la partie verte. Cependant, il semble que la réabsorption ne soit pas la seule raison de la présence de ce pic vert. En effet, les spectres d'émission de la composante C4 (Fig. III.10) possèdent un pic important vers 530 nm, indiquant la participation d'autres 122

127 fluorophores dans la partie verte du spectre. Ce sont très vraisemblablement des flavines car les caractéristiques de la fluorescence responsable du pic à 530 nm de la composante C4 sont tout à fait comparables à celles des flavines. Les flavines ont un maximum d'absorption vers 370 nm, mais absorbent encore bien à 350 nm (Fig. I.13, p. 35). La position du maximum d'émission (530 nm) correspond parfaitement à celui des flavines. Le temps de vie de la composante C4 (3,8 ns) est compatible avec celui des flavines. D'autant plus que le temps de vie de fluorescence des flavines dépend de l'environnement moléculaire. Ainsi un temps de vie de fluorescence proche de celui de la composante C4 a déjà été observé pour des flavoprotéines (Pollock et Lipson, 1985) et du FAD libre (Cerovic et al., 1994). De plus, le FAD lié à la FNR à un temps de vie de 3,9 ns pour 88 % de sa fluorescence (Table III.14, p. 168). Par ailleurs, nous avons réalisé une analyse Obscurité Lumière Fluorescence (u.r.) composante moyenne (C"1) composante longue (C"2) ns 3.9 ns Figure III.11 : Répartition de la fluorescence verte excitée dans le bleu de chloroplastes reconstitués entre deux composantes temporelles, à l'obscurité et à la lumière. Longueur d'onde d'excitation : 450 nm. Longueur d'onde d'émission : 550 nm. Les caractéristiques temporelles de la fluorescence ont été obtenues par déconvolution globale de 12 déclins de fluorescence (6 à l'obscurité et 6 à la lumière) et les barres d'erreur sont les écarts types calculés sur les 6 déclins dans chacune des deux conditions. Lumière actinique : DFPP = 50 μmol photons m -2 s

128 résolue en temps de la fluorescence des chloroplastes reconstitués à l'obscurité et à la lumière à une combinaison de longueurs d'onde d'excitation/émission (450/550 nm) qui favorise la fluorescence des flavines (Fig. III.11). Etant donné que les flavines sont fluorescentes dans leur état oxydé et non-fluorescentes dans leur état réduit, on s'attend à une baisse de la fluorescence des flavines lors des transitions obscurité-lumière, vu l'état réduit des chloroplastes à la lumière. C'est effectivement ce que l'on observe sur des chloroplastes reconstitués lorsque l'on regarde plus spécifiquement la fluorescence des flavines (Fig. III.12). Cette diminution photo-induite de fluorescence est faible et notamment bien plus petite que l'augmentation photo-induite de fluorescence due au NADPH (Fig. III.5). Si cette diminution n'est pas négligeable dans les conditions de la Fig. III.12, il est clair que son influence sur la variation photo-induite de FBV excitée dans l'uv est minime voir négligeable, ce que l'on vérifie plus loin. La Fig. III.11 nous montre que la composante longue (C''2) baisse nettement à la lumière, contrairement à la Fluorescence (u.r.) lumière obscurité Temps (s) Figure III.12 : Fluorescence verte excitée dans le bleu de chloroplastes reconstitués lors d'une transition obscurité-lumière. Mesures effectuées sur le spectrofluorimètre à une longueur d'onde d'excitation de 450 nm et à une longueur d'onde d'émission de 550 nm. Les flèches indiquent le moment ou la lumière actinique (DFPP : 50 μmol photons m -2 s -1 ) a été allumée ou éteinte. 124

129 composante C''1 qui n'est pas affectée de façon significative. On en déduit que les flavines participent à la FBV des chloroplastes reconstitués et que la principale composante, si ce n'est pas la seule, de cette fluorescence à un temps de vie de fluorescence autour de 3.9 ns Fluorescence totale (lum. - obsc.) NADPH C1 composante très courte 0.10 ns Fluorescence (u.r.) C2 composante courte 0.47 ns C3 composante moyenne 1.4 ns Fluorescence (u.r.) C4 composante longue 3.8 ns 450 C5 composante très longue 10 ns Longueur d'onde (nm) Figure III.13 : Spectre d'émission RT de la variation photo-induite de fluorescence des chloroplastes reconstitués. Obtenu à partir des spectre d'excitation RT présentés Fig. III.10 en soustrayant le spectre à l'obscurité de celui à la lumière pour chaque composante. Le spectre d'émission normalisé d'une solution de NADPH (10 μm) dans le milieu général est aussi représenté (pointillés). 125

130 Comme pour le spectre d'excitation, en faisant la différence des spectres d'émission RT à la lumière et à l'obscurité, on obtient le spectre d'émission RT de la variation photoinduite de FBV des chloroplastes reconstitués (Fig. III.13). Cependant, le problème de la distorsion des spectres d'émissions due à la réabsorption par les pigments photosynthétiques est bien sûr toujours présent dans les spectres de différence. Ainsi, on obtient bien un spectre de fluorescence totale très proche, dans sa forme générale, du spectre d'émission de NADPH, mais il y a des différences très nettes, notamment vers 490 nm, qui résultent de la réabsorption par les pigments photosynthétiques. Les spectres des composantes temporelles sont aussi déformés par la réabsorption, mais le spectre des quatre premières composantes (C1 à C4) ressemble bien au spectre de NADPH, bien qu'il soit difficile d'être totalement affirmatif étant donné l'importance du bruit. Par ailleurs, pour les spectres des composantes C3 et C4 le maximum semble être déplacé vers les courtes longueurs d'onde par rapport au cas des composantes C1 et C2. Ce qui est totalement en accord avec les résultats précédents, qui montrent que le NADPH libre participe aux composantes C1 et C2 et le NADPH lié aux composantes C3 et C4, puisque la liaison de NAD(P)H avec les protéines conduit à un décalage de son maximum d'émission d'environ 20 nm vers les courtes longueurs d'onde. III.4. Analyse spectrale et résolue en temps des variations photo-induites de la fluorescence bleu-verte dans les chloroplastes intacts III.4.1. Analyse temporelle aux maxima d'excitation et d'émission du NADPH et spectre d'excitation résolu en temps En se basant sur l'expérience acquise et les résultats obtenus avec les chloroplastes reconstitués, nous avons pu réaliser l'analyse résolue en temps de la petite variation photoinduite de FBV des chloroplastes intacts. En effet, avec les chloroplastes intacts, la FBV variable photo-induite est trop faible pour déduire que l'obtention de temps de vie de 126

131 fluorescence identiques à l'obscurité et à la lumière provient bien d'une non-variation photo-induite de ces paramètres, et non pas que cette variation soit indétectable à cause de la trop faible amplitude de l'augmentation photo-induite de FBV par rapport au niveau de FBV à l'obscurité. Ainsi, comme dans le cas des chloroplastes reconstitués, nous avons réalisé sur les chloroplastes intacts une analyse globale, avec les mêmes temps de vie, des déclins à l'obscurité et à la lumière. Les déclins de fluorescence sur chloroplastes intacts étant très similaires à ceux obtenus sur chloroplastes reconstitués, la question du choix entre quatre et cinq composantes temporelles se pose dans les mêmes termes, encore une fois on s'est basé sur les résultats obtenus sur chloroplastes reconstitués pour retenir cinq composantes, ce qui permet, de plus, une bien meilleure comparaison des caractéristiques temporelles de la fluorescence de ces deux types de chloroplastes. Par ailleurs, seuls les chloroplastes reconstitués ont permis une analyse simultanément spectrale et temporelle de la FBV des chloroplastes à l'obscurité et à la lumière. Avec les chloroplastes intacts, une telle analyse s'est avérée impossible, car pour un grand nombre de longueurs d'onde le signal de fluorescence était trop faible (le faisceau de mesure du spectrofluorimètre étant peu intense pour rester non actinique), premièrement par rapport au bruit du photomultiplicateur et deuxièmement en nécessitant pour l'enregistrement de spectre RT un temps trop long pour les chloroplastes isolés intacts. Seul le spectre d'excitation RT à la lumière a pu être enregistré. Par ailleurs, l'enregistrement de déclins de fluorescence sur chloroplastes isolés intacts à la lumière nécessite de maintenir ces chloroplastes dans un état identique et constant pendant plus d'une dizaine de minutes (temps minimal nécessaire à l'enregistrement d'un déclin de fluorescence dans nos conditions), ce qui est possible seulement en maintenant une très faible vitesse d'assimilation du carbone. En effet, lorsqu'ils sont placés dans un environnement approprié, comme c'est généralement le cas, les chloroplastes isolés intacts en solution ont une vitesse d'assimilation du carbone comparable à celles observées in vivo (ex. Sicher et Jensen, 1979; Seftor et Jensen, 1986; Walker et al., 1987), mais seulement pendant un temps assez court (de l'ordre de la minute). La principale raison étant que cette vitesse dépend très étroitement de la 127

132 concentration en phosphate qui ne peut pas être maintenue constante très longtemps dans les solutions de chloroplastes (puisque la quantité est fixe) lorsque la vitesse d'assimilation de carbone, et donc la consommation de phosphate, est importante. Dans ce cas la photosynthèse change donc constamment. La répartition de la fluorescence bleue des chloroplastes intacts entre les cinq composantes temporelles à l'obscurité et à la lumière est présentée Fig. III.14. Les temps de vie de ces cinq composantes sont quasiment identiques à ceux obtenus avec les chloroplastes reconstitués. De plus, les spectres d'excitation RT à la lumière (Fig. III.15 et Obscurité Lumière Fluorescence (u.r.) C1 très courte (0.12 ns) C2 courte (0.58 ns) C3 moyenne (1.4 ns) C4 longue (4.0 ns) C5 très longue (11 ns) 0 Figure III.14 : Répartition de la fluorescence bleue des chloroplastes intacts entre les cinq composantes temporelles, à l'obscurité et à la lumière. Les caractéristiques temporelles de la fluorescence ont été obtenues par déconvolution globale de 12 déclins de fluorescence (6 à l'obscurité et 6 à la lumière) et les barres d'erreur sont les écarts types calculés sur les 6 déclins dans chacune des deux conditions. Longueur d'onde d'excitation : entre 340 et 350 nm. Longueur d'onde d'émission : 458 nm. Lumière actinique : DFPP = 50 μmol photons m -2 s

133 III.7) sont similaires pour ces deux types de chloroplastes, à la fois en ce qui concerne les temps de vie des composantes et en ce qui concerne la forme du spectre de fluorescence totale et celle des spectres des différentes composantes. Tout cela nous confirme que les fluorophores responsables de la fluorescence bleue sont bien les mêmes dans ces deux types de chloroplastes. La seule différence vraiment significative entre les Fig. III.15 et III.7 est le rapport entre les intensités des pics à 290 et à 340 nm, qui est la Fluorescence totale C1 composante très courte 0.12 ns Fluorescence (u.r.) C2 composante courte 0.67 ns C3 composante moyenne 2.2 ns Fluorescence (u.r.) C4 composante longue 5.3 ns C5 composante très longue 11 ns Longueur d'onde (nm) Figure III.15 : Spectre d'excitation RT de chloroplastes intacts à la lumière. DFPP de la lumière actinique 50 μmol photons m -2 s -1. Longueur d'onde d'émission : 458 nm. 129

134 conséquence d'un pic à 340 nm proportionnellement plus grand pour les chloroplastes reconstitués, pour lesquels le rapport entre la concentration en NADPH et celles en Chl et en protéines est plus important. Comme dans le cas des chloroplastes reconstitués, seules les quatre premières composantes (C1 à C4) sont impliquées dans l'augmentation photo-induite de FBV des chloroplastes intacts, la cinquième composante (C5) n'ayant pas de variation photo-induite significative (Fig. III.14). De plus, comme le montre la Table III.6, il n'y a pas de variation significative des intensités relatives des quatre premières composantes entre l'obscurité et la lumière pour les chloroplastes intacts. On confirme ainsi qu'il n'y a pas de changement photo-induit significatif de la proportion de NADPH libre et lié dans les chloroplastes et donc, que l'augmentation photo-induite de FBV dans les chloroplastes provient en totalité de la réduction du NADP par la photosynthèse. Cependant, si la fluorescence de ces deux types de chloroplastes, intacts et reconstitués, présente des temps de vie et un comportement lors des transitions obscuritélumière tout à fait similaires, les différences dans la répartition de cette fluorescence sont assez importantes, comme on peut le voir en comparant les Fig. III.6 et III.14. Il est Table III.6 : Caractéristiques temporelles de la fluorescence bleue des chloroplastes intacts à l'obscurité et à la lumière. Moyennes et écarts types correspondants (entre parenthèses) obtenus à partir de 6 déclins de fluorescence. Résultats de l'analyse globale de 12 déclins (6 à l'obscurité et 6 à la lumière). Longueur d'onde d'émission : 458 nm. Longueur d'onde d'excitation : entre 340 et 350 nm. Lumière actinique : DFPP = 50 μmol photons m -2 s -1. Composantes temporelles Temps très courte C1 courte C2 moyenne C3 longue C4 très longue C5 de vie moyen (ns) f (%) (ns) f (%) (ns) f (%) (ns) f (%) (ns) f (%) m (ns) Chloroplaste s 0,12 0,58 1,4 4,0 11 Obscurité 8,2 (1,4) 15,3 (2,2) 22,7 (1,9) 29,7 (4,6) Lumière 8,8 16,6 22,6 31,7 (1,0) (1,5) (1,5) (3,0) 24,1 (3,2) 20,3 (1,1) 4,19 (0,26) 3,87 (0,10) 130

135 vraisemblable que ces différences proviennent de la concentration en NADPH, qui est plus importante dans les chloroplastes reconstitués, mais surtout de la dilution importante du stroma dans ce type de chloroplastes. Une plus grande concentration en NADPH explique une fluorescence proportionnellement plus faible de la composante C5, à laquelle NADPH ne participe pas, tandis qu'il participe aux quatre autres composantes. III.4.2. Comparaison avec les résultats obtenus sur chloroplastes reconstitués à l'aide d'un modèle estimant la répartition du NADPH entre forme libre et forme liée Pour vérifier l'hypothèse précédente et comparer la répartition du NADPH entre forme libre et formes liées aux principales protéines du chloroplaste, un modèle très simple a été élaboré et utilisé pour les deux types de chloroplastes à l'obscurité et à la lumière III Equations et processus de calcul du modèle Ce modèle est basé sur les équilibres chimiques de complexation de NADPH et NADP + avec les principales protéines capables de lier ce cofacteur dans le chloroplaste. Il n'était évidemment pas possible de tenir compte de toutes les protéines qui lient un tant soit peu NADPH ou NADP + dans les chloroplastes, et seules celles présentant une concentration et/ou une constante de complexation avec NADPH importante ont été considérées. Quatre "compartiments" de protéines ont été utilisés, un pour chacune des deux protéines les plus importantes du chloroplaste en ce qui concerne la liaison de NADPH : FNR et Rubisco; un "compartiment" appelé "autres protéines" qui rassemble les autres protéines qui lient NADP dans les chloroplastes et un "compartiment" pour la NADP-malate-déhydrogénase (MDH), que nous n'avons pas pu intégrer dans "autres protéines", car elle est inactive à l'obscurité et active à la lumière (Issakidis et al., 1994) et que ces deux formes ont une affinité différente pour NADPH et NADP + (Ashton et Hatch, 1983). Bien sûr, les protéines rassemblées dans "autres protéines" n'ont pas les mêmes 131

136 constantes de complexation avec NADP + et NADPH, et nous avons utilisé une valeur moyenne pour ces deux constantes. Cette simplification semble tout à fait raisonnable puisque, le NADPH se liant essentiellement à la FNR et la Rubisco, l'influence de "autres protéines" reste toujours faible. Pour les caractéristiques de "autres protéines" nous nous sommes basés sur les trois principales protéines de ce "compartiment" : NAD(P)- glycéraldéhyde-3-phosphate déhydrogénase (GAPDH), glutathione réductase (GR) et monodéhydroascorbate réductase (MDHAR). De plus, étant donné que NADPH se lie à la Rubisco de façon non-spécifique sur le site de fixation du RuBP (Badger et Lorimer, 1981), il est en compétition pour ce site avec le RuBP. Nous avons donc tenu aussi compte de l'équilibre de complexation de la Rubisco avec le RuBP. Ce qui fait au total quatre "compartiments" protéines et trois ligands (NADPH, NADP + et RuBP). On notera Ei (avec i de 1 à 4) les protéines, Sj (avec j de 1 à 3) les ligands et EiSj les complexes protéine-ligand. On s'intéresse aux équilibres de complexation : E i + S j E i S j (III.1) Chaque équilibre est caractérisé par sa constante de dissociation Kdij et l'équation : K dij = [E i] [S j ] [E i S j ] (III.2) L'objectif est de calculer toutes les concentrations [Ei], [Sj] et [EiSj] lorsque toutes ces espèces sont en équilibre. On dispose en plus des équations de conservation de la matière pour chaque protéine et chaque ligand. Il s'agit donc de résoudre un système de 16 équations (pas toutes linéaires) à 16 inconnues. La résolution de ce système analytiquement ou par une méthode numérique classique (ex. méthode de Newton) est peut-être possible, mais très compliquée et nécessite des temps de calcul important. Nous avons donc opté pour une autre méthode, par itération, qui utilise les caractéristiques particulières de ce système. On part d'un état initial avec [Ei]0 égal à la concentration totale de la protéine i dans le chloroplaste, [Sj]0 égal à la concentration du ligand j dans le 132

137 chloroplaste et [EiSj]0 = 0, pour toutes les valeurs de i et j. Ensuite, à chaque itération les concentrations correspondant à un couple protéine-ligand sont ajustées pour que l'équation caractéristique (III.2) de l'équilibre considéré soit satisfaite. Puis on passe à un autre couple protéine-ligand et on revient au premier lorsque tous les couples ont été traités. Ainsi, à chaque étape les concentrations [Ei]k, [Sj]k et [EiSj]k correspondant à l'équilibre concerné sont calculées à partir de l'équation (III.2) et des précédentes valeurs des concentrations : [Ei]k-1, [Sj]k-1 et [EiSj]k-1. En se basant sur la conservation de la matière et l'équilibre (III.1), on obtient les relations entre les concentrations k et les concentrations k-1 : [Ei]k = [Ei]k-1 - U [Sj]k = [Sj]k-1 - U [EiSj]k = [EiSj]k-1 + U (III.3a) (III.3b) (III.3c) où U est la variation de concentration nécessaire pour atteindre l'état d'équilibre du couple protéine-ligand concerné. En remplaçant les concentrations k grâce aux relations (III.3a,b,c) dans l'équation (III.2), on obtient : U 2 - U K dij + [E i ] k-1 +[S j ] k-1 + [E i ] k-1 [S j ] k-1 - K dij [E i S j ] k-1 = 0 (III.4) Il y a donc potentiellement deux solutions pour U, mais une seule est acceptable. En effet, une des solutions est toujours positive et n'est donc pas compatible avec ce modèle, puisque le signe de U dépend du sens de l'évolution de l'équilibre de complexation et peut donc être positif ou négatif. U est donc donné par : U = 1 2 K dij + [E i ] k-1 +[S j ] k K dij + [E i ] k-1 +[S j ] k [E i ] k-1 [S j ] k-1 - K dij [E i S j ] k-1 (III.5) 133

