ANALYSE DES AVERMECTINES ET DES MILBEMYCINES DANS LE FOIE PAR HPLC FLUORIMETRIE (anc. MET009)

Agence fédérale pour la Sécurité de la Chaîne alimentaire Laboratoire de Liège MET-LFSAL 099 & 099a I-MET ANALYSE DES AVERMECTINES ET DES MILBEMYCINES DANS LE FOIE PAR HPLC FLUORIMETRIE (anc. MET009) Date d application: 20-07-2010 Nom fonction / service Date Signatures Rédigé par : Ir Marc EVRARD Responsable technique 20-07-2010 Sé Vérifié par : Ing. Marianne AUBRY Responsable de la Qualité 20-07-2010 Sé Approuvé par : Ir Marc EVRARD Responsable technique 20-07-2010 Sé LAB23 I-MET-LFSAL-099 & 099a- Avermectines v.04 2010-07-20 1/21

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ANALYSE DES AVERMECTINES ET DES MILBEMYCINES DANS LE FOIE PAR HPLC FLUOROMETRIE TABLE DES MATIERES 1 OBJECTIF... 4 2 CHAMP D APPLICATION... 4 3 DOCUMENTS LEGAUX ET NORMATIFS... 7 4 DEFINITIONS ET ABREVIATIONS... 8 5 PRINCIPE... 8 6 CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE... 8 7 CONSIGNES DE SECURITE ET MESURES SPECIFIQUES... 8 8 REACTIFS ET ADDITIFS... 9 9 APPAREILS... 9 10 METHODE... 10 10.1 PRELEVEMENT DES ECHANTILLONS... 10 10.2 RECEPTION, STOCKAGE ET DISTRIBUTION DES ECHANTILLONS... 10 10.3 PREPARATION DES REACTIFS DE DERIVATION (NE PAS UTILISER DE DILUTEUR AUTOMATIQUE CAR LES PRODUITS SONT HAUTEMENT CORROSIFS)... 10 10.4 PREPARATION DE LA COURBE D'ETALONNAGE.... 11 10.5 TRAITEMENT DES ECHANTILLONS... 13 10.6 PREPARATION DES PHASES MOBILES... 15 10.7 CONDITIONS EXPERIMENTALES... 15 10.8 SEQUENCE D'ANALYSE... 17 11 CONTROLE DE LA QUALITE... 17 11.1 CONTROLE PREMIERE LIGNE :... 17 11.2 CONTROLE DEUXIEME LIGNE :... 17 11.3 CONTROLE TROISIEME LIGNE :... 17 12 CALCUL ET RAPPORTAGE... 18 12.1 EVALUATION DES MESURES... 18 12.2 EXPRESSION DES RESULTATS... 20 13 REFERENCE AUX PROCEDURES, INSTRUCTIONS, DOCUMENTS, FORMULAIRES OU LISTES Y AFFERENTS... 21 13.1 PROCEDURE... 21 13.2 FORMULAIRES... 21 13.3 LISTE... 21 LAB23 I-MET-LFSAL-099 & 099a- Avermectines v.04 2010-07-20 3/21

ANALYSE DES AVERMECTINES ET DES MILBEMYCINES DANS LE FOIEPAR HPLC FLUOROMETRIE 1 Objectif Cette méthode est destinée à identifier et à quantifier les résidus d'avermectines (éprinomectine, abamectine, doramectine, ivermectines et de milbémycines (moxidectine) dans le foie avec comme standard interne la némadectine, par HPLC-fluorimétrie 2 Champ d application Les avermectines sont un groupe de composés produits à partir d'un bouillon de fermentation de la bactérie : "Streptomyces avermitilis". La moxidectine et la némadectine font partie d'un sous groupe des lactones macrocycliques : les milbémycines. Les avermectines, produits pharmaceutiques parmi les plus utilisés en médecine vétérinaire, sont une famille de composés antiparasitaires (anthelminthiques). Les avermectines contrôlent les injections parasitaires chez les humains, les animaux domestiques, le bétail et les poissons d'aquaculture ; elles sont également connues sous le nom de lactones macrocycliques. Huit composés naturels ont été isolés : A1a, A1b, A2a, A2b, B1a, B1b, B2a et B2b. Les composés A possèdent un groupement méthoxyle sur le carbone numéro 5, alors que les composés B portent un groupement hydroxyle. La liaison entre les atomes de carbone 22 et 23 est double dans le cas des composés 1 ; elle est simple dans la structure des composés 2. Enfin, les composés a possèdent un substituant butyle en position 25 alors qu il s agit d un isopropyle dans le cas des composés b. Les homologues a et b ont une activité presque identique. Leur séparation au cours de la fermentation à grande échelle est difficile et sans intérêt, de sorte que, dans la littérature, l on ne considère quelques fois que quatre types d avermectines : A1, A2, B1 et B2. LAB23 I-MET-LFSAL-099 & 099a- Avermectines v.04 2010-07-20 4/21

