DE L ENANTIOSELECTIVITE DES LIPASES

THESE présentée devant L'INSTITUT NATINAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE TULUSE en vue de l obtention du DCTRAT DE L UNIVERSITE DE TULUSE Spécialité: Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries Filière : Microbiologie et Biocatalyse industrielle par Sophie PUECH-GUENT DEVELPPEMENT D UN MDELE PREDICTIF DE L ENANTISELECTIVITE DES LIPASES Soutenue le 20 décembre 2007 devant la commission d examen Mme Laure LANDRIC-BURTIN Mme Magali REMAUD-SIMEN Mr Frédéric CARRIERE Mr Rolf D. SCHMID Mr Pierre MNSAN Mr Didier CMBES Ingénieur, sanofi-aventis, Vitry-sur-Seine Professeur, INSA, Toulouse Directeur de Recherche, CNRS, Marseille Professeur, Université de Stuttgart Professeur, INSA, Toulouse Professeur, INSA, Toulouse Cette thèse a été préparée au laboratoire d'ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés (UMR CNRS 5504, UMR INRA 792) de l'insa de Toulouse dans le cadre de l'ecole Doctorale SEVAB.

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NM : PUECH-GUENT Prénom : Sophie Titre : Développement d un modèle prédictif de l énantiosélectivité des lipases. Spécialité: Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries, Filière : Microbiologie et Biocatalyse industrielle Année : 2007 Lieu : INSA de Toulouse N d ordre : 921 RESUME : L étude a porté sur le développement d un modèle prédictif de l énantiopréférence de la lipase de Burkholderia cepacia ATCC 21808 et plus particulièrement sur la relation pouvant exister entre l accessibilité au site actif des énantiomères dérivés du (R,S)-α-bromo-phényl acétate d éthyle et l énantiosélectivité. Une approche mixte, couplant des techniques de modélisation moléculaire classiques à de nouvelles techniques algorithmiques de planification de mouvements issues de la robotique, a été utilisée pour modéliser les trajectoires de différents esters dérivés de l α-bromo-phényl acétate d éthyle. Les résultats obtenus in silico ont montré que les recherches de trajectoires sont plus rapides avec l énantiomère (R) qu avec l énantiomère (S) pour 7 substrats synthétisés par voie chimique. De manière qualitative, ces résultats corrèlent avec l énantiosélectivité de l enzyme, obtenue expérimentalement, indiquant que celle-ci pourrait être associée à une plus ou moins grande difficulté d accès. De plus, l analyse des trajectoires a permis d identifier des cibles privilégiées de mutagénèse (points de collision fréquemment rencontrés pour tous les substrats) parmi lesquels trois positions ont été retenues : Leu-17, Val-266 et Leu-287. Afin de générer et caractériser ces mutants ponctuels, un système d expression recombinante de la lipase de B. cepacia chez E. coli et un protocole de purification par chromatographie d affinité ont été développés. Les gènes lip et hp codant respectivement pour la lipase et sa protéine chaperonne ont été clonés dans différents vecteurs d expression sous le contrôle de différents promoteurs. Le plus haut niveau d activité lipase sous forme soluble jamais décrit dans la littérature concernant cette enzyme a été obtenu en utilisant le vecteur pflag-ats sous le contrôle du promoteur tac (6679 U/L culture ). Les mutants ponctuels ont été construits par mutagénèse dirigée en remplaçant chaque position par les 19 autres acides aminés possibles. Les mutants V266, présentant les plus hautes activités lipase lors d un crible au para-nitrophényl butyrate, ont été sélectionnés dans un premier temps afin de mesurer leurs énantiosélectivités lors de l hydrolyse de l α-bromo phényl acétate de 2-chloro éthyle. Parmi ces mutants, le V266G, présente une inversion d énantiosélectivité en faveur de l énantiomère (S) (E=18). L absence de chaîne latérale de la glycine diminue l encombrement stérique au niveau de la position 266 permettant ainsi à l énantiomère (S) soit d accéder plus facilement au site catalytique, soit de mieux se positionner pour former l intermédiaire tétraédrique. En parallèle, un protocole de production de la lipase de B. cepacia à l échelle microplaque a été développé et validé sur la banque de mutants V266, afin de disposer, à terme, d un outil de criblage pour de plus larges banques de mutants créées par évolution dirigée. MTS CLES : Lipase de Burkholderia cepacia ; modélisation moléculaire ; algorithmes de planification de mouvements ; expression recombinante chez E. coli ; mutagénèse dirigée ; énantiosélectivité ; production à l échelle microplaque. 3

JURY : Mme Laure LANDRIC-BURTIN Mme Magali REMAUD-SIMEN Mr Frédéric CARRIERE Mr Rolf D. SCHMID Mr Pierre MNSAN Mr Didier CMBES Ingénieur, sanofi-aventis, Vitry-sur-Seine Professeur, INSA, Toulouse Directeur de Recherche, CNRS, Marseille Professeur, Université de Stuttgart Professeur, INSA, Toulouse Professeur, INSA, Toulouse Cette thèse a été préparée au laboratoire d'ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés (UMR CNRS 5504, UMR INRA 792) de l'insa de Toulouse et soutenue le 20 décembre 2007. 4

PUBLICATINS Small-scale production of Burkhoderia cepacia ATCC21808 lipase adapted to high throughput screening. Puech-Guenot S., Lafaquière V., Guieysse D., Landric-Burtin L., Monsan P., Remaud- Siméon M. (2007). Acceptée dans Journal of Biomolecular Screening. A structure-controlled lipase enantioselectivity investigated by a path planning approach. Guieysse D., Cortés J., Barbe S., Lafaquière V., Puech-Guenot S., Monsan P., Siméon T., André I., Remaud-Siméon M. (2007). Soumise à ChemBioChem. PSTERS Building a predictive model of Burkholderia cepacia lipase enantioselectivity. Guenot S., Guieysse D., Rissom S., Monsan P., Remaud-Siméon M. (2004). International Congress on Biocatalysis 2004, Université technologique de Hambourg, Allemagne. Building a predictive model of Burkholderia cepacia lipase enantioselectivity. Guenot S., Guieysse D., Cortés J., Landric-Burtin L., Monsan P., Siméon T., Remaud- Siméon M. (2006). 21 ème Colloque du Club Bioconversions en Synthèse rganique, Ax-lesthermes, France. Towards a predictive model of Burkholderia cepacia lipase enantioselectivity using a robotic-based path planning approach. Barbe S., Lafaquière V., Guenot S., Guieysse D., Cortés J., Siméon T., Monsan P., André I., Remaud-Siméon M. (2007). Groupe de Graphisme et Modélisation Moléculaire, L Escandille, France. CMMUNICATINS RALES Building a predictive model of Burkholderia cepacia lipase enantioselectivity. (2005). Journées de thèse sanofi-aventis, Lalondes-les-Maures, France. Détermination d un modèle prédictif de l énantiosélectivité des lipases. (2006). XXIIème Journée Chimie-Biologie, Université Paul Sabatier, Toulouse, France. Building a predictive model of Burkholderia cepacia lipase enantioselectivity. (2006). 21 ème Colloque du Club Bioconversions en Synthèse rganique, Ax-les-thermes, France. 5

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SUMMARY 4 The study focused on the development of a predictive model of Burkholderia cepacia ATCC 21808 lipase enantioselectivity and more specifically on the relationship that may exist between enantioselectivity and the accessibility to the active site of (R/S)-α-bromo phenyl acetic acid ethyl ester derivatives. A mixed approach, combining molecular modelling techniques and path planning algorithms issued from robotics research, was used to compute the geometrically allowed trajectories of various α-bromo phenyl acetic acid ethyl ester derivatives. In silico results indicated that the pathways are computed faster for the (R) enantiomer than the (S) enantiomer for 7 substrates synthesized by chemical synthesis. These results are in qualitative agreement with the enzyme enantioselectivity experimentally determined, indicating that enantioselectivity could be associated with a greater or lesser difficulty of access. In addition, the analysis of trajectories allowed to identify targets for mutagenesis (collision points frequently encountered for all substrates), amongst which three positions were selected: Leu-17, Val-266 and Leu-287. In order to generate and characterize these rational mutants, a recombinant expression system of B. cepacia lipase in E. coli and a purification protocol by affinity chromatography have been developed. Genes lip and hp encoding respectively for the lipase and its chaperone protein were cloned in different expression vectors under the control of different promoters. The highest level of lipase activity in soluble form ever described in the literature for this enzyme was obtained by using the vector pflag-ats under the control of the tac promoter (6679 U / L culture ). Rational mutants were constructed by site-directed mutagenesis by replacing each position by the 19 other possible amino acids. Mutants V266, displaying the highest lipase activities in screening with para-nitrophenyl butyrate, were selected to measure their enantioselectivity during hydrolysis of the (R,S)- α-bromo phenyl acetic acid 2-chloro ethyl ester. Among these mutants, V266G displayed an inverted enantioselectivity in favour of the (S)-enantiomer (E=18). The absence of side chain in glycine decreases the steric hindrance at position 266, allowing thus the (S)-enantiomer to (a) access more easily to the catalytic site or (b) adopt a more easily productive conformation in order to form the tetrahedral intermediate. In parallel, a protocol for the production of B. cepacia lipase at microplate scale has been developed and validated on the library of V266 mutants, in order to dispose of a screening tool for larger mutants libraries created by directed evolution. KEYWRDS : Burkholderia cepacia lipase ; molecular modelling ; path planning algorithms ; E. coli recombinant expression; site-directed mutagenesis ; enantioselectivity ; production at microplate scale. 7

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A mon mari, livier 9

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Dans les sciences, le chemin est plus important que le but Erwin Charagff 11

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Et voilà, 4 années sont passées et la thèse est (enfin!) finie. Une thèse, ce n est pas qu un travail scientifique, c est aussi et surtout une période pleine de moments émouvants, de souvenirs, et de rencontres J espère trouver les mots justes pour remercier toutes les personnes qui m ont accompagnée tout au long de cette aventure, en espérant n oublier personne Si c est le cas, mille excuses : il y a peut-être des oublis sur le papier mais pas dans l esprit! Je voudrais tout d abord remercier la société sanofi-aventis qui a financé ces travaux de thèse, et en particulier Laure Landric-Burtin. Laure, lorsque j ai franchi pour la première fois la porte de ton bureau pour passer un entretien de stage, j étais loin de me douter que cela me conduirait aussi loin! Merci pour le soutien et la confiance sans cesse renouvelée dont tu as fais preuve à mon égard Petit clin d œil à Elisabeth, qui a dû me supporter en tant que stagiaire puis en tant que chef! Je crois avoir trouvé en vous deux des amies qui m ont aidé aussi bien dans le travail que dans la vie lorsque j en avais besoin J ai été très sensible à l honneur que m ont fait Rolf D. Schmid et Frédéric Carrière en acceptant d être les rapporteurs de ce travail de thèse. Je les remercie vivement pour les échanges constructifs que nous avons eus le jour de la soutenance ainsi que pour la qualité de leurs remarques sur le manuscrit. Merci également à Didier Combes pour avoir présidé mon jury de thèse. Merci à mes deux directeurs de thèse : Pierre et Mag. A Pierre pour m avoir accueilli au sein de son équipe et fait découvrir le monde merveilleux des enzymes. Et à Mag pour son enthousiasme contagieux et sa rigueur scientifique. Merci à David, sans qui la modélisation moléculaire serait restée un grand mystère de l univers Et merci à Alain pour tous nos échanges et à qui je rappelle qu il me doit un gâteau au chocolat! A Vincent, qui m a accompagné dans ma dernière ligne droite, que dis-je supporté! Pour toutes nos découvertes scientifiques et nos fous rires, un grand merci. Merci à tous «Les Enzymos»! Je n oublierais jamais les pauses à la Cafét, les débats enflammées dans le labo la pipette à la main, les moments de joies partagés et les peines consolées Aujourd hui, en écrivant ces mots, j ai une pensée pour chacun d entre vous. A Cox, Mag, Nan et Dodie, mes «sœurs», rencontrées sur les bancs de la fac il y a de cela bien longtemps malgré nos chemins différents, aujourd hui c est la même amitié qui nous lie encore. A mon mari livier, merci pour ton soutien indéfectible et plus encore pour l amour que tu m as démontré pendant toutes ces années. Tu as toujours été là pour partager les moments de joies, écarter les doutes, et soigner les blessures Enfin, mes dernières pensées iront à mon petit garçon, Noah, mon plus beau combat 13

