2.2 La thérapie génique

2.2 La thérapie génique La thérapie génique vise à remplacer un allèle mutant défectueux (gène) par un allèle fonctionnel afin que la cellule cible produise une protéine fonctionnelle ou à surexprimer une protéine dont l'activité aurait un impact thérapeutique. Elle vise aussi à faire produire à une cellule infectée ou cancéreuse, un signal qui conduirait à la mort cellulaire. Elle est basée sur la construction de vecteurs de transfert permettant l administration de gènes thérapeutiques aux cellules cibles du patient. La thérapie génique consiste donc à faire pénétrer des gènes dans les cellules ou les tissus d'un individu pour traiter une maladie. L utilisation à l'origine de la thérapie génique visait surtout à corriger les maladies héréditaires monogéniques, telles l'hémophilie (trouble de la coagulation sanguine) ou les myopathies (maladie neuromusculaire se traduisant par une dégénérescence du tissu musculaire), mais les espoirs suscités par cette nouvelle technique se sont vite répandus aux maladies acquises, telles les cancers ou la maladie de Parkinson. La thérapie génique en 4 étapes : 1. Isoler et cloner le gène d'intérêt thérapeutique. Les connaissances du génome humain permettent de réaliser cette étape sans difficulté. 2. Réaliser un vecteur Il est chargé d'amener le transgène dans le noyau cellulaire. Il est impossible d'introduire efficacement un gène directement dans une cellule humaine. Pour y arriver il faut se servir d'un véhicule, appelé un vecteur. La plupart des vecteurs utilisés sont des virus vu que l'évolution de ces derniers vise justement à atteindre ce but, soit celui de livrer leur matériel génétiquement dans les cellules ciblées. On utilise des virus qui sont transformés : toutes les séquences nécessaires à sa réplication et à sa pathogénicité sont ôtées. On laisse les gènes nécessaires à la formation de l enveloppe. Ainsi les vecteurs viraux génétiquement modifiés ne peuvent se reproduire ni infecter le patient. Comment procède-t-on en laboratoire pour produire des vecteurs viraux s'ils ont perdu la capacité de générer de multiples copies d'eux-mêmes? Les chercheurs ont créé des cellules spéciales qui contiennent tous les gènes viraux nécessaires à la production de particules virales vides. Ces cellules sont appelées des cellules d'encapsidation. Une cellule modifiée d'encapsidation exprime donc de façon stable les protéines virales formant la capside, l'enveloppe et la transcriptase inverse. Ces cellules ne produisent donc que des particules virales vides. 32

Figure 22 : Production de cellules d encapsidation L'introduction dans ces cellules d'une construction génétique contenant le génome viral porteur du gène thérapeutique conduit à la formation de particules virales complètes contenant le gène thérapeutique. Cette cellule sera donc capable de fabriquer des quantités de particules virales inoffensives mais contenant le gène thérapeutique. Figure 23 : Production de vecteurs viraux par les cellules d encapsidation Comment un virus ou un vecteur viral pénètre-t-il dans les cellules? a. Pour infecter une cellule, la particule virale se fixe d'abord à la membrane cellulaire. Les gènes viraux sont libérés dans le noyau et, qu'ils soient intégrés ou non au génome 33

