Rapport de synthèse (études préliminaire, d extension et interlaboratoire conduites selon la norme EN ISO 16140)

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1 Laboratoire de Touraine biomérieux Rapport de synthèse (études préliminaire, d extension et interlaboratoire conduites selon la norme EN ISO 16140) Validation de la méthode «ONE DAY» pour la recherche de Listeria monocytogenes et de Listeria spp dans les produits d alimentation humaine et les échantillons d environnement Réalisation de l étude par : Pour : Laboratoire de Touraine Unité vétérinaire et Agroalimentaire BP Tours cedex 2 biomérieux SA Chemin de l Orme MARCY L ETOILE N attestation AFNOR : AES 10/3 09/00 RSynthese_AES 10/3 09/00_v6_15/05/2015

2 Tables des matières 1. Introduction Référentiels de validation Protocole et principe de la méthode alternative Domaine d application Méthode de référence Historique de la validation Étude préliminaire Exactitude relative, spécificité relative et sensibilité relative Protocole pour la recherche de Listeria monocytogenes Protocole pour la recherche de Listeria spp Conservation au froid et tests de confirmation Niveau de détection relatif Inclusivité / Exclusivité Étude (2000) menée lors de la validation initiale de la méthode «/ L. Monodisk» pour la recherche de Listeria monocytogenes Étude (2006) menée lors de l extension de la méthode «One Day» pour la recherche de Listeria monocytogenes, en intégrant le protocole de confirmation «Confirmation» (ISHA) Étude (2010) menée lors de l extension du protocole «One Day» pour la recherche de Listeria monocytogenes et de Listeria spp Étude d extension concernant le test «Fast Rhamnose» (confirmation) Principe et mode opératoire Protocole de l étude Résultats des essais «Fast Rhamnose» Conclusion de l étude d extension Etude interlaboratoire Praticabilité Conclusion générale ANNEXES Liste des Annexes - Annexe 1 : Protocole analytique de la méthode «One Day» - Annexe 2 : Mode opératoire de la méthode EN ISO /A1 - Annexe 3 : Inclusivité/ Exclusivité : Tableaux de résultats (étude 2000) - Annexe 4 : Inclusivité/ Exclusivité : Tableaux de résultats (étude d extension : 2005) - Annexe 5 : Inclusivité/ Exclusivité : Tableaux de résultats (ISHA : 2006) - Annexe 6 : Inclusivité/ Exclusivité : Tableaux de résultats (étude d extension : 2010) - Annexe 7 : Résultats des essais Fast Rhamnose : Souches cibles (étude d extension : 2013) - Annexe 8 : Résultats des essais Fast Rhamnose : Souches non cibles (étude d extension : 2013) 2

3 1. Introduction 1.1 Référentiels de validation Norme EN ISO (2003) «Microbiologie des aliments - Protocole pour la validation des méthodes alternatives» Document AFNOR Certification : «Exigences relatives aux études (préliminaire et interlaboratoire) menées par un laboratoire expert». 1.2 Protocole et principe de la méthode alternative Principe de la méthode : Le milieu gélosé est un milieu chromogène qui permet de détecter l ensemble des Listeria par la mise en évidence de l activité béta-glucosidase (colonies rondes, à bord régulier, de couleur bleu-turquoise) et de distinguer Listeria monocytogenes ou Listeria ivanovii par la formation d un halo franc de précipitation des phospholipides clivés par sa phospholipase spécifique. Protocole de la méthode alternative : La gélose est utilisée pour la recherche de Listeria monocytogenes (protocole «One Day») et de Listeria spp dans les échantillons d alimentation humaine et les prélèvements d environnement. Le principe de la méthode repose sur une phase préliminaire d enrichissement de la prise d essai diluée au 1/10 ème en bouillon Fraser demi (incubation 24h +-2h, 30 C +/- 1 C) suivie d un étalement ou d un isolement sur gélose. Il est laissé la possibilité à l utilisateur de conserver le bouillon Fraser ½ jusqu à 72 heures à 5 C +/- 3 C avant de réaliser les ensemencements. Après une incubation des géloses de 24h à 48h, à 37 C +/- 1 C, les Listeria monocytogenes forment des colonies bleues à bleu-vert entourées d un halo opaque (24h). Les Listeria autres que monocytogenes ou ivanovii forment, quant à elles, des colonies bleues à bleu vert, rondes, régulières, sans halo opaque. Conformément aux prescriptions d AFNOR Certification et du fabricant, les colonies typiques doivent faire l objet de tests de confirmation : Pour le cas des colonies typiques de Listeria monocytogenes (colonies bleues à bleues vertes, entourées d un halo opaque) : 1- confirmation d une colonie positive selon les tests classiques des méthodes normalisées, en incluant l étape de purification, 2- confirmation selon le protocole «Confirmation», 3- confirmation selon le protocole VIDAS LMO2, 4- confirmation avec le réactif Accuprobe L. monocytogenes, 5- confirmation en réalisant une galerie API Listeria, 6- confirmation en réalisant une galerie RAPIDEC L. mono, 7- test «FAST Rhamnose», 3

4 8- confirmation par toute autre méthode certifiée AFNOR Validation dont le principe est différent de la méthode «One Day» (les deux méthodes validées devant avoir un tronc commun). Pour le cas des colonies typiques de Listeria spp (colonies bleues à bleues vertes, entourées ou non d un halo opaque) : 1- confirmation d une colonie positive selon les tests classiques des méthodes normalisées, en incluant l étape de purification, 2- confirmation par piqûre sur gélose Palcam à partir d une colonie isolée, 3- confirmation rapide par test immunochromatographique «Listeria species Confirmation Strip», 4- confirmation par toute autre méthode certifiée AFNOR Validation dont le principe est différent de la méthode «One Day» (les deux méthodes validées devant avoir un tronc commun). Protocole d utilisation de la méthode alternative sous forme de schéma : Le synoptique du protocole d utilisation de la méthode alternative est présenté en annexe Domaine d application Tous produits d alimentation humaine et échantillons de l environnement 1.4 Méthode de référence EN ISO / A1 (2004) : «Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Listeria monocytogenes, partie 1 : méthode de recherche Amendement 1» La méthode de référence à laquelle sera comparée la méthode alternative est la norme EN ISO / A1 (2004). Le mode opératoire de la méthode ISO est présenté en annexe Historique de la validation La technique /L MONODISK a été validée par le bureau technique "Microbiologie" de la marque AFNOR Validation en septembre 2000 et a été enregistrée sous le numéro 10/3-09/00. Une demande d extension de certification AFNOR Validation a été instruite en mai 2002 par le bureau technique au terme de laquelle, la méthode «One Day» a été validée (révision 7 des règles de validation AFNOR), en remplacement de la méthode /L MONODISK. Le projet de reconduction de la validation sous la marque AFNOR Validation de la méthode de recherche de Listeria monocytogenes par la technique «One Day» a été proposé à la commission le 24 septembre La reconduction et l extension (intégration d une cinquième matrice : prélèvements d environnement) de la méthode «One Day» datent du 07 avril 2005 et ont été réalisées selon les modalités de la norme EN ISO (2003), hormis l étude collaborative. L amendement A1 de la norme de référence EN ISO a alors été pris en compte. 4

5 En 2006, extension de la méthode «One Day» pour prendre en compte la nouvelle étude interlaboratoire réalisée selon les modalités de la norme EN ISO (2003) et intégrer la possibilité de confirmation par la technique «Confirmation». En 2008, demande de reconduction sans modification de la méthode «One Day» : le bureau technique émet l avis favorable lors de la réunion du 30 juin Le 1 er avril 2010, extension de la méthode «One Day» pour la recherche de Listeria monocytogenes et de Listeria spp dans les produits d alimentation humaine et les échantillons d environnement. Cette extension intègre également la possibilité d effectuer un isolement de 0,1 ml ou un étalement de 0,1 ml, au choix de l opérateur, ainsi que deux nouveaux modes de confirmation (par piqûre sur gélose Palcam et par utilisation du test immunochromatographique «Listeria species Conf irmation Strip»). Le 06 octobre 2011 : extensions de la méthode «One Day» concernant : - la possibilité de conserver le bouillon Fraser ½ après incubation pendant 72 heures maximum à 5 C +/- 3 C, avant de réaliser les ensemencements sur gélose - l intégration au protocole des principes de confirmation des Listeria monocytogenes : «RAPIDEC Lmono» (réalisation d essais) galerie API Listeria (données antérieures de validation dans le cadre de la marque NF VALIDATION) AccuProbe Listeria monocytogenes (données antérieures de validation dans le cadre de la marque NF VALIDATION) VIDAS LMO2 (données antérieures de validation dans le cadre de la marque NF VALIDATION) Le 06 juillet 2012, la validation de la méthode «One Day» a été reconduite par le bureau technique AFNOR (reconduction sans modification). Bureau Technique du 28 mars 2013 : extension à un nouveau mode de confirmation «FAST Rhamnose», concernant les deux méthodes «One Day» et «COUNT». En synthèse : Date de validation initiale : 27/09/ ère extension le : 17/05/2002 Date de reconduction : 07/04/ ème extension le : 15/09/2006 Date de reconduction : 30/06/ ème extension le : 01/04/ ème extension le : 06/10/2011 Date de reconduction : 06/07/ ème extension le : 28/03/2013 Fin de validité : 27/09/2016 5

6 2. Étude préliminaire 2.1 Exactitude relative, spécificité relative et sensibilité relative Protocole pour la recherche de Listeria monocytogenes Nombre et nature des échantillons Des essais ont été effectués en 2000 sur 164 échantillons de produits dont 53 naturellement contaminés et 111 non contaminés, appartenant aux grandes catégories d aliments suivantes : produits carnés, produits de la mer, produits végétaux, produits laitiers. Des essais complémentaires ont été effectués en 2004 et 2005 sur : 92 échantillons appartenant aux catégories produits carnés, produits de la mer, produits végétaux, produits laitiers, dont 23 échantillons naturellement contaminés, 52 artificiellement contaminés et 17 non contaminés, 61 échantillons d environnement dont 4 naturellement contaminés, 26 artificiellement contaminés et 31 non contaminés. Au total, les essais ont porté sur 317 échantillons de produits dont 80 naturellement contaminés, 78 artificiellement contaminés et 159 non contaminés, appartenant aux catégories suivantes : - produits carnés, - produits de la mer, - produits végétaux, - produits laitiers, - échantillons d environnement. Lecture à 24h / 48h : Catégories Types Positif* Négatif Total Brut 13 / / / 25 Viandes et Congelé 11 / 12 9 / 8 20 / 20 charcuteries Traité à chaud 12 / / / 23 Total 36 / / / 68 Fruits et légumes Brut 30 / / / 65 Total 30 / / / 65 Brut 15 / 15 8 / 8 23 / 23 Poissons et crustacés Fumé 15 / / / 38 Total 30 / / / 61 Brut 13 / 13 7 / 7 20 / 20 Produits laitiers Congelé 15 / 15 7 / 7 22 / 22 Fermenté 4 / 4 16 / / 20 Total 32 / / / 62 Chiffonnettes 11 / / / 21 Environnement Ecouvillons 8 / 8 12 / /20 Eau 11 / 11 9 / 9 20 /20 Total 30 / / / 61 Total 158 / / / 317 * il s agit des résultats s par l une ou l autre des méthodes 6

7 Pour chaque catégorie, les échantillons ont été analysés en simple par la méthode alternative et par la méthode de référence. Contamination artificielle des échantillons Le protocole de contamination artificielle utilisé correspond à l option 3 décrite dans l annexe C du référentiel EN ISO Le pourcentage d échantillons naturellement contaminés est de 50,6%. Résultats des essais Les couples de résultats des méthodes de référence et alternative pour l ensemble des produits sont présentés dans les tableaux suivants : Réponses Méthode alternative positive (A+) Méthode alternative négative Tableau de résultats "lecture à 24 heures" Méthode de référence positive (R+) Méthode de référence négative (R-) Accord A+ / R+ Déviation positive A+ / R- PA = 156 (1) PD = 1 (1) Déviation négative A- / R+ Accord négatif A- / R- ND = 1 (2) NA = 159 (3) (A-) (1) il s agit de s confirmés (2), (3) dont aucun échantillon présumé par la méthode alternative, négatif après confirmation Légende : A+ = s confirmés A- = négatifs immédiats et négatifs après confirmation quand présomptifs s Lecture à 24h : Calcul de l exactitude relative (AC), de la sensibilité relative (SE) et de la spécificité relative (SP) L ensemble des résultats permet de calculer l exactitude relative (AC), la sensibilité relative (SE) et la spécificité relative (SP) pour chacune des catégories, selon les formules de la norme EN ISO Lecture des géloses : Catégorie PA NA ND PD Somme N Exactitude relative AC (%) [100x(PA+NA])/N N+ PA + ND Sensibilité relative SE (%) [100xPA]/N+ Spécificité relative N- SP (%) NA + PD [100xNA]/N- Carnée ,52% % 33 96,96% Mer ,36% 30 96,66% % Végétaux % % % Laitiers % % % Environne ment % % % TOTAL ,36% ,36% ,37% 7

8 Pour la méthode alternative, les valeurs en pourcentage calculées pour les trois critères suivants, selon la norme EN ISO sont : 24h d incubation exactitude relative : AC 99,36% spécificité relative : SP 99,37% sensibilité relative : SE 99,36% Le pourcentage de sensibilité (à 24 heures) a également été calculé en tenant compte de l ensemble des s confirmés (ceci inclut le supplémentaire de la méthode alternative), comme suit : 24h d incubation Méthode alternative : Méthode de référence : (PA + PD) / (PA + PD + ND) (PA + ND) / (PA + PD + ND) = 99,4 % = 99,4 % Le nombre d essais discordants étant égal à 2, l annexe F du référentiel EN ISO ne peut s appliquer. L analyse des résultats montre que les deux méthodes sont très proches l une de l autre puisqu elles ne se prennent respectivement à défaut qu une seule fois chacune. Réponses Méthode alternative positive (A+) Méthode alternative négative Tableau de résultats "lecture à 48 heures" Méthode de référence positive (R+) Méthode de référence négative (R-) Accord A+ / R+ Déviation positive A+ / R- PA = 157 (1) PD = 2 (1) Déviation négative A- / R+ Accord négatif A- / R- ND = 0 (2) NA = 158 (3) (A-) (1) il s agit de s confirmés (2), (3) dont aucun échantillon présumé par la méthode alternative, négatif après confirmation Légende : A+ = s confirmés A- = négatifs immédiats et négatifs après confirmation quand présomptifs s Lecture à 48h : Calcul de l exactitude relative (AC), de la sensibilité relative (SE) et de la spécificité relative (SP) L ensemble des résultats permet de calculer l exactitude relative (AC), la sensibilité relative (SE) et la spécificité relative (SP) pour chacune des catégories, selon les formules de la norme EN ISO

9 Lecture des géloses : Catégorie PA NA ND PD Somme N Exactitude relative AC (%) [100x(PA+NA])/N N+ PA + ND Sensibilité relative SE (%) [100xPA]/N+ Spécificité relative N- SP (%) NA + PD [100xNA]/N- Carnée ,06% % 33 93,94% Mer % % % Végétaux % % % Laitiers % % % Environne ment % % % TOTAL ,36% % ,75% Pour la méthode alternative, les valeurs en pourcentage calculées pour les trois critères suivants, selon la norme EN ISO sont : 48h d incubation exactitude relative : AC 99,36% spécificité relative : SP 98,75% sensibilité relative : SE 100% Le pourcentage de sensibilité (à 48 heures) a également été calculé en tenant compte de l ensemble des s confirmés (ceci inclut les s supplémentaires de la méthode alternative), comme suit : 48h d incubation Méthode alternative : Méthode de référence : (PA + PD) / (PA + PD + ND) (PA + ND) / (PA + PD + ND) = 100 % = 98,74 % Les performances de la méthode «One Day» apparaissent équivalentes à celles de la méthode de référence. Les résultats obtenus par la méthode «One Day» avec lecture à 24 heures et lecture à 48 heures sont équivalents Protocole pour la recherche de Listeria spp Nombre et nature des échantillons Quatre catégories d aliments ont été testées ainsi que la catégorie des prélèvements d'environnement agro-alimentaires, avec pour chacune d entre elles, 3 types d'échantillons différents répartis de la façon suivante. 9

10 Catégories Types Positif* Négatif Total Viandes et charcuteries Fruits et légumes Poissons et crustacés Produits laitiers Environnement Brut Congelé Traité à chaud Total Brut Congelé Produits transformés Total Brut Congelé Fumé Total Brut Congelé Fermenté Total Chiffonnettes Ecouvillons Eau Total Total * il s agit des résultats s par l une ou l autre des méthodes Pour chaque catégorie, les échantillons ont été analysés en simple par la méthode alternative et par la méthode de référence. Contamination artificielle des échantillons La recherche de la contamination naturelle des échantillons testés a été privilégiée. Toutefois, il a été nécessaire de recourir à la contamination artificielle, qui s est opérée par utilisation de souches isolées et stressées. Le mode opératoire utilisé est conforme à celui demandé dans le document «Exigences relatives aux études (préliminaire et interlaboratoire) menées par un laboratoire expert». 74 résultats s ont été obtenus suite à une contamination artificielle sur un total de 197 résultats s (123 échantillons naturellement contaminés). Le pourcentage de contamination artificielle est de 37,6%. Il est également à noter que le pourcentage d échantillons s par Listeria monocytogenes seule est de 30% (seuil fixé entre 17% et 33% par le bureau technique). 10