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Sommaire 15

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SMMAIRE SMMAIRE... 15 INTRDUCTIN... 21 CHAPITRE I: ETUDE BIBLIGRAPHIQUE...27 1. MLECULES CHIRALES...29 1.1 DEFINITIN...29 1.2. INTERETS DES MLECULES CHIRALES...30 1.2.1. L activité biologique...30 1.2.2. Production de molécules énantiomériquement pures : un marché en pleine expansion...32 1.3. LES ACIDES 2-SUBSTITUES...33 2. BTENTIN DE MLECULES ENANTIMERIQUEMENT PURES...35 2.1. PRECURSEURS CHIRAUX...35 2.2. SYNTHESES ASYMETRIQUES...36 2.3. DEDUBLEMENT DE MELANGES RACEMIQUES...37 2.3.1. Cristallisation préférentielle...38 2.3.2. Cristallisation de sels de diastéréoisomères...38 2.3.3. Séparation par chromatographie...39 2.3.4. Dédoublement cinétique...40 3. DEDUBLEMENT DE MELANGES RACEMIQUES CATALYSES PAR LES LIPASES...43 3.1. LES LIPASES...43 3.1.1. Les réactions catalysées par les lipases...43 3.1.2. Caractéristiques structurales...44 3.1.3. Mécanisme d action catalytique...48 3.2. ENANTISELECTIVITE...49 3.2.1. Détermination de l énantiosélectivité...49 3.2.2. Analyse thermodynamique de l énantiosélectivité...52 3.3. FACTEURS INFLUENÇANT L ENANTISELECTIVITE...53 3.3.1. Influence des paramètres réactionnels...53 3.3.2. Influence des interactions moléculaires enzyme / substrat...56 3.4. AMELIRATIN DE L ENANTISELECTIVITE...59 3.4.1. L approche rationnelle...60 3.4.2. L approche aléatoire...61 3.4.3. Les techniques semi-rationnelles...65 4. LIPASE DE BURKHLDERIA CEPACIA ATCC21808 (BCL)...67 4.1. RIGINE...67 4.2. CARACTERISTIQUES STRUCTURALES...68 4.2.1. Généralités...68 4.2.2. Pont disulfure et site de liaison au calcium...69 4.2.3. Topographie du site actif...72 4.3. ETUDE DE L ENANTISELECTIVITE DE BCL...73 4.3.1. Cas du dédoublement des acides 2-substitués...74 4.3.2. L accessibilité du substrat au site actif : un paramètre qui contribute à l énantiosélectivité?...79 5. INGENIERIE DE LA LIPASE DE BURKHLDERIA CEPACIA ATCC21808...86 5.1. PRDUCTIN CHEZ L RGANISME NATUREL (PRDUCTIN HMLGUE)...86 5.1.1. Les protéines Lifs...86 5.1.2. Mécanisme de sécrétion...88 5.2. PRDUCTIN SUS FRME RECMBINANTE (PRDUCTIN HETERLGUE)...89 5.2.1. Production chez Escherichia coli...89 5.2.2. Repliement in vitro...91 5.3. PURIFICATIN...91 17

SMMAIRE 5.3.1. Techniques de purification des lipases...91 5.3.2. Purification des lipases de type Pseudomonas et Burkholderia...92 CHAPITRE II : MATERIELS ET METHDES...95 1. CULTURES DE MICRRGANISMES...97 1.1. SUCHES...97 1.2. VECTEURS...97 1.3. CNDITINS DE CULTURES...99 1.4. CNSERVATIN DES SUCHES...99 1.5. PREPARATIN DE CELLULES CHIMICMPETENTES...99 2. TECHNIQUES DE BILGIE MLECULAIRE... 100 2.1. EXTRACTIN D ADN PLASMIDIQUE... 100 2.2. DIGESTIN ET VISUALISATIN DE L ADN, PURIFICATIN DES FRAGMENTS DIGERES... 101 2.3. LIGATURES... 101 2.4. CNDITINS D AMPLIFICATIN PAR PCR DE LA LIPASE DE B. CEPACIA... 102 2.4.1. Construction des plasmides d expression de la lipase de B. cepacia... 102 2.4.2. Constructions des mutants ponctuels par mutagénèse dirigée... 103 2.5. TRANSFRMATIN DES CELLULES CMPETENTES... 108 2.6. ANALYSES DES SEQUENCES... 108 3. PRDUCTIN DE PRTEINES RECMBINANTES... 109 3.1. PRDUCTIN EN FILE D ERLENMEYER... 109 3.1.1. Cassage des cellules par choc osmotique... 109 3.1.2. Cassage des cellules avec du cocktail de lyse... 110 3.2. PRDUCTIN EN FRMAT MICRPLAQUES... 111 3.2.1. Constitution des microplaques stock... 111 3.2.2. Conditions de culture en format microplaque... 111 3.3. ANALYSES DES PRTEINES PAR ELECTRPHRESE... 112 3.3.1. Gels NuPage Bis-Tris 10%Novex... 112 3.3.2. Coloration des protéines totales au Bleu Colloïdal... 113 3.3.3. Western Blot... 113 4. PURIFICATIN DE DE LA LIPASE DE B. CEPACIA...114 4.1. TAMPNS UTILISES... 115 4.2. PREPARATIN DE LA RESINE... 115 4.3. PRTCLE DE PURIFICATIN DE LA LIPASE DE B. CEPACIA... 116 4.4. REGENERATIN ET STCKAGE DE LA RESINE... 116 5. REACTINS ENZYMATIQUES...116 5.1. HYDRLYSE ENZYMATIQUE... 117 5.1.1. Hydrolyse du para-nitrophényl butyrate (pnpb)... 117 5.1.2. Hydrolyse du (R,S)-α-bromo-phényl acétate de 2-chloro éthyle... 118 5.2. SYNTHESE ENZYMATIQUE... 118 5.2.1. Dosage et équilibre de l activité de l eau : aw... 118 5.2.2. Synthèse enzymatique : réaction de transestérification... 119 6. METHDES ANALYTIQUES...119 6.1. DSAGE DES PRTEINES... 119 6.2. ANALYSES PAR CHRMATGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFRMANCE (CLHP)... 120 7. DETERMINATIN DES EXCES ENANTIMERIQUES ET DE L ENANTISELECTIVITE... 120 7.1. DETERMINATIN DES EXCES ENANTIMERIQUES... 120 7.2. DETERMINATIN DE L ENANTISELECTIVITE: E... 121 18

SMMAIRE 8. MDELISATIN MLECULAIRE...121 8.1. CHAMPS DE FRCE CFF91... 121 8.2. ALGRITHME DE MINIMISATIN STEEPEST DESCENT... 123 8.3. MDELISATIN DES INTERMEDIAIRES TETRAEDRIQUES... 123 8.3.1. Construction de la structure protéique... 124 8.3.2. Construction de l intermédiaire tétraédrique : recherche des conformations de basse énergie... 127 8.3.3. Arrimage des intermédiaires dans la lipase découpée... 129 8.3.4. Minimisation des complexes enzyme/substrat... 130 8.4. CALCUL DES TRAJECTIRES DES ENANTIMERES... 131 CHAPITRE III : EVALUATIN IN SILIC DU RLE DE L ACCES DU SUBSTRAT AU SITE ACTIF DE LIPASE DE B. CEPACIA PAR UNE APPRCHE RBTIQUE... 133 1. INTRDUCTIN... 135 2. DEDUBLEMENT DE DIFFERENTS ACIDES RACEMIQUES 2-SUBSTITUTES... 137 3. CALCUL DE L ACCESSIBILITE DU SUBSTRAT VIA LES TRAJECTIRES D ACCES/SRTIE... 138 4. ANALYSES DES TRAJECTIRES D ACCES/SRTIE DES SUBSTRATS...141 5. CARTGRAPHIE DES CLLISINS: UN UTIL PUR L INGENIERIE DES ENZYMES... 145 6. CNCLUSIN... 148 CHAPITRE IV : PRDUCTIN ET PURIFICATIN DE LA LIPASE DE B. CEPACIA...151 1. INTRDUCTIN... 153 2. PRDUCTIN DE BCL VIA LE PLASMIDE DE REFERENCE PT-MPA-LIP-HP... 154 2.1. DESCRIPTIN DE LA CNSTRUCTIN... 154 2.2. EXPRESSIN RECMBINANTE DE BCL VIA LE PLASMIDE DE REFERENCE PT-MPA-LIP-HP... 155 3. PRDUCTIN DE BCL VIA LES VECTEURS PBAD... 158 3.1. PLASMIDE PBAD-MPA-LIP-HP... 158 3.2. PLASMIDE PBAD-THI-MPA-LIP-HP... 158 3.2.1. Influence de la température de culture... 159 3.2.2. Influence de la concentration en inducteur (L-arabinose)... 161 4. PRDUCTIN DE BCL A PARTIR DES PLASMIDES PET ET PFLAG... 163 4.1. CHIX ENTRE LES PLASMIDES PET ET PFLAG... 163 4.2. PTIMISATIN DES CNDITINS D EXPRESSIN DU PLASMIDE PFLAG-ATS-LIP-HP... 164 5. PURIFICATIN DE LA LIPASE BCL RECMBINANTE PAR CHRMATGRAPHIE D AFFINITE... 166 6. CNCLUSIN... 168 CHAPITRE V : ETUDE PRELIMINAIRE DES MUTANTS PNCTUELS : CARACTERISATIN DE L ENANTISELECTIVITE...171 1. INTRDUCTIN... 173 2. STRATEGIE DE MUTAGENESE... 174 2.1. LCALISATIN DES CIBLES DE MUTAGENESE... 174 2.2. CHIX DE LA TECHNIQUE DE MUTAGENESE... 176 3. DETERMINATIN DE L ACTIVITE LIPASE ET DE L ENANTISELECTIVITE DES MUTANTS PNCTUELS... 177 3.1. DETERMINATIN DE L ACTIVITE LIPASE DES MUTANTS PNCTUELS... 177 3.2. CARACTERISATIN DE L ENANTISELECTIVITE DES MUTANTS PNCTUELS SUR LA PSITIN 266180 4. PRDUCTIN DE BCL A L ECHELLE MICRPLAQUE... 185 4.1. PTIMISATIN DES CNDITINS DE CULTURE PUR L EXPRESSIN DE BCL EN FRMAT 96-PUITS... 185 4.2. VALIDATIN DU PRTCLE DE PRDUCTIN RECMBINANTE DE BCL EN DEEPWELL SUR UNE BANQUE DE MUTANTS... 189 19

