CONCOURS EXTERNE DE TECHNICIEN DE LABORATOIRE Session de 2010 Vendredi 23 avril 2010 De 14h à 16h Épreuve d admissibilité Épreuve écrite à caractère scientifique Durée 2 heures Coefficient 1 SPECIALITE A : SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE ET BIOTECHNOLOGIE Avertissement Ce livret comprend 28 pages et est composé de trois parties : Une partie commune, pages 2 à 14 qui doit être traitée par tous les candidats ; Une partie option «biotechnologie», pages 15 à 22 ; Une partie option «sciences de la vie et de la Terre», pages 23 à 28. Chaque candidat devra traiter la partie commune et la partie correspondant à l option choisie au moment de son inscription. Toute composition dans une autre option entraînera l annulation de l épreuve. Si, au cours de l épreuve, un candidat repère ce qui lui semble être une erreur d énoncé, il le signale sur sa copie et poursuit sa composition en précisant les initiatives qu il prend pour la rédaction de sa solution. Le sujet se présente sous forme de QCM. Pour chaque question, plusieurs réponses sont proposées. Suivant le cas, il y a une ou plusieurs réponse(s) juste(s). Vous devez cocher toutes les réponses justes. Le livret sera rendu dans son intégralité en fin d épreuve. S agissant d un concours de recrutement de personnel administratif présentant une spécificité technique particulière, l utilisation d une calculatrice électronique programmable est autorisée conformément aux dispositions de la circulaire n 99-186 du 16 novembre 1999. L usage de tout ouvrage de référence, de tout document et de tout autre matériel électronique est rigoureusement interdit. Vous devez impérativement vous abstenir de signer ou d identifier votre copie. Hormis l en-tête détachable, la copie que vous rendrez ne devra, conformément au principe d anonymat, comporter aucun signe distinctif, tel que nom, signature, origine, etc. Toute annotation distinctive mènera à l annulation de votre épreuve. - 1 -
Partie commune Doit être traitée par tous les candidats FICHE 1 - Purification du lysozyme du blanc d œuf DONNÉES TECHNIQUES Le lysozyme isolé du blanc d œuf de poule est une enzyme monomérique de149 acides aminés, dont la structure est stabilisée par quatre ponts disulfure. Le lysozyme ou muramidase catalyse l hydrolyse des liaisons β 1 4 entre l acide N-acétylmuramique et les résidus de N-acétylglucosamine du peptidoglycane composant les parois bactériennes. MANIPULATION Le lysozyme représente 7 à 8 % des protéines du blanc d œuf. Son phi, égal à 11, est nettement supérieur à celui des autres protéines du blanc d œuf. La première étape de purification du lysozyme du blanc d œuf consiste en une chromatographie d échange d ions, sur carboxyméthylcellulose, résine échangeuse de cations. Étape 1 : rétention du lysozyme sur la résine échangeuse d ions Peser 1 g de carboxyméthylcellulose (CM-cellulose) directement dans le tube à centrifuger. Ajouter 7,5 ml de tampon ph 10 (tampon glycine 0,1 mol.l -1 NaOH). Ajouter 2,5 ml de blanc d œuf filtré. Agiter soigneusement à l aide d un agitateur de verre pour permettre l adsorption du lysozyme sur la résine. Laisser reposer 15 min, puis centrifuger 10 min à 3000 tours.min -1. Conserver le surnageant, qui constitue la fraction F1, dans la glace. Étape 2 : lavages Laver le culot avec 20 ml de tampon ph 10. Agiter soigneusement par rotations manuelles. Laisser reposer 10 min et centrifuger à nouveau : récupérer le culot cellulosique. Renouveler la même opération avec 20 ml de tampon ph 10 : récupérer le culot cellulosique C2, à conserver dans la glace. Étape 3 : élution Reprendre le culot C2 dans 10 ml de tampon ph 10 + NaCl (tampon glycine 0,1 mol.l -1 - NaOH - NaCl 0,5 mol.l -1 ). Agiter soigneusement à l aide d un agitateur de verre. Laisser reposer 10 min et centrifuger : récupérer le surnageant F3, à conserver dans la glace. - 2 -
QUESTIONS 1. Parmi les propositions suivantes concernant la structure du lysozyme, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) : A. Le lysozyme est la protéine majeure du blanc d œuf. B. Le lysozyme est une enzyme à une seule sous-unité. C. Les ponts disulfure sont des liaisons faibles reliant deux groupements sulfates entre deux liaisons peptidiques. D. Les ponts disulfure sont des liaisons covalentes reliant deux résidus de cystéine. E. Les ponts disulfure sont des liaisons faibles stabilisant les feuillets β. 2. Parmi les propositions suivantes concernant l activité du lysozyme, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) : A. Le lysozyme est une hydrolase. B. Le lysozyme est une ligase. C. Le lysozyme est une protéase. D. Le lysozyme est une isomérase. E. Le lysozyme est une enzyme lytique capable de lyser les bactéries, notamment à Gram positif. 