138 Ce processus itératif se poursuit jusqu'à ce que toutes les équations (III.2) soient satisfaites simultanément avec une erreur négligeable. Plus précisément, jusqu'à ce que la relation [E i ] [S j ] [E i S j ] 1 K dij (III.6) soit satisfaite pour toutes les valeurs possibles de i et j, simultanément. Les calculs ont été réalisés avec le logiciel Mathematica 3.0 (Wolfram Research, Champaign, Illinois, USA). On obtient ainsi la concentration de NADPH libre et lié aux différentes protéines en fonction des paramètres d'entrée (concentrations des protéines et des ligands, et constantes de dissociation des complexes) qui changent en fonction des conditions (chloroplastes intacts ou reconstitués, lumière ou obscurité). III Paramètres d'entrée et résultats du modèle Les valeurs des différents paramètres d'entrée nécessaires à ce modèle proviennent de la littérature et sont présentées Table III.7. Les résultats obtenus par le modèle avec ces paramètres d'entrée sont rassemblés Table III.8. Avant de se pencher plus avant sur ces résultats, il est important de détailler les compromis et les choix que nous avons dû faire en ce qui concerne différents paramètres du modèle, étant donnée une trop grande disparité ou l'absence de certaines données dans la littérature. Le NADPH se fixe à la Rubisco sur le site de fixation du RuBP (Badger et Lorimer, 1981), il est donc en compétition pour ce site avec plusieurs autres composés, le substrat RuBP bien sûr, mais aussi l'inhibiteur nocturne 2-carboxy-D-arabinitol 1- phosphate (CA1P) (voir Hartman et Harpel, 1994 et ses références) et d'autres phosphoesters (Badger et Lorimer, 1981) qui sont des agents d'activation de la Rubisco. Par ailleurs, ces ligands ne se fixent généralement pas avec la même affinité sur les deux 134

139 Table III.7 : Paramètres d'entrée du modèle basé sur les équilibres de complexation pour l'estimation de la proportion du NADPH libre et lié dans les chloroplastes. Les concentrations, dans les chloroplastes intacts, des différents composés impliqués et les constantes de dissociation sont tirés de la littérature. Pour le complexe de la Rubisco avec le RuBP un K d égal à 20 μm a été utilisé (Badger et Lorimer, 1981; Hartman et Harpel, 1994; Harris et Koniger, 1997). Certaines données sont présentées dans la littérature en nmol par mg Chl; un volume de 25 μl par mg Chl pour le stroma (Heldt et Sauer, 1971) a été utilisé pour calculer la concentration. Composés Concentrations dans les chloroplastes (mm) K d du complexe avec NADPH (μm) K d du complexe avec NADP + (μm) NADPH obscurité lumière [1] [1] NADP + obscurité lumière [1] [1] RuBP 2 FNR 0.25 a 0.79 [2] 14 [2] Rubisco 4 b [3-6] 70 [7, 8] 70 MDH obscurité lumière b b [9] c [10] 3 40 [10] [10] Autres protéines d 85 e 25 f a Valeur moyenne calculée à partir de différentes sources : 0.33 mm (Usuda, 1988) et 0.2 mm (basé sur 3 FNR / PSI (Böhme, 1978) et 600 mol Chl / mol PSI (Junge, 1977; Lawlor, 1993)). b Concentration de sites actifs. c Valeur moyenne à partir de (Ashton et Hatch, 1983; Issakidis et al., 1994). d Somme des concentrations en sites de fixation des protéines : GAPDH 50 μm (moyenne à partir de (Usuda, 1988; Harris et Koniger, 1997)), GR 1 μm (Miyake et al., 1998) et MDHAR 14 μm (Asada, 1996). e Constante de dissociation globale pour les "autres protéines" estimée à partir des K d suivants : GAPDH μm (Baalmannn et al., 1995), GR 3 μm (Halliwell et Foyer, 1978; Bielawski et Joy, 1986) et MDHAR 210 μm (Asada, 1996). f Constante de dissociation globale pour les "autres protéines" estimée à partir des K d suivants : GAPDH 13 μm (Bergmeyer, 1974) et GR 220 μm (Bielawski et Joy, 1986). [1] : (Takahama et al., 1981). [2] : (Batie et Kamin, 1986). [3] : (Ashton, 1982). [4] : (Woodrow et Berry, 1988). [5] : (Stitt, 1996). [6] : (Harris et Koniger, 1997). [7] : (Dietz et Heber, 1984). [8] : (Badger et Lorimer, 1981). [9] : (Usuda, 1988). [10] : (Ashton et Hatch, 1983). 135

140 Table III.8 : Proportions de NADPH libre et lié aux protéines dans les chloroplastes intacts et reconstitués à l'obscurité et à la lumière calculées avec le modèle basé sur les équilibres de complexation. Les valeurs des paramètres d'entrée du modèle utilisées sont celles de la Table III.7. NADPH Chloroplastes intacts Chloroplastes reconstitués (%) Obscurité Lumière Obscurité Lumière Libre 2,5 3,0 69,2 69,4 Lié (total) 97,5 97,0 30,8 30,6 - à la FNR 44,2 33,7 3,6 2,8 - à la Rubisco 52,1 60,5 26,7 26,8 - à la MDH < 0,1 1,4 < 0,1 0,5 - aux "autres protéines" 1,1 1,4 0,5 0,5 formes de la Rubisco, la forme inactivée et la forme activée, notamment RuBP et CA1P (Hartman et Harpel, 1994). Il était nécessaire de tenir compte dans le modèle de tous ces ligands de la Rubisco, mais cela aurait beaucoup compliqué le modèle de traiter tous ces ligands séparément avec les deux formes de la Rubisco, d'autant plus qu'un certain nombre de données nécessaires concernant ces ligands n'existe pas dans la littérature. Nous avons donc considéré seulement la forme activée de la Rubisco (toute la Rubisco est supposée activée) et le RuBP à une concentration de 2 mm (à l'obscurité et à la lumière). Cette concentration peut paraître un peu surestimée pour des chloroplastes isolés (Sicher et Jensen, 1979; Seftor et Jensen, 1986), mais cela permet de prendre en compte tous les autres ligands. Une telle approximation nous semble raisonnable pour les raisons suivantes. Premièrement, les chloroplastes ont été isolés à partir de feuilles illuminées (700 μmol photons m -2 s -1 ) juste avant pendant 30 min, ainsi, au moment de l'isolation, la Rubisco doit être principalement dans sa forme active, la concentration de CA1P doit être basse (Moore et al., 1991), et celle de RuBP est certainement assez importante. Deuxièmement, les autres ligands ont apparemment une influence moindre, puisqu'ils sont moins concentrés et/ou se fixent moins efficacement (Badger et Lorimer, 1981; Ashton, 1982). Troisièmement, on peut considérer que la concentration du RuBP et des autres ligands, qui sont étroitement liés au métabolisme du carbone, varie peu entre l'obscurité et la lumière lors des mesures de fluorescence résolue en temps, puisque la vitesse 136

141 d'assimilation du carbone dans les chloroplastes est faible. La valeur de 2 mm pour la concentration de RuBP ayant été choisie un peu arbitrairement les calculs ont aussi été effectués avec des valeurs différentes, inférieures et supérieures. Dans la Table III.9 sont présentés les calculs effectués avec des valeurs de 0,2 et 6 mm pour cette concentration, les valeurs extrêmes données dans la littérature pour ce paramètre (Ashton, 1982; Dietz et Heber, 1984; Stitt et al., 1985; Gerhardt et al., 1987; Harris et Koniger, 1997). Comme on pouvait s'y attendre, le pourcentage de NADPH libre augmente avec l'augmentation de la concentration en RuBP, et notamment pour les chloroplastes intacts. Mais, la variation entre obscurité et lumière, pour une même concentration de RuBP, reste proportionnellement peu importante. Pour la constante de dissociation du complexe de NADP + avec la Rubisco, nous avons utilisé une valeur égale à celle de la constante de dissociation du complexe NADPH-Rubisco, parce qu'aucune valeur n'a été trouvée dans la littérature et que la liaison de NADPH avec la Rubisco est considérée comme non-spécifique. Pourtant, il n'y a aucune indication dans la littérature concernant une liaison de NADP + avec la Rubisco, les calculs ont donc été effectués aussi dans le cas où il n'y a pas formation d'un complexe NADP + -Rubisco (Table III.10). Comme on peut le constater en comparant les Tables III.8 et III.10 cela n'a quasiment pas d'influence pour les chloroplastes reconstitués. En ce qui Table III.9 : Proportions de NADPH libre et lié aux protéines dans les chloroplastes intacts et reconstitués à l'obscurité (Obs) et à la lumière (Lum) calculées avec le modèle basé sur les équilibres de complexation. Les valeurs des paramètres d'entrée du modèle utilisées sont celles de la Table III.7, sauf en ce qui concerne la concentration en RuBP (CRuBP) pour laquelle deux valeurs ont été utilisées 0,2 mm et 6 mm. Chloroplastes intacts Chloroplastes reconstitués NADPH C RuBP = 0,2 C RuBP = 6 mm C RuBP = 0,2 C RuBP = 6 mm (%) Obs Lum Obs Lum Obs Lum Obs Lum Libre 1,2 1,4 34,3 39,3 63,0 63,3 79,6 79,9 Lié (total) 98,8 98,6 65,7 60,7 37,0 36,7 20,4 20,1 - à la FNR 41,8 32,4 46,6 34,9 3,5 2,7 3,7 2,8 - à la Rubisco 56,2 64,4 16,7 19,1 33,0 33,1 16,1 16,2 - à la MDH < 0.1 0,9 0,1 3,1 < 0.1 0,5 < 0.1 0,6 - aux "autres protéines" 0,7 0,9 2,3 3,6 0,4 0,4 0,5 0,5 137

142 Table III.10 : Proportions de NADPH libre et lié aux protéines dans les chloroplastes intacts et reconstitués à l'obscurité et à la lumière calculées avec le modèle basé sur les équilibres de complexation. Les valeurs des paramètres d'entrée du modèle utilisées sont celles de la Table III.7. Sauf en ce qui concerne la constante de dissociation du complexe NADP + -Rubisco puisqu'on considère ici que ce complexe ne se forme pas. NADPH Chloroplastes intacts Chloroplastes reconstitués (%) Obscurité Lumière Obscurité Lumière Libre 2,9 3,0 68,6 69,1 Lié (total) 97,1 97,0 31,4 30,9 - à la FNR 27,3 28,2 3,5 2,8 - à la Rubisco 69,6 67,6 27,4 27,1 - à la MDH < 0,1 0,7 < 0,1 0,5 - aux "autres protéines" 0,2 0,5 0,4 0,5 concerne les chloroplastes intacts une partie des sites de la Rubisco libérés par NADP + est occupée par NADPH au détriment de ceux de la FNR et dans une moindre mesure de ceux des "autres protéines", cependant le pourcentage de NADPH lié reste le même et seule la petite différence entre obscurité et lumière est encore diminuée. Le fait d'avoir rassemblé un certain nombre de protéines dans le "compartiment" "autres protéines" a permis de simplifier les calculs, mais nécessite d'utiliser une valeur moyenne pour les constantes de dissociation des complexes NADPH-"autres protéines" et NADP + -"autres protéines". Pour évaluer l'influence de ces deux constantes sur les proportions de NADPH libre, nous avons fait les calculs en les faisant varier. Nous avons utilisé pour cela les valeurs extrêmes de ces constantes telles qu'elles sont données dans la littérature pour les trois protéines GAPDH, GR et MDHAR (Table III.11). On constate que ces paramètres s'ils ont bien sur une influence importante sur le pourcentage de NADPH lié aux "autres protéines", n'ont que très peu d'influence sur le pourcentage de NADPH libre, qui est peu différent de ce qu'il était Table III.8. Il en est de même pour les variations de ce pourcentage entre obscurité et lumière. Enfin, comme on le voit par exemple Table III.8, la diminution entre chloroplastes intacts et chloroplastes reconstitués du pourcentage de NADPH lié à la FNR est proportionnellement bien plus importante que pour les autres protéines (Rubisco par 138

143 Table III.11 : Proportions de NADPH libre et lié aux protéines dans les chloroplastes intacts et reconstitués à l'obscurité (Obs) et à la lumière (Lum) calculées avec le modèle basé sur les équilibres de complexation. Les valeurs des paramètres d'entrée du modèle utilisées sont celles de la Table III.7. Sauf pour la constante de dissociation du complexe de NADPH avec les "autres protéines" (K d (H) ) et celle du complexe de NADP + avec les "autres protéines" (K d (+) ). Chloroplastes intacts K d (H) = mm K d (+) = 0,22 mm K d (H) = 0,21 mm K d (+) = mm Chloroplastes reconstitués K d (H) = mm K d (+) = 0,22 mm K d (H) = 0,21 mm K d (+) = mm NADPH (%) Obs Lum Obs Lum Obs Lum Obs Lum Libre 2,1 2,6 2,5 3,0 64,6 65,7 69,4 69,6 Lié (total) 97,9 97,4 97,5 97,0 35,4 34,3 30,6 30,4 - à la FNR 43,1 33,4 44,3 33,7 3,5 2,7 3,6 2,8 - à la Rubisco 44,7 54,8 52,7 61,3 25,1 25,4 26,8 26,9 - à la MDH < 0,1 1,3 < 0,1 1,4 < 0,1 0,5 < 0,1 0,5 - aux "autres protéines" 10,0 7,9 0,4 0,6 6,7 5,7 0,2 0,2 exemple). C'est la conséquence de l'association de la FNR avec les thylakoïdes. En effet, d'après Palatnik et al. (1997), qui utilisent une méthode comparable à la notre pour séparer le stroma, il n'y a pas de FNR dans la fraction du stroma. Nous avons donc considéré ici que la FNR restait en totalité fixée aux thylakoïdes. Le rapport de sa concentration sur celles des autres composés du modèle, qui sont tous en solution dans le stroma, est donc onze fois plus faible dans le cas des chloroplastes reconstitués que dans celui des chloroplastes intacts. Ces différentes considérations permettent de se faire une idée de l'imprécision et des limites de ce modèle, qui a une approche théorique très simple de la liaison entre NADP et les différentes protéines avec lesquelles il est susceptible de former des complexes dans les chloroplastes, et pour lequel nous ne disposons pas de mesure fiable pour un certain nombre de paramètres. Néanmoins, ce modèle devrait nous donner dans les grandes lignes une vision sans doute assez juste de la situation dans les chloroplastes. On constate que les résultats obtenus avec le modèle (Table III.8) sont en accord avec les résultats obtenus avec l'analyse résolue en temps de la fluorescence, puisqu'ils indiquent seulement une faible variation photo-induite de la proportion de NADPH libre et lié dans les chloroplastes. De plus, cette faible variation va dans le sens d'une diminution de la 139

144 proportion de NADPH lié à la lumière, ce qui confirme que l'augmentation photo-induite de FBV dans les chloroplastes provient totalement de la réduction du NADP par la photosynthèse. Par ailleurs, les résultats des calculs montrent clairement qu'une large majorité du NADPH est liée dans les chloroplastes intacts, ce qui n'est pas du tout le cas pour les chloroplastes reconstitués. Cette différence explique les différences observées dans la répartition de la fluorescence entre les quatre premières composantes temporelles (qui contiennent la fluorescence du NADPH) pour ces deux types de chloroplastes (Fig. III.6 et III.14). Plus précisément, cette différence explique la plus grande contribution relative de la composante C4 et les plus petites contributions relatives des composantes C1 et C2 à l'augmentation photo-induite de FBV dans les chloroplastes intacts. Cependant, la contribution relative de la composante C3 à l'augmentation photo-induite de FBV est plus petite pour les chloroplastes intacts que pour les chloroplastes reconstitués. Cela peut être dû à la différence importante de la répartition relative du NADPH lié entre les différentes protéines, particulièrement FNR et Rubisco. Cette hypothèse implique que le NADPH lié à la Rubisco ait un temps de vie différent de celui lié à la FNR. Hypothèse qui est soutenue par le fait que le NADPH se lie spécifiquement à la FNR et non- Table III.12 : Comparaison des caractéristiques temporelles de la fluorescence bleue et de la fluorescence verte de chloroplastes intacts. Moyennes et écarts types correspondants (entre parenthèses) obtenus à partir de 3 déclins de fluorescence. Résultats de l'analyse globale de 6 déclins (3 à 460 nm et 3 à 520 nm). Les spectres ont été enregistrés sur l'ancienne version du spectrofluorimètre avec une longueur d'onde d'excitation de 350 nm. Composantes temporelles Temps très courte C1 courte C2 moyenne C3 longue C4 très longue C5 de vie moyen (ns) f (%) (ns) f (%) (ns) f (%) (ns) f (%) (ns) f (%) m (ns) Chloroplastes intacts 0,08 0,40 1,3 4,0 12 em = 460 nm 4,5 (0,6) 8,1 (0,7) 18,7 (1,4) 28,3 (0,9) em = 520 nm 4,6 6,5 16,3 28,4 (0,8) (1,0) (1,7) (1,8) 40,4 (1,3) 44,2 (2,7) 6,23 (0,14) 6,64 (0,28) 140

145 spécifiquement à la Rubisco. Malheureusement, nous n'avons pas réussi à mesurer, ni la variation de rendement de fluorescence de NADPH lorsqu'il se lie à ces deux protéines, ni le temps de vie de fluorescence du NADPH lié à ces deux protéines purifiées. Dans le cas de la Rubisco, c'est la présence, dans deux échantillons différents, d'une fluorescence bleue excitée dans l'uv-a intrinsèque qui est responsable de notre échec. Et, dans le cas de la FNR, nous soupçonnons les conditions expérimentales que nous avons utilisées, qui ne sont pas simples étant donnée l'activité diaphorase de la FNR en solution (Palatnik et al., 1997), d'avoir géné la liaison NADPH-FNR. III.4.3. La fluorescence des flavines dans les chloroplastes intacts, comparaison avec les chloroplastes reconstitués Le spectre d'émission RT des chloroplastes reconstitués (Fig. III.10) a permis de mettre en évidence une participation des flavines à la fluorescence verte de ces chloroplastes. Pour les raisons évoquées précédemment (section III.4.1.) le spectre d'émission RT des chloroplastes intacts n'a pu être enregistré. Cependant, une comparaison entre les déclins de fluorescence enregistrés à une longueur d'onde d'émission de 460 nm et ceux enregistrés à 520 nm sur des chloroplastes intacts de pois en cuve plate (0,1 mm de chemin optique) avait pu être réalisée avec une version précédente du spectrofluorimètre. L'analyse globale de tous les déclins à ces deux longueurs d'onde à cinq composantes temporelles a été effectuée (Table III. 12). Une analyse globale des déclins à ces deux longueurs d'onde était possible puisque les temps de vie obtenu lors de l analyse individuelle des déclins étaient quasiment identiques à ces deux longueurs d'onde. Les résultats de la Table III.12 montre qu'il n'y a pas pour les chloroplastes intacts de différences significatives des intensités relatives des cinq composantes temporelles (notamment en ce qui concerne la composante C4, où on s'attendrait à trouver la fluorescence des flavines d'après les résultats précédents) entre ces deux longueurs d'onde d'émission. Ce qui implique que la fluorescence des flavines soit négligeable dans les chloroplastes intacts. Cependant, même si ce n'est pas significatif, les caractéristiques 141

