Mercredi 23 Octobre LECLERCQ Barbara L2 GM Pr Krahn 10 pages Principe des études moléculaires en génétique médicale Méthodes d analyse des microlésions du génome Plan A. Introduction B. Techniques courantes d'analyse de microlésions du génome Notion de diagnostic direct et indirect I PCR II Séquençage direct IV) Micro arrays V) Technique d étude de l expression des gènes A. La nouvelle ère de la génétique moléculaire Principes et enjeux du séquençage à haut débit Rappels et généralités A. Introduction L'intérêt médical est de mettre en évidence les anomalies génétiques qui sont : - Causales c'est-à-dire des maladies qui sont la cause primaire de la maladie du patient : maladies génétiques monofactorielles - Des variations peuvent avoir un effet modificateur («prédisposition génétique»), c'est le cas de nombreuses maladies polyfactorielles (cancérologie, maladies cardio-vasculaires, maladies métaboliques) L'analyse simultanée de tous les gènes d'un individu est impossible actuellement en routine. Il faut choisir les techniques à utiliser en fonction de l'anomalie génétique recherchée. Notamment si on recherche à l échelle du gène ou du chromosome (K), si ce sont des anomalies quantitatives ou qualitatives. Toute ces connaissances sur les techniques s'inscrit dans le cadre d'une démarche diagnostic qui commence par une consultation diagnostique avec l'interrogatoire et l'examen clinique : - histoire de la maladie - arbre généalogique / mode de transmission - examen clinique ciblé - examen clinique généralité et par les examens complémentaires : - analyses biologiques selon le contexte - imagerie - examen ciblés selon l'orientation Tout ceci amène à un diagnostic clinique. 1/10
On peut également compléter, pour confirmer le diagnostic, par des analyses génétiques (cytogénétique et génétique moléculaire) pour conclure avec le diagnostic génétique. Le matériel d'étude le plus utilisé est l ADN Types d'échantillons : l'adn l'arn cdna : séquence d'adn complémentaire à un ARNm obtenue par transcription inverse (Enzyme «reverse transcriptase» ou «transcriptase inverse») Le matériel génétique constitutionnel est identique dans toutes les cellules du corps (or tissu tumoral en cancérologie). Toute analyse à visé diagnostic nécessite un consentement du patient (individu ou représentants légaux). Le prélèvement sanguin périphérique est le prélèvement de base en génétique. Mais d'autres types de prélèvements peuvent être utilisés : les tissus embryonnaires/fœtaux pour le diagnostic prénatal ou d'autres tissus pour des analyses complémentaires dans certaines pathologies. Obtention de K d ADN d ARNm cdna (On peut analyser des cellules (ou de l ADN) fœtales circulantes retrouvées dans le sang maternelle évite les prélèvements à risque et permet des analyses plus précoces. On espère pouvoir réaliser un séquençage complet du génome humain à partir de cette méthode.) A. Techniques courantes d'analyse de microlésions du génome Notion de diagnostic direct et indirect Diagnostic moléculaire des maladies génétique : Objectif : établir un diagnostic précis par identification de l'anomalie génétique. Intérêt : certitude du diagnostic, prise en charge adaptée et conseils génétiques 2/10
Le diagnostic direct : identification de l'anomalie causale : identification de la mutation dans le gène impliqué (dans le cas de la génétique moléculaire) Le diagnostic indirect : Approche secondaire si les analyses direct ne permettent pas d identifier l anomalie génétique causale. Consiste à suivre indirectement la transmission de la mutation au sein de la famille grâce à des marqueurs génétiques. Diagnostic direct : recherche de l'anomalie génétique primaire Identification de mutations constitutionnelles délétères Approche utilisée de préférence qui permet un diagnostic de certitude Principaux problèmes posés : - Parfois lourd sur le plan technique - Parfois non concluant - Polymorphisme ou mutations constitutionnelles délétères? Techniques d'étude des microlésions du génome : génétique moléculaire Objectif : identification d'anomalies à l'échelle du gène Mutation : Substitutions: 1 nucléotide Insertions/délétions de un à quelques nucléotides Insertions/délétions de quelques 10aines ou 100aines de nucléotides (...) Rappel : L information génétique est contenue dans les exons = «séquence codante». NB: la majorité des mutations pathogènes est localisée en séquence codante Analyse préférentielle des exons codants PCR (Polymerase Chain Reaction) Une anomalie génétique que l'on cherche à identifier Problème : étude au niveau moléculaire faible quantité de matériel à disposition or il est nécessaire d avoir une grande quantité de matériel pour réaliser les analyses. Solution : soit on travaille sur de grandes quantités de prélèvement, soit on utilise l amplification de la région d intérêt. La PCR est une technique permettant d'amplifier en grande quantité une région d'intérêt, basée sur l'utilisation : - De courts fragments d'adn synthétiques (les amorces) complémentaires à la séquence d'intérêt (appariement) - D'une enzyme ADN Polymérase (Taq qui est thermostable) qui permet d'amplifier/copier de manière fidèle un ADN cible à partir de régions doubles brin (zones d'appariements ADNcible-amorces) 3/10