11 Résultats des essais Les lectures ont été effectuées à 24h. Tableau de résultats des méthodes de référence et alternative Méthode alternative positive (A+) Méthode alternative négative (A-) Méthode de référence positive (R+) Accord (A+/R+) PA = 191 Déviation négative (A- /R+) ND = 5* Méthode de référence négative (R-) Déviation positive (R- /A+) PD = 1 Accord négatif (A-/R-) NA = 182** Total Total Légende : A+ = s confirmés A- = négatifs immédiats et négatifs après confirmation quand présomptifs s * dont 0 échantillon présumé par la méthode alternative, négatif après confirmation ** dont 3 échantillons douteux non confirmés, mais en concordance avec la méthode de référence (également présumé et confirmé négatif). Calcul de l exactitude relative (AC), de la sensibilité relative (SE) et de la spécificité relative (SP) L ensemble des résultats permet de calculer l exactitude relative (AC), la sensibilité relative (SE) et la spécificité relative (SP) pour chacune des catégories, selon les formules de la norme EN ISO Lecture des géloses : Catégorie PA NA ND PD Somme N Exactitude relative AC (%) [100x(PA+NA)]/N Sensibilité relative N+ SE (%) PA + ND [100xPA]/N+ Spécificité relative N- SP (%) NA + PD [100xNA]/N- Viandes/ charcuteries , , ,00 Fruits/ Légumes , , ,00 Poissons/ Crustacés , , ,44 Produits laitiers , , ,00 Environneme nt , , ,00 TOTAL , , ,45 Pour la méthode alternative, les valeurs en pourcentage calculées pour les trois critères suivants, selon la norme EN ISO sont : 11

12 24h d incubation exactitude relative : AC 98,42 % spécificité relative : SP 99,45 % sensibilité relative : SE 97,45 % Le bureau technique dans le cadre la marque AFNOR Validation demande que la sensibilité des deux méthodes soit recalculée en tenant compte de l ensemble des s confirmés (ceci inclut les s supplémentaires de la méthode alternative) : 24h d incubation Méthode alternative : Méthode de référence : (PA + PD) / (PA + PD + ND) (PA + ND) / (PA + PD + ND) = 97,46 % = 99,49 % Analyse des discordants Selon l annexe F de la norme EN ISO 16140, le nombre de discordants pour lequel un test statistique doit être réalisé afin de comparer les deux méthodes est de 6. Or, après 24h d incubation, le nombre de discordants Y = ND + PD, soit 6. Il s agit de déterminer M en fonction du nombre total de discordants et en fonction de l annexe F de la norme EN ISO Cette valeur M sera comparée à la valeur m, plus petite valeur de PD et de ND. Si 6 Y 22 : m = PD = 1 (parce que PD < ND) La valeur de M est, quant à elle, de 0 (tableau F.1 de la norme). Les deux valeurs sont considérées comme équivalentes si m > M. Nombre de résultats discordants M m Conclusion EQUIVALENCE Les échantillons pour lesquels les résultats sont discordants sont les suivants : pour la déviation négative : 71 (steak haché cru), 100 (tartare de saumon), 367 (saucisse crue), 419 (camembert), 473 (terrine de campagne) pour la déviation positive : 409 (filets de saumon surgelés) Cinq échantillons sont négatifs après 24h d incubation, mais tous s après 48h d incubation. Pour la méthode de référence, la positivité s est manifestée soit sur géloses incubées 48h après Fraser ½, soit sur géloses ensemencées après Fraser. Les souches de Listeria concernées sont Listeria welshimeri et Listeria grayi. Les contaminations sont naturelles et doivent certainement être de très faible niveau. Un échantillon est un supplémentaire. Le résultat a été obtenu dès 24h d incubation par la méthode alternative, alors que la méthode de référence rend un résultat négatif. La souche concernée est Listeria monocytogenes. La contamination est naturelle. 12

13 Confirmation des échantillons s ou douteux Résultats chiffrés des confirmations par «Listeria species Confirmation Strip» et par spots Palcam : Méthode alternative Géloses incubées 24h Total s confirmés 192 Bandelettes positives 191* Spots Palcam s 191* Méthode alternative Géloses incubées 24h Total négatifs 187 Ech. présentant des résultats suspects non confirmés : présence de colonies typiques douteuses, non confirmées Bandelettes positives (à partir des échantillons présentant des résultats suspects non confirmés) Spots Palcam s (à partir des échantillons présentant des résultats suspects non confirmés) * Cas particulier : il s agit de l échantillon n 399 (Ecouvillon/ Listeria monocytogenes) pour lequel la colonie à 24h est trop petite pour effectuer à la fois les tests de confirmation Palcam et immunochromatographique. Ces tests ont été réalisés à 48h et sont ressortis s. Seule la galerie biochimique a pu être faite à 24h. Tous les résultats obtenus sont conformes à ceux attendus. Ensemencement par isolement Cette analyse de l étude comparative démontre que le mode d ensemencement par isolement donne des résultats équivalents à ceux obtenus par la méthode de référence. Le mode d ensemencement par étalement, quant à lui, a déjà été validé lors des études précédentes (notamment en 2005) Conservation au froid et tests de confirmation Conservation des géloses 48h à 2-8 C et test de confirmation «Listeria species Confirmation Strip» La norme EN ISO 7218 précise la possibilité de conserver les géloses au réfrigérateur pendant 48 heures. 13

14 La gélose est formulée selon les indications de la norme EN ISO , et est même explicitement citée. La durée de conservation 48h au froid doit donc s appliquer et aucun essai complémentaire n aurait dû être nécessaire. Malgré tout, ce critère a été vérifié lors de l étude d exactitude menée pour l extension accordée en avril L ensemble des résultats obtenus est conforme aux attentes, également en termes de confirmation par «Listeria species Confirmation Strip». Conservation des bouillons Fraser ½ à 5 C ± 3 C pendant 72 heures Dans le cadre de l étude d extension de 2011, des essais ont été réalisés par la méthode alternative afin de comparer les résultats des ensemencements réalisés dès la fin de l incubation du Fraser ½ à ceux obtenus après passage du Fraser ½ au froid 5 C ± 3 C pendant 72h. Les géloses ont été lues après 24 heures d incubation et après 48 heures d incubation. Sur 117 échantillons s (dont 38 contaminés avec Listeria monocytogenes et 79 contaminés avec Listeria spp), incluant 57 contaminés artificiellement et 60 naturellement contaminés, et répartis sur 5 catégories de produits alimentaires (produits carnés, produits de la mer, produits végétaux, produits laitiers et échantillons d environnement), les résultats étaient les suivants : Pour 115 échantillons, les ensemencements réalisés à partir du Fraser ½ incubé 72 heures au froid ont donné des résultats concordants, après lecture à 24 heures et à 48 heures, à ceux obtenus à partir des ensemencements réalisés directement après incubation. Pour 2 échantillons, les ensemencements réalisés à partir du bouillon Fraser ½ conservé au froid pendant 72 heures se sont révélés s à 24 heures, alors que ceux réalisés directement après incubation étaient s après lecture à 48 heures. Cela s explique par une multiplication bactérienne durant les 72 heures de stockage du bouillon. En conclusion, la conservation du bouillon Fraser ½ pendant 72h à 5 ± 3 C ne modifie pas le rendu des résultats. Tests de confirmation Dans le cadre de l étude d extension de 2011, toutes les confirmations des Listeria monocytogenes (n=38) ont été réalisées avec Confirmation et avec RAPIDEC Lmono. 14

15 Géloses incubées / Géloses incubées / ensemencement à T0 ensemencement à T72H Total L. spp s Bandelettes positives Total L. mono s Aloa Conf. Positifs Rapidec L. mono s Toutes les confirmations effectuées à partir de RAPIDEC Lmono sont concordantes à celles effectuées à partir d Confirmation. Suite à l acquisition de la société «AES Chemunex» par la société «biomérieux» et compte tenu du fait que les formulations des géloses et OAA sont conformes à la définition de la norme EN ISO , le Bureau technique, lors de la séance du 6 octobre 2011, a accepté que les 3 tests de confirmation de la méthode OAA suivants soient appliqués à la méthode sans essais complémentaires : - galerie API Listeria, - par le test AccuProbe Listeria monocytogenes à partir de colonies isolées ou non sur gélose - par le test VIDAS LMO2 à partir de colonies isolées ou non sur gélose Ces modes de confirmation ont été validés dans le cadre de l «étude de reconduction de validation de la méthode OAA protocole court pour la recherche de L. monocytogenes & Résultats d extension à un nouveau protocole de confirmation» (Référence : OAA recherche reconduction ext v01, présenté au bureau technique de Mars 2009). Le protocole court (OAA) est validé sous le numéro d attestation BIO 12/14 04/ Niveau de détection relatif Des essais ont été effectués en 2004 et 2005, sur des combinaisons produits alimentaires/ souches de Listeria monocytogenes, pour les matrices suivantes : Rillettes, Saumon, Salade, Lait cru, Chiffonnette. Quatre niveaux cibles de contamination ont été testés pour chaque couple matrice/ souche (0,25 0,5 0,75 et 1 UFC/25 g). Six réplications ont été réalisées pour chaque niveau, par les deux méthodes. Le laboratoire expert a complété ces données avec des souches de Listeria autres que monocytogenes, pour deux couples «matrice-souche» : Rillettes / Listeria welshimeri (origine : viande de bœuf) Eau de process / Listeria innocua (origine : chiffonnette siphon sol) Quatre niveaux de contamination croissants ont été testés pour chaque couple «matrice souche» (les niveaux cibles sont : 0,25 0,50 0,75 et 1 UFC/ 25 g). Six réplications ont été réalisées pour chaque niveau. 15

16 Les niveaux de détection obtenus pour chaque combinaison "Matrice-Souche" sont les suivants, selon le test Spearman-Karber : Couples (souche, matrice) Flore totale (UFC/g ou UFC/ml) Niveau de détection relatif LOD 50 avec intervalle de confiance (UFC / 25 g ou 25 ml) Méthode de référence Méthode alternative L. monocytogenes (1/2a)- Rillettes <100 0,5 [0,4-0,7] 0,5[0,4-0,7] L. welshimeri - Rillettes < 200 0,5 [0,3-0,7] 0,5 [0,3-0,7] L. monocytogenes (4b) - Saumon ,5 [0,4-0,7] 0,5 [0,4-0,7] L. monocytogenes (1/2b) - Salade ,4 [0,3-0,5] 0,4 [0,3-0,5] L. monocytogenes (1/2a) Lait cru ,5 [0,4-0,8] 0,5 [0,4-0,8] L. monocytogenes (1/2a) ,5 [0,4-0,7] 0,5 [0,4-0,7] Chiffonnettes L. innocua - Eau de process < 20 0,4 [0,3-0,6] 0,4 [0,3-0,6] LOD 50 : estimation du niveau de contamination qui permet d obtenir une détection positive par la méthode alternative dans 50% des cas Remarque : toutes les souches utilisées pour les contaminations ont été préalablement isolées d échantillons des mêmes catégories que les échantillons artificiellement contaminés. Le niveau de détection relatif de la méthode alternative pour la recherche de Listeria monocytogenes est compris entre 0,3 et 0,8 UFC/ 25 g ou ml. Il est identique à celui de la méthode de référence. Le niveau de détection relatif de la méthode alternative pour la recherche de Listeria spp est compris entre 0,3 et 0,7 UFC/ 25 g ou ml. Il est identique à celui de la méthode de référence. 2.3 Inclusivité / Exclusivité Plusieurs études d inclusivité / exclusivité ont été menées depuis la validation initiale de la méthode en 2000, lors des différentes phases de reconduction et/ ou d extension Étude (2000) menée lors de la validation initiale de la méthode «/ L. Monodisk» pour la recherche de Listeria monocytogenes 50 souches de Listeria monocytogenes ont été testées et donné une réponse positive. 51 souches non Listeria monocytogenes ont été testées. Toutes ont répondu négativement sauf quelques souches de Listeria ivanovii qui ont présenté un fin halo à 24 H. La mise en œuvre des tests de confirmation a permis de différencier les deux espèces. Les résultats figurent en annexe 3. 16

17 Étude (2005) menée lors de la validation de reconduction et d extension du protocole «One Day» pour la recherche de Listeria monocytogenes Protocole «inclusivité» : 50 souches de Listeria monocytogenes de collection ou issues de produits alimentaires ont été testées. Chaque souche est d abord repiquée en bouillon nutritif (incubation 24 heures, 37 C). Les cultures obtenues sont diluées pour obtenir environ des suspensions de 10 à 100 UFC / ml. Un millilitre de chaque suspension diluée est ensuite ensemencé dans 225 ml de bouillon FRASER demi. Le bouillon est ensuite incubé à 30 C pendant 24 heures +/- 2 heures. Après enrichissement, un étalement de 0,1 ml est effectué sur gélose. Les boîtes sont incubées à 37 C, puis lues après 24 heures. Protocole «exclusivité» : 30 souches non cibles, autres que Listeria monocytogenes, ont été testées en double sur gélose. Ces souches sont connues soit pour interférer avec Listeria monocytogenes, soit pour être naturellement présentes dans les produits alimentaires d essai. Chaque souche est d abord repiquée en bouillon nutritif (incubation 24 heures, 37 C). Les cultures obtenues sont diluées pour obtenir des suspensions d environ 10 6 UFC / ml. Un étalement de 0,1 ml est alors effectué sur gélose. Les boîtes sont incubées à 37 C, puis lues après 24 heures. Résultats : Les 50 souches de Listeria monocytogenes ont répondu positivement. Les 30 souches non-cibles ont donné des résultats négatifs. Il convient de signaler le fait que certaines colonies de Listeria ivanovii présentent un aspect typique avec un fin halo au terme des 24 premières heures d incubation. Après 48 heures d incubation, Listeria ivanovii peut présenter le même aspect que Listeria monocytogenes. Les résultats figurent en annexe Étude (2006) menée lors de l extension de la méthode «One Day» pour la recherche de Listeria monocytogenes, en intégrant le protocole de confirmation «Confirmation» (ISHA) Souches cibles : 152 souches cibles ont été testées. Les résultats obtenus sont parfaitement conformes à ceux attendus. Toutes les souches de Listeria monocytogenes ont formé des colonies caractéristiques sur après 24 heures d incubation (y compris la souche non hémolytique testée). Aucun résultat discordant entre / Confirmation n a été observé. Souches non cibles : 100 souches non cibles ont été testées, dont 27 Listeria ivanovii. Les résultats obtenus sont parfaitement conformes à ceux attendus. Toutes les souches de Listeria ivanovii testées ont présenté des colonies caractéristiques sur après 48 heures d incubation. Cependant, les profils obtenus sur Confirmation ont montré qu il ne s agit pas de L. monocytogenes. Les résultats des tests d identification de ces souches par la méthode de référence confirment qu il s agit de Listeria ivanovii. Les résultats figurent en annexe 5. 17

18 Étude (2010) menée lors de l extension du protocole «One Day» pour la recherche de Listeria monocytogenes et de Listeria spp Protocole «inclusivité» : 63 souches pures de Listeria spp (20 Listeria monocytogenes et 43 Listeria autres que monocytogenes) de collection ou issues de produits alimentaires ont été testées. Chaque souche est d abord repiquée en bouillon nutritif (incubation 24 heures à 37 C). Le bouillon est ensuite calibré à 1 Mac Farland et les dilutions sont effectuées pour obtenir des suspensions de 10 à 100 cellules / ml. Un millilitre de chaque suspension est ensuite ensemencé dans 225 ml de bouillon FRASER ½. Le bouillon est ensuite incubé à 30 C pendant 24 heures. Après enrichissement, un ensemencement de 0,1 ml est effectué sur gélose. Les boîtes sont incubées à 37 C puis lues à 24 heures. Protocole «exclusivité» : 32 souches non cibles, autres que Listeria spp, ont été testées. Ces souches sont connues soit pour interférer avec Listeria spp, soit pour être naturellement présentes dans les produits alimentaires d essai. Chaque souche est d abord repiquée en bouillon nutritif (incubation 24 heures à 37 C). Les cultures obtenues sont diluées pour obtenir des suspensions supérieures à 10 5 cellules / ml. Un millilitre de chaque suspension est ensuite ensemencé dans 225 ml de bouillon nutritif non sélectif. Après incubation, un ensemencement de 0,1 ml est alors effectué sur gélose. Les boîtes sont incubées à 37 C puis lues à 24 heures. Résultats : Les 63 souches de Listeria spp ont répondu positivement. Toutes les souches ont été confirmées par test immunochromatographique («Listeria species Confirmation Strip») et par spot Palcam. Les 32 souches non-cibles ont toutes donné des résultats négatifs (soit une absence de colonie, soit des colonies non typiques). Aucune de ces souches n a été confirmée par test immunochromatographique («Listeria species Confirmation Strip»). Il est à noter que certaines souches, principalement de Bacillus, ont pu se développer sur gélose Palcam, mais aucun spot n avait un aspect caractéristique de Listeria. Les résultats de confirmation obtenus par «Listeria species Confirmation Strip» et spot Palcam sont conformes à ceux attendus. Les résultats figurent en annexe 6. 18