cellulaire, ils utilisent la machinerie de réplication de la cellule pour produire de nouvelles particules virales. Ces dernières pourront aller infecter d'autres cellules. b. Lorsque le virus est modifié pour être utilisé comme vecteur de transfert, les gènes codant pour les protéines virales sont remplacés par le gène d'intérêt thérapeutique. Ce vecteur pénètre dans la cellule de la même façon que le virus naturel. Il permet la synthèse de la protéine d'intérêt thérapeutique, sans production de particules virales. 3. Administrer le vecteur selon un protocole La thérapie génique «ex vivo» (in vitro) : elle consiste à prélever sur le patient les cellules porteuses de gènes défectueux, à les cultiver, à les multiplier en cultures cellulaires et à les modifier génétiquement avec le vecteur viral porteur du gène d'intérêt thérapeutique, puis à les réintroduire chez le patient. Cette méthode est utilisée en particulier pour les cellules sanguines qui sont faciles à prélever et à réintroduire. La thérapie génique in situ : le vecteur de transfert est directement injecté au sein du tissu cible. La thérapie génique «in vivo» ou directe : elle consiste à injecter le vecteur portant le gène d'intérêt thérapeutique directement dans la circulation sanguine, celui-ci devant atteindre spécifiquement les cellules cibles. Figure 24 : Les différents protocoles 4. Vérifier l'intensité et la durée de l'expression du gène thérapeutique ainsi que les éventuels effets secondaires. Aujourd'hui, l'évolution de la thérapie génique repose essentiellement sur le développement de systèmes de transfert de gènes : ils doivent être sûrs, efficaces, spécifiques à un type cellulaire et capables de fonctionner dans des cellules qui ne se divisent pas en assurant la stabilité de l'expression du gène d'intérêt thérapeutique. De plus, leur production industrielle doit être fiable et rentable. 34

2.2.1 Les vecteurs Les vecteurs sont répartis en 2 catégories : 2.2.1.1 Les vecteurs viraux Ce sont des virus transformés : rétrovirus (pour les cellules de la moelle osseuses, en général pour les cellules qui se multiplient), adénovirus (pour les cellules des bronches, des muscles, du cerveau). Le virus doit d'abord être modifié pour qu'il ne provoque aucune infection, pour l'empêcher de se reproduire. On le modifie aussi en introduisant dans son génome le gène humain normal de la maladie que l'on veut traiter. On utilise les rétrovirus pour la méthode "ex vivo" et les adénovirus pour la méthode "in vivo". Les virus sont particulièrement efficaces pour délivrer leur information génétique (ADN ou ARN) dans des cellules spécifiques. Aujourd hui, approximativement 2/3 des protocoles cliniques des thérapies géniques utilisent un vecteur d origine virale. Les rétrovirus : Ce sont des virus dont le matériel génétique est de l'arn transcrit en ADN par la transcriptase inverse. Le rétrovirus amène le gène thérapeutique à l'intérieur du noyau de la cellule cible lors de la mitose et l'intègre dans le chromosome. Les adénovirus : Virus dont le matériel génétique est de l'adn double brin. L'adénovirus amène le gène thérapeutique dans le noyau de la cellule cible, qu'elle soit en mitose ou non. Par contre, le gène ne s'intègre pas au chromosome mais reste en position épisomale. Il a donc tendance à disparaître au fil des divisions cellulaires. L'élaboration d'un adénovirus porteur d'un gène éliminant les cellules tumorales semble prometteuse et des essais cliniques sont actuellement en cours pour essayer de traiter certains cancers. 35

Rétrovirus (ARN) Adénovirus (ADNdb) - Virus enveloppé - Virus nu - Transduction uniquement dans des Ȼ en mitose (moelle osseuse) - Transduction dans des Ȼ en mitose ou non (bronches, muscles, cerveau) - Taille du gène inséré limitée à 8Kb - Taille du gène inséré 30Kb - Transcriptase inverse ARN ADN - Transcriptase inverse - L ADN s incorpore au chromosome de la Ȼ hôte expression prolongée du gène inséré risque de mutation suite à une mauvaise insertion dans l ADN (ex : gène suppresseur de tumeur) cancer. - L ADN ne s intègre pas au chromosome mais reste dans le nucléoplasme expression transitoire du gène (15 jours maximum). - Faible immunogénicité, sauf réaction avec le complément (protéines de l enveloppe) - Forte immunogénicité administration de doses répétées impossible - Nombreux essais cliniques in vitro (= ex vivo) Exemple : «bébés bulles» - Essais in vitro et in vivo Tableau 2 : comparaison rétrovirus - adénovirus Trouvez les avantages et les inconvénients pour chaque type de virus. 2.2.1.2 Les vecteurs non viraux Il en existe deux classes principales : l ADN plasmidique (ADN nu) et les vecteurs synthétiques (ADN complexé à des lipides cationiques (positifs) ou ADN condensé par des polymères cationiques et inséré dans des liposomes). Ils sont peu immunogènes, ce qui autorise les administrations répétées, n ont pas de limite théorique quant à la taille du gène d intérêt. L'ADN nu (contenant la séquence thérapeutique) est injecté sous forme de plasmide (molécule circulaire) dans le tissu cible. Il est ensuite intégré dans les cellules par des mécanismes encore inconnus. 36