146 temporelles ne sont pas exactement les mêmes à ces deux longueurs d'onde. Les mesures de fluorescence résolue en temps ne sont peut-être pas suffisamment sensibles pour observer la fluorescence des flavines dans la FBV des chloroplastes intacts qui est moins intense que celle des chloroplastes reconstitués. Une hypothèse envisageable est que les chloroplastes reconstitués contiennent proportionnellement plus de flavines libres, étant donnée la façon dont ils sont préparés, puisque la fluorescence des flavines est éteinte par la liaison avec les protéines. D'autre part, les résultats de la Table III.12 à 460 nm devraient être à peu de choses près identiques à ceux de la Table III.6. Or, si c'est effectivement le cas en ce qui concerne les temps de vie de fluorescence de toutes les composantes temporelles, ça ne l'est plus pour les intensités relatives de ces composantes et par conséquent pour le temps de vie moyen. Il y a une augmentation importante de l'intensité relative de la composante C5 au détriment de toutes les autres composantes. On ne peut pas vraiment expliquer cette différence, mais on peut émettre l'hypothèse qu'un autre fluorophore supplémentaire avec un temps de vie long (aux environs de 12 ns) est présent. Avec un temps de vie de fluorescence aussi long une très faible concentration de fluorophore suffit pour générer une fluorescence importante. On peut donc penser que ce fluorophore supplémentaire peut être, soit une impureté apparue pendant la préparation de l'échantillon, soit un composé qui pour une raison indéterminée était présent dans les feuilles et s'est accroché aux chloroplastes lors de leur isolation. Des différences insoupçonnées dans la culture des plantes, l'isolation des chloroplastes ou la préparation des échantillons sont fortement probables puisque plusieurs années séparent ces premières mesures (Table III.12) des autres mesures de fluorescence résolue en temps sur chloroplastes de pois. Bien plus importante est la question de l'influence de la variation photo-induite de la fluorescence des flavines sur la variation photo-induite de FBV des chloroplastes. En effet, étant donnée la baisse photo-induite de fluorescence verte excitée dans le bleu due aux flavines (Fig. III.12), on peut s'attendre à une influence de la fluorescence des flavines dans la partie verte de l'augmentation photo-induite de FBV (excitée dans l'uv) des 142

147 chloroplastes. Les variations photo-induites de la fluorescence des chloroplastes dans la partie bleue et dans la partie verte ne seraient plus proportionnelles. Dans le cas des chloroplastes reconstitués, le spectre d'émission RT de différence (Fig. III.13) montre que l'influence des flavines sur l'augmentation photo-induite de FBV n'est pas vraiment significative. En effet, le spectre de fluorescence total et surtout celui de la composante C4 (où se manifeste la fluorescence des flavines) ne présentent pas par rapport au spectre de NADPH une diminution significative dans la partie verte. Cependant, il faut reconnaître que ces spectres sont assez bruités et qu'une faible diminution dans la partie verte pourrait passer inaperçue dans le bruit. Les résultats présentés Fig. III.16 permettent de confirmer sur chloroplastes intacts que l'influence de la fluorescence des flavines sur l'augmentation photo-induite de FBV est négligeable. Des filtres interférentiels (LMH : 35 nm) centrés à 460 nm Fluorescence (u.r.) flash blanc rouge faible rouge intense flash rouge lointain 530 nm Temps (s) Figure III.16 : Cinétiques de différentes variations du rendement de fluorescence induites par la lumière actinique additionnelle dans des chloroplastes isolés intacts d'épinard mesurées à 460 et 530 nm. Ces mesures ont été réalisées avec l'ancienne version du fluorimètre impulsionnel, donc avec un faisceau d'excitation à 337 nm produit par un laser à azote. Les variations photo-induites du rendement de fluorescence ont été obtenues grâce à : un flash de lumière blanche (lampe Schott, 2 s, DFPP : 1000 μmol photons m -2 s -1 ), une lumière rouge faible (665 nm, 200 s, DFPP : 20 μmol photons m -2 s -1 ), une lumière rouge intense (665 nm, 45 s, DFPP : 300 μmol photons m -2 s -1 ) et un flash de lumière rouge lointain (lampe Schott avec un filtre RGN9, 2 s, 22 W m -2 ). La figure insérée montre les fluorescences aux deux longueurs d'onde tracées l'une en fonction de l'autre pour amplifier les éventuelles différences entre les cinétiques à ces deux longueurs d'onde. 143

148 460 et 530 nm placés devant les détecteurs permettent de séparer les parties bleue et verte de la FBV. Aucune différence entre ces deux longueurs d'onde dans les cinétiques des différentes transitions obscurité-lumière-obscurité n'est visible. Le tracé des deux fluorescence à 460 et à 530 nm l'une en fonction de l'autre (Fig. III.16 insertion) reste toujours sur la même droite. Les variations photo-induites de la fluorescence des chloroplastes à ces deux longueurs d'onde sont donc toujours proportionnelles, elles proviennent donc uniquement du NADPH même dans la partie verte. III.5. Analyse spectrale et temporelle des variations de la fluorescence bleue des mesophylles lors de transitions obscurité/air-lumière/azote. Comme, nous l'avons vu précédemment les mésophylles n'étaient pas adaptés à l'analyse résolue en temps de la FBV photo-induite, puisque dans ce cas l'augmentation photo-induite de FBV ne représentait qu'une très faible partie de la FBV totale à la lumière. Néanmoins, après avoir mené cette analyse sur les chloroplastes reconstitués et intacts, et forts des résultats obtenus, il nous a paru intéressant de faire quelques mesures sur des mesophylles. L'idée étant bien sûr de voir ce que nous obtiendrions in vivo. D'après la Fig. III.3, il aurait mieux valu choisir les feuilles que les mésophylles puisque le rapport FBV photo-induite sur FBV totale y est plus grand, mais la différence est petite et en utilisant des mésophylles on évite la participation des fluorophores de l'épiderme (certes peu présents chez le pois) qui auraient influencé les caractéristiques temporelles de la FBV mesurée. Comme dans l'expérience de la Fig. III.3, les déclins de fluorescence ont été enregistrés à l'obscurité dans une atmosphère d'air ambiant et à la lumière dans une atmosphère d'azote. Le fait de mettre l'échantillon dans une atmosphère d'azote à la lumière permet d'accroître l'augmentation photo-induite de FBV, car cela bloque les principales voies de réoxydation du NADPH. En effet, une atmosphère d'azote a simplement comme conséquence d'éliminer l'o 2 et le CO 2, ce qui entraîne (à court terme 144

149 en tout cas) un simple arrêt de la photorespiration, de la photosynthèse et de la respiration. La photorespiration et la photosynthèse sont les voies principales de réoxydation du NADPH dans les chloroplastes à la lumière. La respiration, qui reste active dans la plupart des cas à la lumière, est aussi une voie possible de réoxydation du NADPH, réoxydation qui a lieu dans les mitochondries après que le pouvoir réducteur des chloroplastes y ait été transporté (Hoefnagel et al., 1998). Les résultats de l'analyse résolue en temps de la fluorescence bleue de ces mésophylles sont présentés Table III.13. Cette analyse a été faite avec cinq composantes temporelles, parce qu'une bonne déconvolution a été obtenue dans ce cas et pour permettre la comparaison avec les résultats obtenus sur les chloroplastes. On remarque tout de suite qu'il n'y a aucun changement entre l'obscurité et la lumière. Ce qui est tout à fait logique étant donnée la très faible proportion que représente la fluorescence photoinduite par rapport à la fluorescence totale (voir Fig. III.3), son influence sur les caractéristiques temporelles de fluorescence est négligeable. Cette expérience ne permet donc pas d'évaluer les caractéristiques temporelles de la FBV photo-induite comme on avait pu le faire avec les chloroplastes, mais ne remet aucunement en question les résultats Table III.13 : Caractéristiques temporelles de la fluorescence bleue de mésophylles de pois à l'obscurité (air) et à la lumière (azote). Moyennes et écarts types correspondants (entre parenthèses) obtenus à partir de 9 déclins de fluorescence. Résultats de l'analyse globale de 18 déclins (9 à l'obscurité et 9 à la lumière). Longueur d'onde d'excitation : 340 nm. Longueur d'onde d'émission : 456 nm. L'air (à l'obscurité) et l'azote (à la lumière) sont humidifiés par passage dans l'eau avant le porte échantillon. Le débit des gaz était d'environ 20 l/h. Lumière actinique : DFPP = 50 μmol photons m -2 s -1. très courte C1 1 = 0,11 ns Composantes temporelles courte moyenne longue C2 2 = 0,59 ns C3 3 = 1,4 ns C4 4 = 2,9 ns très longue C5 5 = 6,1 ns Temps de vie moyen f 1 (%) f 2 (%) f 3 (%) f 4 (%) f 5 (%) m (ns) Obscurité & air 10,8 ± 0,7 17,2 ± 1,2 32,2 ± 1,5 31,9 ± 0,6 7,9 ± 1,1 1,98 ± 0,05 Lumière & N 2 10,9 ± 1,0 16,9 ± 1,5 32,7 ± 1,7 31,2 ± 0,8 8,3 ± 1,1 1,98 ± 0,05 145

150 obtenus sur chloroplastes. Par contre, lorsqu'on compare les caractéristiques temporelles de la fluorescence bleue des mésophylles avec celle des chloroplastes intacts (Table III.13 et III.6), on constate des différences importantes. Les temps de vie des trois premières composantes (C1 à C3) sont identiques, mais ceux des composantes longues (C4 et C5) sont différents et particulièrement celui de C5. Le plus remarquable est la disparition du temps de vie le plus long (11 ns) dans les mésophylles et la diminution d'un facteur environ deux du temps de vie moyen. On en déduit qu'un ou plusieurs fluorophores, qui n'étaient pas présents dans les chloroplastes, participent à la fluorescence bleue des mésophylles. Cela se confirme lors de l'examen des spectres d'excitation et d'émission de fluorescence de ces mésophylles (Fig. III.17). On peut noter que ces spectres ont été réalisés à l'obscurité (air), mais que des spectres identiques ont été obtenus à la lumière (azote). Ces spectres sont assez différents de ceux des chloroplastes (voir Fig. III.7, III.10, III.15 et III.18), notamment le spectre d'excitation. Dans ce cas on ne retrouve plus du tout le pic des protéines et le pic à 340 nm est déplacé à 365 nm. La raison la plus Fluorescence (u.r.) Longueur d'onde (nm) Figure III.17 : Spectre d'excitation et d'émission de fluorescence d'un mésophylle de pois. Pour le spectre d'excitation (trait continu), longueur d'onde d'émission : 456 nm. Pour le spectre d'émission (pointillé), longueur d'onde d'excitation : 340 nm. 146

151 vraisemblable est la présence d'un ou plusieurs fluorophore(s) dans les parois cellulaires ou dans le reste de la cellule (à part les chloroplastes). Ce(s) fluorophore(s) ayant un double effet. Premier effet, un effet d'écran en absorbant le faisceau d'excitation, qui excite alors beaucoup moins les autres fluorophores. Cet effet d'écran expliquerait d'une part la disparition du pic des protéines (la longueur d'onde d'émission 456 nm se situe sur la queue du spectre d'émission des protéines), et d'autre part celle du temps de vie très long des chloroplastes (11 ns), qui provient de fluorophores vraisemblablement peu concentrés (avec un temps de vie aussi long une faible concentration suffit pour produire beaucoup de fluorescence). Deuxième effet, une émission de fluorescence, d'où le pic à 365 nm et la forme du spectre d'émission. Effectivement, sur le spectre d'émission on retrouve comme avec les chloroplastes le creux dû à la réabsorption par les pigments photosynthétiques (autour de 490 nm), mais il y a un pic dans la partie bleue bien plus important que dans le cas comparable des chloroplastes reconstitués à l'obscurité. On en déduit qu'il s'agit sans doute d'un fluorophore (ou d'un groupe de fluorophores) dont le maximum d'excitation se situe vers nm, le maximum d'émission vers nm et le temps de vie de fluorescence n'est pas trop long. Les données sont insuffisantes pour identifier le ou les fluorophore(s) en question et il y a sans doute un certain nombre de candidats potentiels. On peut néanmoins penser aux folates et plus particulièrement au 5,10- methenyltetrahydrofolate dont les caractéristiques spectrales de fluorescence (maximum d'excitation 370 nm et maximum d'émission 470 nm (Udenfriend, 1969)) conviennent parfaitement. Par ailleurs, les folates sont assez présents dans les feuilles, notamment dans les mitochondries, mais on en trouve peu dans les chloroplastes. Ainsi, chez le pois, les mitochondries renferment environ 50 % de la totalité du folate cellulaire à une concentration d'environ 400 μm, tandis que seulement 6-7 % du pool total de folate sont associés aux chloroplastes (Neuburger et al., 1996). Cette hypothèse est cohérente, mais des expériences complémentaires sont nécessaires pour pouvoir la confirmer, ou bien déterminer qui est (sont) ce(s) fluorophore(s) bleu(s) qui apparaisse(nt) lorsqu'on passe du chloroplaste au mésophylle. 147

152 III.6. Correction des spectres d'émission de fluorescence de chloroplastes reconstitués pour s'affranchir de la déformation due à l'absorption des pigments photosynthétiques Dans les chloroplastes, la concentration en pigments photosynthétiques (chlorophylles et caroténoïdes) est importante, de l'ordre de 25 mm pour la Chl, en se basant sur un volume de chloroplaste de 45 μl/mg Chl (Heldt et Sauer, 1971). Ces pigments photosynthétiques absorbent fortement dans la partie bleu-verte du spectre (Fig. I.7, p. 20), ils absorbent donc la FBV des chloroplastes et il en résulte une déformation du spectre d'émission de la FBV, comme on l'a vu Fig. III.13. Cette déformation est la conséquence d'une absorption des pigments photosynthétiques bien plus grande dans la 50 μg Chl cm -2 Fluorescence (u.r.) 12,5 6,25 0 3, Longueur d'onde (nm) Figure III.18 : Effet de la concentration en chloroplastes sur le spectre d'émission de la FBV de chloroplastes intacts. Les spectres ont été enregistrés sur l'ancienne version du spectrofluorimètre avec une longueur d'onde d'excitation de 350 nm. Le spectre désigné par zéro est le blanc sur le milieu de resuspension sans chloroplastes. Les nombres désignant les spectres indiquent le contenu surfacique en chloroplastes en μg Chl cm -2. L'épaisseur de la cuve de mesure vaut 0,1 mm. 148

153 partie bleue que dans la partie verte du spectre. La Fig. III.18 illustre bien cette réabsorption de la FBV des chloroplastes par les pigments photosynthétiques. En effet, elle montre le changement très net du rapport entre l'intensité de la fluorescence bleue et celle de la fluorescence verte avec l'augmentation de la concentration en chloroplastes. Lorsque la concentration en chloroplastes augmente, la concentration des fluorophores responsables de la FBV (notamment NADPH) augmente proportionnellement, ce qui se traduit par une augmentation de l'intensité de la FBV. Mais, l'augmentation de la concentration en chloroplastes se traduit aussi par une augmentation de la concentration des pigments photosynthétiques et donc par une augmentation importante de l'absorption dans le bleu et une augmentation beaucoup plus faible dans le vert. Pour s'affranchir de cette déformation due à la réabsorption de la FBV par les pigments photosynthétiques, nous avons voulu modéliser cette réabsorption pour pouvoir recalculer le spectre d'émission émis par les fluorophores à partir du spectre d'émission enregistré. Avec des spectres ainsi "corrigés" l'interprétation des différences entre spectre à l'obscurité et à la lumière ainsi que du spectre de différence est nettement facilitée et plus rigoureuse. L'objectif principal étant de vérifier spectralement que le NADPH est le seul fluorophore responsable de la variation photo-induite de FBV dans les chloroplastes. III.6.1. Modélisation de l'influence des pigments photosynthétiques sur la fluorescence bleu-verte des chloroplastes en solution Les solutions de chloroplastes, notamment aux concentrations que nous utilisons, sont des solutions assez opaques et diffusantes. Cependant, on se propose de construire un modèle simple, basé uniquement sur la loi de Beer-Lambert et dans lequel les effets de diffusion sont négligés devant l'absorption. Des modèles de ce genre ont déjà été utilisés et ce sont révélés bien adaptés dans le cas de la mesure de la fluorescence du NAD(P)H dans des réacteurs de culture de levures (Srinivas et Mutharasan, 1987) et dans le cas de l'évaluation de l'auto-réabsorption de la fluorescence chlorophyllienne (Agati et al., 1993). La validité du modèle sera dans un premier temps testée sur un système artificiel. 149

154 On utilise la loi de Beer-Lambert sous la forme : I (x) = I 0 e - k x (III.7) I (x) est l'intensité de la lumière au point x et à la longueur d'onde. I 0 est l'intensité de la lumière à la longueur d'onde arrivant sur l'échantillon. k est le coefficient d'absorption. I 0 Cuve de mesure dx 0 L x Soit I 0 ex l'intensité du faisceau d'excitation à la longueur d'onde ex arrivant sur la cuve de mesure, et I ex (x) l'intensité du même faisceau lumineux en x (pour x compris entre 0 et L). Alors : I ex (x) = I0 ex e - k 1 + k 2 x (III.8) k 1 : coefficient d'absorption à la longueur d'onde ex des fluorophores responsables de la FBV des chloroplastes. k 2 : coefficient d'absorption des composés qui absorbent la lumière à ex mais n'émettent pas de FBV. Pour simplifier les équations on a pris seulement k 1 et k 2, ils représentent en fait la somme de tous les coefficients d'absorption des composés correspondants. Soit A dx la lumière absorbée par un élément de volume d'échantillon élémentaire dx situé en x : A dx = - di ex (x) = I ex (x) k 1 + k 2 dx (III.9) 150

155 Seule une partie A' dx de A dx est absorbée par les fluorophores. A' dx = k 1 I ex (x) dx (III.10) Soit de em (x) la fluorescence émise par l'élément élémentaire dx à la longueur d'onde em et soit Q le rendement de la FBV excitée à ex et émise à em. de em (x) = Q k 1 I ex (x) dx (III.11) Cette fluorescence est réabsorbée durant son trajet dans l'échantillon par les composés qui absorbent à em. L'éventuelle fluorescence qui pourrait être ré-émise après autoréabsorption par le fluorophore lui-même a été négligée étant donné le faible rendement de la FBV des chloroplastes. On se place dans le cadre d'une détection de la fluorescence en face avant puisque c'est la géométrie de nos montages expérimentaux. La fluorescence est émise isotropiquement, on n'en détecte donc qu'une partie. Finalement soit di em (x) la fluorescence en provenance de l'élément élémentaire dx qui arrive sur le détecteur : di em (x) = K de em (x) e - k 3 x = K Q k 1 I ex (x) e - k 3 x dx (III.12) K est le facteur géométrique traduisant le fait que seule une partie de la fluorescence est mesurée. k 3 est le coefficient d'absorption global à la longueur d'onde démission. Comme pour k 1 et k 2, il représente en fait la somme de tous les coefficients d'absorption des composés qui absorbent à em. 151

156 I em, la fluorescence totale arrivant sur le détecteur (donc celle qui est mesurée) est la somme sur tout l'échantillon des fluorescences élémentaires di em (x). I em = L di em (x) L = K Q k 1 I0 ex e - k 1 + k 2 + k 3 x dx (III.13) 0 0 Nous avons utilisé des cuves de mesures de 1 cm de chemin optique, on prend donc L = 1. Ce qui impose d'utiliser la valeur des coefficients d'absorption k en cm -1. Et finalement : I em = K Q k 1 I0 ex 1 - e- k1 + k2 + k3 k 1 + k 2 + k 3 (III.14) Par ailleurs, soit I' em l'intensité de la fluorescence qui atteindrait le détecteur s'il n'y avait pas de réabsorption. L I' em = K de em (x) L = K Q k 1 I0 ex e - k 1 + k 2 x dx (III.15) 0 0 Et finalement avec les mêmes conventions que précédemment : I' em = K Q k 1 I0 ex 1 - e- k1 + k2 k 1 + k 2 (III.16) Le spectre d'émission de fluorescence enregistré sur le spectrofluorimètre F( em ) est donc proportionnel à I em, tandis que le spectre d'émission corrigé de la réabsorption que nous cherchons à obtenir F'( em ) est proportionnel à I' em. Sachant que seuls les termes Q et k 3 dépendent de la longueur d'onde d'émission em, on obtient : F' em = F em K' k 1 + k 2 + k e - k1 + k2 + k3 (III.17) K' est une constante. Cette équation permet donc d'obtenir le spectre d'émission corrigé des effets de la réabsorption à partir du spectre mesuré, à condition de connaître le coefficient 152