3. Sachant que le phi du lysozyme est de 11, et que les étapes de rétention et de lavage sur la résine sont effectuées à ph 10, indiquer parmi les propositions suivantes celle(s) qui est (sont) exacte(s) : A. À ph 10, le lysozyme est chargé négativement, car une majorité de chaînes latérales des résidus d acides aminés sont déprotonées. B. À ph 10, le lysozyme est chargé négativement, car une majorité de chaînes latérales des résidus d acides aminés sont protonées. C. À ph 10, le lysozyme est chargé positivement, car une majorité de chaînes latérales des résidus d acides aminés sont déprotonées. D. À ph 10, le lysozyme est chargé positivement, car des chaînes latérales des résidus d acides aminés sont protonées. E. À ph 10, le lysozyme est neutre car le blanc d œuf est dilué dans une solution tampon. 4. La résine échangeuse de cations utilisée, la carboxyméthylcellulose, est un polyoside dont les propriétés permettent de retenir le lysozyme. Parmi les propositions suivantes indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) : A. La carboxyméthylcellulose est une résine échangeuse de cations faible. B. La carboxyméthylcellulose est une résine échangeuse de cations forte. C. Les groupements fonctionnels de la carboxyméthylcellulose sont protonés à ph 10. D. Les groupements fonctionnels de la carboxyméthylcellulose sont déprotonés à ph 10. E. À ph 10, les autres protéines du blanc d œuf sont chargées négativement. - 3 -
5. L élution est effectuée à l aide d un tampon ph 10 (glycine 0,1 mol.l -1 - NaOH - NaCl 0,5 mol.l -1 ). Parmi les propositions suivantes concernant cette étape, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) : A. Les phases de lavage et de centrifugation ont pour objectif d éliminer les protéines libres et celles fixées non spécifiquement à la carboxyméthylcellulose. B. L élution permet d éliminer un maximum de contaminants protéiques et non protéiques du blanc d œuf. C. L élution permet de récupérer le lysozyme retenu sur la résine en jouant sur la force ionique des ions sodium, supérieure à celle du lysozyme. D. L élution permet de récupérer le lysozyme retenu sur la résine par modification du ph. E. Les ions chlorure jouent un rôle essentiel dans l élution. - 4 -
Fiche 2 Amidon et saccharose DONNÉES TECHNIQUES Les formules des deux polymères constitutifs de l amidon ainsi que la formule du saccharose sont rappelées ci-dessous : Amidon = mélange d amylose et d amylopectine, dont les proportions varient en fonction de l origine végétale. Saccharose = α-d-glucopyranosyl-(1 >2)-β-D-fructofuranoside MANIPULATION 1 : Hydrolyse chimique de l amidon : Dans une fiole d Erlenmeyer de 100 ml, verser : - 50 ml d empois d amidon à 0,5 %, - 10 ml d acide chlorhydrique concentré. Bien homogénéiser puis placer la fiole au bain-marie. Toutes les trois minutes, pendant trente minutes, prélever 3 ml d hydrolysat, à placer immédiatement dans la glace. Ajouter trois gouttes de NaOH à 1%. Pour chaque prélèvement, faire le test à la liqueur de Fehling et à l eau iodée. - 5 -
MANIPULATION 2 : Hydrolyse chimique du saccharose : Dans une fiole d Erlenmeyer de 100 ml, verser : - 50 ml de sacharose à 1 %, - 3 ml d acide chlorhydrique concentré. Bien homogénéiser puis placer la fiole au bain-marie. Toutes les trois minutes, pendant trente minutes, prélever 3 ml d hydrolysat, à placer immédiatement dans la glace. Ajouter trois gouttes de NaOH à 1%. Pour chaque prélèvement, faire le test à la liqueur de Fehling. QUESTIONS 6. Choisir, parmi les propositions suivantes, celle(s) qui est (sont) exacte(s) : A. Le saccharose est un hétéroside. B. Le saccharose est un diholoside. C. Le saccharose est un ose. D. L amidon est un polyholoside homogène. E. L amidon est polymère glucidique de réserve. 7. Parmi les propositions suivantes concernant l hydrolyse chimique de l amidon et du saccharose, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) : A. L hydrolyse chimique entraîne la rupture des liaisons faibles stabilisatrices. B. L hydrolyse chimique entraîne la rupture des liaisons osidiques. C. L hydrolyse chimique entraîne la rupture des ponts oxydiques. D. L hydrolyse chimique est effectuée en milieu acide pour les deux manipulations. E. L hydrolyse chimique est effectuée en milieu basique pour les deux manipulations. 8. Les hydrolysats obtenus sont analysés au cours de l hydrolyse par des tests à l eau iodée ou à la liqueur de Fehling. Parmi les propositions suivantes, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) : A. La liqueur de Fehling permet de mettre en évidence la présence de sucres réducteurs. B. La liqueur de Fehling permet de mettre en évidence la présence de saccharose. C. La liqueur de Fehling permet de mettre en évidence la présence de sucres réducteurs par une coloration rouge. D. L eau iodée permet de mettre en évidence la présence d amidon par une coloration rouge. E. L eau iodée permet de rendre totale l hydrolyse de l amidon. - 6 -