Avantages : facilité et faibles coûts de production, de stockage et de contrôle-qualité ; faible immunogénicité, efficacité clinique démontrée pour le traitement d'atrophie des vaisseaux sanguins d'un membre. Inconvénients : très courte durée d'expression dans la plupart des tissus, transduction inefficace in vitro et in vivo, difficultés pour en faire un vecteur plus spécifique. L'ADN nu est un vecteur prometteur pour les patients atteints de problèmes cardiovasculaires car il semble efficace pour transférer le gène promoteur de l'angiogenèse. De plus, il peut avoir un rôle de vaccin en transférant en faible quantité une portion de gène d'un parasite (exemple, Plasmodium falciparum, agent de la malaria). En créant une réaction immunitaire primaire faible, il permet une meilleure protection en cas d'infection réelle. Les liposomes : L'ADN est une molécule chargée négativement, d'où l'idée de la complexer avec des molécules chargées positivement (lipides ou autres polymères). On insère le gène thérapeutique compacté dans une sphère formée par une double membrane lipidique, le tout étant chargé positivement. Un liposome est donc une minuscule vésicule creuse de molécule lipidique capable de véhiculer de l ADN en elle. Ce liposome fusionne avec la membrane cellulaire après liaison aux protéines membranaires négatives et l'adn est intégré par endocytose en évitant toute dégradation extracellulaire. L'ADN doit ensuite sortir de l'endosome et échapper aux lysosomes pour atteindre le noyau. Pour améliorer leur efficacité, les scientifiques tentent d'intégrer certaines protéines virales dans les surfaces extérieures des liposomes, en particulier les protéines virales qui reconnaissent certaines molécules à la surface de la cellule hôte et s'y lient. Avantages : Facilité de production, contrôle qualité et stockage ; transfection efficace ex vivo ; faible réponse immunitaire, sécurité pour le patient (pas d effet secondaire). Inconvénients : Faible taux d'insertion de l'adn thérapeutique, transfection inefficace in vivo ; très courte durée d'expression. 2.2.2 Les méthodes physiques L'électroporation : de l'adn plasmidique est injecté dans le tissu cible (par exemple le muscle de la patte d'une souris) puis on applique 2 plaques d'acier contre la patte qui servent ainsi d'électrodes. On envoie ensuite des impulsions électriques répétées, en essayant de trouver les fréquences et intensité correspondant au meilleur transfert. En effet, cette méthode permet une transduction 100 fois plus efficace qu'une simple injection car elle rend la membrane momentanément poreuse et semble "attirer" l'adn vers l'intérieur de la cellule. Avantages : Transduction améliorée in vitro dans les cellules de la peau et de tumeurs chez la souris. Inconvénients : Cellules non viables à l'issue de cette méthode, un seul essai clinique. 37

