Détermination de l éthylglucuronide (EtG) dans les cheveux

Schweizerische Gesellschaft für Rechtsmedizin SGRM Société Suisse de Médecine Légale Società Svizzera di Medicina Legale Groupe de travail sur les analyses de cheveux Détermination de l éthylglucuronide (EtG) dans les cheveux Version du 02 avril 2014 Approuvé par le comité directeur de la et autorisé à la publication le 01.09.2014.

Détermination de l éthylglucuronide (EtG) dans les cheveux Page 2 sur 10 Sommaire 1 AVANT-PROPOS... 3 2 DEFINITIONS / GLOSSAIRE... 4 3 PRINCIPES... 5 3.1 Généralités... 5 3.2 Applications pour l analyse de l EtG dans les cheveux... 5 3.2.1 Généralités... 5 3.2.2 Analyse des cheveux pour les expertises de médecine du trafic... 5 4 PROCEDURE PRATIQUE... 6 4.1 Prélèvement d échantillon... 6 4.2 Phase préanalytique... 6 4.2.1 Lavage... 6 4.2.2 Segmentation... 6 4.3 Méthodes... 6 4.3.1 Préparation d échantillon... 6 4.3.2 Extraction... 6 4.3.3 Détection... 6 5 EXIGENCES ANALYTIQUES... 7 5.1 Validation... 7 5.2 Etalonnage... 7 5.3 Contrôle de qualité... 7 5.3.1 Contrôle de qualité interne... 7 5.3.2 Comparaisons interlaboratoires... 7 5.3.3 Contrôles de qualité internationaux... 7 5.3.4 Incertitude de mesure... 7 6 INTERPRETATION... 8 6.1 Répartition de la consommation d alcool en catégories de risques... 8 6.2 Concentrations d EtG mesurées dans les cheveux... 8 6.3 Précisions sur la limite de détection et les seuils de décision... 9 6.4 Indication des résultats... 9 6.5 Facteurs supplémentaires pour l interprétation... 9 6.5.1 Cosmétiques pour cheveux... 9 6.5.2 Phénomène de persistance... 9 6.5.3 Poils... 9 7 REFERENCES... 10

Détermination de l éthylglucuronide (EtG) dans les cheveux Page 3 sur 10 1 AVANT-PROPOS Ce document a été élaboré par les membres du groupe de travail Analyse de cheveux de la (Société suisse de médecine légale). Il s agit d un document consensuel interne à la, qui vise à harmoniser la terminologie et l interprétation des résultats d analyses effectuées sur des cheveux. En même temps, il définit les exigences minimales, ainsi que le principe de la gestion de la qualité concernant les analyses médico-légales effectuées sur des cheveux. Membres du groupe de travail: méd. prat. Ph. Keller, IRM Argovie Dr en sc. nat. W. Martz, IRM Argovie Dr en phil. II F. Dussy, IRM Bâle Prof. W. Weinmann Dr en sc. nat., IRM Berne Dr en phil. nat. S. König, IRM Berne Dr en sc. nat. F. Sporkert, CURML Lausanne Dr en sc. For. M.-T. Pinorini, FASV Olivone Dr en sc. nat. J. Beyer, IRM St-Gall Dr en sc. nat. A. Cronin, IRM St-Gall Dr en phil. II M.R. Baumgartner, IRM Zurich Dr en sc. nat. T.M. Binz, IRM Zurich Dr en sc. nat. C. Klemm, IRM Zurich Dr en méd. B. Liniger, IRM Zurich Pharmacienne M.M. Madry, IRM Zurich Dans ce document, les titres des personnes sont mentionnés de manière neutre; pour faciliter la compréhension, c est la forme masculine qui est la plupart du temps, employée.