SMMAIRE 5. CNCLUSIN...191 CNCLUSIN GENERALE... 193 REFERENCES BIBLIGRAPHIQUES... 201 ANNEXES... 235 SEQUENCE NUCLETIDIQUE ET PRTEIQUE DE LA LIPASE DE B. CEPACIA ATCC21808 ET DE SA PRTEINE CHAPERNNE HP... 237 LISTE DES ABREVIATINS... 239 TABLES DES ILLUSTRATINS... 241 TABLE DES FIGURES... 243 TABLE DES TABLEAUX... 245 20

Introduction 21

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INTRDUCTIN Une des caractéristiques du monde vivant est qu il n est pas symétrique. En effet, la plupart des molécules intervenant dans la constitution de la cellule telles que les sucres ou les acides aminés sont des molécules chirales, images l une de l autre dans un miroir et non superposables. L asymétrie, essentielle pour la cellule et son métabolisme, intervient ainsi de manière déterminante dans la plupart des phénomènes de reconnaissance moléculaire ou de transmission de signal biologique. Ainsi, de nombreux médicaments sont des composés chiraux. Pourtant, depuis la découverte du concept de chiralité par Louis Pasteur en 1850, les médicaments chiraux d origine synthétique ont été produits pendant plus d un siècle sous la forme de mélanges racémiques, mélanges en proportions égales des deux énantiomères. A l époque, il était considéré qu au pire l un des deux énantiomères était moins efficace. Cela ne justifiait en rien son élimination qui, au contraire, n aurait fait qu accroître les coûts de production. Depuis l affaire de la thalidomide, un anti-nauséeux commercialisé sous forme racémique dont l un des énantiomères s est malheureusement avéré tératogène, le danger lié à la commercialisation du mélange d énantiomères doit être écarté. Dans ce contexte, l accès à des molécules chirales représente un enjeu majeur pour l industrie pharmaceutique (Breuer et coll., 2004 ; Carey et coll., 2006). Selon les données publiées par Technology Catalyst International, (Erb, 2006), les ventes de médicaments optiquement purs étaient de 225 milliards d euros en 2005, représentant ainsi 37% du marché de l industrie pharmaceutique. La séparation des énantiomères a toujours été considérée comme l un des problèmes les plus difficiles en chimie. Le recours à des catalyseurs enzymatiques apparaît clairement comme une alternative très prometteuse (Paetzold et Backwall, 2005 ; Gotor-Fernandez et coll., 2006 ; Liljeblad et Kanerva, 2006 ; sborne et coll., 2006 ; Ghanem, 2007). La séparation est fondée sur le dédoublement cinétique du mélange racémique. L enzyme lorsqu elle est énantiosélective réagit en effet plus rapidement avec l un des énantiomères qu avec l autre. Concernant le dédoublement d esters racémiques, la plupart des procédés envisagés reposent sur l utilisation de lipases, protéases ou estérases catalysant des réactions d hydrolyse ou de synthèse. Ces enzymes, généralement utilisées comme additifs pour les détergents ou dans l industrie agro-alimentaire sont disponibles en grandes quantités et à moindre coût. 23

INTRDUCTIN En outre, par rapport aux autres hydrolases, les lipases qui, en milieu aqueux, catalysent l hydrolyse d une ou plusieurs liaisons esters des triacylglycérols, sont très fréquemment employées en milieu organique dans les procédés de dédoublement de mélanges racémiques d alcools, d acides, ou d amines, du fait de leur stabilité (Bornscheuer et Kazlauskas, 1999). Le dédoublement cinétique catalysé par les lipases n est pas encore parfaitement compris. Mieux appréhender les phénomènes qui gouvernent la stéréosélectivité de ces catalyseurs devient crucial pour étendre leurs applications et faciliter leurs usages. Avec l essor de la génomique et de la génomique structurale, de plus en plus d enzymes sont potentiellement disponibles pour catalyser le dédoublement cinétique d un mélange racémique donné. De plus, les techniques d ingénieries rationnelle ou combinatoire des protéines permettent d améliorer très significativement les performances des catalyseurs enzymatiques et en particulier la stéréosélectivité. Il reste, néanmoins, que le choix du catalyseur pour le dédoublement nécessite dans tous les cas un criblage préalable qui peut être long et coûteux. Pour éviter cette étape, la compréhension à l échelle moléculaire de l énantiosélectivité enzymatique et le développement de techniques de modélisation moléculaire efficaces permettant d évaluer rapidement l énantiosélectivité et/ou de guider l ingénierie des enzymes représente un intérêt majeur. En particulier, l industrie pharmaceutique est en attente de ce type de méthodes qui pourraient être employées à des fins prédictives pour sélectionner le catalyseur le plus approprié pour le dédoublement. Cela permettrait, à terme, d accélérer la production de molécules chirales et de diminuer leurs coûts de développement. C est dans ce contexte que s inscrivent nos travaux en collaboration avec la société sanofiaventis. Ils ont pour objectif d explorer une nouvelle approche couplant la modélisation moléculaire à des techniques algorithmiques de planification de mouvements pour étudier voire prédire l énantiosélectivité des lipases et proposer des cibles de mutagénèse visant à améliorer cette dernière. Notre modèle d étude est le dédoublement d acides racémiques 2-substitués, tels que le (R,S)- 2-bromo phényl acétate d éthyle, catalysé par la lipase de Burkholderia cepacia ATCC21808. Les acides 2-substitués constituent d importants synthons pour la synthèse de molécules chirales plus complexes et trouvent de nombreuses applications dans le domaine de la pharmacologie et/ou de l agrochimie. Leur dédoublement peut être réalisé lors de réactions de transestérification catalysées par des lipases en milieu organique. 24

INTRDUCTIN Pour tenter d identifier les paramètres responsables de l énantiopréférence de la lipase, Guieysse et coll. (2003b) ont formulé l hypothèse selon laquelle l énantiopréférence serait influencée par l accès des substrats au niveau du site actif très enfoui de l enzyme. Sur un plan expérimental, il est très difficile de dissocier les étapes précédant la catalyse (accès du substrat et reconnaissance) de l acte catalytique proprement dit (formation de l intermédiaire tétraédrique) et d identifier les étapes limitantes. D autre part, la modélisation de trajectoires de substrats est également complexe et il n existe pas de logiciels commerciaux capables de modéliser une trajectoire continue de substrat sur une échelle de temps supérieure à la nanoseconde. Pour évaluer l hypothèse formulée par Guieysse et coll., (2003b), notre approche a tout d abord consisté à tester de nouveaux algorithmes, développés en collaboration avec l équipe de robotique du LAAS-CNRS, pour modéliser les trajectoires de différents substrats dans le site actif de la lipase. Ces travaux, menés dans le cadre du projet ALMA (Algorithmique du mouvement et des interactions macromoléculaires) soutenu par l ITAV (Institut des Technologies Avancées en Sciences du Vivant), ont plusieurs visées : (i) évaluer le rôle de l accès au site actif sur l énantiosélectivité de la lipase et (ii) guider l ingénierie de l enzyme et la construction de biocatalyseurs plus performants. L étude s est ensuite orientée vers le développement d un système recombinant de production de la lipase de B. cepacia avec un objectif double. D une part, il s agissait de pouvoir générer et caractériser facilement les mutants modifiés sur des cibles susceptibles d influencer les trajectoires des énantiomères. D autre part, le système devait être adapté au criblage à haut débit pour permettre à terme de combiner ingénieries rationnelle et combinatoire de l enzyme. Notre manuscrit débutera par une étude bibliographique centrée sur le dédoublement des mélanges racémiques catalysé par voie enzymatique, sur les moyens disponibles pour comprendre, améliorer et prédire la sélectivité des enzymes en mettant l accent sur les travaux relatifs à la lipase de Burkholderia cepacia ATCC21808, notre enzyme modèle. Dans la partie Matériels et Méthodes seront exposés les différents protocoles utilisés au cours des études expérimentales et effectuées in silico. Nos résultats seront ensuite présentés dans trois chapitres. Le premier sera dédié à l approche mixte couplant la modélisation moléculaire aux algorithmes de planification de mouvements pour la simulation des trajectoires de différents esters dérivés de l acide 2-bromo phényl acétate d éthyle dans le site actif de la lipase de B. cepacia ATCC21808. 25

INTRDUCTIN Le deuxième chapitre sera consacré au développement du système d expression recombinante du gène de la lipase de B. cepacia dans Escherichia coli. La construction de mutants ponctuels, ciblés d après les travaux de modélisation moléculaire et leurs caractérisations préliminaires seront décrites dans le dernier chapitre. 26

Chapitre I Etude bibliographique 27

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CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE 1. MLECULES CHIRALES 1.1 DEFINITIN La chiralité est la propriété de tout objet qui n est pas superposable à son image dans un miroir plan (figure 1a). Ces deux formes (l objet et son image ou formes R et S) sont dites énantiomères, aussi appelés antipodes ou inverses optiques. n peut les comparer à deux escargots, dont la spirale de l'un se déroule vers la droite et celle de l'autre vers la gauche. Les coquilles de ces deux escargots sont chirales (figure 1b). Certaines molécules peuvent comporter dans leur structure des éléments de chiralité, le plus courant de ces éléments est le carbone asymétrique* (carbone avec quatre substituants différents). (a) CH HC (b) * H H * H 2 N C H 3 R C H 3 S NH 2 Figure 1 : (a) exemple de molécule chirale, (*)=carbone asymétrique. (b) exemple d un objet chiral: la coquille d escargot. Les énantiomères ont des propriétés physiques identiques vis-à-vis de phénomènes physiques non dissymétriques (point de fusion, solubilité dans un solvant achiral, réactivité avec les réactifs achiraux, etc ). En revanche, ils possèdent des propriétés différentes vis-à-vis d un phénomène physique dissymétrique comme, par exemple, la déviation de la lumière polarisée. n distingue ainsi les composés lévogyres, qui font tourner le plan de polarisation de la lumière vers la gauche, des dextrogyres (qui la font tourner vers la droite). La valeur de la rotation définit le pouvoir rotatoire. Un mélange équimolaire de deux énantiomères, inactif sur la lumière polarisée, est appelé racémique. 29