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Les avermectines en médecine vétérinaire ont révolutionné le traitement antiparasitaire des animaux de rente. Les effets toxiques aigus de ces composés sont principalement d'origine nerveuse. Ils sont dépourvus d'activités mutagène et cancérigène mais sont à l'origine d'effets embryotoxiques chez les animaux de laboratoire. Selon le modèle actuel, les avermectines agissent en interférant avec la fonction des synapses neuromusculaires, ce qui peut provoquer une paralysie des muscles somatiques. Les principaux symptômes d'intoxication sont les suivants : Insomnie, salivation, vomissements, dilatation des pupilles, tremblements musculaires, stupeur, état d'engourdissement. Les avermectines sont efficaces contre les vers capillaires, les poux et les gales. La dose utilisée dépend des parasites concernés et de la voie d'administration. Elles s'administrent par voie orale, par injection ou percutanée, c'est-à-dire que le médicament est déposé sur la peau et la traverse ; ensuite, il est véhiculé par le flux sanguin dans tout l'organisme. Elles sont donc actives essentiellement sur les parasites qui se nourrissent de sang et de sécrétions (vers capillaires, poux piqueurs, gale, ). Les avermectines gardent leur efficacité insecticide très longtemps (+ de 150 jours dans les bouses et les crottins) et peuvent donc avoir des répercussions négatives sur la faune des espaces naturels (Vers, insectes, petits mammifères, oiseaux, chauve-souris ). De leur utilisation très étendue, vu leur grande efficacité, résulte une pollution ponctuelle et diffuse de l'industrie et de l'agriculture. LAB23 I-MET-LFSAL-099 & 099a- Avermectines v.04 2010-07-20 6/21

3 Documents légaux et normatifs Institut scientifique de santé publique : Section Denrées alimentaires : Analyse des avermectines et des mylbémycines dans le foie par HPLC-Fluorimétrie. "Endectocides in the African Veterinary Context". Revue Elev. Méd. Vét. Pays trop., 2004, 57 (1-2) : 49-58 Annexe I du règlement CE 2377/90 Limites maximales résiduelles (MRLs) imposées dans le foie au 16/08/2008. (Annexe I du Règlement CE 2377/90). Les avermectines en médecine vétérinaire : utilisation, toxicité et méthodes de dosage des résidus dans les aliments d'origine animale "Review of avermectins in veterinary medicine: clinical use, toxicity and methods for residue estimation in food of animal origin" B. ROUDAUT, J.P. ABJEAN, J.M. POUL Centre National d'études Vétérinaires et Alimentaires, Laboratoire des médicaments vétérinaires, 35133 FOUGÈRES, France. Analyte Espèce MRL ( ppb ) Abamectine Porc/cheval - Bœuf 20 Mouton 25 Doramectine Porc/cheval 100 Bœuf 100 Mouton 100 Eprinomectine Porc/cheval - Bœuf 1500 Mouton - Ivermectine Porc/cheval 15 Bœuf 100 Mouton 15 Moxidectine Porc/cheval Porc : / - Cheval : 100- Bœuf 100 Mouton 100 LAB23 I-MET-LFSAL-099 & 099a- Avermectines v.04 2010-07-20 7/21