Détermination de l éthylglucuronide (EtG) dans les cheveux Page 4 sur 10 2 DEFINITIONS / GLOSSAIRE Champ d application Cut-off EtG-D 5 Etendue des concentrations des substances recherchées dans l échantillon (limite inférieure/supérieure), avec un degré d exactitude et de précision acceptables. Doit être mentionné dans le rapport de validation. Angl. Limite de décision EtG cinq fois deutéré EI ESI EtG FAEE CPG / GC Angl. Electron impact Ionization: ionisation par impact électronique en MS Angl. Electrospray Ionization: électronébulisation en MS Ethylglucuronide Angl. Fatty Acid Ethyl Ester = esters éthyliques d acides gras Chromatographie en phase gazeuse = procédé chromatographique pour séparer des mélanges de substances (applicable aux substances gazeuses ou évaporables sans se décomposer) GTFCh Société de toxicologie et de chimie forensiques (http://www.gtfch.org/cms/) CIL Comparaison interlaboratoires de la LC Angl. Liquid Chromatography (chromatographie en phase liquide) = procédé chromatographique pour séparer des mélanges de substances (applicable aussi aux substances non volatiles) LOD MS NCI pg/mg proximal SoHT SPE OMS Angl. Limit Of Detection = limite de détection = limite de détection fiable et qualitative d une substance Spectrométrie de masse: Procédé de mesure du rapport masse/charge des ions (utilisable pour la détection qualitative et quantitative des substances) Ionisation chimique négative = procédé d ionisation en MS Picogramme par milligramme Près du cuir chevelu Société suisse de médecine légale (www.sgrm.ch) Angl. Society of Hair Testing (www.soht.org) Angl. Solid Phase Extraction = extraction en phase solide Organisation mondiale de la santé

Détermination de l éthylglucuronide (EtG) dans les cheveux Page 5 sur 10 3 PRINCIPES 3.1 Généralités L éthylglucuronide (EtG) et les esters éthyliques d acides gras (FAEE) sont des marqueurs directs d une consommation d alcool. Les deux marqueurs peuvent être détectés dans les cheveux (poils) et utilisés indépendamment l un de l autre pour interpréter la consommation d alcool éthylique. Cependant, l EtG doit être considéré comme le marqueur le plus probant parce qu il est moins sensible aux influences extérieurs. L EtG est un produit du métabolisme non oxydatif (réaction de phase II des voies métaboliques) de l alcool éthylique (éthanol). L EtG est un composé polaire et soluble dans l eau. Jusqu ici, mis à part l éthanol, on ne connaît aucune autre substance pouvant générer de l EtG après avoir été absorbée. C est pour cela que le dépistage d EtG dans les cheveux sert de marqueur direct de la consommation d alcool. La concentration d EtG mesurée dans les cheveux dépend de la quantité d alcool éthylique ingérée. La quantité d EtG incorporée dans les cheveux ne dépend pas de la couleur naturelle des cheveux, c.-à-d. que les cheveux blancs et pigmentés incorporent l EtG de la même manière. En revanche, le traitement cosmétique peut détruire ou éliminer une partie considérable de l EtG déjà incorporé. 3.2 Applications pour l analyse de l EtG dans les cheveux 3.2.1 Généralités La détermination de l EtG dans les cheveux a pour but de répondre aux questions suivantes: - Contrôle d une abstinence d alcool - Contrôle d une abstinence d alcool suite à un mésusage d alcool - Différentiation entre une consommation d alcool modérée et une consommation abusive 3.2.2 Analyse des cheveux pour les expertises de médecine du trafic Après retrait du permis de conduire à cause d un mésusage d alcool à risque pour la conduite automobile ou d une dépendance à l alcool, la personne concernée doit prouver qu elle a respecté une abstinence d alcool 1) sur une période de 6 mois en règle générale (mésusage d alcool à risque pour la conduite automobile) ou de 12 mois (pour dépendance à l alcool) avant que le permis de conduire ne puisse lui être restitué. Dans ce contexte, le tribunal fédéral suisse a confirmé un jugement qui s appuie sur l examen de cheveux pour contrôler une abstinence d alcool. A ce propos, un métabolite de l éthanol, l EtG, a été reconnu comme un marqueur adapté (décision du tribunal fédéral 6A.8/2007 du 1er mai 2007). La concentration d EtG dans les cheveux donne un résultat important pour l expertise d aptitude à conduire. Il faut néanmoins constater que l analyse de cheveux constitue un examen complémentaire qui doit toujours être évalué dans le contexte global, incluant l ensemble des aspects et résultats pertinents pour l expertise d aptitude à conduire.