9. Au bout de 60 minutes, l hydrolyse est totale pour les deux hydrolysats étudiés. Ils sont alors analysés par chromatographie sur couche mince. Parmi les propositions suivantes, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) : Hydrolysat issu de l amidon A. On obtient un seul spot correspondant au glucose. B. On obtient deux spots correspondant au glucose et au maltose. Hydrolysat issu du saccharose C. On obtient un seul spot correspondant au fructose. D. On obtient deux spots correspondant au glucose et au fructose. E. On obtient deux spots correspondant au glucose et au galactose. 10. La chromatographie mise en œuvre utilise une phase fixe de silice et une phase mobile composée de méthanol (1V), acide éthanoïque (1V), méthylcellosolve (3V). Parmi les propositions suivantes concernant cette technique, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) : A. Plus un soluté analysé est soluble dans la phase mobile, plus il migre loin. B. Il est conseillé d immerger complètement la ligne de dépôt dans la phase mobile, pour faciliter la solubilité des solutés analysés. C. La rétention est due à l établissement de liaisons de surface de faible énergie entre la silice et les solutés analysés. D. Les solutés sont séparés en fonction de leur masse molaire. E. La technique mise en œuvre est une chromatographie d adsorption. - 7 -
Fiche 3 Culture de levures auxotrophes DONNÉES SUR LA CULTURE DE LEVURES AUXOTROPHES LEVURES AUXOTROPHES MISES À DISPOSITION On dispose de différents mutants haploïdes auxotrophes de Saccharomyces cerevisiae. La liste ci-dessous donne les auxotrophies pour chacun de ces mutants. - Souche A : ade, leu - Souche B : leu, trp - Souche C : trp - Souche D: ade NB : seuls les caractères déficients sont notés. Les autres caractères sont donc sauvages. ade : gènes de la voie de biosynthèse de l adénine leu : gènes de la voie de biosynthèse de la leucine trp : gènes de la voie de biosynthèse du tryptophane MILIEU DE CULTURE Le milieu de culture est le milieu de base YNB glucosé*, additionné des substances appropriées**, en fonction des auxotrophies. * YNB glucosé : composition Yeast nitrogen base Glucose Sulfate d ammonium Agar Eau distillée 1,7 g 20 g 5 g 20 g qsp 1 L ph 6,2 ** Substances à rajouter à la gélose YNB en surfusion (supplémentation) Substance à dissoudre Concentration initiale (%) Solvant Concentration finale (mg.l -1 ) Arginine 1 eau 50 Leucine 1 eau 50 Sérine 8 eau 400 Thréonine 4 eau 100 Tryptophane 1 NaHCO 3 5 g.l -1 50 Adénine 0,2 HCl 50 mmol 10 Uracile 0,2 NaHCO 3 5 g.l -1 20-8 -
QUESTIONS 11. Parmi les propositions suivantes concernant les milieux de culture appropriés pour les souches à disposition, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) : A. La souche A cultive sur milieu YNB glucosé de base. B. Les souches A, B, C et D cultivent sur un milieu YNB glucosé additionné d adénine, de leucine et de tryptophane. C. Seule la souche A cultive sur un milieu YNB glucosé additionné d adénine et de leucine. D. Seule la souche C cultive sur un milieu YNB glucosé additionné de tryptophane. E. Les souches A et B ne cultivent que sur un milieu complet YNB glucosé additionné de tous les suppléments proposés dans le tableau. 12. En ce qui concerne la préparation des milieux supplémentés, indiquer la (les) proposition(s) exacte(s) (le volume de substance à ajouter reste négligeable devant le volume de gélose) : A. La leucine doit être ajoutée à raison de 100 µl pour 20 ml de gélose en surfusion. B. La leucine doit être ajoutée à raison de 10 µl pour 20 ml de gélose en surfusion. C. La thréonine doit être ajoutée à raison de 50 µl pour 20 ml de gélose en surfusion. D. L adénine doit être ajoutée à raison de 200 µl pour 20 ml de gélose en surfusion. E. L uracile doit être ajoutée à raison de 200 µl pour 20 ml de gélose en surfusion. 13. Après croisement des souches C et D, on obtient un hybride diploïde, qui subit la méiose une fois cultivé sur milieu appauvri. Au final, on obtient quatre types de spores haploïdes. Leurs phénotypes sont : A. [ade, TRP + ] [ADE +, TRP + ] [ade, trp ] [ADE +, TRP + ] B. [ade, TRP + ] [ade, trp ] [ade, trp ] [ADE +, TRP + ] C. [ade, TRP + ] [ade, trp ] [ade, TRP + ] [ade, trp ] D. [ade, TRP + ] [ADE +, trp ] [ade, trp ] [ADE +, TRP + ] E. [ade, trp ] [ADE +, TRP + ] [ade, trp ] [ADE +, trp ] 14. Indiquer quel(s) milieu(x) permettra(ont) la culture du nouveau mutant double auxotrophe créé, après croisement des souches C et D. A. YNB glucosé additionné de tous les suppléments proposés dans le tableau B. YNB glucosé additionné d adénine et de tryptophane C. YNB glucosé additionné d adénine, de tryptophane et de leucine D. YNB glucosé additionné d adénine et de leucine E. Aucun des milieux proposés 15. Parmi les propositions suivantes concernant le(s) milieu(x) de culture approprié(s) spécifique(s) de ce nouveau mutant double auxotrophe, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) : (rappel : un milieu spécifique correspond à un milieu permettant la culture exclusive de ce mutant) A. YNB glucosé additionné de tous les suppléments proposés dans le tableau B. YNB glucosé additionné d adénine et de tryptophane C. YNB glucosé additionné d adénine, de tryptophane et de leucine D. YNB glucosé additionné d adénine et de leucine E. Aucun des milieux proposés - 9 -