19 3. Étude d extension concernant le test «Fast Rhamnose» (confirmation) 3.1 Principe et mode opératoire Cette méthode de confirmation rapide, repose sur la mise en évidence de la fermentation du Rhamnose. L acidification est révélée par la présence d un indicateur coloré, avec un virage du bouillon du violet au jaune. Ce test permet de discriminer les Listeria monocytogenes des autres souches telles que Listeria ivanovii ou certains Bacillus cereus, qui peuvent présenter un profil caractéristique sur après 24h à 48h d incubation. Mode opératoire : Le test est réalisé à partir d une colonie caractéristique et isolée sur ou à partir d un repiquage de cette même colonie ré-isolée sur TSYE. Un tube de bouillon «Fast Rhamnose» est ensemencé, puis incubé à 37 C +/- 1 C pendant 6 à 24 heures. La formation d une coloration jaune indique un résultat. Dès l observation d un virage au jaune, le résultat est considéré comme, même avant 6 heures d incubation. Un résultat est rendu négatif, après une incubation de 24h à 37 C, si aucun virage n a été observé. Après inoculation, la couleur du milieu pour un résultat négatif, peut évoluer vers le violet pâle ou grisé. Le test non inoculé a une couleur violette. Profil Aspect de la colonie sur FAST Couleur de la colonie Halo d opacification Rhamnose Conclusion 1 bleu + + L. monocytogenes 2 bleu + - L. ivanovii Les tests peuvent également être conservés après une incubation à température ambiante ou à 37 C, pendant 72 heures au total après inoculation des tubes. 3.2 Protocole de l étude Dans le cadre de l étude d extension, le laboratoire expert a réalisé : * la confirmation de 203 souches cibles de Listeria monocytogenes, d origine variée et préalablement sérogroupées, * la confirmation de 103 souches non cibles : 53 de ces souches sont des Listeria autre que monocytogenes (dont 20 Listeria ivanovii) et 50 sont des souches d autres genres, tels que Bacillus, Staphylococcus, Lactobacillus, enterococcus, Les souches ont toutes été isolées sur géloses et TSYE. L ensemble des souches isolées sur et TSYE a fait l objet d une confirmation par la mise en œuvre du test «FAST Rhamnose». 19

20 Chaque souche donnant un résultat discordant entre l aspect sur gélose et le test de confirmation réalisé a été identifiée selon les tests normalisés. Plusieurs lectures ont systématiquement été réalisées. Les tests sont donc interprétés : - après 4h, 6h, 24h, 72h d incubation à 37 C +/-1 C, - après 24h d incubation à 37 C +/-1 C suivies de 48h de conservation à température ambiante. 3.3 Résultats des essais «Fast Rhamnose» Souches cibles Les tableaux de résultats obtenus figurent en annexe souches de Listeria monocytogenes sérogroupées et d origine variée ont été testées avec la répartition suivante : Catégories Nb souches Viandes et charcuteries 82 Fruits et légumes 26 Poissons et crustacés 18 Produits laitiers 18 Environnement 21 Plats cuisinés / mélanges divers 24 Pâtisseries 14 Total 203 Sérotype ou groupe PCR Nb Souches 1/2a, IIa 128 1/2b, IIb 15 1/2c, IIc 8 4b, IVb 46 4a, L 6 Total 203 À partir des colonies issues des géloses incubées, les résultats obtenus sont conformes à ceux attendus après 24 heures d incubation pour les 203 souches de Listeria monocytogenes testées, soit dans 100% des cas. Ces résultats sont identiques dès 6 heures d incubation à 37 C pour 199 souches, soit dans 98% des cas. Ces résultats sont identiques dès 4 heures d incubation à 37 C pour 198 souches, soit dans 97,5% des cas. Toutes les souches de Listeria monocytogenes ensemencées ont présentées des colonies caractéristiques sur gélose après incubation. 20

21 À partir des colonies issues des géloses TSYE incubées, les résultats obtenus sont conformes à ceux attendus après 24 heures d incubation pour les 203 souches de Listeria monocytogenes testées, soit dans 100% des cas. Ces résultats sont identiques dès 6 heures d incubation à 37 C pour 200 souches, soit dans 98,5% des cas. Ces résultats sont identiques dès 4 heures d incubation à 37 C pour 198 souches, soit dans 97,5% des cas. Après conservation des tests pendant 72 heures à 37 C +/1 C, l ensemble des résultats est pour les 203 souches de Listeria monocytogenes, aussi bien à partir des géloses que des géloses TSYE : 100% de résultats conformes. Après conservation des tests à température ambiante, pour une durée allant jusqu à 72 heures après ensemencement, l ensemble des résultats est pour les 203 souches de Listeria monocytogenes, aussi bien à partir des géloses que des géloses TSYE : 100% de résultats conformes. Souches non cibles Les tableaux de résultats obtenus figurent en annexe 8. Les 103 souches non cibles ont été testées à partir de colonies obtenues sur gélose TSYE et sur gélose lorsque des colonies étaient présentes, même si elles étaient non caractéristiques. Elles sont représentées par 53 souches de Listeria autres que monocytogenes, dont 20 souches de Listeria ivanovii et par 50 souches d autres genres, dont 18 souches de Bacillus. Seules les souches de Listeria ivanovii étaient bleues-vertes avec halo après 48 heures d incubation. Toutes les souches des autres genres testés n étaient pas caractéristiques. Parmi les souches testées, toutes les Listeria ivanovii présentent des tests «Fast Rhamnose» négatifs. Certaines souches de Listeria innocua et de Listeria welshimeri présentent des résultats s aux tests «Fast Rhamnose», mais aucune n ont un aspect caractéristique sur gélose. Aucune des 7 souches de Bacillus cereus testées n a présenté de test «Fast Rhamnose» à partir des géloses. Certaines souches sont rhamnose positive (Enterococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus, Brochotrix, Bacillus), mais soit ne présentent aucune croissance sur gélose, soit ne présentent aucune colonie caractéristique. Pour les souches Listeria testées, les résultats après conservation des tests à température ambiante, pour une durée allant jusqu à 72 heures après ensemencement, et les résultats des tests incubés jusqu à 72 heures à 37 C +/- 1 C, restent identiques à ceux obtenus après 24 heures d incubation. 21

22 Dans le cadre des souches d autres genres que Listeria, le laboratoire a constaté quelques cas de tests ayant initialement virés à une couleur jaune qui ont ensuite changé de nouveau de couleur (couleur «gris»). Ces cas s expliquent par une ré-alcalinisation du milieu. 3.4 Conclusion de l étude d extension L ensemble des résultats obtenus est conforme à ceux attendus : Les essais réalisés à partir de souches pures n ont pas mis en évidence de discordance. La réalisation d un test à partir d une colonie caractéristique isolée obtenue sur gélose permet de conclure à Listeria monocytogenes après 24h d incubation (100% de concordance) ou après 6h d incubation (98% des cas), ou encore dès 4h d incubation si le test «Fast Rhamnose» présente un virage au jaune. Les tests peuvent être conservés pour lecture après une incubation à température ambiante ou à 37 C, pendant 72 heures au total après inoculation des tubes. 4. Etude interlaboratoire L étude interlaboratoire selon la norme EN ISO a été réalisée en 2006 avec 14 laboratoires collaborateurs. Les analyses ont été effectuées sur des échantillons de lait de chèvre pasteurisé, contaminés artificiellement avec une souche de Listeria monocytogenes 4b (isolée d un fromage de chèvre au lait cru) aux 3 niveaux suivants : - niveau 0 (niveau cible : 0 UFC/25 ml), - niveau légèrement supérieur au niveau de détection relatif (niveau cible : 3 UFC/25 ml), - niveau 10 fois supérieur au niveau précédent (niveau cible : 30 UFC/25 ml). Les laboratoires ont testé, par les deux méthodes, 8 réplicats pour chaque niveau de contamination. Chaque laboratoire a reçu un total de 26 échantillons : - 24 échantillons répartis en 3 niveaux de contamination (L0, L1 et L2), - 1 échantillon pour le dénombrement de la flore endogène de la matrice, - 1 échantillon pour la prise de température à réception (cet échantillon contenait également un thermobouton TOMPROBE TM destiné au suivi de la température pendant le transport). Les résultats obtenus sont les suivants : Niveaux de contamination Nombre total d'échantillons Nombre d'échantillons analysés Nombre de résultats exploités* Nombre de résultats négatifs Nombre de résultats s REF ALT REF ALT

23 * Un laboratoire a déclaré avoir mal manipulé. Ses résultats n ont pas été pris en compte (contamination de deux échantillons entre eux au moment de la mise en enrichissement. Après vérification des numéros des échantillons concernés par cette erreur de manipulation, il s est avéré qu un échantillon négatif a été mélangé avec un échantillon artificiellement contaminé). a- Pourcentage de spécificité, Pourcentage de sensibilité, Exactitude relative Pourcentage de spécificité : Il est calculé pour les deux méthodes pour le niveau L0. Avec : SP = [ 1 (FP/N-)] X 100 et FP : nombre de faux s - N- = nombre total de tous les essais L0 Pourcentages de sensibilité : Ils sont calculés pour les deux méthodes pour chaque niveau de contamination (L1 et L2) et pour les deux méthodes. Avec : SE = (TP/N+)] X 100 et TP = nombre vrais s N+ = nombre total des essais L1 ou L2 respectivement. Exactitude relative : Elle est calculée pour tous les niveaux. Avec : AC = [(PA+NA) / N] X 100 et PA = nombre d accords s NA = nombre d accords négatifs N = nombre d échantillons soumis à essai. Tableau récapitulatif : Exactitude relative Sensibilité relative Spécificité relative Niveaux N AC(%) LCL(%) N+ SE(%) LCL(%) N- SP(%) LCL(%) L L L TOTAL LCL : low critical value L exactitude relative est de 100 %. La spécificité est de 100 %. La sensibilité est de 100 %. Calcul de la sensibilité des deux méthodes en tenant compte de l ensemble des s confirmés (incluant les éventuels s supplémentaires obtenus par la méthode alternative, dans cette étude : aucun) : METHODE ALTERNATIVE METHODE DE REFERENCE SENSIBILITE (PA+PD) / (PA+PD+ND) = 100 % (PA+PD) / (PA+PD+ND) = 100 % 23

24 Les résultats obtenus dans cette étude interlaboratoire ont corroboré ceux obtenus antérieurement dans la précédente étude collaborative menée selon le référentiel en application en Aucun faux n avait été obtenu avec la méthode de référence et la méthode «One Day». Les résultats de l étude collaborative sont comparables à ceux obtenus lors de l étude préliminaire pour la reconduction de la certification AFNOR Validation de la méthode «One day» et de son extension aux prélèvements d environnement menée en b- Degré d accord, concordance et odds ratio : Degré d accord : % de chance de trouver le même résultat pour deux échantillons identiques analysés par le même laboratoire dans des conditions de répétabilité. C est la moyenne des probabilités que deux réplicats donnent le même résultat pour chaque laboratoire. Concordance : % de chance de trouver le résultat pour deux échantillons identiques analysés dans deux laboratoires différents (conditions de reproductibilité). C est le % de toutes les paires de réplicats donnant le même résultat. Odds ratio (COR) : il est défini par la formule suivante : COR= degré d accord x (100 concordance) / concordance x (100 degré d accord). Le tableau suivant indique les valeurs pour la méthode alternative et pour la méthode de référence : Niveau de contamination Degré d accord Concordance COR L L L La variabilité de la méthode alternative (degré d accord, concordance, odds ratio) est identique à celle de la méthode de référence 5. Praticabilité La praticabilité est étudiée en fonction des 13 critères définis par le bureau technique : 1 - Mode de conditionnement des éléments de la méthode : Les boîtes de gélose sont conditionnées par paquet de 10 en sachet plastique et expédiées par carton de 10 unités (boîtes 140 mm), 20 unités (boîtes 90 mm) ou de 120 unités (boîtes 90 mm). Le kit pour 1 litre «base + suppléments» est constitué de 5 flacons de 200 ml + suppléments (expédié par carton). 2 - Volume des réactifs : Chaque boîte de gélose précoulée contient 16 ml de milieu sélectif (diamètre 90 mm) ou 60 ml de milieu sélectif (diamètre 140 mm). Chaque flacon de gélose a un volume de 200 ml. 24

25 3 - Conditions de stockage et péremption des produits non ouverts : La température de stockage des géloses est celle mentionnée sur la notice technique du fabricant : 2 à 8 C. La date limite d utilisation est indiquée sur le fond des boîtes de gélose (impression jet d encre). Elle correspond à un délai de 10 semaines après fabrication. Pour les flacons, la date limite d utilisation est également mentionnée sur chaque flacon. Elle correspond à un délai de 1 an après fabrication. Les boîtes coulées par le laboratoire utilisateur à partir de flacons prêts à l emploi peuvent être conservées pendant une semaine entre 2 et 8 C. 4 - Modalités d utilisation après première utilisation : Sans objet pour la gélose en boîte précoulée. Les modalités d utilisation après première utilisation sont spécifiées dans la fiche technique du fabricant. En l occurrence : Les boîtes coulées par le laboratoire utilisateur à partir de flacons prêt à l emploi peuvent être conservées pendant une semaine entre 2 et 8 C. Par ailleurs, les flacons d Base non complémentés peuvent subir deux cycles de régénération et de maintien en surfusion sans que la qualité analytique des résultats obtenus par la méthode alternative ne soit réduite. 5 - Équipements ou locaux spécifiques nécessaires : La nature des équipements et les locaux nécessaires à la réalisation des analyses selon le mode d emploi du fabricant de la méthode alternative sont du même niveau que ceux prescrits dans la méthode de référence. 6 - Réactifs prêts à l emploi ou à reconstituer : Les boîtes de gélose sont disponibles en prêt à l emploi. Les kits sont prévus pour la fabrication de 5 fois 200 ml, soit 1 litre de milieu prêt à l emploi. Le milieu est également disponible sous forme déshydratée plus suppléments. 7 - Durée de formation de l opérateur non initié à la méthode : ½ journée 8 - Temps réel de manipulations et flexibilité de la technique par rapport au nombre d échantillons à analyser : La méthode alternative présente l avantage de ne nécessiter que l ensemencement par étalement ou isolement d une seule boîte par rapport aux 4 boîtes (2 et 2 d un autre milieu) prévues dans la méthode de référence. Par ailleurs, cette méthode s affranchit du repiquage sur bouillon FRASER (absence d enrichissement secondaire). Synthétiquement, pour le cas d échantillons négatifs, pour lesquels aucune confirmation n est nécessaire, les temps estimés sont les suivants : 25

26 Étapes Temps moyen pour 1 échantillon (min) EN ISO One Day Préparation, pesée, dilution, broyage 5 5 Transfert du Fraser ½ en Fraser 1 - Isolement sur géloses sélectives du Fraser ½ et du Fraser 2 - Isolement de 100 µl sur gélose - 1 Lecture des géloses 2 1 Temps total moyen 10 7 Dans le cadre des confirmations des colonies caractéristiques de Listeria monocytogenes, la méthode alternative permet de ne repiquer qu une seule colonie au lieu des cinq mentionnées dans la méthode de référence. Différents modes de confirmation peuvent être utilisés à la place des tests normatifs, permettant de gagner plusieurs jours par rapport à la méthode de référence. Dans le cadre des confirmations des colonies caractéristiques de Listeria spp, l opérateur peut effectuer le test «Listeria species Confirmation Strip» par bandelette permettant un gain de temps très important puisque la lecture s effectue en 10 minutes, après 5h à 24h d incubation préalable du bouillon cœur-cerveau. Il convient également de noter que la souplesse d utilisation autorise l induction de l analyse le vendredi, avec étalement / isolement le samedi, pour une lecture finale le lundi, sans obligation pour le manipulateur, d intervenir le dimanche. En effet, la notice prévoit un temps d incubation de 24h à 48h. Cet avantage majeur peut, bien entendu, se transposer sur la gestion des calendriers composés de jours fériés. 26

27 9 - Délai d obtention des résultats : Étapes Délai obtenu Méthode de référence EN ISO Délai obtenu Méthode alternative «One Day»* Réalisation du bouillon Fraser ½ J0 J0 Ensemencement du bouillon Fraser J1 - Isolement sur géloses sélectives Étalement / Isolement sur J1 et J3 - - J1 Obtention des résultats négatifs (absence J5 J2 de colonies caractéristiques) Obtention des résultats s (colonies caractéristiques) ou négatifs après confirmation Confirmation du genre : - Tests normatifs - Listeria species Confirmation Strip Spot Palcam Confirmation de l espèce Listeria monocytogenes : - Tests normatifs - Confirmation - protocole «RAPIDEC Lmono», - protocole VIDAS LMO2, - protocole Accuprobe L. monocytogenes, - galerie API Listeria, - test FAST Rhamnose * Lecture après 24h d incubation J6 à J7 - - J8 à J J4 - J3 à J4 J2 J3 J4 à J9 J3 J2 à J3 J2 J2 J3 à J4 J2 à J Type de qualification de l opérateur Il est identique au niveau requis pour la méthode de référence Étape commune avec la méthode de référence : Indépendamment des étapes éventuelles de confirmation, la méthode alternative partage une seule étape en commun avec la méthode de référence. Il s agit de l étape d enrichissement primaire. Il existe, par ailleurs, une similitude dans l étalement / isolement de 0,1 ml de cet enrichissement primaire sur la gélose et le transfert de 0,1 ml de cet enrichissement primaire dans 10 ml de FRASER d enrichissement secondaire Traçabilité éventuelle des résultats d analyses : La traçabilité des résultats d analyses repose sur le relevé des numéros de lots de gélose ainsi que sur le suivi des fiches de contrôle qualité fournies par la société AES Chemunex et les épreuves de stérilité et de fertilité que le laboratoire peut gérer en interne dans le cadre de ses exigences qualité Maintenance par le laboratoire : Aucune. 27