4 Définitions et abréviations ppb = µg/kg ou ng/g HPLC = chromatographie liquide haute performance SPE = extraction phase solide ACN = acétonitrile MeOH = méthanol TFAA = acide trifluoroacétique anhydre MMI = methylimidazole tpm = tours par minute RT = Temps de rétention SI = standard interne MRLs = niveau maximum résiduel (maximum residue level) 5 Principe Les avermectines et les milbémycines sont extraites d'un échantillon de foie à l'aide d'acétonitrile. La purification de l'extrait est réalisée par extraction en phase solide sur colonnes SPE en 2 étapes successives (phase alumine puis phase C18). L'extrait purifié est évaporé à environ 65 C et ensuite dérivatisé par le TFAA (acide trifluoroacétique anhydre) et le MMI (methylimidazole), en un dérivé hautement fluorescent et analysé par HPLC-fluorimétrie. La séparation se fait sur colonne HPLC C18 en utilisant un gradient d eau et de méthanol/acétonitrile. La détection se fait par fluorescence en comparant les échantillons avec un standard interne et un échantillon de contrôle 6 Caractéristiques de performance Se référer au dossier de validation. 7 Consignes de sécurité et mesures spécifiques Afin d'éviter toute contamination et intoxication, le port de gants est vivement conseillé obligatoire ainsi que l'utilisation de hotte bien ventilée durant toute la manipulation. L'élimination des solvants et des solutions se fait dans les bidons prévus à cet effet en suivant les recommandations d usage au laboratoire. Spécificités : Dangereux en cas d'absorption cutanée. Eviter tout contact avec les yeux, la peau et les vêtements. Se laver les mains à l'eau et au savon après la manipulation du produit et avant de manger, de boire ou d'utiliser les produits du tabac. Toxique pour les poissons et la faune. Ne pas rejeter, dans toute source d'approvisionnement en eau, d'effluents contenant ce produit. Entreposer ce produit au frais et au sec, à l'écart de la nourriture humaine ou animale et des boissons. LAB23 I-MET-LFSAL-099 & 099a- Avermectines v.04 2010-07-20 8/21

8 Réactifs et additifs Le code R ou D est indiqué sur une étiquette apposée sur chaque flacon de réactif (ou support contenant les réactifs). Sauf mention contraire, les solutions restent valables jusqu à ce tant que les critères de validité de l analyse soient respectés. Acétonitrile qualité HPLC (R472) Methanol qualité HPLC (R016) Eau ultrapure de type I à 18,2 MΩ.cm(R293) 1-Methylimidazole SIGMA-ALDRICH (R695) Acide trifluoroacetique anhydre FLUKA (R696) Acide acétique 100% HPLC (R539) Eprinomectine (Dr Ehrenstorfer) (R684) R797 (sigma) Moxidectine (Dr Ehrenstorfer) (R688) R797 (sigma) Abamectine (Dr Ehrenstorfer) (R686) R797 (sigma) Doramectine (Dr Ehrenstorfer) (R685) R797 (sigma) Ivermectine (Dr Ehrenstorfer) (R687) R797 (sigma) Némadectine = standard interne ( NRL ISP ) (R743) Hexane qualité HPLC 9 Appareils Tubes Falcon de 50 ml Tubes en verre Duran, bouchons à visser de 10 ml Tubes à essai gradués en verre de 15 ml à fond cônique Système d'extraction sous vide en phase solide type Supelco Seringues en plastique de 3 ml avec Luer-lock Filtres à seringue Ø 15 mm, GHP, 0,45 µm ou équivalent Vials en verre fumé, avec 'insert' de 300 µl Vials en verre fumé de 10 ml à sertir micropipettes Colonne Varian Bond Elut JR-AL-N, 1g, Alumine ou équivalent Colonne Varian HF-C18 Bond Elut 500 mg ou équivalent Ballons jaugés en verre fumé de 10 ml avec bouchon rôdé Griffe d'évaporation Bloc chauffant à 65 C Balance analytique et microbalance Centrifugeuse réfrigérée à 4 C Diluteur automatique Mixer de cuisine Pipette Pasteur LAB23 I-MET-LFSAL-099 & 099a- Avermectines v.04 2010-07-20 9/21

