ENZYMOLOGIE UE1 PARTIE 1 I. Structure Catalyseur Substance qui réagit avec un réactant en modifiant la distribution d'énergie entre ses liaisons chimiques L'énergie d'activation étant moindre en présence d'un catalyseur, la réaction est plus rapide. La composition chimique du catalyseur n'est pas modifiée par la réaction Une molécule unique de catalyseur peut être utilisée à de multiples reprises pour catalyser la conversion de nombreuses réactions. Un catalyseur ne modifie pas le contenu énergétique des réactants et des produits. Enzyme La plupart des réactions dans l'organisme se feraient à des vitesses très lentes si elles étaient effectuées dans un tube à essai par simple mélange des réactants et produits car leurs énergies d'activation sont très élevées. Pour obtenir de grandes vitesses de réaction observées dans les organismes vivants, il faut que des catalyseurs abaissent les énergies d'activation. Ces catalyseurs particuliers sont appelés enzymes. Ces derniers étant des protéines, ils sont des catalyseurs protéiques. Certaines molécules d'arn possèdent des activités enzymatiques : ce sont des ribozymes. Pour assurer ses fonctions, un enzyme doit être au contact des réactants appelés substrats dans le cas de réactions enzymatiques. Le substrat se fixe sur l'enzyme et forme ainsi un complexe enzyme-substrat, puis se désagrège pour libérer les produits et l enzyme non modifiée. La réaction est décrite de la manière suivante : S A+B + E S AB E P AB + E 1 sur 7
A la fin de la réaction, l'enzyme peut rentrer dans une nouvelle réaction avec d'autres molécules de substrat. L'effet global est l accélération de la conversion du substrat en produit, l'enzyme agissant comme catalyseur. Un enzyme, comme toute protéine, est synthétisée à partir de l'adn ou de l'arn (dans le cas de certains virus). L'ARN mature va être traduit et donner une pré-pro-protéine qui va subir des modifications posttraductionnelles. Un enzyme subit des transformations post-traductionnelles comme la glycosylation, le clivage en partie N-terminale ou C-terminale par des endo- ou exo-peptidases. Les principales caractéristiques des enzymes - Un enzyme ne subit aucun changement chimique au cours de la réaction qu'elle catalyse. - La fixation d'un substrat sur le site actif d'un enzyme à toutes les caractéristiques de la fixation d'un ligand sur une protéine en terme de spécificité chimique, d'affinité, de compétition et de saturation. - Un enzyme augmente la vitesse d'une réaction chimique sans induire d'autres réactions qui n'auraient pas lieu en son absence - Un enzyme abaisse l'énergie d'activation d'une réaction mais ne modifie pas la quantité nette d énergie apportée au système ou libérée par les substrats dans la réaction. - Les enzymes sont des protéines qui jouent le rôle de catalyseur : ils augmentent la vitesse de réaction vers son point d'équilibre sans toutefois modifier la position de celui-ci : ce sont des catalyseurs biologiques (n interviennent pas dans le bilan réactionnel). Les enzymes diffèrent des catalyseurs chimiques par leur structure chimique : les catalyseurs sont des composés minéraux alors que les enzymes sont organiques. 2 sur 7
Il existe 2 grandes catégories d'enzymes : Les enzymes purement protéiques : elles jouent un rôle dans la structure 3D des protéines matures. Les enzymes en deux parties : une partie protéique appelée apoenzyme, et une partie nonprotéique, qui se comme cofacteur ou coenzyme. Si la partie non protéique est un métal présent à l'état de trace (Mg, Ca, Zn, Mn ) cofacteur Si la partie non protéique est un composé organique (souvent de faible PM) coenzyme Le coenzyme participe directement à la réaction en tant que substrat. La fixation du coenzyme ou cofacteur sur l'enzyme modifie sa conformation, lui permettant d interagir avec le substrat. Un enzyme complètement actif sur le plan catalytique (lié à son coenzyme ou cofacteur) est appelé