157 d'absorption de l'échantillon à la longueur d'excitation (c'est la somme k 1 + k 2 ) et à toutes les longueurs d'onde d'émission (k 3 ). Pour déterminer ces coefficients d'absorption la question de la diffusion se pose à nouveau. En effet, peut-on obtenir ces coefficients par une simple mesure du spectre de transmittance de l'échantillon et en se basant sur l'équation III.19 qui ne tient pas compte de la diffusion? T = I (L) I 0 = e - k L (III.18) k = - 1 L ln T (III.19) T est la transmittance à la longueur d'onde. Pour répondre à cette question ces coefficients ont été déterminés pour des chloroplastes reconstitués suivant deux méthodes : la première ci-dessus basée uniquement sur la loi de Beer-Lambert et négligeant la diffusion, et une deuxième utilisant la théorie de Kubelka- Munk (voir Annexe D) dont l'objet est justement de modéliser le comportement de la lumière dans des objets absorbants et diffusants. Cette deuxième méthode nécessite l'enregistrement des spectres de transmittance (T( )) et de réflectance (R( )) de l'échantillon. Dans notre cas L = 1 cm, les coefficients d'absorption (k) et de diffusion (s) sont en cm -1, et d'après les équations D.5, on obtient : T = 2 k k s exp k k s k k s 1 + exp 2 k k s + exp 2 k k s -1 k + s (III.20) R = s exp 2 k k s - 1 k k s 1 + exp 2 k k s + exp 2 k k s -1 k + s (III.21) Ainsi, en résolvant numériquement ce système d'équations, on peut déterminer k et s pour chaque longueur d'onde à partir des spectres T( ) et R( ). On peut noter que lorsque s 153

158 Transmittance (%) Longueur d'onde (nm) Figure III.19 : Spectre de transmittance de chloroplastes reconstitués dans une cuve de mesure en quartz de 1 mm de chemin optique. La cuve de mesure est collée contre le détecteur du spectromètre à double faisceaux (Lambda 18 UV/VIS avec son accessoire de transmittance diffuse, Perkin-Elmer, Norwalk, USA). tend vers 0, R( ) tend vers 0 et T( ) vers exp(-kl) montrant ainsi que l'équation de Beer- Lambert décrit une situation limite de celle décrite par les équations de Kubelka-Munk. Les spectres de transmittance et réflectance ont été mesurés sur des chloroplastes reconstitués dans une cuve de mesure en quartz de 1 mm de chemin optique (Fig. III.19 et III.20). Pour obtenir par la transmittance la meilleure mesure possible de l'absorbance (réduire les effets de diffusion) nous avons utilisé une cuve mince collée contre le détecteur. Il faut bien sûr mesurer T( ) et R( ) sur le même échantillon pour déterminer les coefficients k et s correspondants. En utilisant ces spectres et en résolvant numériquement le système d'équations III.20 et 21 grâce au logiciel de calculs mathématiques Mathematica 3.0, nous avons obtenu les spectres des coefficients k et s (Fig. III.21 et III.22). Le coefficient de diffusion n'est pas nul, ce qui confirme bien que les chloroplastes en solution sont des échantillons diffusants, mais les valeurs de ce 154

159 2.5 2 Reflectance (%) Longueur d'onde (nm) Figure III.20 : Spectre de réflectance de chloroplastes reconstitués dans une cuve de mesure en quartz de 1 mm de chemin optique. coefficient à 350 nm et entre 400 et 600 nm sont faibles. La Fig. III.22 permet de comparer le spectre du coefficient d'absorption des chloroplastes reconstitués calculé avec la théorie de Kubelka-Munk à partir des spectres de transmittance et réflectance, à celui 0.24 Coefficient de diffusion s (cm -1 ) Longueur d'onde (nm) Figure III.21 : Spectre du coefficient de diffusion de chloroplastes reconstitués obtenu à partir des spectres de transmittance et de réflectance (Fig. III.19 et III.20) en utilisant la théorie de Kubelka-Munk. 155

160 Coefficient d'absorption k (cm -1 ) d'après Kubelka-Munk d'après Beer-Lambert Longueur d'onde (nm) Figure III.22 : Spectres du coefficient d'absorption de chloroplastes reconstitués. Trait pointillé : spectre obtenu à partir des spectres de transmittance et de réflectance (Fig. III.19 et III.20) en utilisant la théorie de Kubelka-Munk. Trait continu : spectre obtenu à partir du spectre de transmittance (Fig. III.19) en utilisant la théorie de Beer-Lambert (équation III.19). calculé directement avec l'équation III.19 à partir du spectre de transmittance uniquement. Il y a une petite différence entre ces deux spectres qui est due, bien sûr, à la diffusion, mais cette différence est faible et on peut visiblement la négliger sans conséquence notable. On en conclut qu'on devrait pouvoir corriger les spectres d'émission de fluorescence des chloroplastes des effets de la réabsorption par les pigments photosynthétiques, en utilisant l'équation III.17, et le spectre de transmittance de l'échantillon mesuré dans des conditions minimisant l'effet de diffusion (cuve de mesure fine). III.6.2. Validation expérimentale du modèle Pour valider l'approche décrite à la section précédente nous l'avons appliquée à un système modèle aussi proche que possible des chloroplastes en solution, mais dans lequel 156

161 le spectre d'émission de FBV émis par le fluorophore (qui devrait être celui obtenu après correction des effets de la réabsorption par les pigments photosynthétiques) est connu par ailleurs. Comme système modèle nous avons utilisé une solution de chloroplastes cassés (chloroplastes intacts, cassés par congélation à -80 C et décongelés juste avant utilisation) à 40 μg Chl/ml dans le milieu général contenant 16,7 % (v/v) de percoll (Sigma, St Quentin Fallavier, France). Le percoll, une solution de bille de silice recouverte de polyvinylpyrrolidone, est utilisé comme fluorophore dans la partie nm et en quantité telle que sa fluorescence est très grande devant celle des chloroplastes. Le grand avantage du percoll est qu'il constitue en solution une phase solide séparée et qu'ainsi il n'interagira pas chimiquement, à priori, avec les chloroplastes, ce qui garantit que son spectre d'émission de fluorescence soit le même en présence et en absence de chloroplastes. C'est pourquoi, il a été choisi comme fluorophore bleu-vert même si son spectre d'émission est nettement décalé vers les courtes longueurs d'onde par rapport au Fluorescence (u.r.) -Percoll seul 40x Percoll seul Percoll en présence de chloroplastes Chloroplastes seuls x Fluorescence (u.r.) -en présence de chloroplastes Longueur d'onde (nm) Figure III.23 : Spectres d'émission de fluorescence du percoll seul (pointillés courts), du percoll en présence de chloroplastes (trait continu) et de chloroplastes seuls (pointillés longs). Toutes les solutions étaient à base de milieu général auquel ont été ajouté, soit alternativement soit simultanément, du percoll à 16,7 % (v/v) et des chloroplastes cassés par congélation à -80 C (40 μg Chl/ml, concentration finale). Longueur d'onde d'excitation : 334 nm. 157

162 spectre de NADPH. Le spectre d'émission de fluorescence d'une solution de percoll dans le milieu général et celui de la même solution, à laquelle ont été ajoutés des chloroplastes (nous négligerons le très faible effet de dilution), ont été enregistrés (Fig. III.23). Cette figure montre bien les effets de la réabsorption par les pigments photosynthétiques sur l'émission de fluorescence : une baisse importante de l'intensité de fluorescence et une déformation très nette du spectre d'émission. Le spectre d'émission des chloroplastes seuls présenté également sur cette figure montre que la fluorescence des chloroplastes est effectivement faible par rapport à celle du percoll, mais pas suffisamment faible pour être négligée. Aussi, avant de corriger le spectre du percoll en présence de chloroplastes suivant l'équation III.17 nous lui avons soustrait le spectre des chloroplastes seuls. Le spectre de transmittance de la solution de percoll plus chloroplastes (Fig. III.24) fournit les coefficients d'absorptions nécessaires. Le spectre du percoll corrigé pour la réabsorption par les pigments photosynthétiques est présenté sur la Fig. III.25. On constate qu'après correction, le spectre d'émission du percoll en présence de chloroplastes est bien identique (au bruit de mesure près) à celui du percoll seul. Nous en concluons que notre méthode de 100 Transmittance (%) Longueur d'onde (nm) Figure III.24 : Spectre de transmittance de la solution de percoll plus chloroplastes (même solution que Fig. III.23). La cuve de mesure (2 mm de chemin optique) est collée contre le détecteur du spectromètre à double faisceaux (Lambda 18 UV/VIS avec son accessoire de transmittance diffuse, Perkin-Elmer). Un filtre en verre bleu-vert (BG 39, Schott) placé entre la cuve et le détecteur protège ce dernier de la fluorescence de la Chl. 158

163 Percoll seul Fluorescence (u.r.) Percoll en présence de chloroplastes après correction Longueur d'onde (nm) Figure III.25 : Spectres d'émission de fluorescence du percoll seul (pointillés courts) et du percoll en présence de chloroplastes corrigé pour la réabsorption par les pigments photosynthétiques suivant l'équation III.17 (trait continu). Les conditions de mesure de ces spectres sont indiquées Fig. III.23. correction des spectres d'émission de fluorescence de solutions de chloroplastes pour les déformations résultant de la réabsorption par les pigments photosynthétiques, est totalement adaptée et remplit parfaitement son rôle. III.6.3. Application au spectre d'émission de fluorescence des chloroplastes reconstitués La méthode de correction des spectres d'émission pour la réabsorption par les pigments photosynthétiques ayant été validée sur un système modèle, nous l'avons appliquée aux spectres d'émission (obscurité et lumière) de FBV des chloroplastes reconstitués. Dans la Fig. III.26, les spectres présentés Fig. III.10 ont donc été corrigés en utilisant l'équation III.17 et le spectre du coefficient d'absorption de la solution (Fig.III.22, Beer-Lambert). Lors de cette correction la fluorescence du milieu lui-même, qui est très faible mais pas nulle et aurait pu être soustraite au spectre d'émission des chloroplastes, a 159

164 Fluorescence (u.r.) lumière obscurité Longueur d'onde (nm) Figure III.26 : Spectres d'émission de fluorescence de chloroplastes reconstitués à l'obscurité et à la lumière corrigés pour la réabsorption par les pigments photosynthétiques suivant l'équation III.17. Les spectres d'émission utilisés sont ceux de la Fig. III.10 où ils sont présentés non corrigés de la réabsorption. Les coefficients d'absorption utilisés pour cette correction proviennent de la Fig. III.22 (k d'après Beer-Lambert). été négligée devant la fluorescence des chloroplastes. Les spectres corrigés de la réabsorption par les pigments photosynthétiques sont nettement différents des spectres non corrigés, ce qui confirme que la réabsorption par les pigments photosynthétiques est importante et déforme largement les spectres d'émission de FBV. Le pic dans le vert a disparu dans les spectres corrigés aussi bien à l'obscurité qu'à la lumière, ce qui démontre que ce pic est principalement dû à la réabsorption, plus importante dans la partie bleue que dans la verte. Le spectre corrigé à la lumière a donc une forme très proche d'un spectre d'émission de NADPH. Cependant, cette absence de pic dans le vert ne remet pas en cause la participation des flavines à la fluorescence verte des chloroplastes à laquelle nous avons conclu précédemment, seulement cette contribution est de faible intensité, insuffisante pour qu'apparaisse un pic dans le vert même si on peut observer un léger arrondi vers nm sur le spectre corrigé à 160

165 l'obscurité (Fig. III.26). Pour obtenir le spectre d'émission de l'augmentation photo-induite de FBV dans les chloroplastes reconstitués corrigé de l'absorption par les pigments photosynthétiques (Fig. III.27), nous avons fait la différence (lumière moins obscurité) des spectres d'émission corrigés. Ce spectre concorde vraiment très bien avec le spectre d'émission du NADPH décalé de 10 nm vers les courtes longueurs d'onde. Ce qui confirme : premièrement, que la variation photo-induite de FBV dans les chloroplastes est bien dû seulement au NADPH, et deuxièmement qu'une partie de cette variation provient du NADPH lié aux protéines, puisque cette liaison entraîne un décalage du spectre d'émission de NADPH d'environ 20 nm vers les courtes longueurs d'onde. Par ailleurs, on observe sur la Fig. III.27 que le spectre de différence semble légèrement en dessous du spectre de NADPH dans la partie verte du spectre. Cette différence est faible et incertaine puisque d'amplitude comparable à celle du bruit, mais s'expliquerait bien comme étant la contribution des flavines (dont la fluorescence baisse à la lumière) à la variation photo-induite de FBV dans les chloroplastes reconstitués. NADPH Fluorescence (u.r.) Longueur d'onde (nm) Figure III.27 : Comparaison du spectre de différence (lumière moins obscurité), obtenu à partir des spectres d'émission de fluorescence de chloroplastes reconstitués de la Fig. III.26, avec le spectre normalisé de NADPH en solution. Le spectre de NADPH est le même que celui présenté Fig. III.13, mais il est décalé artificiellement de 10 nm vers les courtes longueurs d'onde. 161

166 III.7. Rapport entre la fluorescence bleue et la concentration en NADPH dans les chloroplastes Pour utiliser de façon quantitative la FBV comme une mesure de la concentration en NADPH dans les chloroplastes, il faut tout d'abord déterminer la relation existant entre ces deux paramètres. Tout porte à croire que, dans les gammes de concentrations qui nous intéressent tout au moins, cette relation peut être considérée comme linéaire. En effet, dans le cas de la fluorimétrie en face-avant, il y a une relation linéaire entre la fluorescence et la concentration en fluorophore lorsque : toute la lumière d'excitation est absorbée par l'échantillon (Eisinger et Flores, 1979), l'absorbance du fluorophore est négligeable par rapport à l'absorbance totale de l'échantillon (Eisinger et Flores, 1979) et que l'auto-réabsorption (qui n'est importante que pour des concentrations élevées de fluorophore) est négligeable (Srinivas et Mutharasan, 1987). Les deux premières conditions découlent directement de l'équation III.14 (p. 152), qui a été obtenue plus haut dans un cas particulier mais est en fait très générale. La première traduit le fait qu'il faut que l'exponentielle soit négligeable devant 1 et donc que (k 1 +k 2 )L soit grand (on se place dans le cas défavorable où il n'y a pas de réabsorption). La deuxième traduit le fait qu'il faut que k 1 soit négligeable devant k 2 (on se place encore une fois dans le cas défavorable où il n'y a pas de réabsorption). Une mesure de transmittance sur une solution de chloroplastes cassés (par congélation) dans le milieu général (40 μg Chl/ml) avec un spectromètre adapté (cf. légende de la Fig. III.19) a permis d'estimer (k 1 +k 2 )L, nous avons obtenu 3,5 à 340 nm pour L = 1 cm, soit 0,03 pour l'exponentielle que l'on peut donc considérer comme négligeable devant 1. Sachant que : k = C ln(10) (III.22) avec C la concentration et le coefficient d'absorptivité molaire, on peut estimer k 1. Dans le cas d'une solution de chloroplastes intacts (40 μg Chl/ml), en reprenant les données de la Table III.7 (p. 135) à la lumière pour NADPH (dont le coefficient d'absorptivité molaire 162

167 à 340 nm vaut 6220 L mol -1 cm -1 (Budavari, 1996)), on trouve une valeur de 0,01 cm -1 pour k 1, que l'on peut effectivement négliger devant k 1 +k 2 (3,5 cm -1 ) et donc devant k 2. Pour vérifier expérimentalement la linéarité entre la concentration en NADPH et la FBV dans les chloroplastes, il était nécessaire de varier la concentration de NADPH, mais sans faire varier la concentration des pigments photosynthétiques, puisqu'ils réabsorbent la FBV. Ainsi, il n'était pas possible d'utiliser des chloroplastes intacts. Pour s'approcher le plus possible des caractéristiques optiques des chloroplastes intacts en solution, nous avons utilisé des fragments de thylakoïdes lavés en solution dans le milieu général et des quantités croissantes de NADPH. Avec un tel système la question se pose de savoir si c'est la concentration totale de NADPH dans la cuve de mesure, ou la concentration de NADPH dans le chloroplaste, qu'il faut considérer pour l'étude de la relation entre la FBV et la concentration de NADPH. Or, une concentration de NADPH de 1 mm dans le chloroplaste devient une concentration de 1,25 μm si on considère le volume total d'une cuve de mesure contenant 50 μg Chl/ml. Ce qui pose un problème puisque pour NADPH en solution aqueuse l'auto-réabsorption n'est négligeable que pour une concentration inférieure à 10 μm (Srinivas et Mutharasan, 1987). Cependant, la présence en solution d'un autre composé qui absorbe la lumière, que ce soit un composé qui absorbe à la longueur d'onde d'excitation, à la longueur d'onde d'émission ou aux deux longueurs d'onde (comme la Chl), accroît la gamme de concentrations sur laquelle la relation entre la concentration du fluorophore et sa fluorescence est linéaire (Lidén et Niklasson, 1993). Plus précisément, plus la concentration du composé absorbant est élevée, plus la gamme de concentrations sur laquelle la relation est linéaire est importante. Or, dans une solution de chloroplastes intacts, le rapport entre la concentration de NADPH et celle des pigments photosynthétiques, qui réabsorbent la FBV, reste le même que l'on s'intéresse aux concentrations dans le chloroplaste ou aux concentrations totales dans la cuve de mesure. On peut donc penser que de fait la relation entre FBV et concentration en NADPH est la même que l'on considère la gamme de concentrations correspondant à l'intérieur du chloroplaste ou celle correspondant à la cuve de mesure. Malheureusement, il n'est pas possible de faire des mesures de fluorescence sur le système fragments de thylakoïdes plus 163

168 NADPH dans la gamme de concentrations correspondant aux concentrations à l'intérieur des chloroplastes, puisque cela impliquerait d'utiliser des solutions de fragments de thylakoïdes à une concentration d'environ 22 mg Chl/ml (sur la base d'un volume de chloroplaste de 45 μl/mg Chl (Heldt et Sauer, 1971)). Cependant, la linéarité entre la concentration en NADPH et la FBV a été vérifiée expérimentalement sur le système fragments de thylakoïdes plus NADPH, dans la gamme de concentrations en NADPH correspondant à la concentration totale en NADPH dans la cuve de mesure pour des solutions de chloroplastes intacts et de chloroplastes reconstitués (Fig. III.28). Pour s'assurer que les mesures de la Fig. III.28 pouvaient aussi Fluorescence (u.r.) (μg Chl / ml) NADPH (μm) 8 10 Figure III.28 : Fluorescence bleu-verte en fonction de la concentration en NADPH dans différentes solutions de thylakoïdes. La concentration en fragments de thylakoïdes (exprimée en concentration de Chl) dans le milieu général est indiquée le long des courbes. Les mesures ont été effectuées sur le fluorimètre impulsionnel. Les traits continus sont les ajustements linéaires des données expérimentales. 164