Vortex 2 colonnes chromatographiques en série Chromolith Performance, RP-18, 100-4, 6 mm, 15 cm Chaîne HPLC Hitachi avec détection fluorimétrique pilotée par le programme Ezchrom Elite 10 Méthode Toutes les dilutions, SAUF celles pour la dérivatisation, sont préparées à l aide d un diluteur automatique. 10.1 Prélèvement des échantillons Les échantillons sont prélevés par le demandeur dans des sacs étanches. 10.2 Réception, stockage et distribution des échantillons Les échantillons sont réceptionnés, inscrits au LIMS et confiés à la section qui les stocke au congélateur à minimum 15 C dans le compartiment réservé à cette analyse. 10.3 Préparation des réactifs de dérivation (ne pas utiliser de diluteur automatique car les produits sont hautement corrosifs) 10.3.1 MMI / ACN (2 : 7) =DERIVATISANT 1 (D363) Dans un vial en verre fumé de 10 ml : Ajouter 3,5 ml d'acn HPLC (R472) à 1 ml de 1-Methylimidazole (R695); sertir le vial. Secouer au vortex => solution MMI. 10.3.2 TFAA / ACN (2 : 7) = DERIVATISANT 2 (D364) Dans un vial en verre fumé de 10 ml : Ajouter 3,5 ml d'acn HPLC (R472) à 1 ml d acide trifluoroacétique anhydre (R696) ; sertir le vial. Secouer au vortex => solution TFAA. Ces deux réactifs doivent être préparés le jour de l'utilisation. Ils ne peuvent être conservés que quelques heures à température ambiante. LAB23 I-MET-LFSAL-099 & 099a- Avermectines v.04 2010-07-20 10/21

10.4 Préparation de la courbe d'étalonnage. 10.4.1 Solutions stocks individuelles à environ 100 µg/ml dans le méthanol Peser environ exactement et indiquer la valeur exacte des solutions suivant le tableau suivant : STANDARDS PURETE PESEES Sol. de DILUTION (Methanol HPLC (R016 ) Epinomectine(R684) 95,0 % 5,26 mg 50 ml Moxidectine(R688) 65,0 % 7,69 mg 50 ml Abamectine(R686) 95,5 % 5,24 mg 50 ml Doramectine(R685) 90,5 % 5,52 mg 50 ml Ivermectine(R687) 92,0 % 5,43 mg 50 ml Némadectine (Std I)(R 743) 76,9 % 6,50 mg 50 ml Tenir compte de la pureté et du poids de chaque substance pour connaître la concentration exacte, donnée par la formule : ( masse pureté) volume = Concentrat ion exacte Les solutions stock sont préparées en flacons jaugés fumés de 50 ml et aliquotées par 3 ml dans des vials fumés de 10ml, ceux-ci sont sertis, placés dans un support et conservés au congélateur à minimum - 15 C. Noter les vials et le support : - Epinomectine (D353) - Moxidectine (D354) - Abamectine (D355) - Doramectine (D356) - Ivermectine (D357) - Némadectine (D358) - Les 6 solutions Stocks individuelles de chaque avermectine et milbémycine se conservent un an au congélateur, à minimum -15 C. 10.4.2 Solution mère d avermectines à 1 µg/ml (D 359) Prélever environ exactement 100 µl de chaque solution stock (D353, D354, D355, D356, D357), après avoir laisser revenir à température ambiante, en fonction des puretés. LAB23 I-MET-LFSAL-099 & 099a- Avermectines v.04 2010-07-20 11/21