La séquence est doublée à chaque cycle. Si l on effectue n cycles on obtient 2n copies. La technique de la PCR est répétée environ 30 cycles amplification exponentielle de la région d intérêt. (Plusieurs 100ènes de millions 230copies) Technique depuis longtemps complètement automatisée. L'objectif n'est pas que d'amplifier mais aussi d'analyser! Le plus important est l'analyse de la séquence de la région d'intérêt. Mais on peut aussi réaliser une analyse de la taille applications diverse (analyse de microsatellites (marqueurs génétiques),...) Cf ED Structure d un gène : L'information est dans la séquence. Au niveau 5' du gène : site de régulation. (Tous les exons ne sont pas forcément codants!) ATG : site d'initiation de la traduction. (souvent dans le 1er exon) Codon stop arrêt de la traduction 3' : site de régulation. La taille moyenne d un gène est de 8 à 10 exons, avec une séquence codante d environ 2 à 5000 pb et une région génomique correspondante d environ 100 000 pb. La séquence codante d'un gène ne représente qu'une petite fraction du gène initial. Les introns peuvent être très longs. Pour déterminer la séquence on utilise la méthode de séquençage direct qui a été automatisé à la fin des années 80. Séquençage direct Technique basé sur la méthode de Sanger. Utilisation de ddntp qui sont des analogues structuraux des dntp mais incapables de réaliser une liaison phosphodiester. Incorporation au hasard de ddntp marqués qui stoppent à chaque fois l'élongation. 4/10
Exemple : Recherche d'une mutation dans un gène chez un patient, par la technique du séquençage direct. Actuellement on utilise cette méthode de séquençage direct sur des échantillons de 700 à 800pb. C est une approche relativement lourde et couteuse malgré une diminution déjà. Des technologies de précriblage mutationnelle ont donc été développées. (= séquençage ciblé) Leur intérêt est de détecter les exons porteurs d'une variation de séquence réduction du temps d'analyse et des couts Comparaison entre un échantillon normal et un échantillon dans lequel on recherche une mutation. C'est une analyse globale de la région d intérêt. On utilise différentes stratégies en fonction des caractéristiques des gènes : - petite taille séquençage complet de la totalité de la séquence codante d intérêt (tous les exons codants et bornes introniques) - petite taille + mutations récurrentes techniques de détection ciblée de mutations récurrentes - grande taille +/- spectre mutationnel large technique de précriblage mutationnel séquençage ciblé des exons présentant des profils anormaux. - Grande taille + mutations récurrentes techniques de détection ciblée de mutations récurrentes Parfois on peut également faire un séquençage complet de la totalité de la séquence codante pour des gènes 5/10
de grande taille. Micro-arrays Lame (support en verre ou autre) sur lesquelles sont déposées des sondes Echantillon ADN ou cdna Marquage différentiel 5' Cy3 (ADN patient) 5' Cy5 (ADN contrôle) Hybridation compétitive et comparative pour détecter les régions d intérêt Analyse : capture des signaux fluorescents (scanner, ratio Cy3/Cy5) Le micro-arrays a été développé au départ pour étudier des 10ène de millier d ARNm différents étude à grande échelle. Il y a de nombreuses applications : Analyse d'expression (ex : «signatures d'expression» de tumeurs) Analyse de liaison (ex : identification de locus candidats par génotypage SNP) Analyse génomiques comparatives (ex : comparaison de génomes procaryotes) Hybridation génomique comparative (ex : identification de remaniements chromosomiques) Re-séquençage (ex : analyses mutationnelles) ChIP-chip (chromatin immunoprecipitation on chip) (ex : identification de sites de fixation de facteurs de transcription) Analyses d ADN méthylé (ex : identification de promoteurs, d ilôts CpG) Séquence-capture (ex : enrichissement de régions génomiques cibles avant séquençage à haut débit) (liste non exhaustive) CGH arrays : détecter des anomalies quantitatives entre un échantillon patient et un échantillon de contrôle 6/10