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE 1.2. INTERETS DES MLECULES CHIRALES 1.2.1. L activité biologique La chiralité joue un rôle déterminant dans les processus vitaux des règnes animal et végétal. En effet, la plupart des molécules organiques naturelles sont chirales. Elles interviennent dans de nombreux processus biologiques comme les transports membranaires, les phénomènes de reconnaissance cellulaire (interaction avec un récepteur), les réactions métaboliques, etc Les activités biologiques de deux énantiomères peuvent être très différentes (figure 2). Par exemple, ils peuvent interagir de manière distincte avec les récepteurs olfactifs. Ainsi, le (R)- limonène, utilisé dans l industrie des parfums, possède une odeur d orange tandis que le (S)- limonène a une odeur de citron. Il en est de même des interactions avec les récepteurs du goût. La (S)-asparagine se trouve à l état naturel dans les jeunes asperges auxquelles elle confère une saveur amère caractéristique alors que l énantiomère (R)-asparagine possède un goût sucré. Cette propriété, plutôt plaisante dans le cas du goût ou de l'odorat, peut devenir gênante voire dramatique lorsqu il s'agit de médicaments. Dans les années 50, la thalidomide (ou Contergan) était commercialisée sous forme de mélange racémique dans plusieurs pays comme hypnogène et prescrit pour ses propriétés antiémétiques pour combattre les nausées matinales chez les femmes enceintes. Après quelques années de commercialisation, de nombreuses malformations observées chez les nouveaux-nés (phocomélie) ont été attribuées à l usage de la thalidomide. Une étude pharmacologique sur des animaux a montré que l activité tératogène était essentiellement due à l énantiomère (S). Des études plus récentes indiquent toutefois que la thalidomide se racémise aisément dans le sang, ce qui montre que même l emploi thérapeutique du (R)-thalidomide était voué à l échec. D une manière inattendue, la thalidomide est redevenue un sujet d étude pour les biologistes qui lui ont trouvé d intéressantes propriétés antitumorales (Muller, 1997). Cependant, cette affaire a eu des répercussions profondes sur l'industrie pharmaceutique en mettant l'accent sur les risques liés à l emploi d un médicament racémique. En effet, souvent seul l un des énantiomères possède l activité thérapeutique recherchée, l autre est au mieux inactif, au pire toxique. 30

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE C H 3 C H 3 C H 3 * H C H 3 H 3 C C H 3 * Carvone saveurs cumin (S) ou menthe verte (R) C H 3 Ibuprofen anti-inflammatoire (S) ou inefficace (R) * H * N H 2 H 3 C C H 3 Limonène odeur d orange (R) ou de citron (S) N * N N H 2 Asparagine goût sucré (R) ou amer (S) H F F Thalidomide anti-nauseux (R) ou tératogène (S) F * C H 3 N H C H 3 C H 3 * N H N H * C H 3 Fluoxetine (Prozac) anti-dépresseur (R) ou inefficace (S) Ethambutol H anti-tuberculeux (S,S) ou entraîne la cécité (R,R) C H 3 H N N S * N C H 3 meprazole (Losec) anti-ulcéreux (S) ou inefficace (R) C H 3 C H 3 Figure 2 : Exemples de molécules chirales dont les propriétés dépendent de leur configuration absolue. La position des centres asymétriques est identifiée par un astérisque. Dès lors, la législation a progressivement imposé un contrôle rigoureux de l'emploi des mélanges racémiques. La FDA (Food and Drug Administration) et son équivalent européen l EMEA (Agence Européenne pour l Evaluation des Médicaments) n imposent pas l usage systématique d un énantiomère, mais exigent une étude biologique poussée. Cette contrainte incite la plupart des laboratoires pharmaceutiques à commercialiser les médicaments sous forme d un seul énantiomère. La séparation des molécules chirales est donc devenue un enjeu pour l industrie pharmaceutique comme en témoigne le développement de ce secteur de 31

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE recherche dans la dernière décennie (Patel, 2000, 2001, 2003, 2006 ; Stinson, 2000, 2001 ; Thayer, 2006, 2007). 1.2.2. Production de molécules énantiomériquement pures : un marché en pleine expansion Du fait de ces nouvelles réglementations, la production d énantiomères purs croît considérablement. Les ventes de médicaments énantiomériquement purs étaient de 225 milliards d euros en 2005, représentant ainsi 37% du marché de l industrie pharmaceutique selon les chiffres fournis par Technology Catalyst International, tableau 1 (Erb, 2006). En 2006, 75% des molécules pharmaceutiques de faible poids moléculaire approuvées par la FDA étaient des énantiomères purs (Thayer, 2007). Tableau 1 : Marché mondial des énantiomères purs en milliards de dollars (Erb, 2006) Domaines Marché en 2000 Marché en 2004 Marché en 2005 Cardio-vasculaire 27,650 34,033 36,196 Antibiotiques/antifongiques 25,942 32,305 34,298 Cancer 12,201 21,358 27,172 Hématologie 11,989 20,119 22,439 Endocrinologie 15,228 20,608 22,355 Système nerveux central 9,322 17,106 18,551 Respiratoire 6,506 12,827 14,708 Antiviraux 5,890 11,654 14,683 Gastro-intestinal 4,171 11,647 13,476 phtalmique 2,265 3,063 3,416 Dermatologie 1,272 1,486 1,561 Vaccins 1,427 2,450 3,100 Autres 7,128 10,400 13,268 Total 130,991 199,056 225,223 32

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE En parallèle, une nouvelle stratégie appelée racemic switch a vu le jour. Cette approche consiste à remplacer un médicament racémique efficace dont le brevet arrive à expiration par sa nouvelle version énantiomériquement pure. Par exemple, l omeprazole, un anti-ulcéreux commercialisé sous le nom Prisolec/Losec par AstraZeneca et situé dans le peloton de tête des ventes mondiales de médicaments, a été remplacé en 2001 par l esomeprazole contenant seulement l énantiomère responsable de l activité biologique (Dorey, 2000). 1.3. LES ACIDES 2-SUBSTITUES Parmi les molécules chirales, les acides 2-substitués, α-arylpropioniques et α- aryloxypropioniques, trouvent de nombreuses applications dans le domaine de la pharmacologie et/ou de l agrochimie. - Les acides α-arylpropioniques représentés principalement par l Ibuprofen, le Naproxen et le Ketoprofen (figure 3) font partie de la classe des anti-inflammatoires non-stéroïdiens (les profènes), prescrits pour l arthrite, pour soulager les blessures lombaires, les maux de tête, ou encore les douleurs menstruelles sévères. L énantiomère (S) est responsable de l activité thérapeutique (Sheldon, 1993 ; De Crescenzo et coll., 2000 ; Chen et Tsai, 2005). H CH 3 H CH 3 H CH 3 CH 3 CH CH CH H 3 C (S)-ibuprofène H 3 C (S)-naproxène (S)-kétoprofène Figure 3 : Acides α-arylpropioniques : anti-inflammatoires non-stéroïdiens - Dans le domaine de l agrochimie, les acides α-aryloxypropioniques comme le mecoprop, le pyrenifop, le diclofop ou encore le fluazifop (figure 4), constituent une importante classe d herbicides commerciaux. L activité herbicide est portée par l énantiomère (R) (Sheldon, 1993 ; Miyazawa et coll., 1999 ; Chen et Tsai, 2007). 33

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE CH 3 H CH 3 Cl H CH 3 Cl (R)-mecoprop CH Cl N (R)-pyrenifop CH Figure 4 : Acides α-aryloxypropioniques : herbicides - D autres acides carboxyliques 2-substitués constituent d importants synthons ou intermédiaires de synthèse pour la synthèse de molécules chirales plus complexes. n trouve notamment les acides 2-hydroxy-carboxyliques intervenant dans la synthèse du Diltiazem (Sundholm et Kanerva, 1998) ou encore les acides 2-halogèno-carboxyliques, tels que l acide 2-bromo-o-tolyl acétique et ses dérivés esters (méthyle et éthyle), intervenant dans la synthèse de prostaglandines, de prostacyclines, de pénicillines semi-synthétiques ou de sels de thiazolium antiulcéreux (Jones et Williams, 1998 ; Tranel et Haufe, 2000 ; Guieysse et coll., 2001, 2003a, 2004 ; Haugton et Williams, 2001 ; Wang et coll., 2007). - L α-bromo phényl acétate de 2-chloro éthyle, qui fait l objet de notre étude (figure 5) est dérivé de l acide α-bromo-phényl acétique, un intermédiaire d intérêt pour la société sanofiaventis intervenant dans la voie de synthèse d une nouvelle molécule thérapeutique. Br CH 2 CH 2 Cl Figure 5 : Formule semi-développée de l α-bromo phényl acétate de 2-chloro éthyle. 34

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE 2. BTENTIN DE MLECULES ENANTIMERIQUEMENT PURES Les molécules énantiomériquement pures sont principalement obtenues par voie chimique ou par voie biologique selon trois méthodes: (i) à partir de précurseurs chiraux, (ii) par synthèse asymétrique et (iii) par dédoublement de mélanges racémiques (Blaser et coll., 2001). 2.1. PRECURSEURS CHIRAUX Les substances naturelles énantiomériquement pures telles que les acides aminés, les terpènes, les alcaloïdes, les sucres et leurs dérivés ou encore les acides carboxyliques, peuvent servir de précurseurs pour la synthèse de dérivés énantiopurs. Un exemple est celui du Taxotère (analogue du Taxol) un anticancéreux développé par la société sanofi-aventis. Le Taxol (ou paclitaxel) est présent en faible abondance dans l écorce d If. Une voie d hemi-synthèse est employée pour produire le Taxotère (ou docetaxel). L intermédiaire naturel utilisé est le 10-déacétyl-baccatin III beaucoup plus disponible et issu des aiguilles d If de Taxus Baccata (figure 6) (Gou et coll., 1993). C 6 H 5 H 3 C Ac CH 3 H H 5 C 6 H 3 C H CH 3 H H 5 C 6 NH H H CH 3 CH 3 H CPh Ac tbu- NH H H CH 3 CH 3 H CPh Ac Taxol (paclitaxel) Taxotère (docetaxel) H 3 C H CH 3 H H CH 3 CH 3 H H CPh Ac 10-déacétyl-baccatin III Figure 6 : Structure du Taxol, du Taxotère et de la Baccatin III. 35

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE 2.2. SYNTHESES ASYMETRIQUES La synthèse de composés énantiomériquement purs à partir d une matière première achirale nécessite l utilisation d un auxiliaire chiral (figure 7). L auxiliaire chiral est soit utilisé en quantité catalytique (c est le cas idéal), soit associé au substrat pour créer de façon stéréosélective un carbone stréréogénique, soit associé au composé qui doit réagir avec le carbone prochiral du substrat. A la fin de la synthèse, l auxiliaire chiral doit pouvoir être détaché de son support et récupéré pour être réutilisé. R 1 R A A Substrats prochiraux a.c. R 1 R A B Enantiomères purs R R 1 X a.c. R 1 R X-B A Figure 7 : Synthèse de composés énantiomériquement purs à partir de réactifs prochiraux et d auxiliaires chiraux (d après Crosby, 1992). Cependant la stéréosélectivité de la réaction n est pas toujours facile à prévoir. De plus, l utilisation de quantités stoechiométriques d auxiliaire chiral peut s avérer onéreuse. Enfin, cette méthode nécessite deux étapes de synthèse supplémentaires pour lier et enlever l auxiliaire chiral dans le cas où ce dernier est lié au substrat. Comme exemple de synthèse asymétrique développée à l échelle industrielle, on peut citer la synthèse de (S)-naproxen [anti-inflammatoire non stéroidien] selon le procédé Zambon (figure 8). 36