169 rendre compte de la situation dans les chloroplastes intacts, la FBV a été mesurée lors d'une transition obscurité-lumière sur une solution de chloroplastes intacts (comme ceux utilisés lors des mesures de fluorescence résolue en temps ils ont une très faible vitesse de fixation du CO 2 ) et sur une solution des mêmes chloroplastes dont l'enveloppe a été préalablement cassée (Fig. III.29). La rupture de l'enveloppe chloroplastique a été réalisée par congélation à -20 C, mais un résultat identique a été obtenu en cassant l'enveloppe par un choc hypo-osmotique. Les niveaux de FBV à l'obscurité sont assez proches et surtout l'amplitude de l'augmentation photo-induite de FBV est identique dans les deux cas. Ce qui permet de penser que la relation entre FBV et concentration en NADPH est sensiblement la même dans les deux cas, et donc qu'elle est bien linéaire aussi Chloroplastes cassés Fluorescence (u.r.) (chloroplastes intacts) Chloroplastes intacts Fluorescence (u.r.) (chloroplastes cassés) Temps (s) Figure III.29 : Comparaison de la FBV d'une solution de chloroplastes intacts (trait continu) et d'une solution des mêmes chloroplastes dont l'enveloppe a été préalablement cassée (pointillés) lors d'une transition obscurité-lumière. Les chloroplastes (80 μg Chl/ml) étaient en solution dans le milieu général contenant 5 mm de MgCl 2. L'enveloppe chloroplastique a été cassée par congélation à -20 C. Les flèches indiquent le moment où la lumière actinique (DFPP : 240 μmol photons m -2 s -1 ) a été allumée ou éteinte. 165

170 dans le cas des chloroplastes intacts. Ainsi, in vitro, dans les solutions concentrées de chloroplastes, mais aussi, par extension in vivo, il y a une relation linéaire entre la concentration en NADPH et la FBV des chloroplastes. Cependant, in vivo un autre problème vient s'ajouter aux considérations physicochimiques précédentes, dans les feuilles ou dans les solutions de chloroplastes fonctionnant normalement (qui ont une vitesse importante de fixation du CO 2 ) la concentration en RuBP augmente très nettement à la lumière (autour de 0,2 mm à l'obscurité (Dietz et Heber, 1984; Stitt et al., 1985) et jusqu'à 6-7 mm à la lumière (Dietz et Heber, 1984; Gerhardt et al., 1987; Harris et Koniger, 1997)), et peut conduire à une libération du NADPH lié à la Rubisco et donc à une augmentation du NADPH libre à la lumière. De plus, certains des effecteurs, qui se lient au site actif de la Rubisco, augmentent aussi à la lumière. Dans ce cas, puisque le rendement de fluorescence du NADPH libre est plus faible que celui du NADPH lié, la relation entre la concentration en NADPH et la FBV lors d'une transition obscurité-lumière ne devrait pas être linéaire. Cependant, il y a des effecteurs dont la concentration diminue à la lumière, en particulier CA1P (Kd = 32 nm (Berry et al., 1987)) qui a une concentration, importante à l'obscurité chez certaines espèces végétales (parfois même supérieure à la concentration de sites actifs de Rubisco) et diminuant beaucoup à la lumière (Moore et al., 1991). Ceci pourrait bien compenser la variation de RuBP. Dans ce cas, la quantité de NADPH lié à la Rubisco ne changerait pas de façon significative entre l'obscurité et la lumière, mais elle resterait toujours très faible. Il y a encore un autre aspect à examiner concernant ce problème. La liaison du NADPH avec la Rubisco n'est pas spécifique, or la fluorescence de NADPH n'augmente pas systématiquement lorsqu'il se lie aux protéines (Velick, 1961) ou lorsqu'il se lie sur des sites non-spécifiques (Weiner et al., 1972), il est donc possible que cette liaison ne modifie pas significativement le rendement de fluorescence. Malheureusement, comme on l'a vu plus haut, nos tentatives pour mesurer le rendement et le temps de vie de fluorescence de NADPH lié à la Rubisco purifiée ont échoué. Ainsi l'influence des variations du RuBP sur la linéarité de la relation entre les variations photo-induites de FBV et les variations correspondantes de concentration en NADPH dans les feuilles et les 166

171 solutions de chloroplastes ayant un fonctionnement normal, reste à approfondir. Cependant, il faut noter que la concentration de NADPH lié à la Rubisco à la lumière peut être plus faible mais pas plus importante qu'à l'obscurité, donc l'augmentation photoinduite de FBV des chloroplastes ne peut provenir que d'une augmentation de la concentration en NADPH, suite à la réduction de NADP +. III.8. Discussion et conclusion Cinq composantes temporelles se sont avérées nécessaires pour décrire correctement les déclins de FBV des chloroplastes. Comme il y a plusieurs fluorophores et potentiellement différents environnements moléculaires pour chaque fluorophore dans les chloroplastes, il est impossible de déterminer précisément l'origine de chaque composante temporelle. Cependant, nous avons montré que le NADPH, les protéines aux courtes longueurs d'ondes d'excitation et dans une moindre mesure les flavines, contribuent aux quatre premières composantes. Par contre nous ne pouvons pas proposer de fluorophore(s) responsable(s) de la composante très longue (C5). Néanmoins, d'après nos mesures on peut penser que cette composante pourrait bien avoir son origine dans les thylakoïdes. En effet, cette composante C5 reste à peu près au même niveau de fluorescence dans les chloroplastes intacts et les chloroplastes reconstitués (Fig. III.6 et III.14), et ainsi sa contribution relative à la FBV totale est plus grande dans les chloroplastes intacts que dans les chloroplastes reconstitués (Table III.3 et III.6). Le fluorophore (ou les fluorophores) responsable de cette fluorescence invariable est donc probablement situé dans les thylakoïdes. Ces derniers émettent effectivement une faible FBV et leur concentration est quasiment la même dans les solutions de chloroplastes intacts et les solutions de chloroplastes reconstitués qui ont été utilisées. Par ailleurs, suite à l'analyse simultanément spectrale et résolue en temps de la FBV des chloroplastes nous avons de bonnes raisons de penser que les flavines participent à la fluorescence verte des chloroplastes (du moins des chloroplastes reconstitués). Par 167

172 contre, nous n'avons aucune indication quant à l'identité des flavines ou flavoprotéines impliquées dans cette fluorescence. Le FAD de la FNR pourrait être un candidat puisque son principal temps de vie de fluorescence (Table III.14) est identique à celui trouvé pour les flavines dans les chloroplastes (Fig. III.11) et que la concentration en FNR est assez élevée dans les chloroplastes (Table III.7). Cependant, nous avons observé que le rendement de fluorescence du FAD de la FNR est vraiment faible, comme c'est le cas généralement dans les flavoprotéines. De plus, l'hypothèse du FAD de la FNR mène à une autre contradiction, elle ne permet pas d'expliquer que nous ayons observé la fluorescence des flavines dans les chloroplastes reconstitués et pas dans les chloroplastes intacts alors que la FNR étant lié aux thylakoïdes sa concentration est la même dans les solutions de ces deux types de chloroplastes. Des recherches supplémentaires apparaissent donc indispensables pour identifier la (les) flavine(s) qui participe(nt) à la fluorescence verte des chloroplastes. Cependant, en dehors de cette différence sur la contribution des flavines et d'une distribution un peu différente de la fluorescence entre les composantes temporelles, les variations photo-induites de FBV sont très semblables pour les chloroplastes intacts et les chloroplastes reconstitués. On peut donc raisonnablement considérer que les résultats obtenus sur les chloroplastes reconstitués sont parfaitement valables pour les chloroplastes intacts. Etant donnés, d'une part la présence dans les chloroplastes et les feuilles de fluorophores bleus autres que NADPH, et d'autre part, les effets de la réabsorption de la FBV par les pigments photosynthétiques, on peut se demander quelle est la meilleure Table III.14 : Caractéristiques temporelles de la fluorescence de la FNR excitée dans la bande d'absorption du FAD. Moyennes obtenues à partir d'une analyse globale réalisée sur 2 déclins de fluorescence. La FNR (20 μm) était en solution dans le milieu général. Longueur Longueur Composantes temporelles Temps d'onde d'excitation d'onde d'émission moyenne C'''1 longue C'''2 de vie moyen (nm) (nm) (ns) f (%) (ns) f (%) m (ns) FNR ,4 11,9 3,9 88,1 3,6 168

173 longueur d'onde d'émission pour mesurer la fluorescence du NADPH chloroplastique. Grâce à la Fig. III.13, on peut dire que dans les solutions de chloroplastes (et par extension dans les algues), malgré la réabsorption par les pigments photosynthétiques, qui diminue bien plus la fluorescence bleue que la verte, la meilleure longueur d'onde d'émission se situe autour de 460 nm ou peut être un peu moins pour les chloroplastes intacts, puisqu'ils ont une proportion de NADPH lié aux protéines plus grande que celle des chloroplastes reconstitués. La fluorescence photo-induite est en effet un peu plus grande dans la partie bleue que dans la partie verte, de plus cela permet d'éviter la contribution de la fluorescence des flavines. Pour les feuilles la situation est différente et il vaut certainement mieux utiliser une longueur d'onde d'émission dans vert, autour de 500 nm. En effet, la Fig. III.30 montre que la fluorescence photo-induite est aussi importante dans le vert que dans le bleu. Par ailleurs, la contribution de la fluorescence des flavines est faible, tandis Fluorescence (u.r.) Longueur d'onde (nm) Figure III.30 : Spectre de la FBV variable photo-induite de feuilles de pois. Les jeunes feuilles de pois d'une faible teneur en Chl (10 μg Chl cm -2 ) étaient placées dans une cuve de mesure en quartz de 0,5 mm de chemin optique. Les mesures ont été réalisées sur l'ancienne version du fluorimètre impulsionnel avec une série de filtres interférentiels (LMH 10 nm) placés successivement devant le détecteur pour obtenir le spectre. Ce spectre a été corrigé pour la réponse spectrale du détecteur. Chaque point est la moyenne de trois mesures individuelles (transition obscurité-lumière). DFPP de la lumière actinique : 300 μmol photons m -2 s

174 que celle provenant des parois cellulaires et de l'épiderme, essentiellement due aux phenylpropanoïdes, est importante puisqu'elle représente la plus grande partie de la fluorescence bleue des feuilles. Or l'utilisation d'une longueur d'onde d'émission dans le vert permet de s'affranchir, du moins en grande partie, de cette dernière fluorescence puisqu'elle a son maximum dans le bleu ( nm), conséquence de la fluorescence des acides hydroxycinnamiques (Lang et al., 1991; Morales et al., 1996; Lichtenthaler et Schweiger, 1998; Cerovic et al., 1999). Le suivi des changements photo-induits de l'état redox du NADPH chloroplastique par la mesure des variations photo-induites de FBV in vivo (feuilles, algues) est plus complexe que sur chloroplastes isolés. La présence de nombreux autres fluorophores émettant dans le bleu-vert rend généralement plus difficile (voire impossible dans un certain nombre de cas) la mesure de la FBV variable. Par ailleurs, l'interprétation des variations photo-induites de FBV est plus compliquée, car, même si l'aspect photo-induit les rends principalement dépendantes du chloroplaste (et donc du NADPH), les interactions avec le reste de la cellule sont importantes et peuvent influencer la FBV variable. Il vaut mieux dans ce cas parler du suivi des changements photo-induits de l'état redox du NAD(P)H dans les cellules végétales, sachant qu'ils sont essentiellement liés aux chloroplastes. Cette mesure peut être très utile, comme nous le verrons au chapitre IV, même si elle est moins précise que dans le cas des chloroplastes isolés, pour lesquels nous arrivons à la conclusion que la FBV peut parfaitement être utilisée pour le suivi en continu, de façon non-invasive et probablement quantitative des changements photoinduits de l'état redox du NADP. 170

175 CHAPITRE IV Utilisation de la fluorescence bleuverte du NAD(P)H pour l'étude de la régulation du métabolisme photosynthétique des végétaux

176 IV. Utilisation de la fluorescence bleu-verte du NAD(P)H pour l'étude de la régulation du métabolisme photosynthétique des végétaux IV.1. Voie chlororespiratoire de réduction non-photochimique des plastoquinones chez les algues Chlamydomonas reinhardtii Ce travail, mené principalement sur des mutants de Chlamydomonas reinhardtii sans PSI, a été réalisé en collaboration avec Laurent Cournac et Gilles Peltier (Laboratoire d'ecophysiologie de la Photosynthèse, CEA Cadarache) qui étudient ces mutants depuis quelques années, notamment en mesurant les échanges gazeux (oxygène) par spectrométrie de masse. Les mesures de FBV, accompagnées par les mesures en parallèle de la fluorescence chlorophyllienne, que nous avons effectuées sur le fluorimètre impulsionnel se sont avérées bien complémentaires des mesures de flux d'o 2. IV.1.1. La chlororespiration chez les algues Chlamydomonas reinhardtii Dans les chloroplastes des algues et des plantes supérieures il existe des voies de transport d'électrons additionnelles, s'ajoutant au transport d'électrons linéaire décrit par le schéma en "Z" (Fig. I.3, p. 12), tels que le flux cyclique d'électrons autour du PSI ou la chlororespiration (Bennoun, 1982; Peltier et al., 1987; Bendall et Manasse, 1995). On appelle chlororespiration le processus de prise d'oxygène qui résulte d'un transport d'électrons vers O 2 dans les thylakoïdes, ce phénomène est différents de la photorespiration et de la prise d'o 2 lors du cycle eau-eau. Ces voies de transport d'électrons additionnels impliquent une réduction non-photochimique de la chaîne de transport d'électron intersystèmes (c est-à-dire au niveau du pool de plastoquinones et/ou du complexe cytochrome b 6 /f) par des composés tels que le NAD(P)H (Godde et Trebst, 1980; Ravenel et al., 1994; Burrows et al., 1998; Endo et al., 1998) ou la Fd réduite (Ravenel et al., 1994; Bendall et Manasse, 1995; Endo et al., 1998). La découverte de gènes chloroplastiques (gènes ndh) ayant des homologies avec les gènes codant pour des 173

177 composants de la NADH-déhydrogénase mitochondriale (complexe I) (Ohyama et al., 1986) a suggéré la présence dans le chloroplaste d'une NAD(P)H-déhydrogénase (NDH). Par la suite, l'existence d'un tel complexe enzymatique a été confirmée (Guedeney et al., 1996; Burrows et al., 1998), et ce complexe NDH a été purifié à partir de chloroplastes de pois (Pisum sativum) et caractérisé comme étant une NADH-PQ-oxydoréductase (Sazanov et al., 1998). Cependant, bien que les Chlamydomonas reinhardtii aient été beaucoup utilisées pour étudier la chlororespiration et le flux cyclique autour du PSI (Bennoun, 1982; Bendall et Manasse, 1995; Cournac et al., 2000), le séquençage du génome chloroplastique de deux espèces de Chlamydomonas ne montre pas la présence de gènes ndh (Boudreau et al., 1994). Il est possible, bien que très peu probable, que les gènes ndh aient été transférés au génome nucléaire chez Chlamydomonas. Une autre possibilité est que dans ces algues un mécanisme différent soit impliqué dans la réduction non-photochimique du pool de PQ. La chlororespiration implique aussi une oxydation des PQ par l'oxygène, catalysée par une oxydase (Bennoun, 1982; Peltier et al., 1987; Cournac et al., 2000). Une auto-oxydation des PQ ou une activité peroxydase auraient pu être des alternatives à l'oxydase, mais elles ne sont pas en accord avec les observations expérimentales (Cournac et al., 2000). Cette oxydase n'est pas identifiée pour le moment, mais ses réponses aux inhibiteurs sont très proches de celles de l'oxydase terminale chloroplastique récemment découverte chez Arabidopsis (Carol et al., 1999; Wu et al., 1999; Cournac et al., 2000). La théorie endosymbiotique (Gray, 1989) permet d'expliquer simplement la présence d'un processus de respiration dans les chloroplastes. En effet, suivant cette théorie les chloroplastes sont issus d'un ancêtre cyanobactérien dans lequel la photosynthèse et la respiration fonctionnaient très probablement dans le même compartiment cellulaire. Dans les thylakoïdes des cyanobactéries actuelles ont lieu photosynthèse et respiration (Scherer, 1990). Les chaînes de transport d'électrons de ces deux processus ont, dans ce cas, en commun certains intermédiaires, tels que le pool de PQ (Scherer, 1990). L'existence d'un phénomène de chlororespiration, potentiellement hérité d'un ancêtre lointain, et le rôle de ce phénomène dans la bioénergétique du 174

178 chloroplaste ont été débattus ces dernières années (Bennoun, 1982; Peltier et al., 1987; Peltier et Schmidt, 1991; Bennoun, 1994; Cournac et al., 2000). Nous discuterons de ce rôle un peu plus bas (section IV.1.3.). Les flux d'électrons dans les voies additionnelles sont très faibles en comparaison du flux d'électrons linéaire, ils ne sont donc pas faciles à mettre en évidence. C'est pourquoi, l'étude de mutants sans PSI a un intérêt certain puisque le flux linéaire d'électron n'existe pas et qu'il est donc plus facile d'étudier les flux alternatifs. IV.1.2. Interaction chloroplastes-mitochondries et transfert d'électron entre PSII et O 2 dans les mutants de Chlamydomonas reinhardtii sans PSI. Dans les mutants de Chlamydomonas reinhardtii sans PSI, il n'y a pas de fixation de CO 2 à la lumière, mais il y a un flux d'électron dépendant du PSII qui se traduit par un dégagement d'oxygène (Peltier et Thibault, 1988; Cournac et al., 1997; Redding et al., 1999). Des mesures de spectrométrie de masse utilisant 18 O 2 ont montré que ce dégagement d'o 2 était couplé à une prise d'o 2 équivalente (Peltier et Thibault, 1988; Cournac et al., 1997; Redding et al., 1999), les électrons produits par le PSII à la lumière sont donc utilisés pour réduire l'o 2. Les deux premières périodes d'illumination de la Fig. IV.1 montrent bien ce flux d'électron dépendant du PSII. En effet, la fluorescence chlorophyllienne n'atteint pas son niveau de saturation avec la seule lumière actinique non-saturante, alors que cette lumière (DFPP : 25 μmol photons m -2 s -1 ) serait suffisante pour amener la fluorescence rouge à son niveau de saturation si le système était complètement bloqué (pas de flux d'électrons du tout). Une fois constatée l'existence de ce flux d'électrons du PSII vers l'o 2 dans les mutants sans PSI, il s'agissait de déterminer quel était le trajet des électrons. Le DCMU, un inhibiteur qui bloque le transfert d'électrons photosynthétique entre Q A et PQ en occupant le site Q B, inhibe très fortement la production d'o 2 induite par le fonctionnement du PSII à la lumière dans ces mutants sans PSI (Peltier et Thibault, 1988; Cournac et al., 2000). Cela est bien illustré par la Fig. IV.1, qui montre qu'en présence de DCMU le flux 175

179 1 Fluorescence rouge (u.r.) DCMU Temps (s) Figure IV.1 : Variations photo-induites de la fluorescence rouge (chlorophyllienne) de mutants de Chlamydomonas reinhardtii sans PSI (psaa ), en présence et en absence de DCMU. Les algues ont été déposées sur support solide (ASS) et la mesure a été réalisée avec le fluorimètre impulsionnel. Les flèches indiquent le moment où la lumière actinique (DFPP : 25 μmol photons m -2 s -1 ) a été allumée ou éteinte. Les flèches brisées indiquent le moment où un flash (2s) de lumière actinique saturante a été utilisé (DFPP : 300 μmol photons m -2 s -1 ). d'électrons dépendant du PSII qui existait auparavant a complètement disparut. Ces expériences avec le DCMU montrent que les PQ sont impliquées dans le transport d'électrons du PSII vers l'o 2. Par ailleurs, le flux d'électron dépendant du PSII n'est pas affecté dans un double mutant de Chlamydomonas reinhardtii sans PSI et sans complexe cytochrome b 6 /f (Cournac et al., 2000). La Fig. IV.2 montre que le flux d'électrons dépendant du PSII est bien présent dans le double mutant. Le flux du PSII vers O 2 ne passe donc pas par le complexe cytochrome b 6 /f. La première hypothèse envisagée pour expliquer ce flux d'électron du PSII vers l'oxygène (Peltier et Thibault, 1988), supposait une réduction de NAD(P) par les électrons fournit par le PSII aux PQ à l'aide d'une réaction utilisant un gradient électrochimique 176