Application importante en génétique chromosomique. Elle permet une détection quantitative : gains ou perte de matériel génétique à l'échelle du génome entier (analyse simultané de tous les K) ou à l'échelle d'une région Kq d'intérêt. Et grâce à l'amélioration de la résolution de ces approches de CGH arrays on peut effectuer l'analyse à l'échelle du gène. Techniques d'étude de l'expression des gènes Objectif : identification d'anomalies quantitatives ou qualitatives de l'expression d'un ou de plusieurs gènes (attention : au niveau de d'arn) Différentes techniques disponibles: RT-PCR et séquençage RT-PCR quantitative en temps réel, très utilisé et très sensible micro-arrays d'expression (...) Exemples d'utilisation : génétique : analyse de gènes exprimés dans le muscle pour le diagnostic de myopathies cancérologie : identification de profils d'expression spécifiques de certains types de tumeurs. Micro-array d'expression : Ex : identification de profils d'expressions spécifiques de certains types de tumeurs Définitions de groupes homogènes Identification de facteurs pronostiques Evaluation de thérapies ciblées Interprétation des données mutationnelles Analyse en génétique moléculaire (et cytogénétique moléculaire) Résultat d'analyse : Identification de variations génomiques (par rapport à la séquence de référence) : effet pathogène ou polymorphisme? Recherche d information dans des bases de données mutationnelles Prédiction bio-informatique de pathogénicité 7/10
A. La nouvelle ère de la génétique moléculaire o 1990-2003 : Human Genome Project Le génome humain séquencé dans un projet international à 3 milliards de dollars o 2013 : séquençage à haut débit, 1 génome humain en 1 semaine à 5000 dollars Mais l'analyse des données reste difficile. Principes et enjeux du séquençage à haut débit Le séquençage ne se fait pas sur un mélange de produit de réaction mais s'effectue de manière clonale sur des millions de molécule de manière individuelle. Des technologies différentes du séquençage direct selon Sanger Production de très grandes quantités de séquences : environ 150 gigabases/run Diminution importante des délais et des coûts : génome à 10 000 euros en 1 semaine Procédure actuelle : Séquençage direct (Sanger ) approche «gène par gène» : 1 ou quelques gènes, long (1 semaine à 1an) et couteux. Procédure future : Séquençage à haut débit approche «haut débit» : plusieurs centaines de gènes ou génome entier, rapide (72h à 1 semaines) et réduction des coûts. The 1 000 dollars genome Dans le futur : séquençage du génome à visée diagnostique? Première preuve de principe en 2010 avec l identification du gène causal chez le patient. Séquençage du génome d un individu. 3millions de variations de séquence dans lesquelles devaient se trouver la mutation. filtrage : ne retient que les variations non synonymes c'est-à-dire de variation qui potentiellement entrainent un changement d AA ou apparition d un codon stop ; et de filtrer dans un second temps, par rapport à des bases de données, d identifier les mutations qui peuvent être à l origine de la maladie. 8/10
Capture de séquence : sondes qui sélectionnent des régions d'intérêt. Fragmentation de la région d'intérêt puis hybridation avec des sondes (soit sur micro-array soit sondes présentes en milieu de réaction = liquide). Permet de retenir de manière spécifique la région d intérêt et d éliminer ce qui est en dehors de la région d'intérêt. Enfin séquençage à haut débit de la région d'intérêt retenue (1 gène ou des 10ène ou 100ène) Exemple de capture : exomes = analyse tous les exons de tous les gènes du génome ~ 1% du génome (30Mb-48Mb) soit ~180 000 exons Criblage moléculaire à haut débit : les limites Précision Ethique Quelles données rendre aux patient? médecine préventive / diagnostic pré-symptomatique Accès au NGS ( ) Masse d'information à traiter Exome : 25 000 variants dont 400 nouveaux Génome : 3M de variants dont 500 000 nouveaux Bio-informatique Filtrage des données Interprétation du caractère pathogène Va-t-on vers une médecine personnalisé? «Prédisposition génétique», «1000 Dollar genome» Une nouvelle ère : le génome personnel Coût de séquençage d'un génome humain en «service» 2011 : 10 000 dollars 2012 : 5 000 dollars Adaptation des débits à des besoins moyens projet de recherche de taille moyenne Séquençage du génome sur la paillasse en 1 jour. 9/10
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