Institut Supérieur de l Education et de la Formation Continue TD de Biochimie SV-342 Enzymologie Radhouane Chakroun 2013-2014
Sommaire TD N 1 - Purification et calcul de l activité enzymatique...3 Exercice n 1 - Activité d une Enzyme...3 Exercice n 2 - Purification et activité de la G6-PD...3 Exercice n 3 - Activité de la ß-Galactosidase...4 TD N 2 - Étude de la cinétique enzymatique...5 Exercice n 1 : Etude Cinétique d une enzyme...5 Exercice n 2 - Activité enzymatique en fonction de la concentration en substrat...5 Exercice n 3 - Comparaison cinétique des enzymes de la phosphorylation du glucose...6 Exercice n 4 - Réaction enzymatique à 2 substrats (1)...6 Exercice n 5 - Réaction enzymatique à 2 substrats (2)...7 TD N 3 - Étude de l inhibition de la catalyse enzymatique...8 Exercice n 1 :...8 Exercice n 2 :...8 Exercice n 3 :...8 TD N 4 - Allostérie... 10 Exercice n 1 :... 10 Exercice n 2 :... 10 N.B. : Se munir du nécessaire de traçage des courbes et dune calculatrice 2
TD N 1 - Purification et calcul de l activité enzymatique Exercice n 1 - Activité d une Enzyme Une enzyme E est constitué de 2 sous-unités identiques de poids moléculaires voisins de 50 000 Da. La réaction catalysée est : S P On dispose d'un extrait de E contenant 3 mg de protéines par ml et dans lequel l enzyme est pure à 80%. La détermination d'activité est réalisée par spectrophotométrie à 512 nm, longueur d'onde à laquelle le produit P absorbe mais non le substrat S. Le coefficient d'absorption molaire du produit est égal dans les conditions de la mesure à 5 000 L. mol -1.cm -1. La cuve utilisée a une largeur de 1 cm. Le milieu réactionnel, tamponné à ph 7 et thermostaté à 30 C, contient une concentration saturante en substrat. Son volume est de 3 ml. On utilise pour la détermination 100 µl d'extrait de E diluée au 500 ème. On arrête la réaction en ajoutant 2 ml de réactif d'arrêt au milieu réactionnel après 2 minutes de temps de réaction. La variation d'absorbance lue est égale à 0,6 unité d'absorbance. 1) Calculer la concentration d'activité catalytique dans l'extrait E. 2) Calculer l'activité spécifique de cet extrait 3) En déduire l activité molaire spécifique à 30 C et ph 7. Exercice n 2 - Purification et activité de la G6-PD La glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6-PD) catalyse la réaction : Le coefficient d extinction molaire du NADPH, à 340nm, est de 6,22.10 3 M -1 cm -1. Les autres composés n absorbent pas à cette longueur d onde. On se propose de purifier la G6-PD de Bacillus subtilis. Pour tester le degré de pureté de la préparation après chaque étape de purification, on ajoute une partie aliquote de la préparation à une solution de D-glucose-6-phosphate et de NADP+ qui restent en excès pendant tout le temps de la mesure dans une cuve de spectrophotomètre de trajet optique = 1 cm. Le volume final de la solution est 1mL. 1) Après un certain nombre d étapes de purification, on ajoute 100µg de protéine au mélange réactionnel. Après 5 minutes, l absorbance enregistrée à 340 nm est 0,30. Calculer l'activité spécifique de la préparation de G6-PD à ce stade de purification. 2) Après de nouvelles étapes de purification, 1 µg de protéine est ajouté au mélange réactionnel. Il entraîne après une minute, une absorbance de 0,358. Calculer l activité spécifique de la préparation de la G6-PD à ce stade de la purification. Par rapport au stade précédent, combien de fois a-t-on purifié la G6-PD? 3
3) Après de nouvelles tentatives de purification, on ne parvient pas à obtenir une activité spécifique plus élevée. Qu en déduisez-vous? 4) Sachant que le poids moléculaire de la G6-PD est 80 000 Da, calculer son activité spécifique moléculaire. Exercice n 3 - Activité de la ß-Galactosidase La lactase hydrolyse le lactose en glucose et galactose selon le schéma réactionnel suivant : On détermine la vitesse d hydrolyse du lactose par la lactase (β-galactosidase) (E.C. 3.2.1.23) dans les conditions initiales. Il apparaît 0,672x10-2 moles de glucose en 10 minutes. On a introduit dans le milieu 1 ml de solution enzymatique dont la teneur en protéines est de 2,85 g.l -1. 1) Que signifie le terme «conditions initiales»? Préciser les conditions de concentrations en substrat. 2) Comment exprime-t-on la concentration d activité catalytique d une enzyme? 3) Calculer la concentration d activité catalytique de la préparation enzymatique de lactase. 4) Calculer l activité spécifique de l enzyme. 5) Calculer l activité molaire spécifique en considérant que l on est en présence d une enzyme pure (PM= 135000 Da). 4