Fiche 4 Les réserves végétales 16 -. Le radis stocke ses réserves au niveau de son : o rhizome o stolon o tubercule 17 - Pour mettre en évidence des réserves de glucose, vous utilisez en classe : o la carotte o la pomme de terre o l oignon o le radis 18 - La pomme de terre est un tubercule : o racinaire o caulinaire o hypocotylaire A B C 19 - Pour mettre en évidence les amyloplastes cicontre, extraits de parenchyme de pomme de terre, vous utilisez : o du bleu de méthylène o du Lugol o du rouge Soudan 20 - Pour obtenir les clichés de gauche des amyloplastes et montrer ainsi l utilisation de leurs réserves, vous utilisez la pomme de terre photographiée ci-dessus en : o A o B o C 21 - Compte-tenu de l échelle indiquée sur le cliché de droite, à quel grossissement avez-vous réalisé ces observations? o 40 o 80 o 400 o 800-10 -
Fiche 5 - Séparation des protéines 22 - Purifier une protéine c est : o la séparer d autres protéines o la cristalliser o séparer ses sous-unités o connaître sa composition en acides aminés 23 - Les protéines peuvent être séparées les unes des autres en utilisant leurs différences : o de solubilité en milieu salin o de masse molaire o de charge globale o d hydrophobicité 24 - Deux protéines X et Y ont respectivement des phi de 5 et 7. Quel ph choisira-t-on pour les séparer par électrophorèse sur gel de polyacrylamide? o ph = 3 o ph = 6 o ph = 9 o ph = 12 25 - La masse molaire d une protéine peut-elle être déterminée par : o précipitation fractionnée en milieu salin o chromatographie par filtration sur gel o électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes o chromatographie échangeuse d ions 26 - Parmi les agents chimiques suivants, quels sont ceux qui peuvent provoquer la dénaturation d une protéine in vitro? o urée 8 mol.l -1 o détergent SDS (sodium dodecylsulfate) 5% o β-mercaptoéthanol 10 % o tampon phosphate 0,1 mol.l -1, ph=7 27 - On réalise une électrophorèse sur feuille d acétate de cellulose en faisant un dépôt d hémoglobine A, normale, et à côté, un dépôt d hémoglobine S, anormale. L hémoglobine anormale S ne diffère de l hémoglobine normale A que par un acide aminé de la chaîne β en position 6 : l acide glutamique est remplacé par la valine. Chaîne latérale de l acide glutamique : CH 2 -CH 2 -COOH (pka = 4,3) Chaîne latérale de la valine : CH-CH 3 CH 3 27.1. Les bandes d acétate que l on va utiliser sont conditionnées dans le tampon Tris- Véronal. Il faut ensuite les placer dans la cuve à électrophorèse et empêcher leur déshydratation en : o plaçant les bandes entières sous le niveau du tampon o plaçant les extrémités des bandes seules dans le tampon o fermant le couvercle de la cuve - 11 -
27.2. Les solutions d hémoglobine formées sont maintenues avant utilisation : o à température ambiante o dans des bacs de glace o à 37 C 27.3. Connaissant les masses molaires atomiques données ci-dessous : Carbone : 12 g.mol -1, Oxygène : 16 g.mol -1, Hydrogène : 1 g.mol -1, quelle est, exprimée en grammes par mole, la masse molaire de l acide glutamique et de la valine : - pour l acide glutamique (en g.mol -1 ) o 150 o 147 o 120 o 73 - pour la valine (en g.mol -1 ) o 150 o 130 o 43 o 35 27.4. La chaîne latérale de l acide glutamique dans le tampon Tris-Véronal (ph = 9,2) est : o chargée positivement o chargée négativement o globalement neutre 27.5. La migration se fait vers l anode pendant 45 minutes à 180V et la révélation permet de montrer que HbA est plus rapide. Le critère dominant ici est donc : o les masses molaires o les charges électriques o les conformations protéiques 27.6. La révélation des protéines HbA et HbS, ayant migré sur feuille d acétate de cellulose, se réalise grâce au colorant : o ninhydrine o rouge Ponceau o bleu de Coomassie 28 - On veut déterminer la structure d une protéine de masse moléculaire estimée à 230 kd. Une électrophorèse dans certaines conditions dénaturantes, n entrainant pas la rupture des ponts disulfures, fait apparaître une bande à 115 kd. Après action du β-mercaptoéthanol (agent réducteur de ponts disulfures), on obtient, dans les mêmes conditions d électrophorèse, deux bandes, l une de 80 kd et l autre de 35 kd. On peut en déduire que cette protéine est : o monomérique o multimérique o constituées de 2 sous-unités de masses identiques unies par des ponts disulfures o constituées de 4 sous-unités de masses identiques o constituées de 4 sous-unités de masses identiques 2 à 2-12 -