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE Me 2 C C 2 Me H 3 C Br Me CH 2 C C 3 2 Me + H H Acide tartrique H + H 3 C Br CH 3 H 3 C H 3 C Br (S)-naproxen ee> 99 %, R dt 80 % C 2 H + Acide tartrique Figure 8 : Synthèse du (S)-naproxen : procédé Zambon (Schaad, 1999). Les synthèses asymétriques peuvent également être catalysées par des enzymes ou des microorganismes. Ces derniers sont fréquemment employés lors de réductions de fonction cétone (Nakamura et coll., 2003 ; Muller et coll., 2005). A titre d exemple, on peut citer la production d un intermédiaire de synthèse du Montelukast [Sinclaire : anti-asthmatique] par réduction énantiosélective de la cétone correspondante via la souche Microbacterium campoquemadoensis MB5614 (figure 9). Cl N CH 3 Microbacterium H CH 3 campoquemadoensis Cl N C 2 Na S H CH 3 CH 3 (S) ee > 95% Cl N Montelukast (Singulair) Figure 9 : Synthèse d un intermédiaire de synthèse du Motelukast (Shafiee et coll., 1998). 2.3. DEDUBLEMENT DE MELANGES RACEMIQUES utre les synthèses asymétriques toujours délicates mais de plus en plus fréquentes, le dédoublement ou par anglicisme la résolution de mélanges racémiques est, de loin, la méthode la plus utilisée dans le secteur industriel pour la préparation de composés énantiomériquement purs. Le dédoublement permet d accéder aux deux énantiomères, ce qui représente par exemple un avantage pour l industrie pharmaceutique dans le cas où les études 37

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE pré-cliniques sont requises pour les deux formes. Les techniques employées pour la séparation de racémiques sont principalement divisées en quatre groupes: (i) la cristallisation préférentielle ou sélective, (ii) la cristallisation de sels de diastéréoisomères, (iii) la séparation par chromatographie et (iv) le dédoublement cinétique. 2.3.1. Cristallisation préférentielle Cette technique consiste en la cristallisation sélective d un énantiomère. Une solution saturée du racémique est ensemencée par un germe cristallin optiquement actif et de même nature. L autre énantiomère reste alors en solution. Il s agit d un procédé non équilibré qui ne se produit qu avec certains racémiques appelés conglomérats. Ils ont la particularité de former des cristaux ne renfermant qu un seul énantiomère rendant aisée la séparation des isomères optiques. Environ 10 % de l ensemble des racémiques possèdent cette propriété. La procédure de dédoublement nécessite en général un contrôle minutieux de la température et l utilisation de germes cristallins extrêmement purs pour l induction de la cristallisation et l obtention de bon rendement (Wood, 1997). 2.3.2. Cristallisation de sels de diastéréoisomères C est la méthode la plus générale. Elle a été initialement proposée par L. Pasteur en 1852, et est encore largement utilisée à l heure actuelle dans l industrie. Le procédé comprend une réaction chimique en présence d un acide (ou d une base) optiquement actif appelé agent résolvant qui conduit à la formation d un mélange de sels de diastéréoisomères qui sont ensuite séparés par simple cristallisation. Le rendement maximum théorique est de 50 %. Un rendement supérieur à 50 % peut être obtenu quand le diastéréoisomère subit spontanément une épimérisation. Le principe est résumé dans la figure 10, ci-dessous. 38

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE X R + X S Mélange racémique : mêmes propriétés physiques Y S, réactif optiquement pur X R Y S + X S Y S Diastéréoisomères : propriétés physiques différentes Séparation des diastéréoisomères X R Y S X S Y S X R + Y S Scission X S + Y S Racémisation de X s (si mauvais énantiomère) Séparation et récupération de Y S X R Pur X S Pur Figure 10 : Dédoublement de racémiques par précipitation diastéréosélective (d après Vollhardt et Schore, 1999). 2.3.3. Séparation par chromatographie La séparation est basée sur la différence d interaction des deux énantiomères avec un adsorbant homochiral. La liaison non covalente entre l adsorbant et les énantiomères forme des complexes de diastéréoisomères qui ont des énergies de liaisons différentes. L équilibre entre l état lié et l état libre est de ce fait distinct pour chacun des énantiomères. Il en résulte une vitesse de migration propre à chacun des énantiomères qui autorise une séparation par chromatographie. Bien que le principe soit connu et compris depuis un certain temps, ce n est que récemment (1983-1986) que les progrès des techniques de chromatographie et de préparation d adsorbants optiquement purs permettent la réalisation pratique de telles séparations. Cependant, le prix élevé des phases stationnaires reste l inconvénient majeur de cette technique. 39

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE 2.3.4. Dédoublement cinétique Il s agit d un autre moyen de séparation qui utilise la différence de vitesse de réaction de chaque énantiomère avec un réactif optiquement pur. Les énergies des états de transition de chaque énantiomère sont différentes, car les deux états sont diastéréoisomères (substrat R- réactif R et substrat S-réactif R), d où la différence de vitesse. Ainsi, la modification chimique de l un des deux énantiomères permettra d assurer le dédoublement du racémique par des méthodes classiques de séparation utilisées en chimie organique. Le rendement qui ne peut excéder 50% est la limitation intrinsèque de cette technique. Pour contourner ce problème, des stratégies de dédoublement cinétique dynamique ont été élaborées en faisant appel à des réactions simultanées de racémisation du substrat non converti. Le substrat reste ainsi sous forme de racémique jusqu à ce que la conversion soit totale (Pellissier, 2003 ; Martin-Matute et Bäckvall, 2007). Comme dans le cas des synthèses asymétriques, le dédoublement de mélanges racémiques peut être catalysé par voie enzymatique. L un des énantiomères sera transformé plus rapidement que l autre. Les propriétés du substrat résiduel et celles du produit sont alors suffisamment différentes pour qu une séparation classique par chromatographie par exemple soit réalisée. Les enzymes sont des protéines formées d un enchaînement d acides aminés qui adoptent par repliement une structure bien définie dans l espace. Dans cette structure tridimensionnelle, il existe des sites particuliers appelés site(s) actif(s). Le site actif est constitué d un petit nombre d acides aminés qui, le plus souvent, ne sont pas contigus dans l enchaînement de la chaîne polypeptidique. L agencement unique de ces acides aminés est la cause de la stéréospécificité de reconnaissance entre le site actif et le(s) substrat(s). Les enzymes présentent de multiples avantages par rapport aux catalyseurs classiques de l industrie chimique (Liese et Filho, 1999 ; Schulze et Wubbolts, 1999 ; Carrea et Riva, 2000 ; Faber, 2000). Elles autorisent des procédés moins polluants, catalysent les réactions dans des conditions douces de mise en œuvre en termes de ph et de température, et présentent une grande spécificité par rapport aux catalyseurs chimiques. En effet, les enzymes sont chimio-, régio- et stéréosélectives. Cette dernière propriété, au cœur de notre étude, est celle mise à profit pour le dédoublement cinétique de racémiques. 40

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE Les hydrolases qui représentent 75 % des enzymes utilisées dans l industrie sont les enzymes les plus fréquemment employées dans les procédés de dédoublement de mélanges racémiques. Les principales réactions catalysées par ces enzymes sont présentées dans la figure 11, (Pantaleone, 1999 ; Bornscheuer et Kaslauskas, 1999). Dans le cas des réactions (2) et (4) le centre asymétrique peut également se trouver sur le radical R 2. B-Gal- R 1 Glycosidases B-Gal- R 1 + H 2 R R + H R 1 R + Galactose (1) R 1 R R 2 + H 2 Lipases Estérases R 1 R R 2 + R 1 R H + R 2 H (2) R + H 2 Epoxyhydrolase R + R H H (3) R 1 R NHR 2 + H 2 Protéases Amidases R 1 R NHR + R 1 R H + R 2 NH 2 (4) R R R 1 Nitrilases R R 1 R 1 + 2 H 2 N N + CH + NH 3 (5) Figure 11 : Principe du dédoublement de mélanges racémiques catalysé par des hydrolases. Dans le tableau 2 ci-dessous sont reportés quelques exemples de dédoublements de mélanges racémiques catalysés par des hydrolases. Parmi ces hydrolases, les lipases (E.C.3.1.1.3) ou triacylglycérols-acylhydrolases, qui naturellement hydrolysent les triglycérides en acides gras et glycérol, sont les enzymes les plus utilisées pour le dédoublement de mélanges racémiques d alcools, d acides, d amines Nous leur avons dédié le chapitre suivant. 41

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE Tableau 2 : Exemples de dédoublements de mélanges racémiques catalysés par des hydrolases. Dédoublements Hydrolases Références H 3 C CH 3 H 3 C CH 3 Cl Cl (S) - ee > 99% Lipase B de Candida antarctica Homann et coll., 2001 Cl Cl H CH 3 (S) - ee = 80% H CH 3 Lipase PS-30 (Pseudomonas cepacia) Easwar et Argade, 2003 CH 3 H 3 C CH 3 H 3 C H CH 3 Estérase de foie de porc Patel et coll., 1998 H 3 C H 3 C (S) - ee = 96% H 2 N CH 3 NH 2 H H 2 N CH 3 (S) - ee = 99% Amidase de Mycobacterium neoaurum ATCC 25795 Bloom et coll., 1989 Fischer et coll., 1994 Patel et coll., 1998 H 2 N CH 3 CH 3 H 2 N CH 3 (S) CH 3 Lipase de Candida antarctica Campos et coll., 2000 - H - H N + Br N + Br Lipase PS-30 (Pseudomonas cepacia) Campos et coll., 2000 (R) N + H Br N + H Br Lipase PS-C-II (Lipase II de Pseudomonas cepacia) Kapoor et coll., 2005 - - (R) - ee = 99% C H 3 H 3 C R R (R) Epoxide hydrolase de Nocardia sp. Pedragosa-Moreau et coll., 1997 rru et coll., 1999 42

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE 3. DEDUBLEMENT DE MELANGES RACEMIQUES CATALYSES PAR LES LIPASES 3.1. LES LIPASES Les lipases constituent un groupe d enzymes très largement utilisées en biotechnologie qui trouve de nombreuses applications dans différents secteurs industriels tels que l industrie pharmaceutique, l industrie alimentaire, l agrochimie (pesticides), l industrie des détergents, l industrie des cosmétiques et des parfums, l industrie du papier, l industrie du cuir (Jaeger et Reetz, 1998 ; Schmid et Verger, 1998 ; Jaeger et coll., 1999 ; Jaeger et Eggert, 2002 ; Houde et coll., 2004 ; Gotor-Fernandez et coll., 2006 ; Hasan et coll., 2006 ; Ghanem, 2007). Elles jouent un rôle important dans le métabolisme des graisses et sont présentes dans la plupart des tissus animaux et végétaux, mais aussi dans de nombreux micro-organismes (Pandey et coll., 1999 ; Gupta et coll., 2004). La fonction biologique des lipases est de catalyser l hydrolyse d esters comme les triglycérides. Elles reconnaissent différemment les acides gras selon leur degré d insaturation et la longueur de la chaîne carbonée. Cependant, elles sont capables d hydrolyser une très grande variété de substrats naturels et non-naturels et de réaliser en milieu organique des réactions de synthèse. 3.1.1. Les réactions catalysées par les lipases 3.1.1.1. Les réactions d hydrolyse Les réactions d hydrolyse s effectuent à l interface entre les substrats hydrophobes et le milieu aqueux, formant ainsi un système réactionnel biphasique. Ce système biphasique résulte de la présence d une phase organique non miscible à l eau, cette phase étant constituée soit du substrat seul soit du substrat dissous dans un solvant non miscible à l eau. R 1 CR 2 + H 2 R 1 CH + R 2 H 43