28 6. Conclusion générale L étude de validation a été menée selon le référentiel EN ISO * Les résultats de l étude comparative permettent de conclure que la méthode «One Day» : - est exacte, sensible et spécifique, Recherche de Listeria monocytogenes : Exactitude relative (à 24 heures) : AC =99,36% Spécificité relative (à 24 heures) : SP =99,37% Sensibilité relative (à 24 heures) : SE =99,36% Les échantillons s par la méthode alternative étant des échantillons s confirmés, les sensibilités et spécificités ont été recalculées par rapport à l ensemble des résultats s et sont de : 99,4% de sensibilité pour la méthode alternative, 99,4% de sensibilité pour la méthode de référence. Exactitude relative (à 48 heures) : AC = 99,36% Spécificité relative (à 48 heures) : SP = 98,75% (une spécificité relative inférieure à 100% résulte d un nombre de s supplémentaires confirmés et non pas de faux s). Sensibilité relative (à 48 heures) : SE = 100% Les échantillons s par la méthode alternative étant des échantillons s confirmés, les sensibilités et spécificités ont été recalculées par rapport à l ensemble des résultats s et sont de : 100% de sensibilité pour la méthode alternative, 98,7% de sensibilité pour la méthode de référence. Recherche de Listeria monocytogenes et autre Listeria spp : Exactitude relative (à 24 heures) : AC =98,42% Spécificité relative (à 24 heures) : SP =99,45% Sensibilité relative (à 24 heures) : SE =97,45% Les échantillons s par la méthode alternative étant des échantillons s confirmés, les sensibilités et spécificités ont été recalculées par rapport à l ensemble des résultats s et sont de : 97,46% de sensibilité pour la méthode alternative, 99,49% de sensibilité pour la méthode de référence. - présente un niveau de détection identique à celui de la méthode de référence, Le niveau de détection relatif de la méthode alternative pour la recherche de Listeria monocytogenes est compris entre 0,3 et 0,8 UFC/ 25 g ou ml. Le niveau de détection relatif de la méthode alternative pour la recherche de Listeria spp est compris entre 0,3 et 0,7 UFC/ 25 g ou ml. 28

29 - est inclusive et exclusive, - est aisée à mettre en œuvre dans les laboratoires. Enfin : tous les tests effectués avec «Listeria species Confirmation Strip» (étude d exactitude, études d inclusivité et d exclusivité) se sont avérés conformes aux attentes, au même titre que les confirmations sur Palcam. toutes les confirmations effectuées à partir de RAPIDEC Lmono sont concordantes à celles effectuées à partir d Confirmation. Suite à l acquisition de la société «AES Chemunex» par la société «biomérieux» et compte tenu du fait que les formulations des géloses et OAA sont conformes à la définition de la norme EN ISO , les tests suivants pour la confirmation des Listeria monocytogenes ont également été validé : - galerie API Listeria, - par le test AccuProbe Listeria monocytogenes à partir de colonies isolées ou non sur gélose - par le test VIDAS LMO2 à partir de colonies isolées ou non sur gélose le fait de conserver les boîtes 48h à 2/8 C n a pas influé sur les résultats obtenus après 24h d incubation. la conservation du bouillon Fraser ½ pendant 72h à 5 ± 3 C ne modifie pas le rendu des résultats. * Les résultats de l étude interlaboratoire permettent de conclure que la méthode «One Day» : - est exacte, sensible et spécifique, L exactitude relative, la spécificité et la sensibilité sont de 100%. Les résultats de l étude interlaboratoire sont comparables à ceux obtenus lors de l étude préliminaire. - a une variabilité (degré d accord, concordance et odds ratio) identique à celle de la méthode de référence, aux trois niveaux de contamination testés : Degré d accord : 100% Concordance : 100% COR : 1 Fait à TOURS, le 15/05/2015 Nicolas GAILLARD Directeur adjoint hygiène 29

30 ANNEXES 30

31 ANNEXE 1 Protocole analytique Méthode «One Day»

32 RECHERCHE DE LISTERIA MONOCYTOGENES ET LISTERIA SPP DANS LES ALIMENTS METHODE «One Day» PROTOCOLE ANALYTIQUE (Attestation AFNOR N 10/3-09/00) Annexe 1 Page 1/1 X g ou X ml de prise d'essai + 9 X ml Fraser-demi 24 heures +/- 2 heures, à 30 C +/- 1 C Possibilité de conserver le bouillon 72 heures à 5 C +/-3 C, après incubation 0,1 ml étalement ou isolement sur Dans le cadre de l ensemencement par étalement, maintenir une zone non ensemencée en périphérie de la boîte. Cette zone facilite l observation des halos pour les boîtes chargées (contraste centre/périphérie de la boîte). 24 heures à 48 heures, à 37 C +/- 1 C Présomption L. spp OUI avec / sans halo colonies typiques? OUI avec halo Présomption L. monocytogenes NON Confirmation Listeria spp (au choix) : - tests classiques des méthodes normalisées, - piqûre sur gélose Palcam, - protocole «Listeria species Confirmation Strip», - autre méthode validée Afnor, dont le principe est différent. Absence Listeria spp. Confirmation (au choix) : - tests classiques des méthodes normalisées, - protocole «Confirmation», - protocole «RAPIDEC Lmono», - protocole VIDAS LMO2 - protocole Accuprobe L. monocytogenes, - galerie API Listeria - test «FAST Rhamnose», - autre méthode validée Afnor, dont le principe est différent.

33 ANNEXE 2 Mode opératoire de la méthode EN ISO /A1

34 Annexe 2 Page 1/1 MODE OPERATOIRE DE LA METHODE EN ISO /A1 X g ou X ml de prise d'essai + 9 X ml Fraser-demi 24 heures +/- 3 heures, à 30 C +/- 1 C 0,1 ml de culture dans 10 ml Fraser 48 heures +/- 3 heures, à 37 C +/- 1 C Isolement de 10 µl sur gélose et isolement sur 2 ème milieu sélectif (gélose Palcam) Isolement de 10 µl sur gélose et isolement sur 2 ème milieu sélectif (gélose Palcam) 24 heures +/- 3 heures, à 37 C +/- 1 C, si nécessaire : 24 heures +/- 3 heures supplémentaires, à 37 C +/- 1 C 24 heures +/- 3 heures, à 37 C +/- 1 C, si nécessaire : 24 heures +/- 3 heures supplémentaires, à 37 C +/- 1 C Confirmation (tests normatifs) Confirmation (tests normatifs)

35 ANNEXE 3 Inclusivité / Exclusivité : Tableaux de résultats (Étude : 2000)

36 ÉTUDE D INCLUSIVITE DE LA GELOSE Annexe 3 Page 1/ = boîtes envahies de colonies isolées

37 ÉTUDE D INCLUSIVITE DE LA GELOSE Annexe 3 Page 2/ = boîtes envahies de colonies isolées 37

38 ÉTUDE D INCLUSIVITE DE LA GELOSE Annexe 3 Page 3/ = boîtes envahies de colonies isolées 38

39 ÉTUDE D INCLUSIVITE DE LA GELOSE Annexe 3 Page 4/ = boîtes envahies de colonies isolées 39

40 ÉTUDE D INCLUSIVITE DE LA GELOSE Annexe 3 Page 5/ = boîtes envahies de colonies isolées 40

41 ÉTUDE D EXCLUSIVITE DE LA GELOSE Annexe 3 Page 6/ = boîtes envahies de colonies isolées 41

42 ÉTUDE D EXCLUSIVITE DE LA GELOSE Annexe 3 Page 7/ = boîtes envahies de colonies isolées 42

43 ÉTUDE D EXCLUSIVITE DE LA GELOSE Annexe 3 Page 8/ = boîtes envahies de colonies isolées 43

44 ÉTUDE D EXCLUSIVITE DE LA GELOSE Annexe 3 Page 9/ = boîtes envahies de colonies isolées 44

45 ÉTUDE D EXCLUSIVITE DE LA GELOSE Annexe 3 Page 10/ = boîtes envahies de colonies isolées 45

46 ANNEXE 4 Inclusivité / Exclusivité : Tableaux de résultats (Étude d extension : 2005)

47 Étude d inclusivité Annexe 4 Page 1/6 Réf. Nom Sérovar Origine Aspect des colonies sur Résultats 1 Listeria monocytogenes 1/2 a Steak haché Colonies bleu-vert avec halo 2 Listeria monocytogenes 1/2 b Viande hachée Colonies bleu-vert avec halo 3 Listeria monocytogenes 4b Steak Colonies bleu-vert avec halo 4 Listeria monocytogenes 1/2a Viande hachée Colonies bleu-vert avec halo 5 Listeria monocytogenes 4b Viande hachée Colonies bleu-vert avec halo 6 Listeria monocytogenes 1/2 a Veau Colonies bleu-vert avec halo 7 Listeria monocytogenes 2b Sauté de veau Colonies bleu-vert avec halo 8 Listeria monocytogenes 4b Faux-filet Colonies bleu-vert avec halo 9 Listeria monocytogenes 4b Viande Colonies bleu-vert avec halo 10 Listeria monocytogenes 1/2a Veau Colonies bleu-vert avec halo 11 Listeria monocytogenes 1/2a Veau Colonies bleu-vert avec halo 12 Listeria monocytogenes 1/2a Chiffonnette Colonies bleu-vert avec halo 13 Listeria monocytogenes 1/2a Saucisson sec Colonies bleu-vert avec halo 14 Listeria monocytogenes 4b Portion unitaire Colonies bleu-vert avec halo

48 Réf. Nom Sérovar Origine Aspect des colonies sur Résultats Annexe 4 Page 2/6 15 Listeria monocytogenes 4b Viande de Colonies bleu-vert avec halo 16 Listeria monocytogenes 4b Cône Saumon Colonies bleu-vert avec halo 17 Listeria monocytogenes 1/2a Fromage Colonies bleu-vert avec halo 18 Listeria monocytogenes 1/2a Chiffonnette Colonies bleu-vert avec halo 19 Listeria monocytogenes 1/2a Saucisson sec Colonies bleu-vert avec halo 20 Listeria monocytogenes 4b Merguez Colonies bleu-vert avec halo 21 Listeria monocytogenes 4b Chipolatas Colonies bleu-vert avec halo 22 Listeria monocytogenes 4b Chiffonnette Colonies bleu-vert avec halo 23 Listeria monocytogenes 4b Ecouvillon Colonies bleu-vert avec halo 24 Listeria monocytogenes 4b Tartelette Colonies bleu-vert avec halo 25 Listeria monocytogenes 1/2a Tartelette Colonies bleu-vert avec halo 26 Listeria monocytogenes 4b Fromage Colonies bleu-vert avec halo 27 Listeria monocytogenes 1/2b Fromage Colonies bleu-vert avec halo 28 Listeria monocytogenes 1/2b Barde Colonies bleu-vert avec halo 29 Listeria monocytogenes 4b Capas Colonies bleu-vert avec halo

49 Réf. Nom Sérovar Origine Aspect des colonies sur Résultats Annexe 4 Page 3/6 30 Listeria monocytogenes 1/2b Fromage Colonies bleu-vert avec halo 31 Listeria monocytogenes 1/2b Lait de chèvre Colonies bleu-vert avec halo 32 Listeria monocytogenes 1/2b Lait de chèvre Colonies bleu-vert avec halo 33 Listeria monocytogenes 4b Epaule d'agneau Colonies bleu-vert avec halo 34 Listeria monocytogenes 1/2a Lait Colonies bleu-vert avec halo 35 Listeria monocytogenes 4b Foie de porc Colonies bleu-vert avec halo 36 Listeria monocytogenes 4b Surface Colonies bleu-vert avec halo 37 Listeria monocytogenes 4b Chair à Colonies bleu-vert avec halo 38 Listeria monocytogenes 1/2a Lait de vache Colonies bleu-vert avec halo 39 Listeria monocytogenes ND Lait CECALAIT Colonies bleu-vert avec halo 40 Listeria monocytogenes ND Chocolats Colonies bleu-vert avec halo 41 Listeria monocytogenes 4b Viande de porc Colonies bleu-vert avec halo 42 Listeria monocytogenes 1/2b Radis Colonies bleu-vert avec halo 43 Listeria monocytogenes 1/2a Cantal Colonies bleu-vert avec halo 44 Listeria monocytogenes 1/2a St Nectaire Colonies bleu-vert avec halo

50 Annexe 4 Page 4/6 Réf. Nom Sérovar Origine Aspect des colonies sur Résultats 45 Listeria monocytogenes 4b Chair à curry Colonies bleu-vert avec halo 46 Listeria monocytogenes 4b placenta Colonies bleu-vert avec halo 47 Listeria monocytogenes 4b placenta Colonies bleu-vert avec halo 48 Listeria monocytogenes 4b placenta Colonies bleu-vert avec halo 49 Listeria monocytogenes 4b Ensilage Colonies bleu-vert avec halo 50 Listeria monocytogenes 4b Fourrage Colonies bleu-vert avec halo ND : non déterminé

51 Annexe 4 Page 5/6 Étude d exclusivité Réf. Nom Origine Aspect des colonies sur Résultats 1 Staphylococcus aureus Fromage de chèvre Colonies non caractéristiques Négatif 2 Staphylococcus aureus Lait de chèvre Colonies non caractéristiques Négatif 3 Staphylococcus aureus Aiguillette de canard Colonies non caractéristiques Négatif 4 Listeria ivanovii Lait de chèvre Petites colonies caractéristiques sans halo Négatif 5 Listeria ivanovii Buvard lait de chèvre Petites colonies caractéristiques avec halo Négatif très fin 6 Listeria ivanovii Lait de chèvre Petites colonies caractéristiques avec halo Négatif très fin 7 Listeria innocua Lait de chèvre Colonies non caractéristiques Négatif 8 Listeria innocua Chiffonnette Colonies non caractéristiques Négatif 9 Listeria innocua Lait de chèvre Colonies non caractéristiques Négatif 10 Listeria seeligeri Souchothèque Colonies non caractéristiques Négatif 11 Staphylococcus enteritidis Souchothèque Colonies non caractéristiques Négatif 12 Bacillus cereus Taboulé Colonies non caractéristiques Négatif 13 Bacillus mycoïdes Radis bio Colonies non caractéristiques Négatif 14 Bacillus cereus Blé Colonies non caractéristiques Négatif 15 Bacillus cereus ATCC14579 Colonies non caractéristiques Négatif

52 Réf. Nom Origine Aspect des colonies sur Résultats Annexe 4 Page 6/6 16 Bacillus megaterium Souchotèque IAA 14/01/93 Colonies non caractéristiques Négatif 17 Bacillus subtilis Souchothèque IAA 21/9/93 Colonies non caractéristiques Négatif 18 Salmonella typhimurium Souche BV Colonies non caractéristiques Négatif 19 Escherichia coli Souchothèque IAA Colonies non caractéristiques Négatif 20 Enterobacter cloacae Souche BV Colonies non caractéristiques Négatif 21 Listeria welshimeri Veau Colonies non caractéristiques Négatif 22 Listeria welshimeri Chiffonnette Colonies non caractéristiques Négatif 23 Staphylococcus haemolyticus Souche BV Colonies non caractéristiques Négatif 24 Pantoea Souche BV Colonies non caractéristiques Négatif 25 Staphylococcus aureus Salade d'endives Colonies non caractéristiques Négatif 26 Enterococcus faecalis Souche BV Colonies non caractéristiques Négatif 27 Enterococcus faecium Souche ATCC Colonies non caractéristiques Négatif 28 Enterococcus faecium Souche AES Colonies non caractéristiques Négatif 29 Enterococcus faecalis Souche AES Colonies non caractéristiques Négatif 30 Enterococcus faecium Souche AES CIP5855 Colonies non caractéristiques Négatif

53 ANNEXE 5 Inclusivité / Exclusivité : Tableaux de résultats (Étude menée par l ISHA : 2006)

54 SOUCHES CIBLES : Listeria monocytogenes Annexe 5 Page 1/10 Profil confirmation Profil confirmation à partir milieu non sélectif à partir Concordance Couleur Virage Colonies Halo Couleur Virage / Résultat Halo Résultat Code Nom Origine strie au jaune typiques strie au jaune conf. R 62 L. monocytogenes CIP BV + + LM oui BV + + LM oui L09 L. monocytogenes Environnement clinique BV + + LM oui BV + + LM oui L10 L. monocytogenes Lait 107P BV + + LM oui BV + + LM oui LIS 3.2 L. monocytogenes Canard BV + + LM oui BV + + LM oui LIS 3.3 L. monocytogenes Produit laitier BV + + LM oui BV + + LM oui LIS 3.6 L. monocytogenes Environnement production BV + + LM oui BV + + LM oui LIS 3.7 L. monocytogenes Environnement production BV + + LM oui BV + + LM oui LIS 3.10 L. monocytogenes Poisson congelé BV + + LM oui BV + + LM oui LIS 3.11 L. monocytogenes Poisson congelé BV + + LM oui BV + + LM oui LIS 3.12 L. monocytogenes Poisson congelé BV + + LM oui BV + + LM oui LIS 3.13 L. monocytogenes Poisson congelé BV + + LM oui BV + + LM oui LIS 3.14 L. monocytogenes Poisson congelé BV + + LM oui BV + + LM oui LIS 3.15 L. monocytogenes Saucisses BV + + LM oui BV + + LM oui LIS 3.18 L. monocytogenes Plat cuisiné (produits de la mer) BV + + LM oui BV + + LM oui LIS 3.19 L. monocytogenes Produit laitier BV + + LM oui BV + + LM oui LIS 3.20 L. monocytogenes ATCC BV + + LM oui BV + + LM oui LIS 3.21 L. monocytogenes Saucisses BV + + LM oui BV + + LM oui LIS 3.22 L. monocytogenes Saucisses BV + + LM oui BV + + LM oui LIS 3.23 L. monocytogenes Poudre de lait BV + + LM oui BV + + LM oui LIS 3.26 L. monocytogenes Poudre de lait BV + + LM oui BV + + LM oui LIS 3.28 L. monocytogenes Poudre de lait BV + + LM oui BV + + LM oui LIS 3.31 L. monocytogenes Produit laitier BV + + LM oui BV + + LM oui LIS 3.32 L. monocytogenes Produit laitier BV + + LM oui BV + + LM oui LIS 3.33 L. monocytogenes Poudre de lait BV + + LM oui BV + + LM oui LIS 3.34 L. monocytogenes Produit laitier BV + + LM oui BV + + LM oui BV : bleu/vert LM : Listeria monocytogenes