Fiche 6 - Fossiles et microfossiles 29 - Cette photo représente : Un fossile de gastéropode Une corne de bélier fossilisée Un fossile d'ammonite 30 - Ce fossile a été trouvé : Dans une roche métamorphique Dans une roche sédimentaire Dans une roche plutonique 31 - Cette photo représente : Un cnidaire fossilisé Un rotifère fossilisé Un foraminifère fossilisé 32 - Les fossiles inclus dans l'échantillon sont : 1cm des orbitulines des nummulites des alvéolines (photo mnhn) - 13 -
33 - Le fossile de la photo ci contre est : une vertèbre un œuf de requin l'axe d'une fougère arborescente 34 - L'inclusion fossilisée de l'échantillon cicontre correspond à : des branchies de mollusques des fougères un organisme colonial 35 La nature de la roche est d origine : carbonatée carbonée évaporitique - 14 -
Partie spécifique : option biotechnologie Fiche 1 Dénombrement bactérien DONNÉES GÉNÉRALES Pour les besoins d une séance de travaux pratiques, 50 ml d une suspension de Lactococcus doivent être ajustés à exactement 1,0.10 5 bactéries.ml 1. Le préparateur estime, dans un premier temps, la densité de deux précultures (A et B) par la technique de Breed, puis réalise, pour la préculture B, un dénombrement en surface d un milieu gélosé M17 spécifique des Lactococcus. DONNÉES SUR LA TECHNIQUE DE BREED La technique de Breed permet d estimer la densité d une population microbienne à partir d un frottis coloré et calibré. Ce frottis est réalisé à partir de 10 µl de préculture, préalablement diluée au ½, étalés sur une surface de 1 cm 2. Le frottis est observé au microscope à l objectif x 100 sous huile à immersion. On détermine le nombre moyen de microorganismes par champ après avoir compté 20 à 30 champs. La concentration cellulaire N est déterminée en utilisant la formule suivante. S 1 N = n Fd s V N = concentration cellulaire en bactéries. ml 1 n = nombre moyen de bactéries comptées par champ S = surface totale du frottis en cm 2 s = surface d un champ microscopique en cm 2 V = volume d échantillon (ml) Fd = facteur de dilution Information complémentaire et résultats : - Diamètre d un champ microscopique = 180 µm - Préculture A : n = 24 bactéries comptées par champ - Préculture B : N = 7,1.10 6 bactéries. ml 1-15 -
QUESTIONS 1. Parmi les propositions suivantes concernant la technique de dénombrement par la technique de Breed, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) : A. La technique de Breed aurait pu être remplacée par un dénombrement en hématimètre de Malassez. B. Cette technique n est valide que si la répartition des cellules sur l ensemble des champs est relativement homogène. C. Le comptage de 20 à 30 champs a pour objectif de vérifier l absence de contaminants. D. La surface s de chaque champ microscopique est de 2,54.10 4 cm 2. E. La surface s de chaque champ microscopique est de 3,05.10 6 cm 2. 2. Parmi les propositions suivantes concernant les résultats des dénombrements de la préculture A par la méthode de Breed, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) : A. N préculture A = 1,9. 10 7 bactéries. ml 1 B. N préculture A = 4,8. 10 8 bactéries. ml 1 C. N préculture A = 9,4. 10 6 bactéries. ml 1 D. N préculture A = 9,4. 10 7 bactéries. ml 1 E. N préculture A = 1,6. 10 9 bactéries. ml 1 3. Parmi les propositions suivantes concernant les résultats des dénombrements de la préculture B par la méthode de Breed, indiquer le nombre moyen de bactéries comptées par champ : A. n préculture B = 21 B. n préculture B = 13 C. n préculture B = 29 D. n préculture B = 5 E. n préculture B = 9 4. Les dilutions à ensemencer pour le dénombrement des bactéries de la préculture B en milieu M17 sont : A. 10 1, 10 2 et 10 3 B. 10-2, 10 3 et 10 4 C. 10 3, 10 4 et 10 5 D. 10 4, 10 5 et 10 6 E. 10 5, 10 6 et 10 7-16 -
5. Parmi les propositions suivantes concernant la réalisation de 50 ml de suspension ajustée à 1,0.10 5 bactéries.ml 1 pour la séance de travaux pratiques, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) : Donnée : Le dénombrement en milieu solide donne le résultat suivant : N préculture B = 3,5.10 6 bactéries.ml 1. A. La préculture est diluée au 1/350 ème et 16,6 ml sont ajoutés à 33,4 ml de milieu de culture. B. La préculture est diluée au 1/10 ème puis 14,3 ml sont ajoutés à 35,7 ml de milieu de culture. C. La préculture est diluée au 1/35 ème sous un volume final de 50 ml. D. L ajustage est réalisé en fiole jaugée de 50 ml. E. L ajustage est réalisé en bécher de 50 ml. - 17 -