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE 3.1.1.2. Les réactions de synthèse Dans des milieux non conventionnels à faible teneur en eau, les lipases catalysent une grande variété de réactions de synthèse. 1- l estérification R 1 CH + R 2 H R 1 CR 2 + H 2 2- la transestérification - Alcoolyse : par échange du groupement alcool R 1 CR 2 + R 3 H R 1 CR 3 + R 2 H - Acidolyse : par échange du groupement acyle R 1 CR 2 + R 3 CH R 3 CR 2 + R 1 CH - Interestérification : par échange du groupement acyle et alcool R 1 CR 2 + R 3 CR 4 R 3 CR 2 + R 1 CR 4 3- l aminolyse (Martínez et coll. 2000 ; Soledad de Castro et coll. 2000 ; López-Serrano et coll. 2001 ; Baldessari et Mangone, 2001), ou amidation si R 2 =H (Maugard, 1996) R 1 CR 2 + R 3 NH 2 R 1 CNHR 3 + R 2 H Elles catalysent également des réactions de thiotransestérification et d oximolyse (Villeneuve et coll., 2000). 3.1.2. Caractéristiques structurales 3.1.2.1. Généralités L étude structurale des lipases, par diffraction aux rayons X, révèle trois caractéristiques principales. 44

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE (1) Un repliement α/β : Toutes les lipases de structures connues présentent un repliement, nommé repliement α/β constitué d un corps central de 8 feuillets β, autour duquel se répartissent au moins 6 hélices α (figure 12) (llis et coll., 1992 ; Nardini et Dijkstra, 1999). La caractéristique la plus importante et la plus conservée des α/β hydrolases est le coude nucléophile appelé γ turn contenant le résidu catalytique sérine (nucléophile, Nu) positionné entre un feuillet β et une hélice α. Repliement α /β-hydrolase oxyanion Nu His acide 1 2 3 4 5 6 7 8 Figure 12 : Diagramme schématique du repliement des α/β hydrolases. xyanion: résidus stabilisant l intermédiaire tétraédrique. Triade catalytique des lipases: Asp/Glu (acide), His et Ser (Nu). Flèches: feuillets β; Rectangles: hélices α; Lignes: boucles (Bornscheuer et Kazlauskas, 1999). (2) Une triade catalytique : Le site catalytique des lipases est formé de la triade catalytique caractéristique des protéases dites à sérine et du trou oxyanion. La triade catalytique est constituée de trois acides aminés Sérine-Histidine-Acide Aspartique (ou Acide Glutamique) très conservés. La sérine catalytique peut être identifiée à partir d une séquence consensus GXSXG (ou exceptionnellement TXSXG ou AXSXG). Le trou oxyanion est constitué de deux acides aminés dont les groupements amides du squelette protéique stabilisent l état de transition du substrat en formant avec celui-ci deux liaisons hydrogènes. Le premier de ces deux acides aminés est localisé dans le coude nucléophile au sein de la séquence consensus G-X-S-X-G. L autre peut être un acide aminé en C-terminal d une glycine conservée (GX) ou une glycine suivie d un résidu hydrophobe conservé (GGGX) définissant ainsi deux types de trou oxyanion (Pleiss et coll., 2000a). A titre d exemple, les lipases appartenant aux superfamilles des Cutinases, Champignons 45

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE filamenteux et Pseudomonas sont des lipases de type GX, tandis que celles appartenant aux superfamilles Candida rugosa et Yarrowia lipolytica sont des lipases de type GGGX (Pleiss et coll., 2000a). Cette classification en deux types de trou oxyanion semble corréler avec une différence de spécificité de substrat. En effet, les lipases dites de type GGGX sont spécifiques des substrats à chaînes carbonées courtes tandis que les lipases de type GX sont spécifiques des substrats à chaînes carbonées moyennes et longues (Pleiss et coll., 2000a). (3) Un volet amphiphile : Le volet amphiphile est un élément mobile formé d une ou deux hélices α reliées au squelette de l enzyme par une structure flexible. L ouverture de ce volet amphiphile rend le site actif accessible au solvant et au substrat (Derewenda et coll., 1992). Lorsque l enzyme se trouve à l interface lipide/eau, l hélice α couvrant le site actif s ouvre, rendant accessible le site actif au solvant et au substrat, l enzyme est sous sa forme ouverte, activée (Brzozowski et coll., 1991 ; Derewenda et coll., 1994a ; Benedetti et coll., 1996). 3.1.2.2. Sites actifs Les structures des lipases cristallisées en présence et en absence d analogues d états de transition ont permis d identifier la topographie générale du site actif (figure 13) et les sites de fixation de la partie alkyle et acyle des esters (figure 14). Selon Pleiss et coll., (1998), les lipases peuvent être divisées en trois sous-groupes : 1- les lipases à site actif hydrophobe localisé près de la surface de la protéine : lipases de Rhizomucor et Rhizopus, 2- les lipases à site actif en forme d entonnoir : lipases de Burkholderia cepacia et Candida antarctica, 3- les lipases à site actif en forme de tunnel : lipase de Candida rugosa. 46

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE Le site de fixation de la partie alkyle est similaire dans toutes les lipases. Il s agit d une poche contenant deux zones, (i) une large poche hydrophobe en amont de la sérine catalytique et (ii) une, plus petite, en aval de la sérine catalytique qui serait responsable de la stéréo-sélectivité des lipases pour les alcools secondaires (Bornscheuer et Kazlauskas, 1999). Au contraire, le site de fixation de la partie acyle, varie considérablement selon les lipases. Dans la lipase de Candida rugosa, par exemple, ce site correspond à un long tunnel pouvant accommoder une chaîne carbonée longue d au moins 18 atomes de carbone, alors que dans la lipase de Rhizomucor miehei, il est beaucoup plus court et se situe en surface de la protéine. La lipase de Burkholderia cepacia présente, pour sa part, un site est assez long et bien plus large que celui de la lipase de Candida rugosa. Le site actif de la lipase de Candida antarctica se situe entre celui de la lipase de Rhizomucor miehei et celui de la lipase de Burkholderia cepacia (Bornscheuer et Kazlauskas, 1999). Figure 13 : Représentation schématique des sites actifs des lipases de Candida antarctica (CAL-B), de Burkholderia cepacia (BCL=PCL), de Rhizomucor miehei (RML), et de Candida rugosa (CRL). (a) La direction des vues est indiquée par une flèche. D, Asp ; H, His ; S, Ser représentent les acides aminés de la triade catalytique. (b-e) Représentations des sites actifs : vue de côté, de face et de dessus (Pleiss et coll., 1998). 47

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE Figure 14 : Topologie des sites actifs de C. rugosa (CRL), B. cepacia (PCL) et C. antarctica-b (CALB) (Bornscheuer et Kazlauskas, 1999). 3.1.3. Mécanisme d action catalytique Un mécanisme général d action catalytique des lipases a été proposé par Cygler et coll., (1994) (figure I-15). Le transfert de proton entre l acide aspartique (ou acide glutamique), l histidine et la sérine catalytique, entraîne l attaque nucléophile de l hydroxyle de la sérine sur le carbonyle du substrat pour former le premier intermédiaire tétraédrique. Cet intermédiaire est stabilisé par au moins cinq liaisons hydrogène dont au moins deux entre l oxygène du substrat chargé négativement et les acides aminés du trou oxyanion. Le retour du doublet de l oxygène et le transfert d un proton de l histidine entraîne la libération du premier produit de la réaction (soit une molécule d eau soit une molécule d alcool, en fonction du substrat mis en jeu) et formation de l acyl-enzyme. Cette première étape d acylation (formation de l acyl-enzyme) est suivie d une étape de déacylation faisant intervenir une attaque nucléophile qui peut être exercée par une molécule d eau (réaction d hydrolyse) ou par une molécule d alcool (réaction de synthèse) sur le carbonyle de l acylenzyme pour former le second intermédiaire tétraédrique. Cette étape de déacylation qui suit un processus analogue à celui de l étape d acylation conduit à la formation du second produit de la réaction (acide carboxylique ou ester) avec régénération de l enzyme native. 48

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE His His Ser Asp - H-N N H- R'- Ser R Asp ---- + H-N N-H ---- ---- R' Intermédiaire tétraédrique - ---- R ---- NH NH trou oxyanion Asp - His H-N N + R'-H ---- Ser R''-H R ---- NH Acyl-enzyme NH trou oxyanion Asp - H-N His N H Ser R R'' NH ---- ---- NH trou oxyanion His His Ser Asp ---- + H-N N-H ---- ---- R'' Intermédiaire tétraédrique - ---- NH R ---- NH trou oxyanion R''- R Asp - H-N N H- Ser Figure 15 : Mécanisme d action catalytique des lipases. 3.2. ENANTISELECTIVITE 3.2.1. Détermination de l énantiosélectivité 3.2.1.1. Excès énantiomériques Le dédoublement cinétique d un mélange racémique peut être caractérisé par la détermination des excès énantiomériques du substrat (ee s ) (1) ou du produit (ee p ) (2) définis dans la figure 16. Cependant, la variation de ces excès énantiomériques est fonction du taux de conversion (figure 17). A de faibles taux de conversion, seul l énantiomère le mieux reconnu est transformé conduisant ainsi à un ee p très élevé. Au fur et à mesure de l avancement de la réaction, la quantité d énantiomère le mieux reconnu diminue dans le mélange racémique, au profit de l autre énantiomère. Ce dernier sera alors à son tour transformé par l enzyme, entraînant une diminution de ee p et une augmentation de ee s. 49

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE Enz + R k 1 k 3 (Enz-R) k 2 k 4 Enz + P Enz + S k' 1 k' 3 (Enz-S) k' 2 k' 4 Enz + Q % e.e. s = (R-S) t x 100 (1) % e.e. p = (P-Q) (R+S) t x 100 (2) % c = 1 - t x 100 (3) (R+S) t (P+Q) t (R 0 +S 0 ) t=0 Figure 16 : Dédoublement enzymatique. (R) et (S) représentent les énantiomères substrats, (P) et (Q) les énantiomères produits de la réaction. Enz= enzyme. (ee s ) excès énantiomérique du substrat, (ee p ) excès énantiomérique du produit, (c) taux de conversion. Figure 17 : Variation des excès énantiomériques en fonction du taux de conversion de la réaction dans le cas d une réaction irréversible. Les chiffres 3, 10 et 100 représentent l énantiosélectivité de la réaction enzymatique (Anthonsen et Jongejan, 1997). 3.2.1.2. Ratio énantiomérique: E Afin de disposer d un paramètre permettant de décrire le degré d énantiosélectivité d une enzyme, Chen et coll., ont introduit la notion de ratio énantiomérique (E), qui se définit comme étant le rapport des efficacités catalytiques, k cat /K M, mesurées pour chaque énantiomère (Chen et coll., 1982, 1987). L énantiosélectivité (E) définit donc la capacité d une enzyme à différencier les énantiomères (R) et (S) dans des conditions de réaction données. C est une propriété intrinsèque de l enzyme qui décrit quantitativement sa stéréosélectivité. Une enzyme non énantiosélective a une valeur de E=1. 50