Figure 25 : l'électroporation 2.2.3 Les applications Le premier cas de thérapie génique remonte à 1990 aux Etats-Unis, chez une fillette de quatre ans qui souffrait d une immunodéficience congénitale. Cette maladie est due à une anomalie d un gène qui code pour l enzyme adénosine désaminase (ADA). En l absence de cette enzyme, des produits de dégradation nocifs s accumulent dans le sang, ce qui entraîne la destruction de cellules importantes du système immunitaire. Toute infection devient alors potentiellement mortelle. Grâce à la thérapie génique, les enfants atteints ont pu être guéris. Toutefois, quelques-uns développèrent par la suite une leucémie, à la suite de quoi les traitements furent stoppés. Cet exemple montre à quel point il est important de peser soigneusement les avantages et les inconvénients avant toute thérapie génique. Depuis lors, les interrelations ont été analysées, et des améliorations ont été apportées au traitement. En décembre 1999, après des années de recherches et de doutes, est survenu le premier succès probant par l'équipe du professeur Alain Fischer de l hôpital Necker (Paris). En effet, des "enfants bulles" (vie dans un environnement stérile), c'est-à-dire atteints d'une grave maladie génétique du système immunitaire combinée sévère (DICS) liée au chromosome X (5 cas / 800'000 naissances), ont pu être soignés, par la thérapie génique. Cet essai consistait à prélever des cellules souches de la moelle des patients, d'y introduire un gène fonctionnel en laboratoire, puis de les réinjecter à ces mêmes patients. Ainsi, ces enfants étaient capables de se défendre contre les antigènes extérieurs par l'expression du gène introduit. Au cours des quinze dernières années, la thérapie génique a connu de nombreuses améliorations. On n en continue pas moins encore de chercher le taxi génétique idéal. L un des défis à relever porte sur l introduction des gènes thérapeutiques dans la cellule somatique. De plus, l intégration dans le génome ne doit pas retentir sur la fonction d un autre gène. Il existe aujourd hui des traitements qui réussissent en faisant appel à des taxis génétiques sans virus. Exemple : le traitement de la gangrène sénile. Dans cette maladie, les vaisseaux sanguins des jambes s obstruent, ce qui entraîne la nécrose des tissus. Dans le traitement par thérapie génique, on injecte directement dans le muscle un gène synthétisant un facteur de croissance de l endothélium vasculaire. Des études montrent que, grâce à ce type de thérapie génique, le nombre d amputations de la jambe qui étaient nécessaires a été divisé par deux. Jusqu à présent, quelques 6000 personnes ont été traitées à l échelle mondiale dans le cadre de projets de recherche menés avec des thérapies géniques. 38

Aujourd hui, la thérapie génique relève encore et seulement du domaine expérimental. On ne peut pour l'instant que parler de résultats en termes d'essais cliniques. Il y a de nombreux espoirs mis dans cette technique, mais il lui reste encore à faire ses preuves sur le long terme, aussi bien sur le plan technique que sur le plan éthique et législatif. 2.3 La Procréation Médicalement Assistée (PMA) La procréation médicalement assistée est l ensemble des méthodes permettant d induire une grossesse en dehors de l union naturelle de l homme et de la femme, en particulier l insémination artificielle, la fécondation in vitro avec transfert d embryons (FIVETE) et la fécondation par micro injection. Louise Brown, de nationalité britannique, née le 25 juillet 1978 est le premier «bébé éprouvette» au monde, c'est-à-dire conçu par fécondation in vitro (FIV). La naissance de Louise a ouvert un nouveau chapitre de la médecine relatif au traitement de la stérilité. Depuis cette naissance, les techniques de procréation médicalement assistée se sont banalisées. L'infertilité peut être définie comme «l'incapacité pour un couple de procréer ou de mener une grossesse à terme après un an ou plus de rapports sexuels réguliers non protégés». Dans le monde, on estime qu'un couple sur six est stérile. La prévalence de l'infertilité est pratiquement la même chez l'homme et chez la femme. Les troubles de l'ovulation sont la cause la plus courante d'infertilité féminine. Des anomalies anatomiques (trompes de Fallope bouchées, infectées..) comptent également pour une grande part des cas d'infertilité. Chez l'homme, ce sont les troubles de la production de spermatozoïdes qui constituent la cause la plus fréquente d'infertilité. Des obstructions anatomiques et des problèmes immunitaires sont également à l'origine de cas d'infertilité masculine. Pour la femme comme pour l'homme, les options de traitement varient en fonction du type d'infertilité diagnostiqué. Elles comprennent la thérapie médicamenteuse, la chirurgie et les techniques de procréation médicalement assistée (PMA). Les taux de succès des traitements sont fonction de divers facteurs essentiels, notamment, l'âge de la femme, la durée de l'infertilité du couple et l'existence de problèmes d'infertilité chez les deux partenaires. Parmi les femmes ayant suivi un traitement d'induction de l'ovulation (thérapie médicamenteuse), 80% conçoivent un enfant après plusieurs cycles de traitement. Les taux de réussite des techniques de PMA sont en constante progression depuis dix ans. Actuellement, on peut s'attendre à un taux de réussite d'environ 25% par cycle pour une fécondation in vitro pratiquée dans des conditions optimales ce qui correspond au taux naturel de réussite. 2.3.1 Les techniques 2.3.1.1 L insémination artificielle Cette technique (figure 26) consiste à injecter, à l aide d une pipette, les spermatozoïdes, recueillis après masturbation, directement dans l utérus, le jour de l ovulation. Dans les cas de stérilité masculine importante, l insémination peut se faire avec le sperme d un donneur. Figure 26 : L insémination artificielle 39