Fiche 2 Culture cellulaire DONNÉES SUR L ENTRETIEN ET LA CULTURE D UNE LIGNÉE CELLULAIRE INFORMATIONS GÉNÉRALES AU SUJET DES CELLULES COS - La lignée COS (CV-1 Origin, SV40) est dérivée de fibloblastes CV-1 de rein de singe adulte africain, le singe vert (Cercopithecus aethiops), transformés par le virus SV40 déficient. - Elles sont envoyées congelées et doivent être mises en culture dans un milieu approprié. MILIEU ET CONDITIONS DE CULTURE - Milieu de culture complet : les cellules COS peuvent être cultivées en RPMI (Roswell Park Memorial Institute) complet, préparé à partir du milieu de base RPMI 1640*. Le milieu complet est préparé par ajout au milieu de base des additifs suivants : o 10% de sérum de veau fœtal (SVF) décomplémenté o 1% d antibiotiques (mélange de streptomycine et pénicilline) o 0,3 mg.l 1 de L-Glutamine (à partir d une solution à 300 mg.l 1 ) - Atmosphère : o air, 95 % o dioxyde de carbone (CO 2 ), 5 % - Température : 37,0 C * RPMI 1640 : composition en mg.l 1 Ions minéraux NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, MgSO 4, CaCl 2, Ca(NO 3 ) 2, Na 2 HPO 4 total = 9341,0 L-amino-acides Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gly, His, Pro, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, total = 694,0 Thr, Trp, Val Autres molécules D-Glucose 2000,0 Glutathion réduit 1,0 Rouge de phénol, sel de sodium 5,3 Vitamines Biotine, choline, acide panthoténique, acide folique, myo-inositol, niacinamide, acide amino-benzoïque, nicotinamide, pyridoxine, total = 43,7 riboflavine, thiamine, cobalamine REPIQUAGE Les cellules doivent être régulièrement repiquées en milieu complet neuf, et ajustées à la concentration désirée. Le repiquage se fera selon la méthode classique suivante : - Trypsination à 37 C ; - Ajout de milieu neuf complet ; - Centrifugation et resuspension, afin de laver les cellules ; - Numération d un aliquot ; - Réensemencement à la concentration choisie. - 18 -
QUESTIONS 6. Parmi les propositions suivantes concernant la composition, la nature, et la préparation du milieu de culture, indiquer celle(s) qui est (sont) exactes : A. Le milieu de base RPMI est un milieu empirique. B. La glutamine est une base azotée fragile et peu stable, c est pourquoi on doit l ajouter au dernier moment. C. Le SVF contient de la trypsine et des facteurs de croissance. D. La décomplémentation du SVF est nécessaire pour éliminer les composants thermolabiles du complément. E. Les antibiotiques ajoutés préviennent les contaminations bactériennes. 7. Dans le but de repiquer les cellules, on a besoin de préparer 250 ml de milieu complet. Indiquer quels sont les volumes des solutions d additifs à ajouter au milieu de base : A. 10 ml de SVF, 2,5 ml d antibiotiques, et 50 µl de glutamine, ajoutés à 250 ml de milieu de base. B. 10 ml de SVF, 1 ml d antibiotiques, et 250 µl de glutamine, ajoutés à environ 240 ml de milieu de base. C. 10 ml de SVF, 2,5 ml d antibiotiques, et 50 µl de glutamine, ajoutés à environ 240 ml de milieu de base. D. 25 ml de SVF, 2,5 ml d antibiotiques, et 250 µl de glutamine, ajoutés à environ 220 ml de milieu de base. E. 25 ml de SVF, 2,5 ml d antibiotiques, et 0,25 ml de glutamine, ajoutés à environ 220 ml de milieu de base. 8. Parmi les propositions suivantes concernant l entretien de la lignée cellulaire, indiquer celle(s) qui est (sont) exactes : A. Un milieu de couleur jaune en 24 h indique une croissance optimale des cellules en culture. B. Une atmosphère à 5% de CO 2 est assurée en reliant l étuve à une bonbonne de CO 2. C. La trypsine doit être laissée plus de 8 h en contact avec les cellules pour assurer leur dissociation et leur décollement. D. Le CO 2 de l atmosphère de culture joue un rôle dans le maintien du ph du milieu, en association avec le NaCl du milieu. E. L ajout de milieu complet après l étape de trypsination sert à arrêter l action de la trypsine. - 19 -
9. Après trypsination, les cellules sont centrifugées, puis remises en suspension dans 5 ml de milieu frais. Un aliquot est prélevé et dilué au demi en bleu Trypan. La suspension obtenue est alors numérée sous hématimètre de Malassez. Les résultats de la numération pour 11 rectangles sont : nombre de cellules bleues : 13 nombre de cellules totales : 207 Rappel : volume d un rectangle de numération = 0,01 µl A. Le pourcentage de viabilité est d environ 94 % et la concentration en cellules viables est de 1,8.10 6 cellules.ml 1. B. Le pourcentage de viabilité est d environ 94 % et la concentration en cellules viables est de 4,2.10 6 cellules.ml 1. C. Le pourcentage de viabilité est d environ 94 % et la concentration en cellules viables est de 3,5.10 6 cellules.ml 1. D. Le pourcentage de viabilité est d environ 6 % et la concentration en cellules viables est de 3,5.10 6 cellules.ml 1. E. Le nombre de cellules viables décollées est d environ 1,8.10 7 cellules. 10. Dans le cadre de la préparation de flasks de culture pour un groupe de quinze élèves, on cherche à ensemencer les cellules précédemment dénombrées à une concentration finale de 10 5 cellules.ml 1, dans des flasks de 5 ml. Indiquer la (les) proposition(s) exacte(s) : A. On doit disposer d au moins 7,5.10 7 cellules, donc la suspension précédemment dénombrée ne suffit pas. B. On doit disposer d au moins 7,5.10 6 cellules, donc la suspension précédemment dénombrée suffit. C. On introduit environ 150 µl de la suspension précédemment dénombrée et 4,3 ml de milieu complet par flask. D. On introduit environ 30 µl de la suspension précédemment dénombrée et 4,97 ml de milieu complet par flask. E. La suspension cellulaire est finalement diluée au 1/35. - 20 -