Les placer dans le même ballon jaugé en verre fumé de 10 ml. Aliquoter dans 4 vials fumés de 10 ml. Compléter au trait à l'aide de Methanol qualité HPLC (R016). Homogénéiser. Validité : 1 mois à minimum -15 C. 10.4.3 Solution mère de standard interne ( Némadectine) à 1 µg/ml (D360) Prélever environ exactement 123 µl de solution stock de Némadectine (D358, après avoir laisser revenir à température ambiante, en fonction de la pureté). Les placer dans un ballon jaugé en verre fumé de 10 ml. Aliquoter dans 4 vials fumés de 10 ml Compléter au trait à l'aide de Methanol qualité HPLC (R016). Homogénéiser. Validité : 1 mois à minimum -15 C. 10.4.4 Solution fille de dopage à 0,2 µg/ml (D361) Prélever 2 ml de solution mère à 1 µg/ml (D359). Les placer dans un ballon jaugé en verre fumé de 10 ml. Compléter au trait à l'aide de Méthanol qualité HPLC (R016). Homogénéiser. Validité : 15 jours à minimum -15 C. 10.4.5 Solution fille standard interne ( Némadectine) à 0,2 µg/ml (D362) Prélever 2 ml de solution stock à 1 µg/ml (D360). Les placer dans un ballon jaugé en verre fumé de 10 ml. Compléter au trait à l'aide de Méthanol qualité HPLC (R016). Homogénéiser. Validité : 1 mois à minimum -15 C. 10.4.6 Solutions de la courbe d'étalonnage (6 levels) L 1 = 10 ng/ml (2 ng/g de foie) (D365) : Prélever 25 µl de la solution fille de dopage à 0,2 µg/ml (D361). Prélever 125 µl de la solution fille de SI (Némadectine Std I) à 0,2 µg/ml (D362). Les placer dans un tube Duran de 10 ml. Evaporer à sec à environ 65 C. Ajouter 220 µl de la Solution MMI de dérivation (D363). Passer au vortex. Ajouter 220 µl de la solution TFAA de dérivation (D364). Passer au vortex. Ajouter 60 µl d'acide acétique 100% HPLC (R539). LAB23 I-MET-LFSAL-099 & 099a- Avermectines v.04 2010-07-20 12/21

Passer au vortex pendant une minute. Placer dans un bloc chauffant à environ 65 C, bouchon fermé pendant 30 minutes. Placer quelques minutes au congélateur à 20 C. Mettre en vial fumé de 2 ml avec insert. Injecter sur l HPLC. L 2 = 20 ng/ml (4 ng/g de foie) (D366) : Procéder de la même manière qu'en L 1, mais prélever 50 µl de la solution fille de dopage à 0,2 µg/ml ( D361). L 3 = 40 ng/ml(8 ng/g de foie) (D367) : Procéder de la même manière qu'en L 1, en prélevant 100 µl de la solution fille de dopage à 0,2 µg/ml ( D361). L 4 = 60 ng/ml (12 ng/g de foie) (D368) : Procéder de la même manière qu'en L 1,en prélevant 150 µl de la solution fille de dopage à 0,2 µg/ml ( D361). L5 = 80 ng/ml (16 ng/g de foie) (D369) : Procéder de la même manière qu'en L 1,en prélevant 200 µl de la solution fille de dopage à 0,2 µg/ml (D361). L 6 = 120 ng/ml (20 ng/g de foie) (D370) : Procéder de la même manière qu'en L 1,en prélevant 250 µl de la solution fille de dopage à 0,2 µg/ml (D361). Ces 6 levels sont préparés le jour de l analyse. 10.5 Traitement des échantillons 10.5.1 Extraction Hacher finement environ 100 g de foie et homogénéiser au mixer. Peser environ exactement 2,5 g de l'échantillon dans un tube Falcon de 50 ml. Ajouter 125 µl de la solution de némadectine (Std I) (D362) à 0,2 µg/ml dans chaque échantillon y compris le blanc. Ajouter 50 µl de la solution de référence à 0,2 µg/ml (D361) pour l'échantillon dopé uniquement. (Spike à 4 ng/g). Vortexer. Laisser en contact à l obscurité pendant 15 minutes. Ajouter 15 ml d'acn HPLC (R472), passer au vortex. Centrifuger à 4000 tpm pendant 5 minutes à 4 C. 10.5.2 Purification Faire passer chacun des surnageants sur une colonne Varian Bond Elut JR-AL-N, 1g, Alumine ou équivalent, non conditionnée et surmontée d un réservoir. Collecter directement le surnageant dans un tube conique en verre de 15 ml. LAB23 I-MET-LFSAL-099 & 099a- Avermectines v.04 2010-07-20 13/21

