Spectrophotométrie d absorption http://www.youtube.com/watch?v=ximapwz5wsi
Spectrophotométrie Usage de la lumière pour mesurer une concentration Basée sur l absorption des radiations lumineuses L absorption de la lumière est proportionnelle à la concentration à certaines conditions Lumière monochromatique Une seule substance absorbante Solution diluée Appareil: spectrophotomètre
Spectre électromagnétique λ ν λ * ν = c c = vitesse de lumière (2.998 x 10 8 m/s)
Spectrophotométrie et les atomes Hg Na He H 2
La lumière comprend des particules d énergie discrète: le Photon Modèle de Bohr NB: plus la fréquence, ν, est élevée, plus son énergie est importante et plus la couleur tend vers le bleu (ie UV ) Modèle de Bohr: Émission de photons quand un électron saute d une orbite de plus haute énergie à une de plus basse énergie. L énergie de ce photon est un multiple entier (quantification) de la valeur hν, ou ν=c/λ ΔE=hν = hc/λ E: énergie de la radiation h: constante de Planck h = 6,626 10-34 J/s c: vitesse de la lumière c = 2,998 10 8 m/s, vide : longueur d onde
Hg Na He H Alors, chaque atome a son propre spectre d émission (et d absorption) particulier. Utilisé en chimie analytique et en astronomie pour l identification et la quantification des molécules.
Exemple Calculer la longueur d onde d une onde avec une fréquence de 5x10 14 Hz. Calculer énergie en joules d un photon de cette radiation. Calculer énergie d une mole de photon de cette radiation.
Spectre électromagnétique - révision ν énergie λ
Les couleurs du spectre visible (révision) absorbé détecté Les molécules absorbent certaines ondes de lumière et nos yeux détectent les ondes non absorbées (le complément).
Spectrophotomètre A = - logt A = log(i 0 /I) T=transmittance T=I/I o I o I I o : intensité de la lumière avant absorption I: intensité de la lumière après absorption
Sources de lumière Soleil l ensemble du spectre (continuum) Lumière incandescente ou décharge électrique dans un gaz (D 2 etc.) Une petite partie du spectre UV, visible et infrarouge (continuum) selon la source LASER Une seule longueur d onde (très limité)
Sources de lumière
Spectrophotomètre T = 10 -A A = - logt T=I/I o
Monochromateur Dispositif permettant de sélectionner une longueur d onde, au choix, dans l ensemble des longueurs d onde émises par la source prisme réseaux de diffraction interféromètre (e.g. FTIR) filtres divers...
Monochromateur
Spectrophotomètre T=I/I o
Porte-échantillon Petites cuves généralement rectangulaire, b= 1,00 cm Parfois cylindrique Labo: 1,16 cm En silice pure, SiO 2 (transparent dans l UV) I o I Transmittance (T) Absorbance (A) 1 cm T=10 -A
Des exemples Si A = 0, A T = I/I o T = 1 et I = I o Si A = 1, T = 10-1 et I/I o = 0,1 Si A = 0,005 T=10-0,005 = 0,989 ou, I = 0,989 I o 0 1 0,100 0,794 0,500 0,316 0,800 0,158 1 0,1 2,0 0,01
Porte-échantillon
Spectrophotomètre T=I/I o
Détecteur
Loi de Beer-Lambert Cette loi donne le lien quantitatif entre la substance qui absorbe la radiation et la quantité de radiation absorbée A = b [C] Absorbance Coefficient d absorption molaire/massique Chemin optique Concentration molaire/massi que
Étalonnage Choisir pour maximiser Abs La loi précédente décrit une variation linéaire de l absorbance, A, en fonction de la concentration 0 o o o + o o [C x ] concentration + : absorbance de la solution inconnue o : absorbances des solutions standards
Pourquoi y a-t-il absorption? Il faut une molécule avec un chromophore Chromophore: atome ou groupe d atomes d une molécule qui est responsable de l absorption de la lumière >C=O N=C=O Etc. En l absence de chromophore sur l analyte, on fait une réaction chimique (réaction de dérivation) pour en attacher un.