180 transthylakoïdal, le pouvoir réducteur étant ensuite transféré à la mitochondrie pour la réduction de l'oxygène. Grâce à des mesures sur les chloroplastes de mutants de Chlamydomonas reinhardtii sans PSI, Cournac et al. (2000) ont démontré que cette explication n'était pas la bonne, puisque la consommation d'o 2 est un processus interne au chloroplaste, réalisé selon toute vraisemblance par une oxydase impliquée dans la chlororespiration. Cependant, l'activité mitochondriale a une incidence indéniable sur ce flux d'électron dépendant du PSII dans les mutants sans PSI. En effet, ce flux d'électrons est très fortement diminué lorsque la respiration mitochondriale est inhibée (Cournac et al., 2000) (c'est notamment sur ce phénomène que s'appuyait l'hypothèse de Peltier et Thibault (1988)). Pour expliquer ce phénomène Cournac et al. (2000) font l'hypothèse qu'il provient d'une inhibition du PSII due a une réduction compétitive du pool de PQ provenant de l'accumulation d'un pouvoir réducteur provoquée par l'inhibition de la Fluorescence rouge (u.r.) Temps (s) Figure IV.2 : Variations photo-induites de la fluorescence rouge (chlorophyllienne) de mutants de Chlamydomonas reinhardtii sans PSI et sans complexe cytochrome b 6 /f (psaa peta ). Les algues ont été déposées sur support solide (ASS) et la mesure a été réalisée avec le fluorimètre impulsionnel. Les flèches indiquent le moment où la lumière actinique (DFPP : 35 μmol photons m -2 s -1 ) a été allumée ou éteinte. Les flèches brisées indiquent le moment où un flash (2s) de lumière actinique saturante a été utilisé (DFPP : 300 μmol photons m -2 s -1 ). 177

181 respiration mitochondriale; la réduction non-photochimique du pool de PQ se faisant vraisemblablement suivant la même voie que celle utilisée par la chlororespiration. IV Effets des inhibiteurs du transport d'électrons mitochondrial Les mitochondries des cellules végétales ont quelques particularités, elles possèdent notamment deux voies de transfert d'électrons depuis les ubiquinones vers l'oxygène : une voie conventionnelle au travers des complexes III (cytochrome bc 1 ) et IV (cytochrome aa 3 ), et une voie utilisant une oxydase alternative (voir par ex. Douce et Neuburger, 1989). L'addition simultanée de myxothiazol, un inhibiteur du complexe cytochrome bc 1 mitochondrial, et de SHAM, un inhibiteur de l'oxydase alternative, est donc nécessaire pour inhiber la respiration mitochondriale. Le myxothiazol ou le SHAM ajoutés seuls n'ont pratiquement pas d'effet sur la prise totale d'oxygène. Pour étudier l'influence de l'inhibition de la respiration mitochondriale sur le flux d'électrons dépendant du PSII dans les mutants sans PSI, il faut donc ajouter simultanément ces deux inhibiteurs. En effet, le flux d'électrons du PSII vers l'o 2 n'est pas affecté par l'ajout de myxothiazol ou de SHAM seul, par contre il est inhibé par l'ajout de ces deux inhibiteurs (Cournac et al., 2000). Cette inhibition est bien la conséquence de l'inhibition de la respiration mitochondriale, elle n'est pas due à une réaction des inhibiteurs avec des composants chloroplastiques (Cournac et al., 2000). La sensibilité du flux d'électrons dépendant du PSII par rapport aux inhibiteurs mitochondriaux est variable, elle dépend de la disponibilité en carbone organique du milieu dans lequel se trouvent les algues. En effet, les algues qui sont placées dans un milieu TAP, dans lequel l'acétate alimente le CAT (cycle des acides tricarboxyliques) et fournit ainsi un pouvoir réducteur, sont plus sensibles que celles qui sont placées dans un milieu minimal (sans acétate) ou un tampon Hepes (Cournac L., Latouche G., Cerovic Z.G., Redding K., Ravenel J. & Peltier G., article en préparation). Ce résultat montre que l'influence de l'inhibition de la respiration mitochondriale sur le flux d'électrons du PSII vers O 2 est dépendante de l'état redox de la cellule. 178

182 Dans le même ordre d'idée, les expériences présentées Fig. IV.3 ont été réalisées sur des algues sauvages pour évaluer l'influence de l'état redox de la cellule sur la chlororespiration. Avec les algues sauvages placées dans un milieu TAP à l'obscurité, une modification transitoire de la prise d'oxygène est induite par une impulsion lumineuse très Figure IV.3 : Perturbation de la consommation d'oxygène d'algues sauvages adaptées à l'obscurité induite par une brève impulsion lumineuse (1 μs). Les algues ont été déposées sur une électrode de platine nue, dans un système identique à celui décrit par Schmid et Thibault (1979). La perturbation due à la lumière induit une inhibition transitoire de la prise d'oxygène, qui apparaît comme une augmentation transitoire du signal de l'oxygène sur l'électrode. Les flèches indiquent le moment auquel l'impulsion lumineuse a été déclenchée. A : les algues sont d'abord resuspendues dans une solution d'acétate (2 mm), puis laissées pendant un long moment (4 h) in situ jusqu'à ce que l'acétate soit consommé, ensuite de l'acétate est à nouveau fourni aux algues. B : des algues adaptées au milieu minimum ont été déposées sur l'électrode puis les inhibiteurs mitochondriaux myxothiazol et SHAM ont été ajoutés. D'après (Cournac L., Latouche G., Cerovic Z.G., Redding K., Ravenel J. & Peltier G., article en préparation). 179

183 courte, flash "single-turnover" (une seule réduction de Q A au maximum par centre réactionnel), comme le montre la première courbe de la Fig. IV.3 A. Cette perturbation est la conséquence de l'interaction du PSI avec la chlororespiration (Peltier et al., 1987). La Fig. IV.3 A montre qu'avec des algues sauvages placées dans les mêmes conditions mais affamées (privées de source extérieure de carbone organique), le signal caractéristique de l'inhibition de la chlororespiration par le fonctionnement du PSI disparaît, mais un autre signal, avec une cinétique bien plus lente, apparaît. Un résultat identique est obtenu avec des algues cultivées sur milieu minimal (Fig. IV.3 B). Lorsque la respiration mitochondriale est inhibée par l'addition de myxothiazol et de SHAM (Fig. IV.3 B), ou lorsque de l'acétate est ajouté (Fig. IV.3 A), on retrouve le signal caractéristique d'une inhibition de la chlororespiration. De plus, le signal lent n'est pas modifié par la présence de 1 mm de propyl gallate (PG) (un puissant inhibiteur de l'oxydase chloroplastique (Cournac et al., 2000)), tandis que le signal caractéristique de l'inhibition de la chlororespiration est supprimé par l'ajout de ce produit (Cournac et al., 2000). On peut expliquer ces résultats de la façon suivante. Lorsque les algues sont privées de source extérieure de carbone organique, elles sont dans un état oxydé, la réduction des PQ est faible et la chlororespiration est faible, voire inexistante. L'impulsion lumineuse induit une oxydation des PQ par le PSI, qui est compensée par une réduction non-photochimique de ces PQ par les composés réducteurs du stroma (NAD(P)H, Fd réduite), qui sont en équilibre redox avec leurs équivalents mitochondriaux. Cela se traduit par une baisse du pouvoir réducteur au niveau des mitochondries et donc une baisse transitoire de la respiration mitochondriale. Dans ce cas, l'effet de l'impulsion lumineuse est qualitativement comparable au signal caractéristique de la chlororespiration, mais se développe plus lentement, puisqu'il implique une communication entre chloroplastes et mitochondries. En présence d'acétate ou lorsque la respiration mitochondriale est inhibée, les algues sont dans un état réduit, la réduction des PQ est plus active et la chlororespiration aussi. Alors, l'oxydation transitoire du pool de PQ par le PSI induite par l'impulsion lumineuse interfère uniquement avec la chlororespiration en la ralentissant transitoirement. On déduit de ces expériences qu'un état réduit, c est-à-dire un pouvoir 180

184 réducteur important (provoqué soit par une production forte de réducteurs, présence d'acétate, soit par une inhibition de sa consommation, présence de myxothiazol plus SHAM), stimule ou favorise le flux d'électrons chlororespiratoire. Les résultats précédents ont montrés le rôle important joué par l'état redox de la cellule, c'est-à-dire l'état redox du NAD(P), sur le flux d'électron vers l'o 2 dans les algues sauvages et les mutants sans PSI, ce qui est en accord avec l'implication du NAD(P)H dans la réduction non-photochimique des PQ qui a été proposé par plusieurs auteurs (Godde et Trebst, 1980; Peltier et Schmidt, 1991). La FBV nous permet de suivre les variations photo-induites de l'état redox du pool de NAD(P). Aussi, était-ce une méthode parfaitement indiqué pour déterminer l'origine de l'inhibition du flux d'électron de PSII vers O 2 par les inhibiteurs mitochondriaux et étudier les interactions entre mitochondrie et chloroplastes dans les mutants de Chlamydomonas reinhardtii sans PSI qui semblent à l'origine de cette inhibition. IV Mesures simultanées de la fluorescence bleu-verte et de la fluorescence chlorophyllienne Nous avons enregistré la FBV (et la fluorescence rouge en parallèle) au cours de transitions obscurité-lumière-obscurité sur des algues sauvages et des mutants sans PSI en présence et en absence des inhibiteurs myxothiazol et SHAM (Fig. IV.4). Avec les algues sauvages (Fig. IV.4 A), le paramètre F V '/F M ' (fluorescence rouge) montre que le flux d'électron photosynthétique linéaire est important. L'augmentation du niveau de FBV à la lumière traduit un état plus réduit du pool de NAD(P)H, ce qui est normal puisque la chaîne de transport d'électrons photosynthétiques est parfaitement fonctionnelle. Avec les mutants sans PSI (Fig. IV.4 B), la très petite variation photo-induite de FBV montre que la réduction photo-induite du NAD(P)H est très faible. De même, le flux d'électrons dépendant du PSII (estimé par F V '/F M ') est nettement plus faible que dans les algues sauvages. Lorsque l'activité mitochondriale est bloquée par l'addition de myxothiazol et de SHAM dans les mutants sans PSI (Fig. IV.4 C), la variation photo-induite ainsi que le 181

185 0.6 1 A B C Fluorescence rouge (u.r.) Fluorescence bleu-verte (u.r.) Temps (s) Temps (s) Temps (s) Figure IV.4 : Comparaison des variations photo-induites de FBV (trait continu) et de fluorescence rouge (pointillés) entre : A) des Chlamydomonas reinhardtii sauvages; B) des mutants sans PSI (psaa ); C) des mutants sans PSI (psaa ) traités avec du myxothiazol (8 μm) et du SHAM (1,6 mm) avant la mesure. Les algues ont été déposées sur support solide (ASS) et la mesure a été réalisée avec le fluorimètre impulsionnel. Les flèches indiquent le moment où la lumière actinique (DFPP : 50 μmol photons m -2 s -1 ) a été allumée ou éteinte. Les flèches brisées indiquent le moment ou un flash (2s) de lumière actinique saturante a été utilisé (DFPP : 300 μmol photons m -2 s -1 ). niveau à l'obscurité de la FBV augmentent nettement. Ceci traduit une réduction supplémentaire du pool de NAD(P)H, à la fois à l'obscurité et lors des transitions obscurité-lumière. Ces résultats sont bien en accord avec l'hypothèse selon laquelle l'inhibition de l'activité du PSII des mutants sans PSI par les inhibiteurs de la respiration mitochondriale est la conséquence d'une compétition pour la réduction des PQ entre le PSII et une voie non-photochimique qui utilise le pouvoir réducteur, pouvoir réducteur qui augmente en présence de myxothiazol plus SHAM, comme le montre l'augmentation de FBV. En effet, l'addition de myxothiazol et de SHAM bloque la respiration mitochondriale, ce qui a pour effet d'induire une réduction du pool de NAD(P) et de stimuler la chlororespiration. Dans ces conditions, à la lumière, le PSII et la voie nonphotochimique sont en compétition pour réduire les PQ et s'inhibent donc l'un l'autre. Ce 182

186 qui se traduit par une diminution du flux d'électron dépendant du PSII et par une augmentation de la concentration de NAD(P)H, qui ne peut pas être compensée par une activité plus grande des mitochondries. On explique ainsi, pourquoi lors des périodes de lumière l'effet de l'activité du PSII sur le niveau redox de NAD(P) est plus important en présence d'inhibiteurs de la respiration mitochondriale. IV Effets du propyl gallate et des découplants La Fig. IV.5 illustre bien l'action du PG sur l'oxydase présente dans les thylakoïdes Figure IV.5 : Variations de la fluorescence rouge (chlorophyllienne) de thylakoïdes de mutants de Chlamydomonas reinhardtii sans PSI (psaa ) en solution suite à l'ajout de NADH (1 mm), de PG (1 mm) et à la suppression de O 2 dans le milieu (anoxia). Les mesures ont été effectuées à l'aide d'un PAM L'anoxie est obtenue par l'ajout de glucose (20 mm), glucose oxydase (2 mg/ml) et catalase (1000 U/ml), un système bien connu qui en oxydant le glucose consomme très rapidement tout l'o 2 du milieu. D'après (Cournac L., Latouche G., Cerovic Z.G., Redding K., Ravenel J. & Peltier G., article en préparation). 183

187 de Chlamydomonas reinhardtii. Les thylakoïdes ont été obtenus par une méthode très voisine de celle décrite dans (Cournac et al., 2000) et leur fluorescence chlorophyllienne a été mesurée à l'aide d'un fluorimètre impulsionnel commercial le PAM (Heinz Walz, Effeltrich, Allemagne). L'ajout de NADH (1 mm) à une solution de thylakoïdes de mutants sans PSI ne provoque pas une réduction significative du pool de PQ. Par contre, en présence de PG le même ajout de NADH provoque une augmentation très nette de fluorescence chlorophyllienne, qui traduit une réduction importante du pool de PQ. La réduction est plus importante quand NADH est ajouté lors d'une anoxie. Des résultats identiques ont été obtenus en ajoutant NADPH à la place de NADH. Les découplants sont des composés qui suppriment le gradient transmembranaire de protons et/ou le champ électrique transmembranaire. Peltier et Thibault (1988) ont observé que le CCCP (un découplant à la fois du gradient de protons et du champ électrique) inhibait le flux d'électron du PSII vers l'o 2 dans des mutants de Chlamydomonas reinhardtii déficients en PSI. Cependant, cet effet des découplants n'est pas observé avec les chloroplastes ou les thylakoïdes isolés des mutants sans PSI (Cournac L. et al., article en préparation). Nous avons utilisé deux découplants différents : la nigéricine et le crown. Cela nous a permis de supprimer, soit le gradient de protons (principale composante du gradient électrochimique transthylakoïdal dans les chloroplastes), soit le champ électrique (principale composante du gradient électrochimique transmembranaire dans les mitochondries). La nigéricine est un découplant du gradient de protons mais pas du champ électrique. Elle est connue pour avoir un puissant effet découplant dans les chloroplastes, mais n'a pas d'effet découplant dans les mitochondries (Douce et Neuburger, 1989), ce qui explique pourquoi l'ajout de nigéricine n'a pratiquement pas d'effet d'accélération de la respiration à l'obscurité sur les algues que nous utilisons (Cournac L. et al., article en préparation). Au contraire, le crown (un découplant du champ électrique mais pas du gradient de protons) a un effet puissant sur les mitochondries et accélère considérablement la consommation d'oxygène mitochondriale des algues que nous utilisons (Cournac L. et al., article en préparation). 184

188 IV Effets comparatifs et combinés des inhibiteurs mitochondriaux, du propyl gallate et des découplants sur la fluorescence bleu-verte et sur la fluorescence chlorophyllienne Les expériences suivantes ont été réalisées sur des algues en solution et pas sur des ASS. Le grand désavantage de ce changement de type d'échantillons est une dégradation du rapport signal/bruit. En contrepartie, cela permet de mieux contrôler les conditions expérimentales, notamment la concentration des inhibiteurs, et de se rapprocher des conditions expérimentales utilisées lors des mesures d'échange d'o 2. Cette diminution du rapport signal/bruit avec les algues en solutions est la conséquence de l'agitation permanente des solutions qui amène transitoirement des micro-aggrégats d'algues ou des impuretés fluorescentes dans le trajet du faisceau de mesure. Par ailleurs, la plupart des inhibiteurs utilisés dans les expériences suivantes absorbent significativement la lumière UV et émettent éventuellement de la FBV. Dans ces cas, l'effet d'écran du faisceau d'excitation par les inhibiteurs, qui diminue le niveau de fluorescence rouge, a été compensé en utilisant le rapport entre le niveau de fluorescence rouge après et avant l'addition des inhibiteurs comme facteur de la baisse de fluorescence rouge due à cet effet d'écran. De même, la FBV constante provenant des inhibiteurs, qui vient s'ajouter à la FBV des algues, est estimée par la montée immédiate de FBV, qui coïncide avec l'ajout de ces inhibiteurs, et elle est soustraite du signal total. La Fig. IV.6 permet de comparer les effets des inhibiteurs mitochondriaux (myxothiazol et SHAM) et du PG sur les variations photo-induites de FBV et de fluorescence rouge. La diminution du paramètre F V '/F M ' (fluorescence rouge) est nettement plus grande après l'ajout de PG qu'après l'ajout myxothiazol et SHAM, on en déduit que l'activité du PSII est plus affectée par le PG que par myxothiazol et SHAM. Ce paramètre nous montre aussi que l'addition des trois inhibiteurs supprime totalement le flux d'électrons dépendant du PSII. Le niveau de fluorescence rouge reflète le taux de réduction du premier accepteur Q A qui est déterminé principalement par l'état redox du pool de PQ. Le niveau de fluorescence rouge à l'obscurité n'augmente pas en présence de 185

189 Fluorescence rouge (u.r.) A Mx+SH PG Fluorescence bleu-verte (u.r.) Fluorescence rouge (u.r.) B PG Mx+SH Fluorescence bleu-verte (u.r.) Temps (s) Figure IV.6 : Variations photo-induites de la FBV (trait continu) et de la fluorescence rouge (pointillés) de mutants de Chlamydomonas reinhardtii sans PSI (psaa ). Les algues étaient en solution (agitation permanente) dans une cuve de mesure standard en quartz. Les inhibiteurs myxothiazol (Mx, 4 μm concentration finale), SHAM (SH, 0,8 mm concentration finale) et propyl gallate (PG, 1 mm concentration finale) ont été ajoutés aux moments indiqués. Les périodes d'illumination actinique (DFPP : 80 μmol photons m -2 s -1 ) sont facilement identifiables grâce à l augmentation de la fluorescence rouge. Les pics de fluorescence rouge au centre des périodes d'illuminations sont induits par des flashs (2s) de lumière saturante (DFPP : 300 μmol photons m -2 s -1 ). myxothiazol et SHAM, ce qui nous indique que le pool de PQ n'est pas particulièrement réduit, bien que la réduction du pool de NAD(P) soit importante. Quand le PG est ajouté en plus du myxothiazol et du SHAM, la fluorescence rouge augmente, ce qui montre que le pool de PQ est nettement réduit, tandis que le NAD(P) ne subit qu'une faible réduction 186

