Développement de cultures bactériennes protectrices antifongiques pour améliorer la conservation des produits laitiers fermentés Jean-Marc CHOBERT Yvan CHOISET INRA Angers Nantes, UR 1268 BIA Gen2Bio 2011 Angers, jeudi 31 mars 2011
Ce projet a été retenu par l ANR dans le cadre de l appel à projet ALIA-2009 «Alimentation et Industries Alimentaires» Axe 2 : recherche en alimentation pour une économie plus dynamique des productions alimentaires». Il a pour objectif principal de permettre la diminution des additifs chimiques dans les produits laitiers fermentés en fournissant des cultures protectrices efficaces et adaptées à différents types de produits laitiers. Page 2
Les champignons, les levures et les bactéries sont les premiers responsables de l'altération des produits alimentaires : impact très important sur la durée de conservation. Les pertes dues à la contamination fongique sont évaluées à 5-10% de la production alimentaire mondiale: Penicillium et Aspergillus, considérés comme les plus grands ravageurs ainsi que les levures du genre Candida et Rhodotula. Différents moyens ont été déployés afin de contrer la contamination fongique des aliments. Parmi ces techniques on décrit: Page 3
Méthodes physiques comme le séchage, la lyophilisation et les chambres froides Méthodes chimiques comme: les additifs : acides ascorbique, propionique, sorbique, benzoique et acétique ; l éthanol. La Bio- conservation, suscite un grand intérêt. Les substances antifongiques produites par des plantes : les protéines comme : chitinases, glucanases les inhibiteurs de protéases les thionines (peptides) L'utilisation des cultures bioprotectrices actives contre les champignons : Culture de bactéries lactiques Page 4
Activité antifongique des bactéries lactiques (synthèse) Bactéries lactiques Organismes sensibles Métabolites antifongiques Lactobacillus rhamnosus VT1 Lactobacillus plantarum Fusarium et autres Acétate de sodium ( Stiles al. 2002) Peptide cyclique ( Katrin et al. 2002) Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis Lactobacillus plantarum 21B Lactobacillus sanfrancisco CB1 Lactococcus lactis subsp.lactis CHD 28.3 CHD- Fusarium et Aspergillus Fusarium et Aspergillus Fusarium et autres Fusarium et autres Peptide ( Magnusson et al. 2001) Acide phényllactique (Lavermicocca et al. 2000) Acides organiques (Corsetti et al. 1998 ) Peptide (Utpal et al. 1996 ) Page 5
OBJECTIFS Déterminer la localisation de la substance antifongique: extracellulaire ou intracellulaire; Caractérisation biochimique de la substance antifongique: Stabilité en fonction de la température, du ph. Effet des protéases Purification de la fongicine par chromatographies Identification par spectrométrie de masse. Page 6
I- Mise en évidence de l activité antifongique Effet du surnageant de culture de bactéries lactiques sur les champignons Technique de diffusion dans l'agar Suspension de spore 10 6 spore/ml Milieu PDA Réalisation de puits culture d'une nuit de bactéries lactiques (30 C) puis centrifugation à 4000 tr, 15 min PDA + suspension de spore + 100 µl de surnageant de culture bactérienne surnageant (100 µl) Incubation à 25 C pendant 48 à 72 h Mesure du diamètre d'inhibition Page 7
I- Mise en évidence de l activité antifongique Effet inhibiteur des bactéries lactiques en culture avec le champignon Technique de strie Ensemencement en strie de la souche lactique MRS Réalisation de puits PDA + Suspension de spores Colonies de bactéries lactiques + suspension de spores de champignons (10 6 spore / ml) Incubation à 25 C pendant 48 à 72 h Zones d inhibition autour des souches actives Page 8
II- Caractérisation biochimique de la substance antifongique 1- Stabilité en fonction de la température Un échantillon de culture ou de surnageant de culture de bactéries Chauffage à 100 C pendant 5, 10, 20 et 30 min Arrêt de la réaction dans la glace Tester l activité antifongique résiduelle 2- Stabilité en fonction du ph Ajustement du ph de l échantillon de culture ou du surnageant de culture de bactéries entre ph 3 et 10 avec NaOH 2 N ou HCl 2 N Incubation 2 h à température ambiante Neutralisation des échantillons à ph 6,2-6,4 Tester l activité antifongique résiduelle Page 9
III- Protocole de Purification Séparation par chromatographie d échanges d ions Tests d activité Application sur une colonne RP-FPLC Tests d activité Étude de la stabilité de la substance (stockage à 4 C en fonction du ph, lyophilisation) Activité spécifique Essais de caractérisation: analyse par LC - MS, séquençage Page 10
Élucidation du mécanisme d action des molécules peptidiques Caractérisation et purification des peptides actifs Synthèse peptidique Analyses des relations structure-fonction Analyses de cytotoxicité Page 11
Intérêt de la Synthèse peptidique Obtention rapide de peptides en quantité (50-100 mg) Modifications de Peptides Réalisation de délétions et substitutions Étiquetage d acides aminés pouvant être utilisés comme sonde RMN Page 12