2.3.1.2 La Fécondation In Vitro Et Transfert d Embryon (FIVETE) La fécondation in vitro et transfert d embryon (figure 27), comme son nom l indique, va permettre de mettre en présence, hors de l utérus, des ovocytes de deuxième ordre et des spermatozoïdes. Cette technique permet de surveiller la fécondation. La femme subit un traitement hormonal qui va favoriser la maturation de plusieurs ovocytes II en même temps. Chez l homme, des spermatozoïdes sont recueillis par masturbation. Les ovocytes II sont prélevés et sont mis en présence des spermatozoïdes dans un tube ou une boite de culture. On surveille alors au microscope la fécondation de plusieurs ovocytes II : les œufs fécondés commencent à se diviser. Trois jours après le prélèvement des ovocytes II, les embryons sont injectés dans l utérus. En général, on en utilise trois ou quatre afin d augmenter les chances que l un d eux aboutisse à une grossesse. Les ovules imprégnés en trop peuvent être congelés pour être réutilisés. Le taux de réussite de cette technique est d environ 25 %. Figure 27 : La fécondation in vitro et transfert d embryon 2.3.1.3 La fécondation par micro injection L Intra Cytoplasmic Sperm Injection (ICSI) ou fécondation par micro injection (figure 28) est une technique récente. Elle ressemble à la FIVETE, sauf que cette fois, on injecte directement, à l aide d une micro pipette, le spermatozoïde dans l ovocyte de deuxième ordre. On est sûr ainsi qu il y a fécondation. Cette technique est utilisée lorsqu il y a un trop petit nombre de spermatozoïdes dans le sperme pour que la fécondation se réalise. S il n y en a pas du tout, on peut même aller les prélever directement dans les canaux génitaux masculins et les testicules. Le taux de réussite de cette technique est d environ 25%. Figure 28 : La fécondation par micro injection 40

La PMA pose des problèmes beaucoup plus généraux tels que le diagnostic préimplantatoire, les embryons surnuméraires, le clonage humain. Actuellement, les techniques de PMA ne sont pas optimales et c'est pourquoi il existe des taux d'échecs non négligeables. La recherche sur les embryons surnuméraires permettrait : - une optimisation du diagnostic préimplantatoire. Cette technique est autorisée alors qu'elle n'est pas optimale. Des recherches permettraient donc de rendre vraiment fiable cette méthode afin d'implanter in utero des embryons viables. - une amélioration de la réimplantation des embryons. En effet cette technique ne connaît pas un bon taux de réussite. Les chercheurs souhaiteraient donc faire des travaux sur différents milieux pour l'améliorer. Cela permettrait de réimplanter moins d'embryons in utero et de réduire ainsi les grossesses multiples. La loi CH sur la PMA se trouve sur le lien suivant : www.admin.ch/ch/f/as/2000/3055.pdf 41