Chromophores
Pourquoi y a-t-il absorption? Énergie Antiliantes nonliantes liantes Les transitions... d électrons Dans une molécule, les électrons occupent des orbitales moléculaires,, n, *, * * Transition * * UV - lointain, intense Transition n * limite du visible, intensité moyenne n Transition n * UV et visible, faible intensité
Analyse d une protéine Protéine: macromolécule de MM > 5000 D Constituée d acides aminés attachés les uns aux autres par des liaisons peptidiques, -CO-NH Le chromophore n absorbe que dans l UV ( <320 nm) Beaucoup d interférences possibles Former un dérivé: méthode de Lowry Le dérivé est un complexe avec les ions de cuivre en milieu alcalin (ph élevé) suivi de la réduction d un complexe du réactif Folin-Ciocalteu couleur bleue
Étude de l absorbance Maximum d absorption: 540 nm Suivre la réaction de Lowry en fonction du temps: A vs temps Travail en milieu alcalin: voir qualitativement l effet du ph sur l absorbance: A vs ph
Au labo 1501 Préparer les solutions cinétique (valeurs nominales vs valeurs exactes ) Attention aux quantités de réactifs!!! Attention chauffage, préparation de l échantillon, agitation Spectrophotométrie Ajuster Ajuster le «0%» de transmission Ajuster le «100%» de T Propreté des cuvettes (éprouvettes) Examen attentif Usage de Kimwipes Traitement des données Graphiques: A vs t; A vs C pente calcul de, de [C x ]
ATTENTION Ne perdez pas votre temps à mettre le volume à un point exact (par exemple 0,00 ml). Toujours, lisez le volume initial/final précisément Calculer le volume total (V f V i = V tot )
Énergie Spectre électromagnétique faible 10 13 10 11 10 4 10 6 Radio AM Imagerie par rˇé sonance magnˇ étique é Radiofrˇ quences RMN 10 9 10 7 10 5 10 3 10 10 8 10 10 10 12 10 14 10 16 Micro-ondes Infra-rouge Visible (400-700 nm) Ultraviolet Radio FM, Tˇ élˇ é Tˇ élˇ éphone cellulaire Four micro-ondes, satˇ éllite lampe de chaleur lampe du soleil IR UV-vis 10-1 10 18 rayons-x Radiographie mˇ édicale élevée 10-3 10 20 rayons- / nm / Hz Type de radiation Application Spectroscopie (Adaptation. Source: A.B. Padias, Making the Connections, Hayden McNeil, 2007) 31
Spectroscopie infrarouge (IR) L énergie du rayonnement infrarouge ( =0.78-300 mm) est insuffisante pour exciter des transitions électroniques (telle qu en spectrophotométrie d absorption UV-vis). Ce sont plutôt des transitions vibrationnelles qui sont induites. (D après Skoog, West & Holler, Chimie analytique, 7è éd. De Boeck, 1997) 32
Spectre IR Un spectre infrarouge (4000 400 cm -1 ) est caractérisé par des pics d absorption étroits, très rapprochés, qui résultent de transitions entre les différents niveaux quantiques de vibration. Le nombre de modes de vibration d une molécule dépend du nombre de liaisons qu elle contient. Les pics servent à l identification des groupements fonctionnels (ex. C=O, NH, OH, etc.). 33
Aperçu des longueurs d'ondes d'absorption pour les molécules organiques ( cm ) 1 1 E c h Voir le tableau 6.1 à la page 62 du manuel de travaux pratiques pour le nombre d ondes de diverses liaisons chimiques 34
Une approche possible pour analyser un spectre IR Présence d un groupe carbonyle? (pic intense dans la région 1600-1850 cm -1 ) Si OUI et - Pic très large pour OH (3500-2000 cm -1 ) et C=O à ~1700 cm -1 : acide carboxylique RCOOH - Pic(s) intense(s) pour NH (3300-3500 cm -1 ) et C=O à ~1650 cm -1 : amide R-CO-N - C=O à ~1735 cm -1 et pic intense à ~1200 cm -1 : ester RCOOR - Deux pics intenses pour C=O à 1750-1850 cm -1 : anhydride - C=O à 1800 cm -1 et C-Cl (600-800 cm -1 ): chlorure d acide R-CO-Cl - C=O à ~1700 cm -1 et C-H à ~2800 cm -1 : aldéhyde R-CHO - Si seulement C=O à ~1700 cm -1 : cétone (D après A.B. Padias, Making the Connections, Hayden McNeil, 2007) Si NON et - Pic intense pour OH à ~3500 cm -1 : alcool ROH - Pic intense pour OH à ~3500 cm -1 et C=C à 1600 cm -1 : phénol - Pic(s) intense(s) pour NH (3300-3500 cm -1 ): amine - Pic intense à ~1200 cm -1 : éther - C=C à 1600 cm -1 et C-H à 3300 cm -1 : groupe aromatique - Pics faibles à 1650 cm -1 : alcène - Pic intense à ~2200 cm -1 : acétylène ou nitrile - Pic intense < 600 cm -1 : halogène C-X - Pic intense à 1560 et 1350 cm -1 : nitro - Si pas d autres pics: alcane 35