55 Annexe 5 Page 2/10 Profil confirmation Profil confirmation à partir milieu non sélectif à partir Concordance Couleur Virage Colonies Couleur Virage / Halo Résultat Halo Résultat Code Nom Origine strie au jaune typiques strie au jaune conf. SOUCHES CIBLES : Listeria monocytogenes P1 TA100 L. monocytogenes Truite fumée BV + + LM oui BV + + LM oui P2TA100 L. monocytogenes Poisson pané BV + + LM oui BV + + LM oui P4TA100 L. monocytogenes Darne saumon BV + + LM oui BV + + LM oui P10TA100 L. monocytogenes Saumon fumé BV + + LM oui BV + + LM oui P11TA100 L. monocytogenes Saumon fumé BV + + LM oui BV + + LM oui P12TA100 L. monocytogenes Saumon fumé BV + + LM oui BV + + LM oui P13TA100 L. monocytogenes Saumon fumé BV + + LM oui BV + + LM oui P14TA100 L. monocytogenes Saumon fumé BV + + LM oui BV + + LM oui P15TA100 L. monocytogenes Saumon fumé BV + + LM oui BV + + LM oui P16TA100 L. monocytogenes Saumon fumé BV + + LM oui BV + + LM oui P17TA100 L. monocytogenes Saumon fumé BV + + LM oui BV + + LM oui P18TA100 L. monocytogenes Saumon fumé BV + + LM oui BV + + LM oui E16TA100 L. monocytogenes Eau de rinçage Atelier transformation d BV + + LM oui BV + + LM oui C11TA100 L. monocytogenes Chiffonnettes Atelier transformation de BV + + LM oui BV + + LM oui V1TA100 L. monocytogenes Viande hachée (bœuf) BV + + LM oui BV + + LM oui V2TA100 L. monocytogenes Viande hachée (bœuf) BV + + LM oui BV + + LM oui V3TA100 L. monocytogenes Viande hachée (bœuf) BV + + LM oui BV + + LM oui V4TA100 L. monocytogenes Steak haché (bœuf) BV + + LM oui BV + + LM oui V5TA100 L. monocytogenes Viande hachée (boeuf) BV + + LM oui BV + + LM oui V8TA100 L. monocytogenes Viande hachée (bœuf) BV + + LM oui BV + + LM oui V9TA100 L. monocytogenes Steak haché (bœuf) BV + + LM oui BV + + LM oui V10TA100 L. monocytogenes Steak haché (bœuf) BV + + LM oui BV + + LM oui V12TA100 L. monocytogenes Steak haché (bœuf) BV + + LM oui BV + + LM oui V13TA100 L. monocytogenes Viande hachée (bœuf) BV + + LM oui BV + + LM oui V14TA100 L. monocytogenes Steak haché (bœuf) BV + + LM oui BV + + LM oui BV : bleu/vert LM : Listeria monocytogenes

56 Annexe 5 Page 3/10 Profil confirmation Profil confirmation SOUCHES CIBLES : Listeria monocytogenes à partir milieu non sélectif à partir Concordance Couleur Virage Colonies Couleur Virage / Halo Résultat Halo Résultat Code Nom Origine strie au jaune typiques strie au jaune conf. V17TA100 L. monocytogenes Steak haché (bœuf) BV + + LM oui BV + + LM oui V18TA100 L. monocytogenes Steak haché (bœuf) BV + + LM oui BV + + LM oui V19TA100 L. monocytogenes Steak haché (bœuf) BV + + LM oui BV + + LM oui V20TA100 L. monocytogenes Viande hachée (bœuf) BV + + LM oui BV + + LM oui V21TA100 L. monocytogenes Steak haché (bœuf) BV + + LM oui BV + + LM oui V22TA100 L. monocytogenes Steak haché (bœuf) BV + + LM oui BV + + LM oui V23TA100 L. monocytogenes Viande hachée (bœuf) BV + + LM oui BV + + LM oui V24TA100 L. monocytogenes Steak haché (bœuf) BV + + LM oui BV + + LM oui V25TA100 L. monocytogenes Steak haché (bœuf) BV + + LM oui BV + + LM oui V26TA100 L. monocytogenes Steak haché (bœuf) BV + + LM oui BV + + LM oui V27TA100 L. monocytogenes Steak haché (bœuf) BV + + LM oui BV + + LM oui V17A48 L. monocytogenes Steak haché (bœuf) BV + + LM oui BV + + LM oui LIS 3.1 L. monocytogenes 1/2 ATCC BV + + LM oui BV + + LM oui L101 L. monocytogenes 1/2 H=0 Poulet rôti BV + + LM oui BV + + LM oui I100 L. monocytogenes 1/2a brochette courgette chèvre BV + + LM oui BV + + LM oui I103 L. monocytogenes 1/2a jambon crudité BV + + LM oui BV + + LM oui I104 L. monocytogenes 1/2a sdwich jambon emmental BV + + LM oui BV + + LM oui I107 L. monocytogenes 1/2a sdwich jambon emmental BV + + LM oui BV + + LM oui I108 L. monocytogenes 1/2a sdwich thon œuf surimi BV + + LM oui BV + + LM oui I109 L. monocytogenes 1/2a granulé de bœuf rôti BV + + LM oui BV + + LM oui I112 L. monocytogenes 1/2a salade BV + + LM oui BV + + LM oui I121 L. monocytogenes 1/2a poulet curry BV + + LM oui BV + + LM oui I122 L. monocytogenes 1/2a saumon fumé BV + + LM oui BV + + LM oui I123 L. monocytogenes 1/2a foie gras BV + + LM oui BV + + LM oui I125 L. monocytogenes 1/2a sauce ktipiti BV + + LM oui BV + + LM oui BV : bleu/vert LM : Listeria monocytogenes

57 Annexe 5 Page 4/10 Profil confirmation Profil confirmation SOUCHES CIBLES : Listeria monocytogenes à partir milieu non sélectif à partir Concordance Couleur Virage Colonies Couleur Virage / Halo Résultat Halo Résultat Code Nom Origine strie au jaune typiques strie au jaune conf. I130 L. monocytogenes 1/2a tartare de saumon BV + + LM oui BV + + LM oui I132 L. monocytogenes 1/2a contrôle surface égoût BV + + LM oui BV + + LM oui I134 L. monocytogenes 1/2a crudités BV + + LM oui BV + + LM oui I135 L. monocytogenes 1/2a salade de légumes BV + + LM oui BV + + LM oui I 97 L. monocytogenes 1/2a pintade fermière BV + + LM oui BV + + LM oui I 99 L. monocytogenes 1/2a sandwich bacon crudité BV + + LM oui BV + + LM oui L11 L. monocytogenes 1/2a CIP (152P) BV + + LM oui BV + + LM oui L12 L. monocytogenes 1/2a CIP (153P) BV + + LM oui BV + + LM oui L52 L. monocytogenes 1/2a Fromage frais BV + + LM oui BV + + LM oui L53 L. monocytogenes 1/2a Repas fromager BV + + LM oui BV + + LM oui L58 L. monocytogenes 1/2a Poisson et légumes à la provençale BV + + LM oui BV + + LM oui L60 L. monocytogenes 1/2a Jambon BV + + LM oui BV + + LM oui L62 L. monocytogenes 1/2a Viande hachée BV + + LM oui BV + + LM oui L83 L. monocytogenes 1/2a Ecouvillon égout BV + + LM oui BV + + LM oui L86 L. monocytogenes 1/2a Reblochon BV + + LM oui BV + + LM oui L94 L. monocytogenes 1/2a Escabèche de légumes BV + + LM oui BV + + LM oui L97 L. monocytogenes 1/2a Fromage de brebis BV + + LM oui BV + + LM oui L98 L. monocytogenes 1/2a Fromage bleu BV + + LM oui BV + + LM oui L99 L. monocytogenes 1/2a Concombres en dés BV + + LM oui BV + + LM oui L100 L. monocytogenes 1/2a Ecouvillon ligne BV + + LM oui BV + + LM oui L104 L. monocytogenes 1/2a Crabe BV + + LM oui BV + + LM oui L105 L. monocytogenes 1/2a Tartare de Saint-Jacques BV + + LM oui BV + + LM oui L106 L. monocytogenes 1/2a Chiffonnette sur sol BV + + LM oui BV + + LM oui L107 L. monocytogenes 1/2a Saucisse BV + + LM oui BV + + LM oui L108 L. monocytogenes 1/2a Chiffonnette sur égout BV + + LM oui BV + + LM oui BV : bleu/vert LM : Listeria monocytogenes

58 Annexe 5 Page 5/10 Profil confirmation Profil confirmation SOUCHES CIBLES : Listeria monocytogenes à partir milieu non sélectif à partir Concordance Couleur Virage Colonies Couleur Virage / Halo Résultat Halo Résultat Code Nom Origine strie au jaune typiques strie au jaune conf. L102 L. monocytogenes 1/2a Viande hachée BV + + LM oui BV + + LM oui L69 L. monocytogenes 1/2a Poulet indies BV + + LM oui BV + + LM oui L73 L. monocytogenes 1/2a Foie gras de canard BV + + LM oui BV + + LM oui L74 L. monocytogenes 1/2a Poivron vert BV + + LM oui BV + + LM oui L76 L. monocytogenes 1/2a Campagnard jambon emmental BV + + LM oui BV + + LM oui L80 L. monocytogenes 1/2a Granulé de bœuf rôti BV + + LM oui BV + + LM oui L 116 L. monocytogenes 1/2a Tortilla tzatziki saumon fumé BV + + LM oui BV + + LM oui L117 L. monocytogenes 1/2a Poitrine de porc hachée BV + + LM oui BV + + LM oui I106 L. monocytogenes 1/2b cuisse de canard BV + + LM oui BV + + LM oui I114 L. monocytogenes 1/2b pâte praliné BV + + LM oui BV + + LM oui I 96 L. monocytogenes 1/2b roulé de dinde cru BV + + LM oui BV + + LM oui L55 L. monocytogenes 1/2b Hareng aux épices BV + + LM oui BV + + LM oui L68 L. monocytogenes 1/2b Lait cru BV + + LM oui BV + + LM oui L110 L. monocytogenes 1/2b Assortiment de charcuteries fines BV + + LM oui BV + + LM oui L72 L. monocytogenes 1/2b Légumes grillés BV + + LM oui BV + + LM oui I102 L. monocytogenes 1/2c viande hachée BV + + LM oui BV + + LM oui I113 L. monocytogenes 1/2c Gouda BV + + LM oui BV + + LM oui I129 L. monocytogenes 1/2c Sdwich salade du chef BV + + LM oui BV + + LM oui L13 L. monocytogenes 1/2c CIP (154P) BV + + LM oui BV + + LM oui L54 L. monocytogenes 1/2c Foie gras de canard BV + + LM oui BV + + LM oui L59 L. monocytogenes 1/2c Foie gras de canard BV + + LM oui BV + + LM oui L64 L. monocytogenes 1/2c Tartare saumon BV + + LM oui BV + + LM oui L65 L. monocytogenes 1/2c Sauce ktipiti BV + + LM oui BV + + LM oui L66 L. monocytogenes 1/2c Foie gras BV + + LM oui BV + + LM oui L84 L. monocytogenes 1/2c Viande hachée BV + + LM oui BV + + LM oui BV : bleu/vert LM : Listeria monocytogenes

59 Annexe 5 Page 6/10 Profil confirmation Profil confirmation SOUCHES CIBLES : Listeria monocytogenes à partir milieu non sélectif à partir Concordance Couleur Virage Colonies Couleur Virage / Halo Résultat Halo Résultat Code Nom Origine strie au jaune typiques strie au jaune conf. L87 L. monocytogenes 1/2c Foie gras BV + + LM oui BV + + LM oui L109 L. monocytogenes 1/2c Foie gras de canard BV + + LM oui BV + + LM oui L111 L. monocytogenes 1/2c Crudités BV + + LM oui BV + + LM oui L115 L. monocytogenes 1/2c Comté BV + + LM oui BV + + LM oui I105 L. monocytogenes 3a Saumon fumé BV + + LM oui BV + + LM oui I131 L. monocytogenes 3a Bacon tranché BV + + LM oui BV + + LM oui L57 L. monocytogenes 3a Contrôle de surface BV + + LM oui BV + + LM oui L61 L. monocytogenes 3a Bacon grillé BV + + LM oui BV + + LM oui L63 L. monocytogenes 3a Sandwich chèvre BV + + LM oui BV + + LM oui L88 L. monocytogenes 3a Tarama œufs de truite BV + + LM oui BV + + LM oui L90 L. monocytogenes 3a Saumon sauvage BV + + LM oui BV + + LM oui L93 L. monocytogenes 3a Tarama au saumon BV + + LM oui BV + + LM oui L103 L. monocytogenes 3a Tarama BV + + LM oui BV + + LM oui L112 L. monocytogenes 3a Salade coupée BV + + LM oui BV + + LM oui L113 L. monocytogenes 3a Ecouvillon rebords conditionneuse BV + + LM oui BV + + LM oui L114 L. monocytogenes 3a Filet de pintade BV + + LM oui BV + + LM oui L118 L. monocytogenes 3a Tarama BV + + LM oui BV + + LM oui L82 L. monocytogenes 3b Arlequin de poivrons BV + + LM oui BV + + LM oui L92 L. monocytogenes 3c Saumon BV + + LM oui BV + + LM oui I128 L. monocytogenes 4b lanières de saumon BV + + LM oui BV + + LM oui L14 L. monocytogenes 4b CIP (155P) BV + + LM oui BV + + LM oui L15 L. monocytogenes 4b CIP 7838 (156P) BV + + LM oui BV + + LM oui L56 L. monocytogenes 4b Contrôle de surface sur saumon BV + + LM oui BV + + LM oui L95 L. monocytogenes 4b Cantal au lait cru BV + + LM oui BV + + LM oui L96 L. monocytogenes 4b Lait cru BV + + LM oui BV + + LM oui LIS 3.5 L. monocytogenes 4b ATCC BV + + LM oui BV + + LM oui L16 L. monocytogenes 4c CIP 7839 (157P) BV + + LM oui BV + + LM oui BV : bleu/vert LM : Listeria monocytogenes

60 Annexe 5 Page 7/10 SOUCHES NON CIBLES Profil confirmation Profil confirmation à partir milieu non sélectif à partir Concordance Identification Couleur Virage Colonies Couleur Virage / selon Halo Résultat Halo Résultat Code Nom Origine strie au jaune typiques strie au jaune conf. ISO I 38 Bacillus amyloliquefasciens Produit laitier pas de croissance pas de croissance / / / / / / R 87 Bacillus cereus CIP T translucide - - non LM non / / / / / / I 28 Bacillus cereus Industrie laitière pas de croissance pas de croissance / / / / / / I 80 Bacillus cereus Lait UHT translucide + - non LM non / / / / / / R 53 Bacillus cereus CIP 54.9 translucide + - non LM non / / / / / / R 70 Bacillus cereus SIK 281 Sué translucide + - non LM non / / / / / / BA.1.2 Bacillus cereus Nems translucide + - non LM non* translucide + - non LM / / BA.1.5 Bacillus cereus Poudre de lait translucide + - non LM non* translucide + - non LM / / R 86 Bacillus circulans CIP pas de croissance pas de croissance / / / / / / I 21 Bacillus circulans Industrie laitière pas de croissance pas de croissance / / / / / / I 22 Bacillus subtilis Crème dessert pas de croissance pas de croissance / / / / / / I 40 Bacillus subtilis Produit laitier pas de croissance non / / / / / / R 10 Bacillus subtilis CIP T pas de croissance pas de croissance / / / / / / I 35 Brevibacterium casei Produit laitier pas de croissance pas de croissance / / / / / / R 63 Candida albicans CNCM pas de croissance pas de croissance / / / / / / R 75 Candida albicans ATCC pas de croissance pas de croissance / / / / / / LevD Cryptococcus Produits végétaux pas de croissance pas de croissance / / / / / / I 25 Enterobacter aerogenes Industrie laitière pas de croissance pas de croissance / / / / / / I 37 Enterobacter sakazakii Poudre de lait pas de croissance pas de croissance / / / / / / R 3 Escherichia coli CIP pas de croissance pas de croissance / / / / / / I2 Escherichia coli Carottes rapées pas de croissance pas de croissance / / / / / / L02 L. grayi CIP T BV - + non LM non / / / / / / LIS 5.1 L. grayi Saucisses BV - + non LM non / / / / / / I124 L. innocua Sdwich légumes BV - + non LM non / / / / / / I126 L. innocua Sdwich bacon crudité BV - + non LM non / / / / / / BV : bleu/vert LM : Listeria monocytogenes * colonies non typiques pour un œil expérimenté