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE Comme indiqué dans la figure 17, le profil de variation des excès énantiomériques en fonction du taux de conversion change avec l énantiosélectivité de la réaction. Pour des valeurs très élevées d énantiosélectivité correspondant donc à des enzymes très énantiosélectives, la vitesse de la réaction diminue brutalement au-delà de 50% de conversion. L énantiosélectivité peut être calculée à partir des équations (4) et (5) qui font intervenir le taux de conversion (3) et les excès énantiomériques du substrat (1) et du produit (2). Dans le cas où le taux de conversion est très faible ou très élevé, l équation (6) est utilisée (Rakels et coll., 1993). Ces équations ne s appliquent que dans le cas de réactions enzymatiques irréversibles. Ce sont les réactions où k 4 =k 4 =0 (figure 16). ln 1-c(1+eep) E= (4) ln 1-c(1-eep) pour le produit ln (1-c)(1-ees) E= (5) ln (1-c)(1+ees) pour le substrat eep(1-ees) ln (eep+ees) E= (6) eep(1+ees) ln (eep+ees) La détermination de l énantiosélectivité dans le cas de réactions réversibles (k 4 et k 4 0 ; figure 16) a été reportée par Chen et coll., (1987), Chen et Sih, (1989) et Straathof et Jongejan, (1997). Pour calculer l énantiosélectivité, il faut alors en toute rigueur faire intervenir la constante d équilibre K dans les expressions (7) et (8). ln 1-(1+K)c(1+eep) ln 1-(1+K)(c+ees(1-c)) E= (7) E= (8) ln 1-(1+K)c(1-eep) ln 1-(1+K)(c-ees(1-c)) pour le produit pour le substrat Dans certains cas, l expression (9) qui définit l énantiosélectivité comme le rapport des vitesses initiales de la réaction, est préférée car elle est beaucoup moins complexe, plus rapide à estimer au niveau expérimental et est une bonne approximation de l énantiosélectivité (Ducret et coll. 1998 ; Wu et Liu 2000). E = vir / vis (9) 51

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE 3.2.2. Analyse thermodynamique de l énantiosélectivité L énantiosélectivité d une enzyme peut être corrélée avec la différence d énergie libre d activation ( R-S G) entre deux énantiomères en se basant sur l hypothèse que l état de transition de plus faible énergie doit correspondre à l énantiomère qui est le plus vite transformé par l enzyme (figure 18). Cette différence d énergie libre d activation est ellemême reliée à la différence entre l enthalpie d activation et l entropie (expression 10). R-S G = -RTln E = R-S H T R-S S (10) Figure 18 : Diagrammes d énergies d une réaction énantiosélective catalysée par une enzyme. R et S sont les énantiomères, G=énergie libre de Gibbs, H=enthalpie et S=entropie. Considérant que les énantiomères sont fortement contraints dans le site actif, la contribution de l entropie était souvent considérée comme négligeable (DeTar, 1981 ; Holmberg et Hult, 1991 ; Norin et coll., 1993). Cependant, de nombreux exemples de la littérature ont mis en évidence l importance de ce facteur entropique dans la catalyse enzymatique, et plus particulièrement sur l énantiosélectivité (Philips, 1992 ; verbeeke et coll., 1999 ; ttosson et Hult, 2001 ; ttosson et coll., 2001, 2002a ; Bocola et coll., 2003). Les différences d enthalpie d activation ( R-S H) et d entropie d activation ( R-S S) entre les deux énantiomères (figure 18) peuvent être déterminées en étudiant les variations du ratio énantiomérique (E) en fonction de la température (T) (expression 11). ln E = - R-S H R. 1 T + R-S S R (11) 52

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE La différence d enthalpie d activation ( R-S H) est reliée aux interactions stériques et électrostatiques entre les composants de la réaction, l enzyme, son substrat et le solvant. Elle traduit la complémentarité de chaque énantiomère avec le site actif de l enzyme. Plus cette complémentarité sera importante, plus l enthalpie sera faible. La température racémique (T R ), température à laquelle l enzyme n est pas énantiosélective (E=1 et R-S G=0), est déterminée par le rapport des différences d enthalpie d activation et d entropie (équation 12). T R = R-S H R-S S (12) Généralement, l enthalpie et l entropie se compensent, et ce, qu elles soient toutes les deux positives ou négatives. En d autres termes, l énantiomère favorisé par l enthalpie sera défavorisé par l entropie (figure 18). Au-dessous de la température racémique (T R ), l enzyme va préférentiellement transformer l énantiomère favorisé par l enthalpie, et l énantiosélectivité va diminuer avec la température à mesure que le terme entropique (T R- S S, équation 10) augmente. A l inverse, au-dessus de T R, l enzyme va préférentiellement transformer l énantiomère favorisé par l entropie, et l énantiosélectivité augmente avec la température à mesure que le terme entropique (T R-S S, expression 10) augmente. 3.3. FACTEURS INFLUENÇANT L ENANTISELECTIVITE 3.3.1. Influence des paramètres réactionnels Les enzymes sont naturellement optimisées pour leur environnement cellulaire. Par conséquent, peu d enzymes sont adaptées aux milieux réactionnels utilisés pour la production de composés d intérêts. Ainsi, l emploi des enzymes dans des procédés industriels peut être limité par leur faible thermostabilité, leur ph optimal différent de celui du milieu réactionnel, leur instabilité en milieu organique, leur sélectivité. 53

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE Dans les cas de dédoublement de mélanges racémiques par voie enzymatique, l obstacle majeur provient du fait que l enzyme n est pas toujours suffisamment énantiosélective pour un substrat donné. Cela conduit à un dédoublement enzymatique incomplet et à une pureté énantiomérique faible. Pour remédier à ce problème, une stratégie consiste à modifier les paramètres réactionnels susceptibles d affecter l énantiosélectivité comme le solvant, l activité de l eau, ou encore la température. - Le solvant : Aucune corrélation claire n a été mise en évidence en ce qui concerne l effet du solvant sur l activité et l énantiosélectivité des enzymes. En effet, certains auteurs montrent que l énantiosélectivité varie avec la constante diélectrique du solvant (Fitzpatrick et Klibanov, 1991 ; Carrea et coll., 1995) ou encore avec la taille des molécules de solvant (ttosson et coll., 2002b). D autres n observent aucune corrélation quel que soit le paramètre utilisé (Bovara et coll., 1991 ; Secundo et coll., 1992 ; Ducret et coll., 1998 ; Chua et Sarmidi, 2006). Parfois en modifiant le solvant, il se produit une inversion de l énantiosélectivité (Ueji et coll., 1992 ; Hirose et coll., 1992 ; Tawaki et Klibanov, 1992). Généralement, le paramètre le plus utilisé pour exprimer l effet du solvant est le log P, qui traduit l hydrophobicité du solvant, mais comme le montre verbeeke et coll., (2000), il n est pas possible d établir de corrélation directe entre l énantiosélectivité et le log P (figure 19). L une des avancées les plus importantes dans le domaine de l ingénierie des milieux réactionnels est la catalyse par voie enzymatique en présence de liquides ioniques (Lau et coll., 2000 ; Kragl et coll., 2002 ; Ulbert et coll., 2004 ; Lou et coll., 2006 ; Yuan et coll., 2006). Quelques exemples de la littérature montrent qu il est ainsi possible d augmenter l énantiosélectivité des lipases lors du dédoublement d alcools secondaires ou d acides 2- substitués en présence de liquides ioniques (Kim et coll., 2001 ; Schöfer et coll., 2001 ; Park et Kazlauskas, 2002 ; Hongwei et coll., 2005). Cependant, des changements mineurs dans la structure du liquide ionique peuvent entraîner des changements drastiques sur les propriétés cinétiques de l enzyme. De plus, des études doivent encore être menées pour comprendre les facteurs structuraux clés des liquides ioniques contrôlant les réactions enzymatiques (Jaeger et Eggert, 2002). 54

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE Figure 19 : Variation de l énantiosélectivité de différentes enzymes en fonction du log P des solvants organiques pour diverses réactions (verbeeke et coll., 2000). - L activité de l eau : L activité de l eau (a w ), qui représente la quantité d eau disponible pour l enzyme, joue un rôle important dans les réactions de synthèse catalysées par les lipases. Elle influence la flexibilité de la protéine et par conséquent son activité catalytique (Simon et coll., 1998). De plus, l eau est importante pour la stabilité de l enzyme puisqu elle est impliquée dans de nombreux mécanismes d inactivation (Wehtje et coll., 1996). Les vitesses de réaction dépendent fortement de l activité de l eau du milieu réactionnel (Marty et coll., 1992, 1997 ; Wehtje et Adlercreutz, 1997). Cependant, le problème est nettement plus complexe lorsqu il s agit d analyser l effet de l activité de l eau sur l énantiosélectivité. Un taux d hydratation faible conduit à une enzyme moins flexible normalement moins active. Dans la littérature, les données sont contradictoires en ce qui concerne l effet de l activité de l eau sur l énantiosélectivité des lipases. Certains auteurs rapportent que l augmentation de l activité de l eau entraîne une augmentation de l énantiosélectivité (Högberg et coll., 1993 ; Anthonsen et Hoff, 1998 ; Wu et Liu, 2000 ; Léonard et coll., 2007). Dans d autres cas, c est l inverse qui est observé (Bornscheuer et coll., 1993 ; rrenius et coll., 1995 ; Pepin et Lortie, 1999). Parfois même, aucun effet n est noté (Bovara et coll., 1993 ; Nordin et coll., 1994 ; Wehtje et coll., 1997 ; Persson et coll., 2002 ; Yu et coll., 2007). - La température : La température est un facteur qui peut potentiellement affecter l énantiosélectivité des enzymes. En général, les enzymes présentent une plus grande sélectivité à basse température (verbeeke et coll., 1999 ; ttosson et Hult, 2001 ; Miyazawa et coll., 2001 ; López-Serrano 55

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE et coll., 2001 ; Persson et coll., 2002 ; Sakai, 2004 ; Yu et coll., 2007). Cependant, quelques exemples de réactions pour lesquelles l énantiosélectivité augmente avec la température ont été rapportés (Yasufuku et Ueji, 1995, 1996 ; Watanabe et coll., 2001 ; Ema, 2004 ; Magnusson et coll., 2005). En conclusion, les paramètres réactionnels n apparaissent pas cruciaux pour contrôler l énantiosélectivité au regard de l importance des paramètres structuraux du couple enzymesubstrat (Zuegg et coll., 1997 ; Lang et Dijkstra, 1998 ; Lang et coll., 1998 ; rrenius et coll., 1998a,b ; Rotticci et coll., 1998 ; Tuomi et Kazlauskas, 1999 ; Schulz et coll., 2000, 2001 ; Tomic et Kojic-Prodic, 2002 ; Ema et coll., 2003 ; Guieysse et coll., 2003a,b ; Tomic et coll., 2004 ; Tomic et Ramek, 2006). 3.3.2. Influence des interactions moléculaires enzyme / substrat Les premières analyses structurales proposées pour rendre compte de l énantiosélectivité reposaient sur des modèles simplistes basés sur la taille des substituants du centre asymétrique et la topologie des poches destinées à recevoir les groupements acyle ou alkyle du substrat (Kazlauskas et coll., 1991 ; Ahmed et coll., 1994 ; Franssen et coll., 1996 ; Tuomi et Kazlauskas, 1999). Pour tenter de comprendre l énantiosélectivité à l échelle moléculaire, de plus en plus d auteurs ont recours à la modélisation moléculaire. 3.3.2.1. Introduction à la modélisation moléculaire La modélisation moléculaire consiste à proposer, pour une molécule donnée, un modèle géométrique tridimensionnel de cette molécule dont la probabilité d existence est estimée selon un critère énergétique. Ainsi, plus l énergie potentielle d une conformation sera faible, plus la conformation sera considérée comme stable, et plus elle aura de chances d exister. Pour déterminer l énergie potentielle des protéines, on a généralement recours à la mécanique moléculaire, méthode simple et empirique, dans laquelle seuls les mouvements des noyaux sont pris en compte alors que les électrons ne sont pas explicitement examinés. Cette méthode permet donc d évaluer l énergie potentielle de systèmes moléculaires à partir de leur 56