190 supplémentaire. Par ailleurs, le PG seul n'a pas d'influence sur le niveau de fluorescence rouge à l'obscurité. Il apparaît donc qu'une réduction importante du pool de PQ nécessite à la fois une accumulation de pouvoir réducteur et une inhibition de l'oxydase chloroplastique. L'addition du PG seul, bien qu'elle se traduise par une inhibition de l'oxydase chloroplastique, n'affecte pas la FBV à l'obscurité, ce qui est en accord avec le fait que le PG n'affecte pas la consommation d'o 2 à l'obscurité (Cournac et al., 2000). Cependant, en présence de myxothiazol et SHAM le PG supprime l'augmentation photoinduite de FBV. Ceci confirme que la réduction photo-induite du NAD(P) provient d'une compétition entre la PQ-réductase non-photochimique et le PSII pour la réduction des PQ. Cette compétition se produit à la lumière mais ne peut avoir lieu que lorsque la chlororespiration est active, c est-à-dire lorsqu'il existe déjà à l'obscurité dans les chloroplastes un flux d'électron depuis le NAD(P)H vers l'o 2. En supprimant la chlororespiration, le PG supprime le flux du NAD(P)H vers l'o 2 dans les chloroplastes et donc supprime l'interaction entre NAD(P)H et les PQ, ce qui se traduit par la suppression de la stimulation photo-induite de la réduction du pool de NAD(P). L'ampleur de l'augmentation photo-induite de NAD(P)H est donc fortement dépendante de l'intensité de la chlororespiration. L'ajout de nigéricine n'a pas d'effet sur le flux d'électrons dépendant du PSII, comme le montre le paramètre F V '/F M ' qui n'est pas du tout influencé par cet ajout (Fig. IV.7 B). La nigéricine n'a pas d'effet non plus sur l'état redox du NAD(P). La Fig. IV.7 A nous montre que l'ajout de crown aux mutants sans PSI se traduit : par une inhibition du flux d'électrons dépendant du PSII (baisse de F V '/F M '), par une réduction du pool de NAD(P) (monté de la FBV) et par une augmentation de la variation photo-induite de l'état redox du NAD(P) (augmentation de la variation photo-induite de FBV). L'effet des découplants du champ électrique apparaît ainsi très similaire à celui de l'addition simultanée de myxothiazol et de SHAM. On peut l'expliquer de la façon suivante : le découplage du champ électrique affecte essentiellement les mitochondries bloquant le fonctionnement des ATP-synthases et donc la production d'atp. La baisse de la concentration d'atp, qui en résulte, stimule la glycolyse et donc une réduction du pool de 187

191 Fluorescence rouge (u.r.) A Crown Fluorescence bleu-verte (u.r.) Fluorescence rouge (u.r.) B Nigéricine Fluorescence bleu-verte (u.r.) Temps (s) 0.06 Figure IV.7 : Variations photo-induites de la FBV (trait continu) et de la fluorescence rouge (pointillés) de mutants de Chlamydomonas reinhardtii sans PSI (psaa ). Les algues étaient en solution (agitation permanente) dans une cuve de mesure standard en quartz. Les découplants crown (1 mm concentration finale) et nigéricine (1 μm concentration finale) ont été ajoutés aux moments indiqués. Les périodes d'illumination actinique (DFPP : 80 μmol photons m -2 s -1 ) sont facilement identifiables grâce à l'augmentation de la fluorescence rouge. Les pics de fluorescence rouge au centre des périodes d'illuminations sont induits par des flashs (2s) de lumière saturante (DFPP : 300 μmol photons m -2 s -1 ). NAD(P) (Gans et Rebeille, 1990). Cette augmentation du NAD(P)H entraîne, comme lors de l'ajout de myxothiazol et de SHAM, une augmentation de la réduction nonphotochimique des PQ et de la chlororespiration. 188

192 IV.1.3. Discussion et conclusion Les mesures de FBV montrent que le NAD(P)H est impliqué dans l'interaction entre les chloroplastes et les mitochondries et dans la réduction non-photochimique des PQ, mais ne permettent pas de savoir si NAD(P)H réagit directement avec les PQ. Les expériences de la Fig. IV.5 montrent que NAD(P)H peut réduire le pool de PQ et que cette réduction dépend de l'interaction entre thylakoïdes et oxygène. Le PG seul et le NAD(P)H seul n'ont pratiquement aucune incidence sur l'état redox des PQ, par contre, leur présence simultanée induit une réduction du pool de PQ. Ce comportement est tout à fait similaire à ce que nous avons observé in vivo concernant la réponse de l'état redox des PQ à l'inhibition de la respiration mitochondriale et à l'addition de PG. Ces expériences nous amènent à conclure à l'existence d'une activité NAD(P)H-PQ-oxydoréductase dans les thylakoïdes de Chlamydomonas reinhardtii, qui, étant donné l'absence de gènes ndh dans ces algues, pourrait être similaire à celle décrite récemment dans les chloroplastes de pomme de terre (Corneille et al., 1998). L'affinité similaire observée à l'égard de NADH et de NADPH lors de l'expérience sur les thylakoïdes est un argument supplémentaire en faveur de cette hypothèse. Cependant, on ne peut pas exclure l'implication d'autres types d'interactions entre les PQ et le pouvoir réducteur. Pour pouvoir éclaircir correctement ce point il faudrait rechercher les bases moléculaires de cette (ces) interaction(s) du pouvoir réducteur avec les PQ. L'existence d'une PQ-oxydase chloroplastique et d'une activité NAD(P)H-PQoxydoréductase dans les thylakoïdes plaident très fortement en faveur de l'existence dans les Chlamydomonas reinhardtii d'une chlororespiration dont la chaîne de transfert d'électrons irait du NAD(P)H (et peut-être aussi de la Fd réduite) à l'o 2 en passant par les PQ. Lorsque la chlororespiration a été proposée par Bennoun (1982) dans les Chlamydomonas reinhardtii, elle était supposé être électrogénique et donc responsable, au moins en partie, du gradient électrochimique transthylakoïdal dans les chloroplastes à l'obscurité. Elle aurait pu ainsi participer à la production d'atp dans les chloroplastes à l'obscurité. Cependant, plus récemment, Bennoun (1994) a remis en question le rôle de la 189

193 chlororespiration dans l'établissement du gradient électrochimique à l'obscurité, et Cournac et al. (2000) propose que la chaîne de transport d'électrons chlororespiratoire ne soit pas (ou soit peu) électrogénique. Dans ce cas, la fonction physiologique de la chlororespiration ne serait pas essentiellement liée à la production d'atp, et le flux d'électrons chlororespiratoire aurait plutôt une fonction de régulation qui gaspille le pouvoir réducteur sans rien fournir en échange. L'inhibition de l'oxydase chloroplastique par le PG n'a pas d'effet significatif sur le flux d'électrons photosynthétique linéaire dans les algues sauvages, ce qui montre que le flux d'électrons entre les PQ et l'o 2 est marginal à la lumière dans des conditions normales (Cournac et al., 2000). Cependant, on peut penser que dans des conditions où le pool de PQ est très fortement réduit, ce mécanisme pourrait empêcher la sur-réduction des PQ. De telles conditions se rencontrent quand le PSI est bloqué ou lors de l'induction de la photosynthèse; c'est par exemple le cas pour certaines espèces lors de l exposition simultanée au froid et à une forte lumière (Havaux, 1987). D'autre part, la réduction non-photochimique des PQ pourrait faire partie d'un mécanisme d'inhibition de la photosynthèse quand le pouvoir réducteur devient trop grand. Cette sur-accumulation de pouvoir réducteur pouvant provenir directement du chloroplaste ou de la mitochondrie étant donné l'interaction mitochondrie-chloroplaste. Par ailleurs, en dehors de ces effets de régulation, la chlororespiration pourrait être impliquée dans la synthèse de composants chloroplastiques dépendante de l'état redox des PQ. C'est apparemment le cas de la synthèse des caroténoïdes chez Arabidopsis (Norris et al., 1995), synthèse qui dépend de l'activité d'une protéine qui est vraisemblablement une oxydase chloroplastique (Carol et al., 1999; Wu et al., 1999). 190

194 IV.2. Voie de réduction non-photochimique des plastoquinones dans les chloroplastes de plantes supérieures IV.2.1. Introduction Lorsqu'on se place dans des conditions favorables (notamment illumination assez intense et assez longue) on observe juste après une transition lumière-obscurité une augmentation transitoire de la fluorescence chlorophyllienne (cf. Fig. IV.8). Cette augmentation transitoire est le résultat de la réduction non-photochimique des PQ par les réducteurs accumulés pendant la période de lumière (Mano et al., 1995). C'est pour cette raison qu'elle est souvent utilisée dans les travaux sur la chlororespiration et le flux d'électrons cyclique autour du PSI (par ex. Mano et al., 1995; Endo et al., 1998; Feild et al., 1998), puisque la voie non-photochimique de réduction des PQ est impliquée dans ces deux phénomènes. Dans la section précédente (IV.1.), nous nous sommes intéressés principalement à la chlororespiration, puisque nous travaillions sur des mutants sans PSI dans lesquels il ne peut pas y avoir de flux d'électrons cyclique. Le flux d'électrons cyclique autour du PSI (pour des articles de synthèse voir Bendall et Manasse, 1995; Asada et al., 1998) se produirait de la façon suivante : une partie des électrons fournis par le PSI à la Fd et/ou au NADP sert à réduire les PQ, ensuite les électrons empruntent la chaîne de transport linéaire de la photosynthèse, ils passent des PQ au complexe cytochrome b 6 /f puis aux PC avant de revenir au PSI. Un tel flux participe donc à l'établissement du gradient de protons transthylakoïdal. Un rôle physiologique multiple est attribué au flux d'électrons cyclique autour du PSI (Asada et al., 1998), notamment : permettre la production d'atp supplémentaire lorsque le flux linéaire ne suffit pas, et encourager les processus de désactivation thermique lorsque le rendement photochimique du PSII est trop élevé par rapport au reste du processus photosynthétique. En ce qui concerne la réduction non-photochimique des PQ, il semble qu'il y ait deux voies empruntées par les électrons (Mano et al., 1995; Asada et al., 1998; Endo et al., 191

195 1998; Feild et al., 1998). Une voie FQR (ferrédoxine quinone réductase) dans laquelle c'est la Fd réduite qui réduit les PQ. Cette voie est inhibée par l'antimycine A et elle impliquerait la participation d'un cytochrome b (Miyake et al., 1995). L'autre voie est celle de la NDH dont nous avons parlé précédemment. Les gènes codant pour cette protéine ont été découverts dans le génome chloroplastique d'un certain nombre d'espèces et elle a été purifiée et partiellement caractérisée à partir de chloroplastes de pois (Sazanov et al., 1998). Il y a visiblement une diversité assez importante parmi les différents organismes photosynthétiques en ce qui concerne les composants impliqués dans la réduction non-photochimique des PQ (Endo et al., 1998). En effet, les deux voies semblent être présentes simultanément chez les plantes supérieures (Mano et al., 1995; Asada et al., 1998; Endo et al., 1998; Feild et al., 1998), mais il y a apparemment des différences dans la répartition du flux d'électrons entre ces deux voies. En effet, dans les épinards (plante C 3 ) la quantité (par molécule de Chl) du cytochrome b - 559, qui est impliqué dans la voie FQR, est 10 % de ce qu'elle est dans le maïs (plante C 4 ) (Miyake et al., 1995). Dans les cyanobactéries, la NDH est présente (Asada et al., 1998) et sert apparemment d'intermédiaire aussi bien à la réduction des PQ par NAD(P)H que par la Fd; la voie FQR sensible à l'antimycine A n'est pas présente (Mi et al., 1995). Enfin, dans les Chlamydomonas, les deux voies sont présentes simultanément (Ravenel et al., 1994), mais comme nous l'avons conclu dans la section précédente (IV.1.) l'activité NAD(P)H- PQ-oxydoréductase est différente de la NDH dont les gènes sont absents du chloroplaste. Les mesures réalisées par Mano et al. (1995) sur des chloroplastes intacts d'épinard montrent que le flux d'électrons du NADPH vers les PQ est régulé par la lumière. En effet, une partie au moins de ce flux est induit par la lumière et cesse à l'obscurité. Une explication possible serait la modulation de l'activité de la FNR par la lumière (activation à la lumière, désactivation à l'obscurité) qui a été observée et étudiée (Carrillo et al., 1981; Carrillo et Vallejos, 1983; Rühle et al., 1987). La FNR pourrait bien effectivement être impliquée dans la réduction non-photochimique des PQ par NAD(P)H par la voie FQR, puisqu'un transfert d'électrons de NAD(P)H à la Fd est nécessaire dans ce cas. 192

196 IV Transitions lumière-obscurité D'après les expériences rapportées dans la littérature, on connaît l'influence d'un certain nombre de paramètres sur l'augmentation transitoire de fluorescence chlorophyllienne qui suit immédiatement une transition lumière-obscurité. L'amplitude de cette augmentation transitoire s'accroît avec la durée et l'intensité de la lumière actinique (Mano et al., 1995). Sa durée peut varier de façon importante d'une espèce à l'autre (Feild et al., 1998), mais elle est sensiblement la même pour les chloroplastes intacts d'épinard (Mano et al., 1995) et pour les chloroplastes intacts de pois sur lesquels nous avons réalisé nos mesures. Pour obtenir une augmentation transitoire de fluorescence rouge après une transition lumière-obscurité sur des chloroplastes intacts il est nécessaire que la photosynthèse soit suffisamment importante (Mano et al., 1995). L'augmentation transitoire de fluorescence rouge après une transition lumière-obscurité est transitoirement supprimée par une lumière rouge lointain (Mano et al., 1995; Asada et al., 1998; Feild et al., 1998), qui fait fonctionner le PSI mais pas le PSII et permet ainsi une réoxydation des PQ. L'augmentation transitoire de fluorescence rouge est en partie inhibée par l'ajout d'antimycine A (Mano et al., 1995; Endo et al., 1998) et, dans les chloroplastes intacts, elle augmente avec l'ajout de DHAP (Mano et al., 1995). En s'appuyant sur les résultats précédents et étant donné le rôle important que semble jouer NAD(P)H dans l'augmentation transitoire de fluorescence chlorophyllienne qui suit immédiatement une transition lumière-obscurité, nous avons voulu utiliser la FBV pour suivre l'état redox du NAD(P) lors de ces transitions. En effet, la mesure des variations photo-induites de FBV sur les chloroplastes isolés intacts nous permet suivre les changements photo-induits de l'état redox du NAD(P)H. En fait, comme nous l'avons vu précédemment, sur chloroplastes isolé les changement redox photo-induits du pool de NAD(P) sont des changement du pool de NADP, puisque le pool de NAD est presque toujours essentiellement oxydé (Heber et Santarius, 1965; Heineke et al., 1991). 193

197 IV.2.2. Mesures simultanées de la fluorescence bleu-verte et de la fluorescence rouge lors de transitions lumière-obscurité Pour vérifier le bon fonctionnement de la photosynthèse dans nos chloroplastes isolés dans les conditions de mesure de la fluorescence, nous avons mesuré la vitesse de dégagement d'oxygène lors des mesures de fluorescence en introduisant dans la cuve de mesure une électrode à oxygène de type Clark (Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, USA). Cette vitesse était au environ de 30 μmol O2 (mg Chl) -1 h -1 pour tous les échantillons utilisés, c'est une vitesse faible par rapport à celle qui est mesurée lors de l'isolation des chloroplastes (voir section II.2.2.) en raison de l'intensité de la lumière actinique qui est environ six fois plus faible. La mesure simultanée de la FBV et de la fluorescence rouge de chloroplastes intacts de pois lors d'une transition lumière-obscurité est présentée Fig. IV.8. L'augmentation transitoire de fluorescence chlorophyllienne qui peut se produire après une transition lumière-obscurité est nettement visible. Par contre, pendant la période d'obscurité qui suit immédiatement la transition lumière-obscurité la FBV n'a pas d'autre variation que son retour au niveau qu'elle avait avant la période d'illumination. On en déduit que pendant la période correspondant à l'augmentation transitoire de fluorescence chlorophyllienne après une transition lumière-obscurité, qui traduit la réduction nonphotochimique des PQ par les réducteurs accumulés à la lumière, il n'y a pas une réduction supplémentaire (par rapport au niveau à l'obscurité) du pool de NAD(P), dont l'état redox reste constant durant toute cette période. Par ailleurs, l'ajout de lumière rouge lointain (environ 80 μmol photons m -2 s -1 ) lors de l'augmentation transitoire de fluorescence chlorophyllienne après une transition lumière-obscurité a bien induit, comme prévu, une suppression temporaire de l'augmentation transitoire, mais n'a pas eu d'effet visible sur le niveau de FBV et donc sur l'état redox du pool de NAD(P). Ces résultats montrent que le NAD(P)H n'est qu'un intermédiaire dans ce processus entre le pool de PQ et les métabolites produites par la photosynthèse (comme le DHAP), accumulées pendant la période d'illumination et dont une partie se réoxyde juste après l'extinction de la lumière. 194

198 0.65 Fluorescence rouge (u.r.) Fluorescence bleu-verte (u.r.) Temps (s) Figure IV.8 : Mesure simultanée de la FBV (trait continu) et de la fluorescence rouge (pointillés) de chloroplastes de pois lors d'une transition lumière-obscurité. Les chloroplastes isolés intacts de pois (30 μg Chl/ml) étaient en solution dans un milieu général contenant 10 mm KHCO 3, 0,2 mm KH 2 PO 4, 1 mm ATP, 5 mm K 4 P 2 O 7, 0,2 mm PGA et 1000 unités/ml de catalase. La période d'illumination actinique (DFPP : 240 μmol photons m -2 s -1 ) est facilement identifiable grâce à l'augmentation de la fluorescence rouge. Les six pics de fluorescence rouge pendant la période d'illumination sont induits par des flashs (2s) de lumière saturante (DFPP : 400 μmol photons m -2 s -1 ). On remarque qu'il y a un bruit important sur le signal de FBV. Cela est dû à l'agitation, pour les mêmes raisons que lors des expériences sur les algues en solution. Lors de l'expérience présentée Fig. IV.9, nous avons ajouté de l'antimycine A peu avant l'extinction de la lumière. L'antimycine A étant fluorescente dans le bleu-vert (Wolfbeis, 1985), nous avons procédé comme lors des expériences sur les algues : la FBV constante provenant de l'inhibiteur, qui vient s'ajouter à la FBV de la solution de chloroplastes, est estimée par la montée immédiate de FBV, qui coïncide avec l'ajout de l'inhibiteur, et elle est soustraite du signal total. Cet ajout d'antimycine A entraîne une augmentation de la fluorescence rouge car elle inhibe partiellement le site Q B, ce qui a l'avantage de nous montrer que l'antimycine A a parfaitement pénétré dans les 195

199 AA Fluorescence rouge (u.r.) Fluorescence bleu-verte (u.r.) Temps (s) Figure IV.9 : Mesure simultanée de la FBV (trait continu) et de la fluorescence rouge (pointillés) de chloroplastes de pois lors d'une transition lumière-obscurité en présence d'antimycine A. Les chloroplastes isolés intacts de pois (30 μg Chl/ml) étaient en solution dans un milieu général contenant 10 mm KHCO 3, 0,2 mm KH 2 PO 4, 1 mm ATP, 5 mm K 4 P 2 O 7, 0,2 mm PGA et 1000 unités/ml de catalase. L'antimycine A (AA, 5 μm) a été ajoutée au moment indiqué. La période d'illumination actinique (DFPP : 240 μmol photons m -2 s -1 ) est facilement identifiable grâce à l'augmentation de la fluorescence rouge. Les six pics de fluorescence rouge pendant la période d'illumination sont induits par des flashs (2s) de lumière saturante (DFPP : 400 μmol photons m -2 s -1 ). chloroplastes. Comme prévu, la présence d'antimycine A a fait diminuer l'augmentation transitoire de fluorescence chlorophyllienne après la transition lumière-obscurité mais ne l'a pas fait disparaître, ce qui confirme la présence de deux voies dans les chloroplastes de pois : une sensible à l'antimycine A et l'autre non. Nous avons ajouté une quantité pas trop importante d'antimycine A (5 μm, concentration finale), car il semblerait qu'en quantité importante l'antimycine A inhibe non seulement la voie FQR mais aussi la voie NDH (Endo et al., 1998). Cependant, la quantité ajoutée devrait largement suffire à inhiber totalement la voie FQR puisque 1 μm suffit pour l'obtenir dans le cas de chloroplastes intacts d'épinard à 20 μg Chl/ml (Mano et al., 1995). L'ajout d'antimycine A induit une 196