61 SOUCHES NON CIBLES Annexe 5 Page 8/10 Profil confirmation Profil confirmation à partir milieu non sélectif à partir Concordance Identification Couleur Virage Colonies Couleur Virage / selon Halo Résultat Halo Résultat Code Nom Origine strie au jaune typiques strie au jaune conf. ISO I133 L. innocua contrôle surface porte BV - + non LM non / / / / / / L04 L. innocua CIP BV - + non LM non / / / / / / L47 L. innocua CTSCCV BV - + non LM non / / / / / / L49 L. innocua (viande de porc) BV - + non LM non / / / / / / L50 L. innocua Sandwich poulet bacon BV - + non LM non / / / / / / L51 L. innocua Langue de bœuf BV - - non LM non / / / / / / L67 L. innocua Viande hachée BV - + non LM non / / / / / / R 30 L. innocua CIP BV - + non LM non / / / / / / L71 L. innocua Canard laqué BV - + non LM non / / / / / / L75 L. innocua Poulet crudités BV - - non LM non / / / / / / L77 L. innocua Rôti de dinde BV - + non LM non / / / / / / L89 L. innocua Saumon BV - - non LM non / / / / / / L91 L. innocua Canard laqué BV - + non LM non / / / / / / L120 L. innocua Sdwich jambon emmental BV - + non LM non / / / / / / LIS.1.3 L. innocua viande hâchée BV - + non LM non / / / / / / LIS.1.4 L. innocua Viande BV - + non LM non / / / / / / LIS.1.5 L. innocua Poudre de Lait BV - + non LM non / / / / / / LIS.1.6 L. innocua Poudre de lait BV - + non LM non / / / / / / L41 L. ivanovii lait cru BV +/- - non LM oui** BV +/- - non LM non L. ivanovii L45 L. ivanovii CTSCCV BV + - non LM oui** BV + - non LM non L. ivanovii R 31 L. ivanovii CIP BV + - non LM oui** BV + - non LM non L. ivanovii LIS.2.1 L. ivanovii Brocolis BV +/- - non LM oui** BV +/- - non LM non L. ivanovii LIS.2.2 L. ivanovii Volaille BV + - non LM oui** BV + - non LM non L. ivanovii LIS.2.5 L. ivanovii Souche clinique BV + - non LM oui** BV + - non LM non L. ivanovii LIS.2.6 L. ivanovii Fromage lait cru BV +/- - non LM oui** BV +/- - non LM non L. ivanovii BV : bleu/vert LM : Listeria monocytogenes ** après 48 heures d'incubation

62 Annexe 5 Page 9/10 Profil confirmation Profil confirmation à partir milieu non sélectif à partir Concordance Identification Couleur Virage Colonies Couleur Virage / selon Halo Résultat Halo Résultat Code Nom Origine strie au jaune typiques strie au jaune conf. ISO SOUCHES NON CIBLES LIS.2.7 L. ivanovii Fromage lait cru BV +/- - non LM oui** BV +/- - non LM non L. ivanovii LIS 2.8 L. ivanovii Lait brebis BV + - non LM oui** BV + - non LM non L. ivanovii LIS 2.9 L. ivanovii Lait brebis BV + - non LM oui** BV + - non LM non L. ivanovii LIS 2.11 L. ivanovii Fromage lait cru BV + - non LM oui** BV + - non LM non L. ivanovii LIS 2.12 L. ivanovii Poudre de lait BV + - non LM oui** BV + - non LM non L. ivanovii LIS 2.13 L. ivanovii Poudre de lait BV + - non LM oui** BV + - non LM non L. ivanovii PG L. ivanovii CTSCCV BV + - non LM oui** BV + - non LM non L. ivanovii LIS.2.4 L. ivanovii (Londoniensis) CIP T BV +/- - non LM oui** BV +/- - non LM non L. ivanovii L01 L. ivanovii (Londoniensis) CIP BV + - non LM oui** BV +/- - non LM non L. ivanovii I 41 L. ivanovii Produit laitier BV + - non LM oui** BV +/- - non LM non L. ivanovii L 119 L. ivanovii Sandwich BV + - non LM oui** BV +/- - non LM non L. ivanovii L. ivanovii Lait de chèvre BV + - non LM oui** BV + - non LM non L. ivanovii L. ivanovii Lait de chèvre BV + - non LM oui** BV + - non LM non L. ivanovii L. ivanovii Viande de surface BV + - non LM oui** BV + - non LM non L. ivanovii L. ivanovii Viande de surface BV + - non LM oui** BV + - non LM non L. ivanovii L. ivanovii Lait de chèvre BV + - non LM oui** BV + - non LM non L. ivanovii L. ivanovii Lait de chèvre BV + - non LM oui** BV + - non LM non L. ivanovii L. ivanovii Lait de chèvre BV +/- - non LM oui** BV +/- - non LM non L. ivanovii L. ivanovii Fromage de chèvre BV + - non LM oui** BV +/- - non LM non L. ivanovii L. ivanovii Fromage Rocamadour BV + - non LM oui** BV +/- - non LM non L. ivanovii L03 L. seeligeri CIP BV - + non LM non / / / / / / L48 L. seeligeri CTSCCV BV - - non LM non / / / / / / LIS 4.2 L. seeligeri Lait brebis BV - +/- non LM non / / / / / / LIS 4.3 L. seeligeri Saucisses BV - +/- non LM non / / / / / / LIS 4.4 L. seeligeri Poudre de lait BV - +/- non LM non / / / / / / BV : bleu/vert LM : Listeria monocytogenes ** après 48 heures d'incubation

63 Annexe 5 Page 10/10 SOUCHES NON CIBLES Profil confirmation Profil confirmation à partir milieu non sélectif à partir Concordance Identification Couleur Virage Colonies Couleur Virage / selon Halo Résultat Halo Résultat Code Nom Origine strie au jaune typiques strie au jaune conf. ISO L05 L. welshimeri CIP BV - + non LM non / / / / / / L06 L. welshimeri CIP T BV - + non LM non / / / / / / L46 L. welshimeri CTSCCV BV - + non LM non / / / / / / L70 L. welshimeri Ailes jaunes BV - + non LM non / / / / / / I 33 Lactobacillus casei produit laitier pas de croissance pas de croissance / / / / / / R 96 Lactobacillus casei CIP pas de croissance pas de croissance / / / / / / R113 Lactobacillus casei rhamnosub 7138 (ADRIA) pas de croissance pas de croissance / / / / / / R 99 Lactobacillus johnsonii CIP pas de croissance pas de croissance / / / / / / R 98 Lactobacillus leishmanii CIP pas de croissance pas de croissance / / / / / / R114 Lactobacillus paracasei 99A70 (ADRIA) pas de croissance pas de croissance / / / / / / R 97 Lactobacillus plantarum CIP A pas de croissance pas de croissance / / / / / / R 66 Leuconostoc pseudomesenter CIP pas de croissance pas de croissance / / / / / / I 42 Pediococcus Produits végétaux pas de croissance pas de croissance / / / / / / R 65 Pseudomonas aeruginosa ATCC pas de croissance pas de croissance / / / / / / R 6 Rhodococcus equi CIP pas de croissance non / / / / / / R 37 Staphylococcus aureus CIP pas de croissance pas de croissance / / / / / / R 46 Staphylococcus aureus CIP pas de croissance pas de croissance / / / / / / R 73 Staphylococcus aureus ATCC pas de croissance pas de croissance / / / / / / R 83 Staphylococcus aureus CIP pas de croissance pas de croissance / / / / / / I 32 Staphylococcus aureus Eaux superficielles pas de croissance pas de croissance / / / / / / I 34 Staphylococcus epidermidis produit laitier pas de croissance pas de croissance / / / / / / I 11 Staphylococcus epidermidis 2boîte de contact in pas de croissance pas de croissance / / / / / / I 39 Staphylococcus equorum Pâté vietnamien au bœuf pas de croissance pas de croissance / / / / / / I 12 Staphylococcus haemolyticusboîte de contact in pas de croissance pas de croissance / / / / / / R 85 Staphylococus xylosus CIP T pas de croissance pas de croissance / / / / / / BV : bleu/vert LM : Listeria monocytogenes

64 ANNEXE 6 Inclusivité / Exclusivité : Tableaux de résultats (Étude d extension : 2010)

65 Étude d inclusivité Annexe 6 Page 1/8 Réf. Nom Origine Taux d'inoculation dans 225 ml Fraser 1/2 (en UFC) Aspect des colonies sur (incubation 24h) Résultats «Listeria species Confirmation Strip» Résultats Palcam 1635/20/15 L. monocytogenes (1/2a) Steak haché 75 colonies bleues-vertes, avec halo 1651/20/31 L. monocytogenes (1/2a) Blanc d'œuf 55 colonies bleues-vertes, avec halo 1641/20/21 L. monocytogenes (1/2b) Radis 30 colonies bleues-vertes, avec halo L. monocytogenes Carcasse de bœuf 20 colonies bleues-vertes, avec halo L. monocytogenes (1/2c) Foie gras cuit 65 colonies bleues-vertes, avec halo L. monocytogenes Chapeau berrichon (glace) 35 colonies bleues-vertes, avec halo 1630/20/10 L. monocytogenes (1/2a) Chiffonnette 85 colonies bleues-vertes, avec halo L. monocytogenes Religieuse chocolat 50 colonies bleues-vertes, avec halo 1645/20/25 L. monocytogenes (1/2a) Saumon fumé 25 colonies bleues-vertes, avec halo 1648/20/28 L. monocytogenes (4b) Lait cru de chèvre 25 colonies bleues-vertes, avec halo 1629/20/9 L. monocytogenes (1/2c) Chiffonnette 70 colonies bleues-vertes, avec halo 1632/20/12 L. monocytogenes (1/2a) Viande hachée 35 colonies bleues-vertes, avec halo 1632/20/14 L. monocytogenes (1/2a) Veau 40 colonies bleues-vertes, avec halo

66 Annexe 6 Page 2/8 Réf. Nom Origine 1636/20/16 L. monocytogenes (1/2a) Taux d'inoculation dans 225 ml Fraser 1/2 (en UFC) Veau 15 Aspect des colonies sur (incubation 24h) colonies bleues-vertes, avec halo Résultats «Listeria species Confirmation Strip» Résultats Palcam 1639/20/19 L. monocytogenes (1/2a) Kebab 50 colonies bleues-vertes, avec halo 1527/20/7 L. monocytogenes (1/2a) Chiffonnette 65 colonies bleues-vertes, avec halo 1647/20/27 L. monocytogenes (1/2a) Fromage 35 colonies bleues-vertes, avec halo 1630/20/10 L. monocytogenes (1/2a) Chiffonnette 85 colonies bleues-vertes, avec halo 1640/20/20 L. monocytogenes Saucisse aux herbes 30 colonies bleues-vertes, avec halo 1628/20/8 L. monocytogenes (1/2a) Eau de rinçage 90 colonies bleues-vertes, avec halo LIS 5.2 L. grayi Saucisse 50 petites colonies bleues vertes, sans halo LIS 5.3 L. grayi Camembert 50 petites colonies bleues vertes, sans halo L190 L. grayi Frites surgelées 50 petites colonies bleues vertes, sans halo L143 L. grayi Frites surgelées 50 09_IAA_ L. ivanovii Cecalait L. ivanovii Veau L. ivanovii Lait de chèvre 80 petites colonies bleues vertes, sans halo petites colonies vertes clairs avec halo (24h) puis bleu-vert avec halo (48h) petites colonies vertes clairs avec halo (24h) puis bleu-vert avec halo (48h) petites colonies vertes clairs avec halo (24h) puis bleu-vert avec halo (48h) Positif (témoin ok, 2ème trait léger) Positif (témoin ok, 2ème trait léger)

67 Annexe 6 Page 3/8 Réf. Nom Origine Taux d'inoculation dans 225 ml Fraser 1/2 (en UFC) Aspect des colonies sur (incubation 24h) Résultats «Listeria species Confirmation Strip» Résultats Palcam L. ivanovii Lait de chèvre 75 petites colonies vertes clairs avec halo (24h) puis bleu-vert avec halo (48h) Positif (témoin ok, 2ème trait léger) L. ivanovii Maigre de veau 80 petites colonies vertes clairs avec halo (24h) puis bleu-vert avec halo (48h) L. ivanovii Lait de chèvre 70 petites colonies vertes clairs avec halo (24h) puis bleu-vert avec halo (48h) L. ivanovii Crottin de chèvre 75 petites colonies vertes clairs avec halo (24h) puis bleu-vert avec halo (48h) L. ivanovii Fromage de chèvre 80 petites colonies vertes clairs avec halo (24h) puis bleu-vert avec halo (48h) L. ivanovii Viande hachée de boeuf (frais) 65 petites colonies vertes clairs avec halo (24h) puis bleu-vert avec halo (48h) Positif (témoin ok, 2ème trait léger) L. innocua Fromage de chèvre 55 colonies bleues-vertes, sans halo L. innocua Lait de chèvre 50 colonies bleues-vertes, sans halo L. innocua Alfafa 40 colonies bleues-vertes, sans halo L. innocua L. innocua L. innocua Chiffonnette sol, syphon fromagerie Surface carcasse bœuf Surface carcasse bœuf 60 colonies bleues-vertes, sans halo 35 colonies bleues-vertes, sans halo 40 colonies bleues-vertes, sans halo L. innocua Poireau 45 colonies bleues-vertes, sans halo L. innocua Lait de chèvre 50 colonies bleues-vertes, sans halo

68 Annexe 6 Page 4/8 Réf. Nom Origine Taux d'inoculation dans 225 ml Fraser 1/2 (en UFC) Aspect des colonies sur (incubation 24h) Résultats «Listeria species Confirmation Strip» Résultats Palcam L. innocua Farine 50 colonies bleues-vertes, sans halo L. innocua Chiffonnette (environnement/ volaille) 60 colonies bleues-vertes, sans halo LIS 1.7 L. innocua Brocolis 45 colonies bleues-vertes, sans halo L. seeligeri Lait de chèvre 55 colonies bleues-vertes, sans halo L. seeligeri Cecalait 70 colonies bleues-vertes, sans halo 586/7/19 L. seeligeri Chiffonnette 65 colonies bleues-vertes, sans halo 317/3/74 L. seeligeri Viande de bœuf 80 colonies bleues-vertes, sans halo 1326/16/30 L. seeligeri Salade 70 colonies bleues-vertes, sans halo LIS 4.3 L. seeligeri Saucisse 60 colonies bleues-vertes, sans halo LIS 4.8 L. seeligeri Chiffonnette 75 colonies bleues-vertes, sans halo LIS 4.10 L. seeligeri Endives braisées 80 colonies bleues-vertes, sans halo L140 L. seeligeri Frites surgelées 90 colonies bleues-vertes, sans halo L115 L. seeligeri Eau de lac 50 colonies bleues-vertes, sans halo

69 Annexe 6 Page 5/8 Réf. Nom Origine Taux d'inoculation dans 225 ml Fraser 1/2 (en UFC) Aspect des colonies sur (incubation 24h) Résultats «Listeria species Confirmation Strip» Résultats Palcam LIS 6.2 L. welshimeri Cecalait 50 colonies bleues-vertes, sans halo L. welshimeri Chiffonnette suif chaine 1 80 colonies bleues-vertes, sans halo L. welshimeri Riz germé 60 colonies bleues-vertes, sans halo L. welshimeri Maigre de veau 50 colonies bleues-vertes, sans halo L. welshimeri Veau, portion unitaire 50 colonies bleues-vertes, sans halo L. welshimeri Affranchi bœuf 45 colonies bleues-vertes, sans halo L. welshimeri Roti de dinde cru 40 colonies bleues-vertes, sans halo L. welshimeri L. welshimeri Chiffonnette zone cuisson rillettes Chiffonnette (environnement/ volaille) 65 colonies bleues-vertes, sans halo 60 colonies bleues-vertes, sans halo

70 Étude d exclusivité Annexe 6 Page 6/8 Réf. Nom Origine Taux d'inoculation Aspect des colonies Résultats Résultats dans 225 ml bouillon sur (incubation 24h) «Listeria species Confirmation Strip» Palcam non sélectif (en UFC) 09_IAA_ Bacillus cereus Graines germées 1,2E /17/23 Bacillus cereus Taboulé 2,5E+06 Petites colonies blanches crénelées, mates, petit halo Petites colonies blanches crénelées, mates, petit halo 1399/17/22 Bacillus cereus Blé 1,4E+06 absence de colonie BA 10.3 Bacillus circulans Ferment lactique 1,6E+06 absence de colonie Petites colonies blanches frangées BA 9.1 Bacillus megaterium Salade 1,8E+06 mates BA 8.2 Bacillus mycoïdes Radis bio 1,2E /22/9 Bacillus subtilis Petites colonies blanches avec halo Collection ATCC ,5E+06 absence de colonie 08_IAA_ Candida albicans Jus d'orange 2,3E+06 absence de colonie 617/7/50 Corynebacteriaceae sp Abat de volaille 2,3E+06 absence de colonie 1786/22/4 Enterococcus faecalis Collection ATCC ,0E+06 absence de colonie 1412/17/35 Enterococcus faecalis Lait de vache 3,0E+06 absence de colonie 1413/17/36 Enterococcus faecium Découpe de canard 2,5E+06 absence de colonie 1411/17/34 Enterococcus faecium Collection CIP ,5E+06 petites colonies vertes non typiques, sans halo 928/11/37 Enterococcus hirae Eau 2,0E+06 absence de colonie négatif négatif non effectué non effectué négatif négatif non effectué non effectué non effectué non effectué non effectué non effectué négatif non effectué négatif négatif non effectué non effectué négatif négatif non effectué non effectué non effectué non effectué non effectué non effectué négatif non effectué