Détermination de l éthylglucuronide (EtG) dans les cheveux Page 6 sur 10 4 PROCEDURE PRATIQUE 4.1 Prélèvement d échantillon Les particularités du prélèvement de cheveux pour des analyses toxicologiques et médicolégales, sont déterminées dans le document «Analyses médico-légales et toxicologiques des cheveux» rédigé par le groupe de travail «Analyse de cheveux» de la. 4.2 Phase préanalytique 4.2.1 Lavage Pour effectuer le lavage des cheveux, il est conseillé de rincer le segment de cheveu dans de l eau puis de le mélanger avec un détergent organique en le secouant ou l agitant fortement pendant quelques minutes. 4.2.2 Segmentation En règle générale, on est censé analyser des segments proximaux de cheveux, de 6 cm de longueur au maximum 2,3). Toutefois, il est recommandé d analyser des segments proximaux de cheveux de 3 à 5 cm de longueur. Si un changement significatif de la quantité d alcool consommé est invoqué pendant la période couverte par l analyse qui est fixée en fonction de la longueur du cheveu, il est recommandé 4,5) de faire une segmentation conforme aux indications de la personne participant à l examen en tenant compte de la vitesse moyenne de croissance des cheveux. 4.3 Méthodes 4.3.1 Préparation d échantillon Les échantillons de cheveux doivent être réduits en très petits morceaux et homogénéisés. Il est recommandé de pulvériser l échantillon de cheveux pour effectuer une extraction optimisée et standardisée. 4.3.2 Extraction Il est recommandé d utiliser de l eau pour extraire l éthylglucuronide de l échantillon de cheveux homogénéisé. Pour effectuer cela, il faut secouer ou agiter en permanence l échantillon de cheveux, ou le soumettre à une incubation de plusieurs heures à température élevée (par ex. 50 C), ou le soumettre à un traitement à ultrasons d au moins une heure. Selon la méthode d analyse, une dérivation ou une purification à l aide d une SPE peut ensuite s avérer nécessaire. 4.3.3 Détection Différentes méthodes de spectrométrie de masse (CPG-MS-NCI, CPG-MS/MS-NCI, LC-MS/MS) sont appropriées pour mesurer l EtG dans les cheveux. Jusqu ici, il n existe aucun procédé immunochimique présentant une sensibilité suffisamment élevée pour détecter l EtG dans les cheveux.

Détermination de l éthylglucuronide (EtG) dans les cheveux Page 7 sur 10 5 EXIGENCES ANALYTIQUES 5.1 Validation Le procédé analytique doit être validé conformément aux directives en vigueur. 5.2 Etalonnage Nous recommandons d effectuer l étalonnage à partir d échantillons de cheveux fortifiés en utilisant un étalon interne deutéré (EtG-D 5 ). Il faudrait atteindre une concentration 5 pg/mg pour le point d étalonnage le plus faible. 5.3 Contrôle de qualité 5.3.1 Contrôle de qualité interne Des contrôles de qualité internes effectués régulièrement et la documentation des résultats constituent la base permettant de montrer la fiabilité des résultats d analyse. Il est recommandé d effectuer au moins un contrôle négatif et un contrôle positif lors d une série de mesures. Les valeurs mesurées du contrôle positif doivent être consignées. Il faut utiliser des échantillons de cheveux réels pour effectuer le contrôle positif. D après notre expérience, l EtG dans les cheveux est stable, exception faite des influences environnementales dérangeantes. 5.3.2 Comparaisons interlaboratoires Les laboratoires des instituts suisses de médecine légale ont l obligation de participer une fois par an à un CIL organisé par la. Chaque année, un autre laboratoire est chargé de l organisation du CIL. 5.3.3 Contrôles de qualité internationaux Les laboratoires doivent participer à au moins un contrôle de qualité (test multicentrique) par an à l échelle internationale. Des tests multicentriques adaptés sont actuellement proposés par la SoHT et la GTFCh. 5.3.4 Incertitude de mesure Actuellement, l incertitude de mesure harmonisée pour la détermination de la concentration de l EtG dans le champ d application est de +/- 25%. Cette valeur a été calculée sur la base des résultats des enquêtes inter-laboratoires effectuées pour l EtG.