Fiche 3 Dosage enzymatique de substrats DONNÉES TECHNIQUES On se propose de réaliser le contrôle quantitatif du glucose et du fructose d une boisson sucrée, par méthode enzymatique en point final (test UV à 340 nm) 1- Principe D-Glucose + ATP D-Fructose + ATP hexokinase hexokinase D-Glucose-6-phosphate + ADP D-Fructose-6-phosphate + ADP D-Glucose-6-phosphate + NAD + H + glu cos e 6 phosphate deshydrogénase D-gluconate-6-phosphate + NADH + D-Fructose-6-phosphate phosphoglu cos e isomérase D-Glucose-6-phosphate 2- Linéarité de la méthode Le dosage est linéaire pour des quantités allant de 5 à 80 µg de D-glucose + D-fructose dans les conditions du dosage. 3- Réactifs R1 : Tampon ph 7,5, NAD +, ATP. Prêt à l emploi. R2 : Hexokinase (300 U.mL -1 ), Glucose-6-phosphate Deshydrogénase (400 U.mL -1 ). Prêt à l emploi. R3 : Phosphoglucose-isomérase (450 U.mL -1 ). Prêt à l emploi. Les réactifs doivent être conservés à 2-8 C. 4- Mode opératoire - longueur d onde : 340 nm - trajet optique : 1 cm - température 20-25 C - mesure contre l air ou l eau distillée Réactifs et solutions Témoin réactifs Essai R1 (ml) 1,000 1,000 Eau distillée (ml) 2,000 1,900 Echantillon (ml) 0 0,100 Mélanger. Lire les absorbances (A1). Ajouter ensuite R2 (ml) 0,020 0,020 Mélanger. Lire les absorbances (A2) après environ 15 minutes. Vérifier que la réaction est terminée en effectuant une relecture après quelques minutes. Ajouter ensuite R3 (ml) 0,020 0,020 Mélanger. Lire les absorbances (A3) après environ 15 minutes. Vérifier que la réaction est terminée en effectuant une relecture après quelques minutes. Données : M(glucose) = M(fructose) = 180,16 g.mol -1 340 2 1 ε = 630 m.mol NADPH - 21 -
QUESTIONS 11. Parmi les propositions suivantes concernant le principe du dosage mis en œuvre, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) : A. Le dosage est spécifique de tous les oses. B. Le dosage est spécifique du glucose et du fructose. C. La réaction indicatrice du système réactionnel utilisé fait intervenir l hexokinase. D. Au cours du dosage, on mesure une diminution d absorbance à 340 nm. E. Au cours du dosage, on mesure une augmentation d absorbance à 340 nm. 12. Parmi les propositions suivantes concernant les conditions opératoires du dosage, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) : A. La température d incubation n est pas rigoureusement fixée au cours du dosage. B. La concentration en ATP doit être très proche de celle du glucose et du fructose. C. Les K M de l hexokinase pour le glucose et le fructose doivent être très élevés. D. Les temps d incubation dépendent de la température d incubation. E. Le ph du tampon doit correspondre au ph optimum des différentes activités enzymatiques. 13. Sachant que les concentrations attendues en glucose, comme en fructose, sont de l ordre de 20 g par litre de boisson, parmi les propositions suivantes, indiquer celle qui est exacte : A. Il n est pas utile d effectuer une dilution de la boisson préalablement au dosage ; B. Il faut diluer la boisson au 1/10. C. Il faut diluer la boisson au 1/25. D. Il faut diluer la boisson au 1/100. E. Il faut diluer la boisson au 1/1000. 14. Parmi les propositions suivantes concernant les variations d absorbance uniquement liées à la présence de fructose, ΔA fructose, et de glucose, ΔA glucose indiquer celle(s) qui est(sont) exacte(s) : A. ΔA fructose = (A2-A1)essai (A2-A1)témoin réactifs B. ΔA fructose = (A3-A1)essai (A3-A1)témoin réactifs C. ΔA fructose = (A3-A2)essai (A3-A2)témoin réactifs D. ΔA glucose = (A2-A1)essai (A2-A1)témoin réactifs E. ΔA glucose = (A3- A1)essai (A3-A1)témoin réactifs 15. Parmi les propositions suivantes concernant la formule de calcul de la concentration en glucose C mglucose (en g.l -1 ) dans l échantillon, indiquer celle qui est exacte : A. C mglucose = 869,3 x ΔA glucose B. C mglucose = 0,8636 x ΔA glucose C. C mglucose = 0,02860 x ΔA glucose D. C mglucose = 28,60 x ΔA glucose E. C mglucose = 0,2860 x ΔA glucose - 22 -
Partie spécifique : option sciences de la vie et de la Terre Fiche 1 : enzyme et cinétique enzymatique 1 - On purifie une enzyme d un tissu hépatique. Avant la purification, on avait une activité de 1000 unités internationales et 100 mg de protéines. Après purification, on a une activité de 500 unités internationales pour 1 mg de protéines. On a purifié l enzyme : o 10 fois o 20 fois o 50 fois o 100 fois o 500 fois 2 - Le foie contient deux enzymes, l hexokinase et la glucokinase capables de phosphoryler le glucose selon la réaction suivante : Glucose + ATP -> glucose 6P + ADP Les deux cinétiques des enzymes sont présentées ci-dessous Vitesse de la réaction Taux de glucose dans le sang Hexokinase Glucokinase 5x10-5 mol.l -1 2x10-2 mol.l -1 Concentration en glucose (en mol.l -1 ) 2.1. Le taux de glucose dans le sang est d environ : o 1 mg.l -1 o 10 mg. L -1 o 1 g.ml -1 o 1 g. L -1 2.2. Sachant que la masse molaire du glucose est 180 g.mol -1 quel est le taux de glucose dans le sang : o 5,5 x10-4 mol. L -1 o 2 x10-4 mol. L -1 o 5,5 x10-3 mol. L -1 o 2 x10-3 mol. L -1-23 -