TD N 2 - Étude de la cinétique enzymatique Exercice n 1 : Etude Cinétique d une enzyme On réalise sur une préparation pure en enzyme la mesure de l'apparition du produit en fonction du temps pour une concentration en substrat de 0,1 mol.l -1 dont voici les résultats : Temps (min) 0 0,5 1 2 3 4 5 [Produit] (µmol.l -1 ) 0 109 205 405 489 534 555 1) Tracer le graphique de la concentration de produit en fonction du temps. 2) Déterminer la vitesse initiale de la réaction enzymatique. 3) On mesure la vitesse initiale Vi pour différentes concentrations de substrat (voir tableau ci-dessous). Déterminer graphiquement les constantes cinétiques de cette enzyme et déterminer sa vitesse initiale pour une concentration en substrat égale à 0,1 mol.l -1. [S] (mol.l -1 ) 0,0125 0,025 0,05 0,1 Vi (µmol.l -1 minute -1 ) 133 167 190 Compléter Exercice n 2 - Activité enzymatique en fonction de la concentration en substrat Une enzyme E catalyse la réaction d'hydrolyse: A + H2O <=====> B + C On suit la cinétique d'apparition du produit C, pour différentes concentrations en substrat A. Les valeurs obtenues (en μmoles de C par tube) sont présentées dans le tableau suivant : Temps (min) [S0] mm 10 30 100 150 0 0 0 0 0 2,5 0,9 1,9 3,2 3,6 5 1,8 3,9 6,4 7,1 7,5 2,5 5,6 9,6 10,7 12,5 3,7 7,6 15,2 17,6 17,5 4,4 9,1 18,3 1) Représentez les cinétiques et déterminez la vitesse initiale de chacune d'elle. 2) Dans quelle condition de concentration du substrat A s'est-on placé pour suivre ces cinétiques? 3) Tracez la courbe de saturation et commentez-la. Déterminez les paramètres cinétiques de l'enzyme. 5
Exercice n 3 - Comparaison cinétique des enzymes de la phosphorylation du glucose Le glucose est dégradé dans l organisme par la voie de la glycolyse. La première réaction de cette voie est une phosphorylation du glucose qui peut être catalysée par deux enzymes différentes : la Glucokinase ou l' Hexokinase. On se propose d étudier les caractères cinétiques de ces deux enzymes vis à vis de leur substrat commun : le glucose. La vitesse initiale de la réaction a été mesurée pour des concentrations différentes en substrat à 20 C et à ph=7. Les résultats expérimentaux sont reproduits dans le tableau suivant : Sachant que la concentration en enzyme utilisée pour les deux séries d expériences est la même : [Glucose] en mol.l -1 [Glucose] i en mol.l -1 V i avec la glucokinase V i avec l hexokinase en µmol.l -1.min -1 i en µmol.l -1.min -1 5,0.10-3 1,61 5,0.10-3 0,490 6,7.10-3 2,00 6,7.10-3 0,575 10,0.10-3 2,67 10,0.10-3 0,607 20,0.10-3 2,93 20,0.10-3 0,806 50,0.10-3 4,17 50,0.10-3 0,893 1) Déterminer les valeurs de K M et de V m pour ces deux enzymes. 2) Comparer les deux K M. Conclure. 3) Comparer les deux V m. Conclure. 4) Sachant que la glycémie normale est d'environ 5 mmol.l -1, indiquer si chacune de ces deux enzymes agit dans les conditions d obtention de la vitesse maximum. 5) Quelle serait l influence d une augmentation importante de la glycémie? Exercice n 4 - Réaction enzymatique à 2 substrats (1) La phospholipase A2 catalyse l'hydrolyse de l'acide gras estérifié en position 2 des 1-2- diacylphosphoglycérides en présence d'ion calcium. On mesure les vitesses initiales d'hydrolyse de la dibutyryl-lécithine (DBL), à différentes concentrations de ce substrat et de calcium. La réaction est suivie en titrant l'acide libéré par la soude et les résultats en µmoles d'acide libéré.min -1.mg -1 de phospholipase sont les suivantes : [DBL] (mm) [Ca 2+ ]x10-6 (M) 25 50 100 200 11,4 0,60 0,83 1,00 1,15 22,7 1,07 1,40 1,70 1,85 34 1,45 1,85 2,15 2,35 45,4 1,75 2,20 2,50 2,70 Déterminez le mécanisme et les paramètres cinétiques de la réaction. 6