holoenzyme. L'activité catalytique spécifique appartient à l'apoenzyme l'activité enzymatique est portée par la composante protéique. II. Coenzyme Définition : composé organique de nature non protéique qui est associé à la partie protéique de l'enzyme et qui lui confère ses propriétés enzymatiques. Sans le coenzyme, la catalyse réactionnelle ne peut avoir lieu. Les enzymes qui nécessitent des coenzymes catalysent des réactions dans lesquelles quelques atomes (hydrogène, groupement méthyl/acétyl ) sont soit extraits, soit ajoutés au substrat. Précurseurs des coenzymes Les vitamines sont souvent précurseurs des coenzymes. Ce sont des petites biomolécules nécessaires en petite quantité dans le régime des animaux supérieurs. Les vitamines hydrosolubles sont : vitamine C ou ascorbate : anti-oxydant nécessaire à l'hydroxylation des résidus Proline du collagène vitamine B 3 sur 7
Les vitamines liposolubles sont : vitamine A ou rétinol précurseur du rétinal vitamine D régulateur du métabolisme phospho-calcique vitamine E anti-oxydant des membranes vitamine K acteur lors de la carboxylation du Glutamate Propriétés générales - Les coenzymes et cofacteurs sont stables à la chaleur, de faible PM et non responsables de la spécificité des enzymes (rôle d'aide uniquement). Ils retrouvent toujours leur état initial - À l'inverse des substrats qui eux sont transformés en produits, durant la réaction enzymatique. - Un coenzyme comme l'atp peut être utilisé par des enzymes de spécificités différentes mais exerçant le plus souvent un même type d'effet sur les substrats. Exemple : Acetyl-CoA carboxylase et Pyruvate carboxylase sont des réactions enzymatiques différentes mais utilisent toutes les deux l'atp comme coenzyme. Les réactions auxquelles participent les coenzymes sont des réactions de transfert d électrons, de protons et groupements phosphate et servent d'accepteurs temporaires. On distingue les coenzymes activateurs (ou groupements prosthétiques) qui sont fortement liés à l'apoenzyme par des liaisons covalentes. Ils ne se détachent pas de l'apoenzyme au cours de la réaction, à l'inverse du substrat. On distingue aussi les coenzymes transporteurs (ou cosubstrats) qui eux, se dissocient facilement de l'apoenzyme. Le coenzyme retrouve son état initial lors d'une seconde réaction faisant intervenir un autre enzyme. Quand l'enzyme est inactif, le coenzyme n'est pas fixé sur l'enzyme. 4 sur 7
III. Isoenzymes De nombreux enzymes apparaissent sous plus d'une forme moléculaire dans la même espèce, même tissu ou même cellule. Dans chaque cas, les formes différentes de l'enzyme catalysent la même réaction mais ont des propriétés cinétiques différentes puisqu'ils ont une séquence en AA différente, ils peuvent alors être distingués et séparés par des procédés appropriés. Ces formes multiples d'enzyme sont appelées isoenzymes ou isozymes. Le premier enzyme trouvé possédant des isoenzymes est la lactate déshydrogénase (LDH) qui catalyse une réaction réversible d'oxydoréduction. LDH Lactate + NAD + Pyruvate + NADH + H + La LDH apparaît chez les animaux sous 5 formes différentes d'isoenzymes séparables par électrophorèse, cet enzyme catalyse le stade final de la glycolyse anaérobie dans toutes les cellules. Il possède une structure de 4 sous-unités dont deux types sont observées : chaines M dans les enzymes musculaires (muscle) chaines H dans le cœur (heart) La composition en AA de ces chaines sont différentes, elles peuvent s'assembler pour former 5 isoenzymes différents : - M4 - M3H1 - M2H2 - M1H3 - H4 Au cours de leur biosynthèse, les peptides (neuropeptides, hormones ) subissent plusieurs modifications post-traductionnelles dont la plus fréquente est l'α-amidation en C-terminal. Cette fonction amide est essentielle à leur activité biologique. La peptidyl-glycine α-amidating mono-oxygénase (PAM, EC.1.14.17.3) catalyse la réaction d'αamidation de ces peptides, c'est une réaction en deux étapes dont chacune est catalysée par un domaine différent de l'enzyme bi-fonctionnelle. Un seul gène complexe code pour la PAM, le phénomène d'épissage alternatif soumis à une régulation au cours du développement et présentant une spécificité cellulaire engendre plusieurs ARNm codant pour les différentes formes protéiques (isoenzymes) de l'enzyme. 5 sur 7