2.3. D après les cinétiques obtenues ci-dessus, on déduit de ces courbes que : o le Km de l hexokinase est supérieur à celui de la glucokinase o L affinité pour le glucose de la glucokinase est plus forte que celle de la glucokinase o L affinité pour le glucose de l hexokinase est plus forte que celle de la glucokinase 2.4. Si on rajoute au milieu réactionnel de départ du glucose 6P, on observe les résultats suivants : enzymes Glucose 6-P Km Vm hexokinase 0,4 mmol. L -1 constant Diminuée glucokinase 65 mmol. L -1 augmenté constant Ces résultats indiquent : o Le glucose 6P est un inhibiteur compétitif pour l hexokinase o Le glucose 6P est un inhibiteur non compétitif pour l hexokinase o Le glucose 6P est un inhibiteur compétitif pour la glucokinase - 24 -
Fiche 2 : Mise en évidence expérimentale de structures végétales 3 - Pour mettre en évidence des chloroplastes, il est souvent proposé aux élèves une observation de feuille d Elodée. Le choix de cette plante réside dans le fait que l Elodée est une : o plante aquatique o plante particulièrement riche en chloroplastes o plante qui possède des feuilles particulièrement fines (une ou deux assises cellulaires seulement) o plante qui possède des chloroplastes particulièrement gros 4 - La photo A montre l extrémité de feuille d Elodée et à plus fort grossissement, le cliché B montre les chloroplastes. La matière organique présente dans les chloroplastes a été mise en évidence grâce à du Lugol (cliché C). Pour obtenir ce résultat, il a fallu : o placer préalablement l Elodée dans une solution d hydrogénocarbonate 1% o placer préalablement l Elodée dans une solution NaCl 35 g.l -1 o placer préalablement l Elodée sous une lampe o placer la préparation sur la platine du microscope et attendre un moment avec la lampe allumée A B C Portion de feuille d'élodée (taille réelle 10 mm) 5 - Pour obtenir les états de turgescence et de plasmolyse photographiés ci-dessous, l épiderme d un oignon rouge a été monté : o pour D : dans de l eau du robinet o pour D : dans une solution saccharose 0,6 mol.l -1 o pour E : dans une solution saccharose 0,6 mol.l -1 o pour E : dans une solution KH 2 PO 4 40 g.l -1 D E - 25 -
6 - Les vacuoles des cellules épidermiques d oignon rouge sont bien visibles car elles contiennent : o du lycopène o du carotène o de l anthocyane o des xanthophyllles 7 - Si on ne dispose pas d oignon rouge, on peut néanmoins utiliser de l oignon blanc et un colorant pour reproduire le même résultat. Il suffit d utiliser : o du rouge Soudan o du rouge neutre o du rouge Congo - 26 -
Fiche 3 : Tomographie sismique valeurs élevées A B profondeur valeurs faibles Coupe de tomographie sismique (d'après Ritsema et al., 1999 cité par King 2003). Les points verts représentent les épicentres et les foyers des séismes. Question 8 - Sur la coupe de tomographie sismique, les valeurs représentées sont : Les anomalies de vitesses des ondes sismiques en fonction de la profondeur Les anomalies magnétiques en fonction de la profondeur Les pourcentages de fusion des roches en fonction de la profondeur Question 9 - La zone notée A : est une zone d'obduction est une zone de subduction autre Question 10 - La zone notée B correspond : à une marge passive à une zone de divergence de la lithosphère à une zone de convergence de la lithosphère Question 11 - Vers 200 km de profondeur, on observe la transition entre : la croûte et le manteau la lithosphère et l'asthénosphère le manteau supérieur et le manteau inférieur - 27 -
Fiche 4 : Propriétés des roches et des minéraux Question 12 - La dureté des minéraux : Le gypse est rayé par l'ongle et l'orthose est plus dur que le quartz L'acier est plus dur que tous les minéraux sauf le diamant Le topaze est plus dur que le quartz mais moins dur que le corindon Question 13 - L'effervescence à l'acide chlorhydrique dilué à froid est observée : avec un échantillon de calcaire avec un échantillon de calcite pur avec un échantillon de calcium pur Question 14 - Les roches magmatiques : correspondent aux roches volcaniques et plutoniques ont toutes une composition globale identique avec une minéralogie variable ont toutes une minéralogie identique avec une composition chimique variable Question 15 - les roches sédimentaires : ne contiennent jamais de minéraux contiennent toujours des fossiles peuvent se former par précipitation - 28 -