71 Annexe 6 Page 7/8 Réf. Nom Origine Taux d'inoculation Aspect des colonies Résultats Résultats dans 225 ml bouillon sur (incubation 24h) «Listeria species Confirmation Strip» Palcam non sélectif (en UFC) non non effectué 09_IAA_ Escherichia coli Viande de bœuf 2,5E+06 absence de colonie effectué non non effectué 09_IAA_ Escherichia coli Lait de chèvre 2,4E+06 absence de colonie effectué non non effectué 1415/17/38 Lactobacillus acidophilus Produit laitier 2,2E+06 absence de colonie effectué non non effectué 1414/17/37 Lactobacillus casei Produit laitier 2,0E+06 absence de colonie effectué non non effectué 1416/17/39 Lactobacillus casei Poudre de lait 2,0E+06 absence de colonie effectué non non effectué 1522/18/64 Pediococcus pentosaceus Ferment lactique 1,0E+06 absence de colonie effectué 09_IAA_ Pseudomonas aeruginosa Foie de veau 5,0E /22/10 Pseudomonas aeruginosa ATCC ,0E+05 colonies jaunâtres, plates, sans halo colonies jaunâtres, plates, sans halo 1328/16/32 Rhodococcus equi Matrice carnée 1,5E+06 absence de colonie 1797/22/15 Saccharomyces cerevisiae Collection ATCC ,0E+06 Tapis de colonies blanches mates, non typiques 1310/16/14 Staphylococcus aureus Lait de vache 4,3E+06 absence de colonie 1307/16/11 Staphylococcus aureus Lait de vache 3,5E+06 absence de colonie 1321/16/25 Staphylococcus intermedius IAA 3,5E+06 absence de colonie 16/0/16 Streptococcus agalactiae Lait de vache 3,0E+06 absence de colonie 279/3/36 Streptococcus dysgalactiae Lait de vache 3,0E+06 absence de colonie 772/9/43 Streptococcus uberis Lait de vache 3,0E+06 absence de colonie négatif négatif non effectué négatif non effectué non effectué non effectué non effectué non effectué non effectué négatif négatif non effectué négatif non effectué non effectué non effectué non effectué non effectué non effectué

72 Annexe 6 Page 8/8 Réf. Nom Origine Taux d'inoculation Aspect des colonies Résultats Résultats dans 225 ml bouillon sur (incubation 24h) «Listeria species Confirmation Strip» Palcam non sélectif (en UFC) non non effectué IAA_ML Micrococcus luteus ATCC ,5E+06 absence de colonie effectué non non effectué 5 SOU Micrococcus luteus CIP ,5E+06 absence de colonie effectué

73 ANNEXE 7 Résultats des essais : Souches cibles (Étude d extension concernant Fast Rhamnose : 2013)

74 Etude d'inclusivité Annexe 7 - Page 1/11 N Souche 2 L. monocytogenes Sérotype / Groupe PCR Matrice 8 L. monocytogenes IIa Buvard 10 L. monocytogenes IIa Eclair café 14 L. monocytogenes Ivb Filet de boeuf cru 16 L. monocytogenes Ivb Pâté de campagne 18 L. monocytogenes IIa Céleri rémoulade 20 L. monocytogenes Ivb Salade verte 22 L. monocytogenes Ivb Abat cœur 24 L. monocytogenes IIa Viande d'oie IIa 17 L. monocytogenes IIa 19 L. monocytogenes Ivb 21 L. monocytogenes IIa Saucisse nature 4 L. monocytogenes IIa Magret de canard cru Terrine de volaille foie gras Sandwich thon tomates mayonnaise Concombre à la crème Catégorie matrice Plats cuisin. / 3 L. monocytogenes L Salade saumon maïs 12_IAA_ Mélanges div. Emplacement 4h 6h 24h 48h 72h 24h à 37 C 24h à 37 C souchothèque / Géloses 37 C 37 C 37 C 37 C 37 C puis 24h à puis 48h à N dossier T ambiante T ambiante 12_IAA_ _IAA_ L. monocytogenes IIa Découpe poulet cru 12_IAA_ Produits laitiers 12_IAA_ L. monocytogenes IIa Cheveux d'ange 12_IAA_ Pâtisseries 12_IAA_ L. monocytogenes Ivb Religieuse chocolat Pâtisseries 12_IAA_ _IAA_ L. monocytogenes IIa Chair à saucisse crue 12_IAA_ Fruits & Lég. Plats cuisin. / Mélanges div. Fruits & Lég. Fruits & Lég. 12_IAA_ _IAA_ _IAA_ _IAA_ _IAA_ _IAA_ _IAA_ L. monocytogenes IIc Tomme de brebis Produits laitiers 12_IAA_ _IAA_ Légende : (+) : test / (-) : test négatif

75 Etude d'inclusivité Annexe 7 - Page 2/11 Emplacement 4h 6h 24h 48h 72h 24h à 37 C 24h à 37 C Sérotype / Catégorie N Souche Matrice souchothèque / Géloses 37 C 37 C 37 C 37 C 37 C puis 24h à puis 48h à Groupe PCR matrice N dossier T ambiante T ambiante Poissons 25 L. monocytogenes IIa Beignets calamar 12_IAA_ crust. 26 L. monocytogenes IIb Sushi saumon 28 L. monocytogenes IIb Poelée gourmande 32 L. monocytogenes IIa Farce à la tomate 35 L. monocytogenes IIa Chair à saucisse 38 L. monocytogenes Ivb Pizza 4 fromages 41 L. monocytogenes IIa Poulet mariné 43 L. monocytogenes Ivb Foie gras 46 L. monocytogenes Ivb Terrine de lapin 48 L. monocytogenes L Lasagnes Poissons & crust. 12_IAA_ L. monocytogenes IIa Poulet cru 12_IAA_ Fruits & Lég. 12_IAA_ Poissons & 31 L. monocytogenes L Tartare saumon 12_IAA_ crust. 12_IAA_ L. monocytogenes Ivb Saucisson à l'ail 12_IAA_ _IAA_ L. monocytogenes IIa Filet de poulet 12_IAA_ Plats cuisin. / Mélanges div. 12_IAA_ L. monocytogenes Ivb Poireaux Fruits & Lég. 12_IAA_ _IAA_ L. monocytogenes IIa Jarret de veau cru 12_IAA_ _IAA_ L. monocytogenes IIb Chiffonnette Environnement 12_IAA_ _IAA_ Poissons & 47 L. monocytogenes L Tartare saumon 12_IAA_ crust. Plats cuisin. / Mélanges div. 12_IAA_ L. monocytogenes IIa Foie gras 12_IAA_ TSYE TSYE Légende : (+) : test / (-) : test négatif

76 Etude d'inclusivité Annexe 7 - Page 3/11 N Souche Sérotype / Groupe PCR Matrice 52 L. monocytogenes IIa Saucisse nature 53 L. monocytogenes IIa Steack haché 12_IAA_ L. monocytogenes IIa Saucisson sec 57 L. monocytogenes IIa Tomates/légumes/œu fs 59 L. monocytogenes Ivb Minerai 62 L. monocytogenes Ivb Magret de canard 64 L. monocytogenes IIa Rôti de veau 67 L. monocytogenes Ivb Chair bœuf agneau 69 L. monocytogenes IIa Salade piémontaise 71 L. monocytogenes IIa Rillons 73 L. monocytogenes IIa Escalope de veau Emplacement 4h 6h 24h 48h 72h 24h à 37 C 24h à 37 C Catégorie souchothèque / Géloses 37 C 37 C 37 C 37 C 37 C puis 24h à puis 48h à matrice N dossier T ambiante T ambiante 12_IAA_ _IAA_ L. monocytogenes IIa Boulettes de bœuf 12_IAA_ Plats cuisin. / Mélanges div. 12_IAA_ L. monocytogenes IIa Melon Fruits & Lég. 12_IAA_ _IAA_ L. monocytogenes IIa Steack haché cuit 12_IAA_ _IAA_ L. monocytogenes Ivb Opéra Pâtisseries 12_IAA_ _IAA_ L. monocytogenes IIa Saucisse aux herbes 12_IAA_ _IAA_ L. monocytogenes IIa Farce 12_IAA_ Plats cuisin. / Mélanges div. 12_IAA_ L. monocytogenes IIa Bavette crue 12_IAA_ _IAA_ L. monocytogenes IIa Lait de chèvre Produits laitiers 12_IAA_ _IAA_ TSYE Légende : (+) : test / (-) : test négatif

77 Etude d'inclusivité Annexe 7 - Page 4/11 Emplacement 4h 6h 24h 48h 72h 24h à 37 C 24h à 37 C Sérotype / Catégorie N Souche Matrice souchothèque / Géloses 37 C 37 C 37 C 37 C 37 C puis 24h à puis 48h à Groupe PCR matrice N dossier T ambiante T ambiante 74 L. monocytogenes IIa Lait Béneteau Produits laitiers 12_IAA_ L. monocytogenes IIb Valençay 77 L. monocytogenes IIa Valençay 79 L. monocytogenes IIa Salade pdt/hareng 84 L. monocytogenes Ivb 94 L. monocytogenes Ivb Faisselle échalottes/oignons 86 L. monocytogenes Ivb Salade piémontaise 88 L. monocytogenes IIb Boudin blanc 90 L. monocytogenes IIb Pavé 3 chocolats 93 L. monocytogenes IIa Saucisses aux herbes Haricots blancs vinaigrette 96 L. monocytogenes Ivb Pied de porc 98 L. monocytogenes Ivb Farce lapin Produits laitiers 12_IAA_ L. monocytogenes IIa Lait de chèvre Produits laitiers 12_IAA_ Produits laitiers 12_IAA_ L. monocytogenes IIa Foie de vache 12_IAA_ Plats cuisin. / Mélanges div. 12_IAA_ Plats cuisin. / 82 L. monocytogenes IIa Salade piémontaise 12_IAA_ Mélanges div. Produits laitiers Plats cuisin. / Mélanges div. 12_IAA_ _IAA_ _IAA_ L. monocytogenes IIa Andouillette 12_IAA_ Pâtisseries 12_IAA_ Plats cuisin. / 92 L. monocytogenes IIa Salade piémontaise 12_IAA_ Mélanges div. Fruits & Lég. 12_IAA_ _IAA_ _IAA_942.2 Poissons & 97 L. monocytogenes Ivb Maki de saumon 12_IAA_897.2 crust. 12_IAA_914.1 Plats cuisin. / 100 L. monocytogenes IIa Risotto 12_IAA_586.2 Mélanges div. Légende : (+) : test / (-) : test négatif

78 Etude d'inclusivité Annexe 7 - Page 5/11 N Souche Sérotype / Groupe PCR Matrice 101 L. monocytogenes Ivb Rillettes 102 L. monocytogenes IIa Jambon sec 12_IAA_ L. monocytogenes IIa Pâté de campagne 106 L. monocytogenes IIa Emincé de veau cuit 108 L. monocytogenes IIa Steak haché cuit 111 L. monocytogenes IIa Terrine de porc 116 L. monocytogenes IIa Jambon de pays 118 L. monocytogenes IIa Bûche 119 L. monocytogenes IIa 120 L. monocytogenes IIa Steak haché 124 L. monocytogenes IIb Foie gras/gambas/quinoa Saucisse de strasbourg 128 L. monocytogenes Ivb Faux filet Emplacement 4h 6h 24h 48h 72h 24h à 37 C 24h à 37 C Catégorie souchothèque / Géloses 37 C 37 C 37 C 37 C 37 C puis 24h à puis 48h à matrice N dossier T ambiante T ambiante 12_IAA_ _IAA_ L. monocytogenes IIa Haché de veau cuit 12_IAA_ _IAA_ L. monocytogenes IIa Filet mignon de porc 12_IAA_ _IAA_ L. monocytogenes Ivb Rillettes de canard 12_IAA_ _IAA_ L. monocytogenes Ivb Shake Produits laitiers 12_IAA_ _IAA_ L. monocytogenes IIa Onglet cru 12_IAA_24.2 Pâtisseries Plats cuisin. / Mélanges div. 12_IAA_ _IAA_22.1 %8_El49 Poissons & 121 L. monocytogenes IIa Salade d'écrevisse 12_IAA_ crust. 12_IAA_ L. monocytogenes L Saucisse fumée 12_IAA_ _IAA_ Légende : (+) : test / (-) : test négatif

79 Etude d'inclusivité Annexe 7 - Page 6/11 Emplacement 4h 6h 24h 48h 72h 24h à 37 C 24h à 37 C Sérotype / Catégorie N Souche Matrice souchothèque / Géloses 37 C 37 C 37 C 37 C 37 C puis 24h à puis 48h à Groupe PCR matrice N dossier T ambiante T ambiante 132 L. monocytogenes L Soubressade 12_IAA_ L. monocytogenes IIc Steak 139 L. monocytogenes IIa Treaming 143 L. monocytogenes IIa Cheveux d'ange 145 L. monocytogenes IIa Lait de chèvre 152 L. monocytogenes IIa Poisson 154 L. monocytogenes Ivb Fromage 158 L. monocytogenes IIb radis 160 L. monocytogenes IIa Poireaux 12_IAA_ L. monocytogenes IIa Chiffonnette Environnement 12_IAA_ _IAA_ L. monocytogenes IIa Soubressade 12_IAA_2791.1à5 12_IAA_ L. monocytogenes IIa Haché de bœuf 12_IAA_ Produits laitiers 12_IAA_ L. monocytogenes IIa Chiffonnette Environnement 12_IAA_274.6 Poissons & crust. P1D48_Etude_Aloa_05_ L. monocytogenes IIa Fenouil Fruits & Lég _Etude_Aloa_05_08 Produits laitiers 583.4_Etude_Aloa_05_ L. monocytogenes IIa Lait Produits laitiers 903.3_Etude_Aloa_05_08 Fruits & Lég. Etude_Aloa_05_ L. monocytogenes Ivb Fromage Produits laitiers 583.3_Etude_Aloa_05_08 Fruits & Lég _Etude_Aloa_05_08 Poissons & 161 L. monocytogenes 1/2a Saumon fumé Etude_Aloa_05_08 crust. Légende : (+) : test / (-) : test négatif

80 Etude d'inclusivité Annexe 7 - Page 7/11 N Souche Sérotype / Groupe PCR Matrice 162 L. monocytogenes 1/2a Salade de poisson 164 L. monocytogenes 1/2c Chiffonnette Environnement Etude_Aloa_05_ L. monocytogenes 1/2a Chiffonnette 167 L. monocytogenes 1/2a Chiffonnette 170 L. monocytogenes 1/2a Fromage 172 L. monocytogenes 1/2b Fromage 174 L. monocytogenes 4b viande hachée 176 L. monocytogenes IIa Eclair chocolat 180 L. monocytogenes IIa Salade composée 182 L. monocytogenes IIa Avocat crevettes 185 L. monocytogenes IIa Sushi crevette Emplacement 4h 6h 24h 48h 72h 24h à 37 C 24h à 37 C Catégorie souchothèque / Géloses 37 C 37 C 37 C 37 C 37 C puis 24h à puis 48h à matrice N dossier T ambiante T ambiante Poissons Etude_Aloa_05_08 crust. Environnement Etude_Aloa_05_ L. monocytogenes 1/2a Eau de rinçage Environnement Etude_Aloa_05_08 Environnement Etude_Aloa_05_ L. monocytogenes 4b Lait Produits laitiers Etude_Aloa_05_08 Produits laitiers Etude_Aloa_05_ L. monocytogenes 1/2a Fromage Produits laitiers Etude_Aloa_05_08 Produits laitiers Etude_Aloa_05_ L. monocytogenes 1/2c Foie de porc Etude_Aloa_05_08 Etude_Aloa_05_ L. monocytogenes 1/2a kebab de veau Etude_Aloa_05_08 Pâtisseries 11_IAA_ Poissons & 177 L. monocytogenes Ivb espadon 11_IAA_603.1 crust. Fruits & Lég. 11_IAA_ L. monocytogenes IIa Moka café Pâtisseries 11_IAA_955.2 Plats cuisin. / Mélanges div. 11_IAA_ L. monocytogenes Ivb Mille feuille Pâtisseries 11_IAA_987.1 Poissons & crust. 11_IAA_ TSYE TSYE Légende : (+) : test / (-) : test négatif

81 Etude d'inclusivité Annexe 7 - Page 8/11 N Souche Sérotype / Groupe PCR 187 L. monocytogenes IIa 190 L. monocytogenes IIa Matrice Salade pomme de terre hareng 188 L. monocytogenes IIb Macédoine de légume Pomme de terre/saumon 192 L. monocytogenes Ivb Paris Brest 194 L. monocytogenes IIa Betterave 196 L. monocytogenes IIa Gland 198 L. monocytogenes IIa Chiffonnette 200 L. monocytogenes IIa Eau de rinçage 203 L. monocytogenes IIa Minestrone 206 L. monocytogenes Ivb Betterave Catégorie matrice Emplacement 4h 6h 24h 48h 72h 24h à 37 C 24h à 37 C souchothèque / Géloses 37 C 37 C 37 C 37 C 37 C puis 24h à puis 48h à N dossier T ambiante T ambiante Plats Viandes cuisin. & / 11_IAA_218.1 Mélanges div. Fruits & Lég. 11_IAA_ L. monocytogenes IIa Chiffonnette Environnement 11_IAA_ Plats cuisin. / Mélanges div. 11_IAA_ Plats cuisin. / 191 L. monocytogenes IIa Salade endive thon 11_IAA_ Mélanges div. Pâtisseries 11_IAA_ L. monocytogenes Ivb Betterave Fruits & Lég. 11_IAA_ Fruits & Lég. 11_IAA_ L. monocytogenes Ivb Chiffonnette Environnement 11_IAA_ Pâtisseries 11_IAA_ L. monocytogenes IIc Chiffonnette Environnement 11_IAA_ Environnement 11_IAA_ L. monocytogenes IIa Ecouvillon Environnement 11_IAA_ Environnement 11_IAA_ Plats cuisin. / 202 L. monocytogenes Ivb Salade Tailandaise 11_IAA_ Mélanges div. Fruits & Lég. 11_IAA_ L. monocytogenes IIa Lait Produits laitiers 11_IAA_ Fruits & Lég. 11_IAA_ L. monocytogenes Ivb Gland Pâtisseries 11_IAA_ Légende : (+) : test / (-) : test négatif