Détermination de l éthylglucuronide (EtG) dans les cheveux Page 8 sur 10 6 INTERPRETATION 6.1 Répartition de la consommation d alcool en catégories de risques Selon l OMS, on peut définir une répartition des dangers de longue durée relatifs à l alcool suivant les niveaux de danger faible, moyen et élevé, en se basant sur la consommation d alcool moyenne par jour 6). Selon cette définition internationale, le seuil de la Consommation d alcool à haut risque ou High-Risk Drinking est de 60 g d alcool par jour. La répartition dans des catégories de risques sert de valeur de référence et permet une comparaison du comportement de consommation entre différents pays. En utilisant le classement par catégories de risques, il faut remarquer que le risque n est pas le même pour tous les individus, mais qu il faut le considérer comme risque moyen pour une population. Il ne faut pas non plus en déduire que la consommation à faible risque est sans danger, d autant plus que la quantité d alcool consommée n est pas le seul critère d évaluation du danger. 6.2 Concentrations d EtG mesurées dans les cheveux Pour interpréter les concentrations d EtG mesurées dans les cheveux, on se sert essentiellement de trois catégories: 1) l abstinence; 2) la consommation modérée (degrés de risque faible et moyen au sens de l OMS); 3) la consommation abusive (degré de risque élevé au sens de l OMS). L interprétation des valeurs mesurées se rapporte aux consensus de la SoHT 2,3). Par conséquent, une valeur mesurée supérieure au seuil inférieur de décision de 7 pg/mg d EtG (mesuré sur des segments de cheveux proximaux de 3 à 6 cm de longueur) parle en faveur d une consommation d alcool modérée. Si la valeur mesurée d EtG est inférieure à ce seuil inférieur de décision, alors aucune preuve de consommation régulière d alcool n est apportée selon le niveau actuel des connaissances scientifiques. Lorsqu on ne peut pas dépister d EtG, alors le résultat ne contredit pas une abstinence déclarée. Les concentrations d EtG (mesurées sur des segments de cheveux proximaux de 3 à 6 cm de longueur) supérieures au seuil de décision supérieur de 30 pg/mg parlent en faveur d une consommation d alcool abusive. Echelle Interpretation EtG < LOD Ethylglucuronide non détecté: Le résultat ne contredit pas une abstinence. LOD EtG < 7 pg/mg Ethylglucuronide détecté: Le résultat ne fournit aucune preuve d une consommation régulière d alcool. 7 pg/mg EtG < 30 pg/mg Ethylglucuronide détecté: La valeur parle en faveur d une consommation d alcool modérée. EtG 30 pg/mg Ethylglucuronide détecté: La valeur parle en faveur d une consommation d alcool abusive.