Evaporer à sec à 65 C sous léger flux gazeux (+/- 2 heures). Rem : Préparer la courbe d étalonnage durant ce temps. Reprendre le résidu sec avec 500 µl d ACN HPLC (R472), vortexer 30 secondes Faire passer les 500 µl d ACN HPLC (R472) sur une colonne Varian HF-C18 Bond Elut 500 mg ou équivalent préalablement conditionnée avec 2 ml d ACN HPLC (R472) et collecter dans un petit tube Duran en verre avec bouchon à visser. Rincer le tube conique avec 2 3 X 2 ml d ACN HPLC (R472) en vortexant quelques secondes, faire passer sur la même colonne C18 et collecter directement dans le même tube en verre. Dégraisser l éluat en ajoutant 3 ml d Hexane HPLC, boucher le tube, vortexer 30 secondes et centrifuger, 4000 tpm pendant 5 minutes à 4 C. Aspirer la phase supérieure Hexane à l aide d une pipette Pasteur. Evaporer à sec le volume total de 4,5 ml à 65 C sous un faible flux gazeux (+/- 0,5 h). 10.5.3 Dérivation Ajouter 220 µl de la Solution MMI de dérivation (D363). Passer au vortex. Ajouter 220 µl de la solution TFAA de dérivation (D364). Passer au vortex. Ajouter 60 µl d'acide acétique HPLC 100 % (R539). Passer au vortex pendant une minute. Placer dans un bloc chauffant à 65 C, bouchon fermé pendant 30 minutes. Placer 3 minutes au congélateur à minimum - 15 C. Filtrer sur filtres PAL Acrodisc 13, Ø 15 mm, GHP, 0,45 µm ou équivalent dans un vial fumé avec insert de 300 µl. Injecter sur l HPLC. Remarques : Après dérivation, les extraits se conservent pendant 24 heures maximum à température ambiante et à l obscurité. S il n est pas possible d injecter en HPLC, il est permis de conserver les échantillons avant la dérivatisation. Il faut alors ajouter 500 µl de Methanol qualité HPLC (R016) sur le résidu sec et conserver au frigo. Pour l injection, évaporer le méthanol et effectuer la dérivatisation. Cette interruption est exceptionnelle et n excédera pas 24H. La préparation des standards doit se faire en début de journée pendant la première évaporation) cela permet d injecter un standard de la plus basse concentration avant de dérivatiser les échantillons inconnus. LAB23 I-MET-LFSAL-099 & 099a- Avermectines v.04 2010-07-20 14/21

10.6 Préparation des phases mobiles Phase A Eau ultrapure de type I à 18,2 MΏ.cm(R293). Phase B Mélange d'acétonitrile HPLC (R472) et de Méthanol pour HPLC (R016) dans la proportion volume-volume 30:60 (D371). 10.7 Conditions expérimentales 10.7.1 Conditions chromatographiques Software Ezchrom Elite : projet Avermectines Injection automatique de 50 µl Colonne : 2 colonnes en série : Chromolith Performance, RP-18C, 100-4,6 mm, 150 mm. Phase mobile : A : eau ultrapure (R293) B : ACN/MeOH (30 : 60) (D 371) Température colonne : 30 C Les vials en attendant l injection sont maintenus à 15 C.(Autosampler thermostatisé). Détecteur fluorimétrique λ ex : 361 nm λ em 465 nm 10.7.2 Conditionnement Tps (min) Pour conditionner les colonnes, avant chaque séquence, la méthode suivante est utilisée : AverCondition A : eau ultrapure (R293) B : ACN-MeOH 30 :60 (D371) Flux: ml/min. 0 0% 100% 0.1 4 1% 99% 0.6 6 5 % 95% 0.8 10 5% 95% 1.5 15 10 % 90 % 2.0 20 10 % 90 % 2.5 120 10 % 90% 2.5 LAB23 I-MET-LFSAL-099 & 099a- Avermectines v.04 2010-07-20 15/21