200 monté de la FBV qui montre qu'il y a eu inhibition d'une voie de réoxydation du NADPH. A l'obscurité, juste après l'extinction de la lumière, le niveau de FBV, et donc l'état redox du NAD(P), est constant mais augmente après un certain temps. Cela montre, premièrement, qu'il y a bien une réduction du NAD(P) par les métabolites accumulées pendant la période lumineuse, mais que normalement (en absence d'inhibiteur) cette réduction est exactement compensée par le transfert des électrons au pool de PQ. Deuxièmement, c'est une indication de la photo-régulation par la lumière d'une partie au moins du flux des électrons du NAD(P)H vers les PQ, puisque réduction et oxydation du NAD(P) se compensent pendant un certain temps après l'extinction de la lumière, mais qu'assez rapidement la réoxydation n'est plus suffisante. IV.2.3. Conclusions Nous n'avons malheureusement fait que très peu d'expériences sur ce phénomène de réduction non-photochimique transitoire du pool de PQ à la suite d'une transition lumière-obscurité. C'est un peu dommage car la mesure de la FBV, conjuguée à celle de la fluorescence rouge en parallèle, fourni des renseignements intéressants sur ce phénomène. Elle montre que l'état redox du pool de NAD(P) ne suit pas la variation transitoire de celui du pool des PQ mais reste constamment à son niveau à l'obscurité, le NAD(P)H a le rôle d'un simple intermédiaire, qui est réoxydé aussi vite qu'il est réduit. Ces mesures permettent aussi de renforcer l'hypothèse d'une photo-régulation du flux d'électrons du NAD(P)H vers les PQ, mais il semble que le site de cette régulation ne soit pas, ou en tout cas ne soit pas uniquement, la FNR, puisque nous avons constaté cette photo-régulation en présence d'antimycine A qui inhibe la voie FQR. 197

201 CONCLUSION GENERALE

202 Conclusion générale Ce travail avait pour objectif d'étudier la FBV des végétaux, et plus particulièrement ces variations photo-induites, pour le suivi des changements de l'état redox du NAD(P). Il y avait deux raisons pour s'intéresser aux variations photo-induites de la FBV : premièrement, parce que sur chloroplastes isolés elles sont spécifiques au NADPH, et deuxièmement, parce que c'est lors des changements lumineux (notamment lors des transitions obscurité-lumière) que l'on obtient le plus de renseignements sur le fonctionnement de la photosynthèse. Dans le cadre de cette étude des variations photoinduites de la FBV des végétaux, les résultats que nous avons obtenus peuvent être divisés suivant deux aspects principaux. D'un côté nous avons réalisé une étude approfondie des variations photo-induites de la FBV dans les chloroplastes isolés, qui nous permet de conclure que la FBV peut être utilisée pour mesurer en continu, de façon non-invasive et probablement quantitative les changements photo-induits de l'état redox du NADP dans les chloroplastes. D'un autre coté, nous avons mesuré en parallèle la FBV et la fluorescence chlorophyllienne sur des algues et des chloroplastes in vivo, et nous avons utilisé l'information que nous fourni, dans ces conditions, la FBV sur l'état redox du NAD(P), pour étudier deux mécanismes de régulation du métabolisme photosynthétique : le transport cyclique et la chlororespiration. Notre étude de la fluorescence du NADPH dans les chloroplastes isolés est basée sur les résultats de Cerovic et al. (1993) qui ont pu montrer que la variation photo-induite de FBV des chloroplastes provient uniquement du NADPH. Ce résultat nous l'avons confirmé par deux approches différentes : premièrement, en utilisant des mutants de Chlamydomonas reinhardtii sans PSI, et deuxièmement, en utilisant un modèle de la réabsorption de la FBV par les pigments photosynthétiques pour retrouver le spectre d'émission "vrai" de la variation photo-induite de FBV dans les chloroplastes en solution. Pour étudier en détail l'augmentation photo-induite de FBV dans les chloroplastes, nous avons combiné une analyse spectrale et résolue en temps de la FBV avec la transition entre obscurité et lumière, qui induit des changements physiologiques dans les 201

203 chloroplastes. Sur des systèmes complexes, ce genre d'association entre les mesures de fluorescence résolue en temps et un changement physiologique, que l'on retrouve par exemple dans le travail de Wakita et al. (1995) sur la fluorescence du NADH dans les mitochondries de foie de rat, s'avère particulièrement utile pour résoudre l'hétérogénéité de l'émission de fluorescence. Dans notre cas, grâce à cette approche nous avons ainsi pu montrer qu'il n'y a pas de participation d'un changement dans la liaison de NADPH avec les protéines à l'augmentation photo-induite de FBV des chloroplastes et que cette augmentation est due uniquement à la réduction du NADP par la photosynthèse. Dans ce contexte nous nous sommes intéressés au problème de l'influence de la liaison de NADPH avec la Rubisco sur le temps de vie et le rendement de fluorescence, qui pourrait être différente de ce qu'elle est généralement avec les protéines, à cause du caractère non-spécifique de cette liaison. Les quelques expériences que nous avons réalisé pour éclaircir ce point, n'ont pas permis de le faire, mais il serait intéressant de poursuivre les recherches dans ce domaine. Grâce notamment à l'aspect spectral de notre analyse de l'augmentation photoinduite de FBV dans les chloroplastes, nous avons pu évaluer la contribution des flavines à la fluorescence verte des chloroplastes et vérifier que leur contribution à la variation photo-induite de FBV dans les chloroplastes est négligeable devant celle du NADPH. Concernant cet aspect spectral, il faut souligner l'avantage du rayonnement synchrotron qui permet de réaliser, sans aucune contrainte, des déclins de fluorescence à n'importe quelle longueur d'onde d'excitation, ce qui nous a été fort utile. En mettant à profit les trois aspects spectral, résolu en temps et photo-induit de notre analyse, nous avons aussi mis en évidence l'existence dans les chloroplastes d'un transfert d'énergie d'excitation non-radiatif entre les protéines et le NADPH. Par ailleurs, nous avons vérifié que la FBV est bien linéairement reliée à la concentration de NADPH dans les conditions qui sont celles des chloroplastes. Cependant, pour étudier plus avant la possibilité d'utiliser la FBV pour quantifier les variations photoinduites de l'état redox du NADP dans les chloroplastes, il faudrait comparer sur les mêmes échantillons, puis éventuellement calibrer, les mesures de FBV avec des 202

204 techniques établies de mesure de la concentration en NADPH, telle que l'extraction acide/base suivie par un cycle enzymatique (ex. Takahama et al., 1981). C'est l'ensemble des résultats que nous venons de rappeler qui nous permet de conclure que la FBV peut être utilisée pour mesurer de façon continue, non-invasive et potentiellement quantitative les changements photo-induits de l'état redox du NADP dans les chloroplastes. Un des aspects que nous avons négligés dans ce travail, mais qui mériterait d'être approfondi, est la résolution de la cinétique des variations photo-induites de la FBV dans les chloroplastes. En effet, cette cinétique dépend vraisemblablement du fonctionnement de la chaîne de transport d'électrons photosynthétique, qui réduit le NADP, et des différentes voies de réoxydation du NADPH, que l'on pourrait ainsi étudier. Un autre phénomène qui pourrait intervenir dans ces cinétiques, mais sans doute à plus long terme, est la phosphorylation de NAD en NADP dans les chloroplastes à la lumière (Muto et al., 1981). Des mesures de fluorescence résolue en temps de ces variations sont tout à fait envisageables par fluorimétrie de phase. Cela permettrait d'étudier le rapport entre la cinétique des variations photo-induites de la fluorescence du NADPH et la liaison du NADPH avec les protéines. C'est notamment dans l'optique d'une telle étude cinétique et résolue en temps des variations photo-induites de la FBV qu'un instrument de fluorimétrie de phase multifréquences a été construit au LURE par Nicolae Moise et Ismaël Moya, et qu'il sera bientôt installé sur l'anneau de stockage Super ACO. D'un point de vue plus général, les aspects qui restent encore à explorer concernant la FBV des végétaux sont nombreux, ne serait ce que du fait du nombre de fluorophores qui sont susceptibles d'y participer. Mais étant données la dépendance de la FBV des végétaux envers l'environnement et l'espèce végétale, ce signal pourrait trouver des applications intéressantes dans les domaines de l'agronomie et de l'environnement. En ce qui concerne la fluorescence du NADPH en rapport avec la photosynthèse, il n'est pas envisageable d'en faire une mesure de terrain. Mais, au laboratoire c'est un bon outil pour l'étude des mécanismes de la photosynthèse notamment par son caractère complémentaire avec la fluorescence chlorophyllienne, qu'il est assez facile de mesurer simultanément 203

205 comme nous le faisons sur notre fluorimètre impulsionnel. Dans ce cadre, il est sans doute possible d'améliorer la détection spécifique de la fluorescence du NAD(P)H par rapport à la fluorescence des autres fluorophores émettant dans le bleu-vert qui sont présents dans les échantillons végétaux. En effet, d'une part on peut envisager d'optimiser le domaine spectral de détection pour mesurer plus spécifiquement la fluorescence du NAD(P)H. Dans le cas des chloroplastes isolés ou des micro-algues se serait vraisemblablement une bande spectrale assez large, mais limitée à la partie bleue du spectre. Dans le cas des feuilles, dont les fluorophores de l'épiderme émettent surtout de la fluorescence bleue, ce serait plutôt une bande spectrale dans le vert. D'autre part, on peut envisager de sélectionner temporellement la fluorescence en détectant seulement celle dont le temps de vie correspond aux temps de vie de NAD(P)H et pas aux temps de vie des autres fluorophores. On pourrait ainsi diminuer la contribution de la fluorescence dont le temps de vie est très long (supérieur à 5 ns) à laquelle NAD(P)H ne participe pas, ou peu, et on pourrait diminuer la contribution des acides hydroxycinnamiques, dont la fluorescence représente souvent une très large partie de la FBV des feuilles et qui ont des temps de vie de fluorescence très court (bien inférieurs à 0,5 ns) (Cerovic et al., 1999). La mesure de la FBV, notamment lors de transitions obscurité-lumière, permet de suivre in vivo les changements de l'état redox du NAD(P)H et s'est, pour cette raison, avérée un outil très utile pour l'étude du mécanisme photosynthétique et de ces phénomènes de régulation. Cette mesure est d'autant plus utile qu'elle est réalisée en parallèle avec celle de la fluorescence chlorophyllienne, qui nous renseigne sur l'état redox des PQ et sur le fonctionnement de la photosynthèse en général. La mesure de FBV, combinée à celle de la fluorescence chlorophyllienne, nous a permis d'étudier les interactions entre chloroplastes et mitochondries dans des mutants de Chlamydomonas reinhardtii sans PSI, et d'expliquer l'effet des inhibiteurs de la respiration mitochondriale sur le flux d'électrons dépendant du PSII de ces mutants, qui est en relation avec la chlororespiration. Nous avons conclu à l'existence d'une voie non-photochimique de réduction des PQ au travers d'une NAD(P)H-déhydrogénase. Sur les chloroplastes de pois, nous avons pu constater que le NAD(P)H n'était qu'un intermédiaire, dont l'état redox ne 204

206 varie pas, dans le phénomène de re-réduction transitoire des PQ pendant la période d'obscurité qui suit immédiatement une période d'éclairement. De plus, nos résultats confirment l'hypothèse d'une photo-régulation du flux d'électrons du NAD(P)H vers les PQ. Dans ce cadre, nous n'avons réalisé que quelques mesures sur les chloroplastes de pois, et il serait intéressant d'approfondir ces expériences. La mesure de la FBV a déjà prouvé son utilité pour l'étude des mécanismes photosynthétiques et pourrait à l'avenir contribuer, en complément de la fluorescence chlorophyllienne, à de nombreuses recherches sur la photosynthèse. 205

207 206

208 Publications personnelles sur le sujet Cerovic Z.G., Langrand E., Latouche G., Morales F. & Moya I. (1998) Spectral characterization of NAD(P)H fluorescence in intact isolated chloroplasts and leaves: Effect of chlorophyll concentration on reabsorption of blue-green fluorescence Photosynth. Res. 56, Latouche G., Montagnini F., Cerovic Z.G. & Moya I. (1998) Spectral and time-resolved analysis of light-induced changes of NADPH fluorescence in chloroplasts, in: Photosynthesis: Mechanisms and Effects, Gorab G. (Ed.), Kluwer Acad. Pub., Dordrecht, Cournac L., Guedeney G., Joët T., Rumeau D., Latouche G., Cerovic Z.G., Redding K., Horváth E., Medgyesy P. & Peltier G. (1998) Non-photochemical reduction of intersystem electron carriers in chloroplasts of higher plants and algae, in: Photosynthesis: Mechanisms and Effects, Gorab G. (Ed.), Kluwer Acad. Pub., Dordrecht, Latouche G., Cerovic Z.G., Montagnini F. & Moya I. (2000) Light-induced changes of NADPH fluorescence in isolated chloroplasts: a spectral and fluorescence lifetime study Biochim. Biophys. Acta 1460, Cournac L., Latouche G., Cerovic Z.G., Redding K., Ravenel J. & Peltier G. Interactions between photosynthesis, mitorespiration and chlororespiration in Chlamydomonas reinhardtii studied using photosystem I deficient mutants Plant Physiol., submitted. 207

209 208

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224 224

225 ANNEXES

226 Annexe A : mesure de la viscosité absolue Les mesures ont été effectuées à l'aide d'un viscosimètre Cannon-Manning 50 C58 (Cannon Instrument, State College, USA) plongé dans un bain thermostaté. La mesure du temps nécessaire au liquide pour s'écouler entre deux traits du viscosimètre, multipliée par une constante du viscosimètre (qui dépend de la température), nous donne la viscosité cinétique du liquide. Pour une solution de chloroplastes reconstitués nous avons obtenu une viscosité cinétique de 1,218 cst (ou mm 2 /s). Pour obtenir la viscosité absolue à partir de la viscosité cinétique il suffit de multiplier cette dernière par la densité du liquide. Nous avons donc mesuré à l'aide d'une balance de précision la densité d'une solution de chloroplastes reconstitués. Finalement, la viscosité absolue d'une solution de chloroplastes reconstitués vaut 1,25 cp (ou mpa s). 227

227 228

228 Annexe B : estimation du volume d'une protéine à partir de sa masse molaire Il est possible d'estimer de façon tout à fait correcte le volume d'une protéine à partir uniquement de sa masse molaire et de caractéristiques moyennes communes aux protéines. Soit : V p, le volume de la protéine hydraté en Å 3. M, la masse molaire de la protéine en daltons (D). V, le volume spécifique partiel de la protéine. C'est le volume occupé en solution par gramme (g) de protéine. Typiquement pour une protéine V vaut 0,73 cm 3 /g (P. Vachette, communication personnelle)., le facteur d'hydratation. C'est la masse d'eau par masse de protéine en g/g. Typiquement pour une protéine, on a 0,2 < < 0,3 (P. Vachette, communication personnelle). d, la densité de l'eau : 1 g/cm 3. N a, le nombre d'avogadro : 6, mol -1. On a : V p = 1024 M V + d N a (B.1) Typiquement pour une protéine V + d vaut environ 1 cm3 /g. On a donc une bonne estimation du volume d'une protéine en utilisant la formule : V p = M 0,6 (B.2) Avec V p en Å 3 et M en D. 229

229 230

230 Annexe C : schéma électronique du détecteur à photomultiplicateur R1 = 51 C1 = 100 nf L1 = 100 mh 231

231 R2 = 10 k C2 = 100 pf D1 : diode HP2800 R3 = 160 k C3 = 10 nf D2 : diode Zener BZT03C120 R4 = 330 k C4 = 1 μf D3 : diode schottky MUR1100E R5 = 560 k C5 = 20 nf D4 : diode transil P6KE22 R6 = 1 k C6 = 10 μf D5 : diode 1N4148 Aop1 : amplificateur opérationnel, LM7171A Tr1 : transistor MOS, MTW10N1OOE CTr1 : commande de transistor, MOS EL7222 Comme on peut le constater sur ce schéma les deux dernières dynodes sont alimentées en permanence et seules les six premières dynodes ne sont alimentées que pendant la fenêtre de mesure (20 μs par période de mesure). Le fait d'avoir les deux dernière dynodes sous tension en permanence permet de diminuer fortement les signaux parasites qui apparaissent lors des basculements de la haute tension. Par ailleurs, il est nécessaire que les six première dynodes ne soient pas alimentées en dehors de la période de mesure pour que le photomultiplicateur ne soit pas opérationnel. 232

232 Annexe D : théorie de Kubelka-Munk La théorie de Kubelka-Munk (voir Fukshansky et Kazarinova, 1980 et les références citées) est utilisée pour décrire la propagation de la lumière au sein d'objets homogènes, où ne comportant que des micro-hétérogénéités, et lorsque cette propagation est gouvernée simultanément par l'absorption et de multiples diffusions élastiques (sans changement de longueur d'onde). La propagation de la lumière dans la théorie de Kubelka-Munk peut être schématisée de la façon suivante pour un échantillon compris entre 0 et L : J(0, ) J(x, ) J(L, ) I(0, ) I(x, ) I(L, ) 0 L x La lumière qui se propage à l'intérieur de l'échantillon est supposée être constituée par deux flux diffus I et J se propageant dans des sens opposés, dans la direction de l'axe des x. Les photons peuvent être absorbés avec une probabilité k (coefficient d'absorption) ou diffusés dans les deux sens I ou J avec la même probabilité s (coefficient de diffusion). Ce qui nous amène en chaque point au système d'équations différentielles suivant : di dx = - k + s I + s J - dj dx = - k + s J + s I (D.1) k et s étant supposés constants dans tout l'échantillon, ce système d'équations différentielles linéaire admet des solutions de la forme : 233

233 I = e - a x 1 + a s + k s C 1 + e a x 1 - a s + k s C 2 J = e - a x C 1 + e a x C 2 (D.2) Avec a = k k s C 1 et C 2 sont des constantes qui dépendent des conditions aux limites. Soit I 0 ( ) l'intensité de la lumière incidente sur l'échantillon. Alors : I(0, ) = I 0 ( ). On se place dans le cas où, en x = L, il n'y a pas de lumière incidente et la lumière réfléchie est négligeable. Alors : J(L, ) = 0. On en déduit : s I C 1 = 0 e 2 a L a + a e 2 a L + e 2 a L -1 k + s s I C 2 = - 0 a + a e 2 a L + e 2 a L -1 k + s (D.3) Dans ce modèle les spectres de transmittance (T( )) et de réflectance (R( )) sont donnés par : T( ) = I(L, ) / I 0 ( ) R( ) = J(0, ) / I 0 ( ) (D.4) Soit : T = 2 a e a L a + a e 2 a L + e 2 a L -1 k + s s e R = 2 a L - 1 a + a e 2 a L + e 2 a L -1 k + s (D.5) 234