Détermination de l éthylglucuronide (EtG) dans les cheveux Page 9 sur 10 6.3 Précisions sur la limite de détection et les seuils de décision La limite de détection (LOD en angl.) dépend de la méthode analytique et peut varier d un laboratoire à l autre. En outre, une adaptation supplémentaire de la limite de détection est envisageable à cause de l optimisation permanente des techniques analytiques. Par contre, les seuils de décision supérieurs et inférieurs (cut-off en angl.) représentent des seuils qui peuvent être définis aussi bien à partir de considérations analytiques que de considérations liées à l interprétation des résultats. Dans le futur, les seuils de décision peuvent être adaptés selon le résultat d études ou l optimisation de méthodes (amélioration de la sensitivité). 6.4 Indication des résultats Les valeurs mesurées 7 pg/mg doivent être indiquées à deux chiffres significatifs. Les valeurs mesurées supérieures à une concentration de 100 pg/mg sont mentionnées sous la forme > 100 pg/mg. Dans le rapport d analyses, il faut signaler que les valeurs mesurées sont sujettes à une incertitude de mesure ou présentent une marge d erreur. 6.5 Facteurs supplémentaires pour l interprétation 6.5.1 Cosmétiques pour cheveux En principe, on peut remarquer que la concentration d EtG dans les cheveux n est pas stable face à certaines influences environnementales, et qu elle peut être diminuée en particulier à cause de soins cosmétiques et/ou d un lavage intensif des cheveux. 6.5.2 Phénomène de persistance Le phénomène de persistance a été plusieurs fois décrit lors de l interruption de la consommation d une substance. Il décrit la possibilité de mettre en évidence dans les cheveux la présence d une substance malgré l arrêt de la consommation de celle-ci. La raison de la persistance de la présence d EtG dans les cheveux pendant quelques semaines après l arrêt de la consommation se trouve dans le cycle de croissance des cheveux. Lorsqu une mèche de cheveux est prélevée, il y a toujours une certaine proportion de cheveux en phase télogène (arrêt de croissance). Selon notre expérience le phénomène de persistance peut se produire suite à un arrêt brusque de la consommation abusive ou modérée d alcool ayant perduré longtemps. Dans une telle situation, on peut observer une diminution significative de la concentration d EtG dans le segment proximal, de l ordre d au minimum un facteur 3 (la plupart du temps entre 5 et 15, dépendant de la longueur du segment) par rapport au segment distal. Si de l EtG ne peut pas être mis en évidence dans un segment de cheveux proximal de 5 cm de longueur (EtG < LOD), alors on peut conclure à une abstinence de consommation d alcool durant les 6 derniers mois, en raison du phénomène de persistance. 6.5.3 Poils En principe, il vaut mieux privilégier les cheveux pour effectuer des analyses. S il n y a pas de cheveux à disposition, il est recommandé d utiliser des poils des bras, des jambes, de la barbe,

Détermination de l éthylglucuronide (EtG) dans les cheveux Page 10 sur 10 ou du torse. L absence d EtG dans des poils pubiens est compatible avec une abstinence de consommation d alcool, bien que les poils pubiens ne soient pas adaptés à l évaluation de la consommation d alcool. Selon notre expérience, les poils des aisselles ne sont également pas appropriés 8). Il est difficile de déterminer la longueur du matériel à étudier, quand il s agit de poils. On peut partir des poils les plus longs pour une première approximation. Pour l interprétation des résultats obtenus avec des poils, on peut utiliser les mêmes seuils de décision que ceux définis pour les cheveux. 7,8,9) Pour pouvoir estimer la période correspondante, il faut prendre en considération un pourcentage nettement plus important de poils en phase télogène et une cinétique de croissance différente 4). 7 REFERENCES 1) Handbuch der verkehrsmedizinischen Begutachtung Huber Verlag; 1. Auflage; 2005 (ISBN 978-3-456-84113-7) Manuel d expertise de médecine du trafic édition Huber; première édition 2) Use of Alcohol Markers in Hair for Abstinence Assessment 2012 (www.soht.org) [Utilisation de marqueurs d alcool dans les cheveux pour l évaluation de l abstinence 2012] 3) Consensus of the Society of Hair Testing on hair testing for chronic excessive alcohol consumption 2011 (www.soht.org) [Consensus de la Society of Hair Testing sur les essais de consommation excessive chronique d alcool sur des échantillons de cheveux 2011] 4) Pragst F. & Balikova MA., Clin Chim Acta. 2006 Aug;370(1-2):17-49. Epub 2006 Mar 6. 5) LeBeau MA et al., Forensic Sci Int. 2011 Jul 15;210(1-3):110-6. Epub 2011 Mar 6. 6) International Guide For Monitoring Alcohol Consumption And Related Harm, WHO/MSD/MSB/00.4, à partir de la page 51 [«Guide international de contrôle de la consommation d alcool et des nuisances correspondantes»] 7) Kerekes I. et. al., Alcohol Alcohol. 2009 Jan-Feb;44(1):62-6. Epub 2008 Nov 28. 8) Pirro V. et. al, Forensic Sci Int. 2011 Jul 15;210(1-3):271-7. Epub 2011 Apr 20. 9) Pianta A. et al, Alcohol and Alcoholism, 48, 3, 295 302, 2013 Note : ce document est une traduction du texte original publié en allemand qui fait foi