10.7.3 Analyse La méthode Avermectine de l HPLC est utilisée : Tps (min) A : eau ultrapure (R293) B: ACN/MeOH(D371) Flux: ml/min.) 0 10% 90% 2,5 5 10% 90% 2,5 15 1 % 99% 2,5 20 10% 90% 2,5 10.7.4 Rinçage Après chaque séquence d analyse, il est conseillé de procéder à un rinçage du système et des colonnes. Pour ce faire, utiliser la méthode rinçeaver se trouvant dans les méthodes se trouvant dans le projet Avermectine dans l HPLC. Le rinçage se déroule comme suit : Temps (min) A : eau ultrapure(r293) B : ACN/MeOH(D371) Flux: ml/min 0 10% 90% 2,5 5 0% 100% 2,5 30 0% 100% 1 Remarque : Cette étape n est pas obligatoire si l appareil sert immédiatement après pour la même analyse. LAB23 I-MET-LFSAL-099 & 099a- Avermectines v.04 2010-07-20 16/21

10.8 Séquence d'analyse ACN/MeOH 30 : 60 ( D371 ) 2 level 1 stabilité Rt:ok inj. droite L 1 (level 1) L 2 (level 2) L 3 (level 3) L 4 (level 4) L 5 (level 5) L 6 (level 6) L 2 (level 2) (vérification) Blanc-échantillon (aucun pic > LOQ ok) Echantillon dopé (< ou = 3 δ carte de contrôle ok) Echantillon 1 Echantillon 2 Echantillon 3 L 2 (level 2) (vérification ) Echantillon 4 Echantillon 5 Echantillon 6 Echantillon 7 L 2 (level 2) (vérification ) Etc. L 2 (level 2) (verification ) ACN/MeOH 30 : 60 ( D371 ) Shutdow Méthode : AverCondition Méthode : Avermectines Méthode : RinceAver 11 Contrôle de la qualité 11.1 Contrôle première ligne : Dans chaque séquence d analyse, un échantillon dopé à 4 ng/g sert de contrôle et le résultat est reporté sur une carte de contrôle. Les teneurs doivent se situer dans l écart +/- 3 S de la carte. 11.2 Contrôle deuxième ligne : Un contrôle "en aveugle" est introduit dans le système, au moins une fois par an, par le collaborateur qualité ou le responsable technique. La teneur trouvée doit se situer dans un intervalle de ± 20 % de la teneur supposée. 11.3 Contrôle troisième ligne : Quand cela est possible, le laboratoire sera inscrit aux différents tests interlaboratoires. LAB23 I-MET-LFSAL-099 & 099a- Avermectines v.04 2010-07-20 17/21

12 Calcul et rapportage 12.1 Evaluation des mesures Les contrôles de chaque séquence d analyses sont consignés sur le formulaire ASAVERCHK LAB 23 F543 AS05 Suivi analyses HPLC Avermectines. Les critères d acceptation sont : 12.1.1 La stabilité du système Après avoir effectué le conditionnement des colonnes, injection en double d une solution de L 1 à 2 ng/g. 1. Il faut observer dans le chromatogramme six pics (en plus du pic solvant) correspondants aux six analytes entre 0 et 15 minutes, approximativement aux temps de rétention suivants : Analyte Eprinomectine Moxidectine Némadectine (Std I) Abamectine Doramectine Ivermectine RT ( Min) 4 5 6 8 10 12 2. Les temps de rétention relatifs de chaque analyte ne devront pas (par rapport au Standard interne) excéder 5%, selon la formule : Rt Rt 1 Stdi1 Rt Rt 2 Stdi2 100 5% 12.1.2 Droite d étalonnage La droite d étalonnage est une régression linéaire au sens des moindres carrés en étalonnage interne (némadectine 10 ng/g). L intégration des pics se fait sur la hauteur. Le critère à respecter est le suivant : Les points de l étalonnage ne doivent pas dévier de plus de 10 % de la droite ( pourcentage résiduel).la valeur estimée du Level 2 bis ne devra pas s écarter de plus de 10 % de sa valeur théorique. Le pourcentage résiduel est calculé comme suit : Valeur théorique Valeur estimée Valeur théorique 100 Il est permis le cas échéant de retirer 2 points sur les 6. Si les critères ci-dessus ne sont pas respectés, refaire un étalonnage. LAB23 I-MET-LFSAL-099 & 099a- Avermectines v.04 2010-07-20 18/21