Tous les peptides devraient être sous la forme : Cependant, 70% des peptides et hormones présente un groupe amide au lieu du groupe COOH en C- terminal. Ceci est du à l action de la PAM. Toute protéine portant un groupement amide en C-ter a subit l'action de la PAM, nécessaire à la vie. Exemple du fonctionnement de la PAM Dans cette séquence, on a un résidu Proline, lui même lié à une Glycine, et lui aussi lié à 2 AA basiques. Le ph optimal de la PAM est de 7,5-8,5. Premières étapes, distinctes des étapes de la PAM : activité endopeptidase et exopeptidase. Endopeptidase : va couper la liaison entre les deux AA basiques et n en laisser qu un (coupe au milieu du peptide donc) Exopeptidase : va, quant à elle, couper à droite de la Glycine, c est à dire entre la Glycine et l AA basique restant (coupe donc une extrémité) On obtient donc un peptide avec une Glycine du côté C-terminal. C est à ce moment là que la PAM rentre en action, via ses deux activités enzymatiques. On dit que la PAM est bifonctionnelle. La première action de la PAM se fait via ce que l on appelle PHM ( PeptidylGlycine Hydroxylating Monooxygenase ) qui se fait à ph acide. Elle va avoir une action d hydroxylation du Cɑ en ajoutant un groupement -OH sur celui ci. La nucléophilie de ce groupement va fragiliser les autres liaisons du peptide en électrons. Cette première action se fait en présence de Cu 2+, d ascorbate et d O 2. La deuxième action de la PAM est appelée PAL ( Peptidyl Amidating Lyase ) et catalyse la rupture de la liaison entre le Cɑ et le groupement azote de la Glycine, et se fait à ph alcalin. 6 sur 7
On se retrouve donc avec un peptide (ici Pro) avec un groupement -NH2 supplémentaire en C-terminal (au lieu de COOH) et d un composé appelé Glyoxalate (ou Glyoxylate), qui est en réalité une «Glycine» modifiée, hydroxylée et désaminée. Exemple dans la vie : un composé appelé TRH synthétisé dans l hypothalamus va venir se mettre sur l hypophyse et stimuler la sécrétion d un petit peptide de 3 AA, appelé TSH, qui va se retrouver avec un groupement -NH2 en C-terminal. On en déduit que la PAM a eu une action sur ce peptide, et cela a permis d augmenter jusqu à 2000 fois son activité. Le peptide TSH amidé est bien plus puissant que le peptide seul. IV. Vitesse de réaction La vitesse de réaction enzymatique est mesurée à partir de la quantité de produits formés ou de réactifs disparus par unité de temps. L'affinité de l'enzyme est donnée par la constante de Michaelis, Km dans le cas d'un enzyme simple avec un seul site de fixation. Les enzymes sont de vrais catalyseurs, ils augmentent considérablement la vitesse des réactions chimiques spécifiques qui pourraient se produire sinon très lentement. Ils augmentent la vitesse en abaissant leur énergie d'activation. Une réaction chimique telle que A+B AB s'effectue car une certaine fraction de molécules possèdent plus d'énergie interne que le reste de la population : énergie suffisante pour les amener au sommet de la colline énergétique à une forme réactive appelée état de transition. Les substrats A et B requièrent en conditions normales une quantité d énergie considérable E1 pour atteindre l'état de transition AB à la suite duquel AB peut se former. L'enzyme crée un micro-environnement dans lequel A et B peuvent atteindre l état AB plus facilement, réduisant par conséquent l'énergie requise. Comme il est plus facile d'atteindre un niveau d'énergie inférieur, la réaction peut avoir lieu plus fréquemment ce qui se traduit par une vitesse de réaction accrue. 7 sur 7