82 Etude d'inclusivité Annexe 7 - Page 9/11 N Souche Sérotype / Groupe PCR Matrice 208 L. monocytogenes Ivb Sushi Poissons & 209 L. monocytogenes IIa Tarama saumon 11_IAA_ crust. 210 L. monocytogenes IIa Eclair chocolat 212 L. monocytogenes IIa Salade de l'adour 214 L. monocytogenes Ivb Taboulé agrume 216 L. monocytogenes IIa Céleri rémoulade 218 L. monocytogenes IIa Salade pomme de terre betterave 220 L. monocytogenes IIa Pizza 222 L. monocytogenes IIb Brandade 224 L. monocytogenes IIa Pizza thon 226 L. monocytogenes IIa Saumon Emplacement 4h 6h 24h 48h 72h 24h à 37 C 24h à 37 C Catégorie souchothèque / Géloses 37 C 37 C 37 C 37 C 37 C puis 24h à puis 48h à matrice N dossier T ambiante T ambiante Poissons 11_IAA_ crust. Pâtisseries 11_IAA_ L. monocytogenes IIb Eclair chocolat Pâtisseries 11_IAA_ Plats cuisin. / Mélanges div. 11_IAA_ L. monocytogenes Ivb Chou fleur cuit Fruits & Lég. 11_IAA_ Fruits & Lég. 11_IAA_ Poissons & 215 L. monocytogenes IIa filet fletan cru 11_IAA_ crust. Fruits & Lég. 11_IAA_ Plats cuisin. / 217 L. monocytogenes IIa Salade piémontaise 11_IAA_ Mélanges div. Fruits & Lég. 11_IAA_ L. monocytogenes IIb Paris Brest Pâtisseries 11_IAA_ Plats cuisin. / Mélanges div. 11_IAA_ Plats cuisin. / 221 L. monocytogenes IIa Salade vendange 11_IAA_ Mélanges div. Poissons & crust. 11_IAA_ Poissons & 223 L. monocytogenes IIa Blinis saumon 11_IAA_ crust. Plats cuisin. / Mélanges div. 11_IAA_ L. monocytogenes IIa Carottes Fruits & Lég. 13_IAA_261.2 Poissons & crust. 13_IAA_263.1 Légende : (+) : test / (-) : test négatif

83 Etude d'inclusivité Annexe 7 - Page 10/11 Emplacement 4h 6h 24h 48h 72h 24h à 37 C 24h à 37 C Sérotype / Catégorie N Souche Matrice souchothèque / Géloses 37 C 37 C 37 C 37 C 37 C puis 24h à puis 48h à Groupe PCR matrice N dossier T ambiante T ambiante 279 L. monocytogenes IIa Rillons 11_IAA_ L. monocytogenes IIc 281 L. monocytogenes IIa 282 L. monocytogenes IVb 284 L. monocytogenes IIa 288 L. monocytogenes IIa 289 L. monocytogenes IIa 290 L. monocytogenes IIa 292 L. monocytogenes IIa Rôti de porc cuit 294 L. monocytogenes IVb 296 L. monocytogenes IVb Salade composée nature Tarama aux œufs de truite Chiffonnette chambre froide Salade de perles provençales 286 L. monocytogenes IIa Taboulé Concombre vinaigrette Salade jambon/macédoine/m ayonnaise Chiffonnette trancheuse Chiffonnette trancheur à jambon Chiffonnette plan de travail cuisine Fruits & Lég. Poissons & crust. Environnement 11_IAA_ L. monocytogenes IIa Viande hachée 10_IAA_ Fruits & Lég. 10_IAA_ L. monocytogenes IIa Cuisse de dinde cuite 10_IAA_ Fruits & Lég. 10_IAA_ L. monocytogenes IIa Salade composée Fruits & Lég. 10_IAA_ Fruits & Lég. Plats cuisin. / Mélanges div. Environnement 11_IAA_ _IAA_ _IAA_ _IAA_ _IAA_ L. monocytogenes IIa Rôti de porc cuit 10_IAA_ _IAA_ L. monocytogenes IIa Rôti de porc cuit 10_IAA_259-3 Environnement 10_IAA_ L. monocytogenes IVb Laboratoire patisserie Environnement 10_IAA_ Environnement 10_IAA_ L. monocytogenes IIa Chair à tomates 10_IAA_ Légende : (+) : test / (-) : test négatif

84 Etude d'inclusivité Annexe 7 - Page 11/11 N Souche Sérotype / Groupe PCR Matrice 298 L. monocytogenes IIb Chair à tomates 299 L. monocytogenes IIa Chair à tomates 10_IAA_ L. monocytogenes IIa Chiffonnette hachoir 301 L. monocytogenes IIa 311 L. monocytogenes IIa Chiffonnette labo prépa chair 302 L. monocytogenes IIb Sol laboratoire 304 L. monocytogenes IVb Rosbeef mixé cuit 306 L. monocytogenes IIa Farce à légumes 308 L. monocytogenes IIa Foie gras 310 L. monocytogenes IIa Foie gras Harengs + pommes de terre 312 L. monocytogenes IIc Poitrine crue de veau Emplacement 4h 6h 24h 48h 72h 24h à 37 C 24h à 37 C Catégorie souchothèque / Géloses 37 C 37 C 37 C 37 C 37 C puis 24h à puis 48h à matrice N dossier T ambiante T ambiante 10_IAA_ Environnement Environnement Environnement 10_IAA_ L. monocytogenes IVb Rosbeef mixé cuit 10_IAA_ _IAA_ _IAA_ L. monocytogenes IIa Farce à légumes 09_IAA_ _IAA_ _IAA_ L. monocytogenes IIa Foie gras 09_IAA_ _IAA_ L. monocytogenes IIc Foie gras 09_IAA_ Plats cuisin. / Mélanges div. 09_IAA_ _IAA_ _IAA_ Légende : (+) : test / (-) : test négatif

85 ANNEXE 8 Résultats des essais : Souches non cibles (Étude d extension concernant Fast Rhamnose : 2013)

86 Etude d'exclusivité Annexe 8 - Page 1/9 N Souche Matrice 247 L. grayi Chifonnette 11_IAA_ L. grayi IAA IAA 272 L. grayi 12L: /16/ L. innocua Chiffonnette 12_IAA_ L. innocua Lait de chèvre 12_IAA_ L. innocua Buvard lait 12_IAA_ L. innocua Lait de chèvre 12_IAA_ L. innocua Chiffonnette Emplacement 4h 6h 24h 48h 72h 24h à 37 C 24h à 37 C Informations souchothèque / Géloses 37 C 37 C 37 C 37 C 37 C puis 24h à puis 48h à complémentaires N dossier T ambiante T ambiante (si nécessaire) 12_IAA_ L. innocua Chiffonnette 12_IAA_ L. innocua L. innocua Chiffonnette 12_IAA_ Chiffonnette 246 L. innocua Chifonnette 249 L. innocua Chifonnette 12_IAA_ _IAA_ _IAA_ L. innocua Compost 11_IAA_ L. innocua Ecouvillon Etude EC L. innocua Lait 11_IAA_ L. innocua Abats 13_IAA_ TSYE confirmation par galerie biochimique confirmation par galerie biochimique confirmation par galerie biochimique confirmation par galerie biochimique confirmation par galerie biochimique confirmation par galerie biochimique confirmation par galerie biochimique Légende : (+) : test / (-) : test négatif

87 Etude d'exclusivité Annexe 8 - Page 2/9 N Souche Matrice 230 L. ivanovii 241 L. ivanovii 242 L. ivanovii Minerai Lait de chèvre Emplacement 4h 6h 24h 48h 72h 24h à 37 C 24h à 37 C Informations souchothèque / Géloses 37 C 37 C 37 C 37 C 37 C puis 24h à puis 48h à complémentaires N dossier T ambiante T ambiante (si nécessaire) 12_IAA_ L. ivanovii Buvard lait 12_IAA_ L. ivanovii Lait de chèvre 12_IAA_ L. ivanovii 12_IAA_ L. ivanovii Buvard lait 12_IAA_ L. ivanovii Lait de chèvre 12_IAA_ Agneau Viande hallal 12_IAA_ _IAA_ L. ivanovii Merguez 11_IAA_ L. ivanovii Cote d'agneau 11_IAA_ L. ivanovii Filet d'agneau 254 L. ivanovii Veau 255 L. ivanovii Farce de veau 274 L. ivanovii 12L: L. ivanovii Foin 276 L. ivanovii Foie 277 L. ivanovii Placenta bovin 11_IAA_ _IAA_ _IAA_ /16/ /16/41 656/8/8 1286/15/ Légende : (+) : test / (-) : test négatif

88 Etude d'exclusivité Annexe 8 - Page 3/9 N Souche Matrice 278 L. ivanovii Lait de chèvre 313 L. ivanovii 314 L. ivanovii Environnement 259 L. seeligeri Ecouvillon E10P L. seeligeri 243 L. welshimeri Chiffonnette 11_IAA_ L. welshimeri Chifonnette 248 Agro-alimentaire 260 L. welshimeri Ecouvillon Emplacement 4h 6h 24h 48h 72h 24h à 37 C 24h à 37 C Informations souchothèque / Géloses 37 C 37 C 37 C 37 C 37 C puis 24h à puis 48h à complémentaires N dossier T ambiante T ambiante (si nécessaire) 11_IAA_ L. welshimeri Chifonnette 11_IAA_ L. welshimeri Chiffonnette 11_IAA_ E10P L. welshimeri Poisson P14P L. welshimeri Boisson P11O L. welshimeri Steak haché 13_IAA_ L. welshimeri Minerai 265 L. welshimeri Tartare 13_IAA_741.3 AES 2.18 AES 2.6 Placenta vache 317/3/ L. seeligeri Foin 586/7/ L. seeligeri 12L: /16/30 13_IAA_522.1 T TSYE Légende : (+) : test / (-) : test négatif

89 Etude d'exclusivité Annexe 8 - Page 4/9 N Souche Matrice 266 L. welshimeri 268 Soubressade Emplacement 4h 6h 24h 48h 72h 24h à 37 C 24h à 37 C Informations souchothèque / Géloses 37 C 37 C 37 C 37 C 37 C puis 24h à puis 48h à complémentaires N dossier T ambiante T ambiante (si nécessaire) 13_IAA_501.1_5 L. welshimeri Cheveux d'ange 13_IAA_ TSYE E1 Bacillus cereus Taboulé 1400/17/ TSYE Aspect gélose : non caractéristique (nappe blanche) E2 Bacillus cereus Blé 1399/17/ Aspect gélose : non caractéristique (nappe blanche et verte) E30 Bacillus cereus ATCC /32/ Aspect gélose : non caractéristique (nappe blanche) E41 Bacillus cereus IAA IAA Aspect gélose : non caractéristique (petite nappe blanche) E42 Bacillus cereus Flocon purée déshydratée IAA Aspect gélose : non caractéristique (petite nappe blanche) E44 Bacillus cereus IAA LDA Aspect gélose : colonies vertes et blanches et nappe blanche E45 Bacillus cereus Bactério des eaux pas de croissance TSYE E49 Bacillus circulans Agro-alimentaire AES BA Aspect gélose : non caractéristique (petite nappe blanche) Légende : (+) : test / (-) : test négatif

90 Etude d'exclusivité Annexe 8 - Page 5/9 N Souche Matrice E54 E51 E3 E48 E58 E34 E31 E50 Bacillus circulans Bacillus lentus Bacillus mycoïdes Bacillus mycoides Bacillus mycoïdes Bacillus macerans Bacillus megaterium Bacillus megaterium Industrie Laitière ISHA BAC 2.1 Agro-alimentaire AES BA 16.2 Radis bio 1398/17/2 Environnement AES BA 8.1 Salade camargaise Ferment lactique 93/1/12 Souchothèque IAA 14/01/1993 Agro-alimentaire Emplacement 4h 6h 24h 48h 72h 24h à 37 C 24h à 37 C Informations souchothèque / Géloses 37 C 37 C 37 C 37 C 37 C puis 24h à puis 48h à complémentaires N dossier T ambiante T ambiante (si nécessaire) 13_IAA_ /17/24 AES BA 9.7 E4 Bacillus subtilis ATCC /22/ TSYE pas de croissance pas de croissance pas de croissance Aspect gélose : non caractéristique (colonies blanches frangées à halo et qqs colonies vertes) Aspect gélose : non caractéristique (nappe blanche et qqs très petites colonies vertes pâles) Aspect gélose : non caractéristique (nappe blanche) Aspect gélose : non caractéristique (nappe blanche et qqs colonies vertes) Aspect gélose : non caractéristique (toute petite nappe blanche) Aspect gélose : non caractéristique (petite nappe blanche) Légende : (+) : test / (-) : test négatif

91 Etude d'exclusivité Annexe 8 - Page 6/9 N Souche Matrice E35 E43 E52 E40 E5 Candida magnoliaeae ATCC /22/14 E6 E46 E56 E7 Bacillus subtilis Brevibacillus laterosporus Brevibacterium casei Brochotrix Corynebacteriaceae sp Enterococcus durans Enterococcus durans Enterococcus faecalis Souchothèque IAA 1993 Fromage chèvre au lait cru Emplacement 4h 6h 24h 48h 72h 24h à 37 C 24h à 37 C Informations souchothèque / Géloses 37 C 37 C 37 C 37 C 37 C puis 24h à puis 48h à complémentaires N dossier T ambiante T ambiante (si nécessaire) 1402/17/25 Produit laitier ISHA BRE 1.1 Souchothèque IAA 2001 Abat de volaille 617/7/50 Contamination de levures sèches Ovoproduit 13_IAA_ /17/44 AES ENT 10.1 ADRIA Ad182 ATCC /22/ TSYE pas de croissance pas de croissance pas de croissance pas de croissance Aspect gélose : non caractéristique (colonies vertes frangées à halo) Aspect gélose : non caractéristique (nappe verte et qqs colonies isolées vertes) Aspect gélose : non caractéristique (nappe verte et petites colonies blanches) Aspect gélose : non caractéristique (toute petite nappe verte) Aspect gélose : non caractéristique (nappe verte, toutes petites colonies) Légende : (+) : test / (-) : test négatif

92 Etude d'exclusivité Annexe 8 - Page 7/9 N Souche Matrice Emplacement 4h 6h 24h 48h 72h 24h à 37 C 24h à 37 C Informations souchothèque / Géloses 37 C 37 C 37 C 37 C 37 C puis 24h à puis 48h à complémentaires N dossier T ambiante T ambiante (si nécessaire) E8 E9 E10 Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Enterococcus faecium Lait de vache 1412/17/35 Découpe canard 1413/17/36 CIP /17/ Aspect gélose : non caractéristique (nappe verte, toutes petites colonies) Aspect gélose : non caractéristique (nappe verte, toutes petites colonies et qqs colonies vertes isolées) Aspect gélose : non caractéristique (nappe verte, toutes petites colonies et qqs colonies vertes isolées) E47 Enterococcus hirae CCM2423 AES ENT Aspect gélose : non caractéristique (colonies vertes à centre blanc) E55 Enterococcus hirae Eau ADRIA Ad Aspect gélose : non caractéristique (toute petite nappe verte) E13 Lactobacillus acidophilus Produit laitier 1415/17/ Aspect gélose : non caractéristique (nappe verte, toutes petites colonies) E15 Lactobacillus casei Poudre de lait 1416/17/39 pas de croissance TSYE E28 Leuconostoc sérum lait IAA pas de croissance E29 Micrococcus luteus IAA 1447/17/ Aspect gélose : non caractéristique (nappe petites colonies jaunes) Légende : (+) : test / (-) : test négatif

93 Etude d'exclusivité Annexe 8 - Page 8/9 N Souche Matrice Emplacement 4h 6h 24h 48h 72h 24h à 37 C 24h à 37 C Informations souchothèque / Géloses 37 C 37 C 37 C 37 C 37 C puis 24h à puis 48h à complémentaires N dossier T ambiante T ambiante (si nécessaire) E16 Pediococcus pentosaceus Ferment lactique 1522/18/ Aspect gélose : non caractéristique (nappe verte, toutes petites colonies) E18 Rhodococcus equi Matrice carnée 1328/16/ Aspect gélose : non caractéristique (colonies blanches muqueuses) E19 Sacharomyces cerevisiae Bière EAU Aspect gélose : non caractéristique (toutes petites colonies blanches) E20 Staphylococcus aureus Lait de vache 1310/16/ TSYE Aspect gélose : non caractéristique (colonies jaunâtres) E21 Staphylococcus aureus Lait de vache 1307/16/ TSYE Aspect gélose : non caractéristique (colonies jaunâtres) E32 Staphylococcus aureus ATCC /22/3 pas de croissance TSYE E37 Staphylococcus haemolyticus Lait de vache 284/3/ Aspect gélose : non caractéristique (colonies vertes pâles et blanchâtres) E38 Staphylococcus haemolyticus Souchothèque BV 1407/17/ Aspect gélose : non caractéristique (colonies vertes pâles et blanchâtres) E53 Staphylococcus epidermidis Produit laitier ISHA STA 2.1 pas de croissance TSYE Légende : (+) : test / (-) : test négatif

94 Etude d'exclusivité Annexe 8 - Page 9/9 N Souche Matrice E22 E36 E39 E33 E23 E24 Staphylococcus intermedius Staphylococcus lugdunensis Streptococcus agalactiae Streptococcus bovis Streptococcus dysgalactiae Streptococcus uberis Emplacement 4h 6h 24h 48h 72h 24h à 37 C 24h à 37 C Informations souchothèque / Géloses 37 C 37 C 37 C 37 C 37 C puis 24h à puis 48h à complémentaires N dossier T ambiante T ambiante (si nécessaire) IAA 1321/16/25 Lait de chèvre 89/1/8 Lait de vache 16/0/16 Rein de bovin 1499/18/41 Lait de vache 279/3/96 Lait de vache 772/9/43 TSYE TSYE TSYE TSYE pas de croissance pas de croissance pas de croissance pas de croissance TSYE Aspect gélose : non caractéristique (colonies muqueuses blanchâtres) Aspect gélose : non caractéristique (toute petite nappe verte) Légende : (+) : test / (-) : test négatif