12.1.2 Vérification de la dérive, du blanc et du blanc dopé Dans le blanc, il ne peut pas y avoir, au temps de rétention des analytes, un pic de hauteur supérieure à celle observée dans l échantillon dopé. Le pic de standard interne doit être présent pour prouver une dérivatisation. L échantillon dopé à 4 ng/g en analytes et à 10 ng/g en standard interne est reporté dans une carte de contrôle. Les analytes, hormis le standard interne, doivent se situer dans les limites de ± 3 S (contrôle de 1 ère ligne). Le rendement d extraction est évalué. Toutes les 5 injections, on procède à une injection d une solution de Level 2 bis à 4 ng/g (solution de vérification). Les valeurs des 5 analytes ne doivent pas s écarter de plus de 10 % de leur valeur nominale soit 0,4 ng/g (de 3,96 à 4,4 ng/g) entre 2 vérifications successives et entre la première et la dernière vérification. Sinon, il faut tenir compte de cette dérive (cfr 12.1 MET-LFSAL-024). L'identification des pics est réalisée en comparant les temps de rétention de l'analyte concerné avec ceux des standards. Le rapport des temps de rétention entre un pic d avermectine et le pic de standard interne ne peut différer de plus de 5% par rapport au pic d avermectine correspondante et du standard interne de la vérification la plus proche. Dans le cas où un échantillon serait douteux (à partir de 50% du Ccα), il convient de refaire l analyse sur l échantillon et de réaliser une seconde extraction de ce même échantillon avec un ajout dosé du (des) analyte(s) concerné(s) à une valeur égale ou se rapprochant de celle(s) estimée(s) lors de la première analyse. Un pic d une valeur double de celle observée initialement confirme la présence de ce composé dans l échantillon. L échantillon d essai suspect ayant une teneur T de l analyte est divisé en 2 fractions à analyser 1 et 2 de masse m 1 et m 2. La fraction 2 est supplémentée d un volume V A d une solution de concentration ρ A de l analyte. La récupération RC est supposée identique dans l échantillon natif et supplémenté. Cette méthode dite des ajouts dosés permet de vérifier la teneur dans l échantillon selon la formule : T = ( X m X m ) 2 X ρ V 1 1 A A 1 2 où : T = teneur dans l échantillon (ng/g) X 1-2 = réponse analytique (corrigée sur le SI) en ng/g V A = volume de dopage en ml m 1-2 = prise d esai en g ρ A = concentration de la solution de dopage (ng/ml) (ρ A.V A )/m en ng/g doit être choisi de manière à correspondre à la teneur calculée en première approximation lors de la première analyse. LAB23 I-MET-LFSAL-099 & 099a- Avermectines v.04 2010-07-20 19/21

La récupération RC supposée identique dans les 2 fractions ; le % de récupération est donné selon la formule : 100 % récupération = ( X m X m ) 2 2 ρ AV A 1 1 Le % de récupération devrait être compris entre 70 et 110 % pour des teneurs entre 1 et 10 ng/g et entre compris entre 80 et 110 % pour des teneurs supérieures ou égales à 10 ng/g. 12.2 Expression des résultats Les résultats sont encodés dans UNILAB en précisant préalablement si l échantillon est conforme ou non. LAB23 I-MET-LFSAL-099 & 099a- Avermectines v.04 2010-07-20 20/21

Si l échantillon est non conforme, les résultats sont introduits dans UNILAB en précisant les valeurs obtenues en µg / kg de foie pour chaque avermectine. 13 Référence aux procédures, instructions, documents, formulaires ou listes y afférents 13.1 Procédure Pas d'application 13.2 Formulaires ASAVERFOR : formulaire de travail et de pesées des échantillons ASAVERCHK : formulaire de travail et de vérification de la droite d étalonnage, des "vérifications", des dopages et des rendements LAB 23 F543 AS06 Feuille de travail Avermectines LAB 23 F543 AS05 Suivi analyses HPLC Avermectines 13.3 Liste Incertitude LAB23 L010-03 :Liste des incertitudes de mesure Analyses Spéciales LAB23 I-MET-LFSAL-099 & 099a- Avermectines v.04 2010-07-20 21/21