Exercice n 5 - Réaction enzymatique à 2 substrats (2) On étudie le mécanisme catalytique de la glycogène phosphorylase en mesurant les vitesses initiales de la réaction pour différentes concentrations des 2 substrats (le glycogène et le phosphate). Les résultats, en µmoles de glucose 1-phosphate.min -1.mg -1 glycogène phosphorylase, sont les suivants : [Phosphate]x10-3 (M) [Glycogène] (mg.ml -1 ) 3,2 8 16 24 48 6 12 18 21 23 25 15 24 35,5 43 46 49 30 35,5 53 64 68,5 74 45 43 64 77 82 88 60 47,5 71 85 91,5 98,5 Déterminez le mécanisme et les paramètres cinétiques de cette réaction. 7
TD N 3 - Étude de l inhibition de la catalyse enzymatique Exercice n 1 : L activité d une enzyme est mesurée en fonction de la concentration en substrat en absence et en présence d un inhibiteur à une concentration de 2.10-3 M. On trouve les résultats suivants : [S] x 10-5 (M) Vitesses (µmoles.min -1 ) Sans Inhibiteur Avec Inhibiteur 0,3 10,4 4,1 0,5 14,5 6,4 1 22,5 11,3 3 33,8 22,6 9 40,5 33,8 1) Déterminez V m et K M en absence et en présence de l'inhibiteur. Précisez le type d'inhibition et calculez la constante d'inhibition K I. Exercice n 2 : On suit la réaction enzymatique, en absence et en présence de l inhibiteur I, en mesurant l absorbance du produit. Pour différentes concentrations initiales en substrat, on obtient les vitesses initiales suivantes (U.A. = unité d'absorbance) : [S] 0 (mm) vi (U.A.min -1 ) Sans inhibiteur vi (U.A.min -1 ) [I] = 9 mm 0,032 0,18 0,070 0,048 0,25 0,097 0,076 0,35 0,137 0,096 0,42 0,164 0,136 0,50 0,195 0,232 0,68 0,270 0,348 0,78 0,312 1) Déterminez les paramètres cinétiques (V m exprimée en molarité et K M ) et les paramètres cinétiques en présence de l'inhibiteur. 2) Précisez le type d'inhibition et calculez la constante d'inhibition K I. Données : [E] 0 = 27 nm ; ε M produit = 2600 M -1.cm -1 et l = 1 cm. Exercice n 3 : L acide 1-anilino-8-naphtalène sulfonate (ANS) est un inhibiteur de l acétylcholine estérase. Pour déterminer la nature de l inhibition, on a mesuré les vitesses initiales d hydrolyse de l acétylcholine, à différentes concentrations de ce substrat, en absence d ANS (expérience A), en présence d ANS (2,05x10-4 M) (expérience B) et 1,07x10-4 M d ANS (expérience C). Le tableau suivant exprime ces expériences. Les vitesses sont exprimées en µm d acétylcholine hydrolysé par minute et par mg de protéine. 8
[Acétylcholine] (mm) Vitesses de la réaction A B C 0,165 66 40 35 0,220 82 45 39 0,330 107 52 44 0,450 130 56,5 47,5 0,550 143 59 49,5 0,660 156 61 51 Précisez le type d'inhibition et calculez la constante d'inhibition K I. 9
TD N 4 - Allostérie Exercice n 1 : On étudie la cinétique de deux enzymes A et B. A partir des données suivantes, distinguez le type d enzyme (c'est-à-dire s il s agit d une enzyme ordinaire ou allostérique) et expliquez l allure des courbes représentant la vitesse en fonction de la concentration du substrat. [S] x 10-3 (M) V enzyme A (µmol.min -1 ) V enzyme B (µmol.min -1 ) 0,00 0,00 0,00 0,50 8,80 0,30 1,00 14,00 1,00 2,00 19,00 4,70 3,00 21,50 12,40 4,00 22,80 19,00 5,00 22,30 21,80 6,00 23,50 22,80 8,00 23,60 23,30 Exercice n 2 : L acide aspartique est à l origine de la biosynthèse de 4 autres acides aminés chez E. Coli : la lysine, la méthionine, la thréonine et l isoleucine. L aspartokinase I (sous forme de complexe multienzymatique) intervient au cours de la première étape de la biosynthèse. Dans certaines conditions, sa cinétique peut être michaélienne. Son activité est régulée par quelques effecteurs, notamment la thréonine. Le tableau suivant donne les mesures de la vitesse initiale (en unités arbitraires) obtenues en l absence et en présence de thréonine à une concentration de 40 µmol.l -1. [S] mol.l -1 0,0 1,0 x 10-3 2,5 x 10-3 5,0 x 10-3 7,5 x 10-3 10,0 x 10-3 15 x 10-3 20 x 10-3 25 x 10-3 Vi Sans thréonine Vi avec thréonine 0,000 0,343 0,567 0,727 0,800 0,843 0,890 0,917 0,933 0,000 0,000 0,015 0,122 0,331 0,549 0,813 0,915 0,956 1) Représentez les courbes vi=f(s) en l absence et en présence de thréonine. Conclure. 2) Effectuez la représentation en double inverse en l absence de thréonine. En déduire la valeur de la constante de Michaelis et celle de la vitesse initiale maximale. 3) Effectuez la représentation de Hill en l absence et en présence de thréonine. En déduire la valeur de la constante de Michaelis (à comparer avec celle obtenue à la question n 2), ainsi que l indice de coopérativité en présence de thréonine. 10
11