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE géométrie. Dans ce cas, la structure moléculaire est définie comme étant composée de sphères (les atomes) associés par des ressorts (les liaisons) et son énergie potentielle est décomposée en la somme de l énergie d élongation des liaisons, l énergie de déformation angulaire, l énergie de déformation des angles dièdres, l énergie due aux interactions de van der Waals, l énergie due aux interactions électrostatiques et l énergie des liaisons hydrogène. E total = E liaison + E angle +E torsion + E van der Waals + E électro + E liaison-h Chacun de ces termes possédant une valeur d équilibre préférentielle, l énergie minimale sera recherchée par optimisation de la géométrie de la structure par rapport à des paramètres structuraux de référence (pour les protéines, ces données correspondent aux résultats issus de la cristallographie). Cette procédure de recherche minimale de l énergie porte le nom de minimisation. Le principe consiste à déplacer individuellement chaque atome de la structure et à recalculer son énergie potentielle après chaque déplacement. Cette opération est répétée jusqu à atteindre une valeur de l énergie potentielle la plus basse possible. Les différentes fonctions énergétiques choisies définissent le champ de force, qui doit être le plus adapté possible au calcul des variations de l énergie potentielle en fonction de la géométrie de base. L avantage d une telle approche empirique réside dans le fait que les calculs sont facilement maîtrisables et surtout assez rapides. De plus, la simplicité de définition des termes énergétiques permet de traiter des molécules de taille importante. Toutefois, la mécanique moléculaire ne permet pas de rendre compte de la formation et de la rupture des liaisons, un pré-requis pour la simulation de l état de transition. Les méthodes de mécanique quantique, basées sur la solution de l équation de Schrödinger, permettent de lever ces limitations. Elles fournissent avec une très grande exactitude des modèles moléculaires et permettent de traiter les effets électroniques. Cependant, la complexité des calculs limite leur application à des cibles chimiques constituées de peu d atomes. Les méthodes hybrides combinant la mécanique moléculaire et la mécanique quantique représentent une alternative intéressante. Le substrat et le site actif de l enzyme peuvent être modélisés en utilisant la mécanique quantique tandis que le reste du système enzymatique peut être modélisé via la mécanique moléculaire. 57

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE 3.3.2.2. Techniques de modélisation moléculaire pour l étude de l énantiosélectivité Pour comprendre la sélectivité des lipases à l échelle moléculaire, trois approches principales sont employées. La première consiste à utiliser un inhibiteur suicide chiral (analogue de substrat) qui mime le complexe covalent formé entre la lipase et l énantiomère le mieux reconnu, ce complexe sera ensuite cristallisé. Les structures obtenues servent ensuite de matrice pour modéliser le complexe enzyme/énantiomère non reconnu et analyser les facteurs responsables de l énantiosélectivité de l enzyme (Lang et coll., 1998 ; Luic et coll., 2001). La seconde consiste à modéliser l état de transition obtenu avec chacun des énantiomères pour estimer l énergie d activation de la réaction dans chacun des cas et éventuellement corréler cette énergie avec la cinétique de la réaction. Cette approche repose sur l hypothèse que l état de transition de plus faible énergie doit correspondre à l énantiomère qui est le plus vite transformé par l enzyme. Les auteurs considèrent généralement l intermédiaire tétraédrique de la réaction (figure 20) comme étant le meilleur modèle de l état de transition (rrenius et coll., 1998b). Asp H1 ------ H - His N ---- + ---- Enzyme Ser R H2 N R H - H4 H3 NH H5 R' NH trou ---- ---- ---- ---- R' Substrat Intermédiaire tétraédrique oxyanion Figure 20 : Représentation schématique de l intermédiaire tétraédrique avec les cinq liaisons hydrogène (H1-H5) nécessaires à la stabilisation. L intermédiaire tétraédrique est formé par l attaque nucléophile de la sérine catalytique sur la fonction carbonyle du substrat. La troisième approche repose sur un simple arrimage (docking) du substrat à l intérieur du site actif de l enzyme. n suppose dans ce cas que l énantiosélectivité résulte d un arrimage préférentiel de l un des énantiomères (Botta et coll., 1997 ; Manetti et coll., 2000 ; Tyagi et Pleiss, 2006). 58

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE Dans les deux dernières approches, les complexes enzyme/substrat formés sont soumis à diverses procédures de calculs d optimisation de la conformation par minimisation d énergie parfois accompagnées de procédures de dynamique moléculaire. Les données de la littérature montrent que la modélisation de l état de transition est l approche la plus employée pour étudier les interactions moléculaires enzyme/substrat (Norin et coll., 1994 ; Holmquist et coll., 1996 ; Yagnik et coll., 1997 ; Berglund et coll., 1998 ; rrenius et coll., 1998a,b ; Haeffner et Norin, 1999 ; Hwang et coll., 2000 ; Pleiss et coll., 2000b ; Schulz et coll., 2000, 2001 ; Tomic et Kojic-Prodic, 2002 ; Tomic et coll., 2004 ; Mittal et coll., 2005 ; Tomic et Ramek, 2006). utre l estimation de l énergie d activation, la modélisation de l état de transition permet également de déterminer le mode d orientation des énantiomères et d examiner les interactions avec les acides aminés du site actif de l enzyme. Dans la plupart des cas, la modélisation moléculaire permet de formuler des hypothèses pour expliquer l énantiosélectivité des lipases, mais il reste cependant très difficile de prédire et de quantifier le degré d énantiosélectivité (Kazlauskas, 2000, 2001). De plus, les interprétations sur l énantiosélectivité à l échelle moléculaire, résultant de l analyse de modèles, doivent être corrélées à des résultats expérimentaux pour être validées. 3.4. AMELIRATIN DE L ENANTISELECTIVITE L évolution de l ingénierie biomoléculaire au cours de ces dernières années a permis de développer des procédés de biocatalyse efficaces en remodelant les enzymes, c est-à-dire en modifiant et/ou en améliorant leurs capacités naturelles (Bornscheuer et Pohl, 2001 ; Zhao et coll., 2002 ; Jaeger et Eggert, 2004 ; Lutz et Patrick, 2004 ; Rubin-Pitel et Zhao, 2006). Ce remodelage peut être envisagé (i) de manière rationnelle, par mutagénèse dirigée si la structure de l enzyme est connue et si les acides aminés impliqués dans la sélectivité sont identifiés (Harris et Craik, 1998 ; Svendsen, 2000 ; Cedrone et coll., 2000 ; Rabhi et coll., 2004), et/ou (ii) de manière aléatoire par les techniques d évolution moléculaire dirigée qui ne nécessitent pas de connaissance structurale de l enzyme (Reetz et Jaeger, 1999, 2000 ; Powell et coll., 2001 ; Arnold et Georgiou, 2003 ; Dalby, 2003 ; Jaeger et Eggert, 2004 ; Reetz, 2004a,b ; Yuan et coll., 2005 ; Kaur, 2006). 59

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE 3.4.1. L approche rationnelle L approche rationnelle consiste à changer spécifiquement, par mutagénèse dirigée, un (ou des) acide(s) aminé(s) d une protéine. Ces cibles de mutagénèse sont généralement identifiées par alignements de séquences ou par analyse de la structure tri-dimensionnelle de l enzyme obtenue par cristallographie et analyse aux rayons X ou modélisée. Cette stratégie nécessite une connaissance détaillée de la structure de la protéine et des relations structure/fonction. Plusieurs structures cristallographiques de lipases sont actuellement disponibles dans la Protein DataBank (PDB ; Bernstein et coll., 1977), comme par exemple celles de Rhizomucor miehei (Brady et coll., 1990), Thermomyces lanuginosa (Derewenda et coll., 1994a,b ; Lawson et coll., 1994), Burkholderia glumae (Noble et coll., 1993), Candida antarctica (Uppenberg et coll., 1994, 1995), Candida rugosa (Grochulski et coll., 1994), Chromobacterium viscosum (Lang et coll., 1996), Burkholderia cepacia (Kim et coll., 1997 ; Schrag et coll., 1997) et Pseudomonas aeruginosa (Nardini et coll., 2000). Les techniques de mutagénèse dirigée comme la PCR par overlap extension (Higuchi et coll., 1988), la PCR inverse (chman et coll., 1988), ou encore la PCR avec megaprimer (Ke et Madisson, 1997) reposent toutes sur l emploi de la méthode PCR (Polymerase Chain Reaction). Dans le tableau 3 sont reportés quelques exemples de lipases dont les propriétés ont été améliorées et/ou modifiées par mutagénèse dirigée. n note que le modelage rationnel cible plus souvent les acides aminés proches du site actif. En effet, leur rôle dans l interaction avec le substrat peut être plus facilement identifié (Morley et Kazlauskas, 2005 ; Park et coll., 2005). Bien que de nombreuses études aient fournies une base moléculaire pour la compréhension de l énantiosélectivité des lipases (Patkar et coll., 1998; Tuomi et Kazlauskas, 1999; Rotticci et coll., 2001; Lutz, 2004; Ema et coll., 2005), augmenter celle-ci par ingénierie rationnelle reste encore un challenge. L effet d une mutation est encore difficilement prévisible, en particulier pour les mutations les plus distantes du site actif. 60

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE Tableau 3 : Exemples de propriétés de lipases améliorées par mutagénèse dirigée. Lipases Variants Propriété améliorée / Substrat Références Lipase B de Candida antarctica M72L Stabilité face aux oxydants Patkar et coll., 1998 Lipase B de Candida antarctica S47A Stéréosélectivité / 1-chloro-octanol Rotticci et coll., 2001 Lipase B de Candida antarctica T103G Thermostabilité Patkar et coll., 1998 Lipase B de Candida antarctica W104A Enantiosélectivité / alcools secondaires Magnusson et coll., 2005 Lipase de Rhizopus delemar V209W/F112W Sélectivité / triglycérides à chaîne courte Klein et coll., 1997 Lipase de Rhizopus oryzae L258F/L254F Stéréosélectivité / di-, triradylglycérides Scheib et coll., 1998 Lipase de Burkholderia cepacia NBRC 14595 I287F Enantiosélectivité / alcools secondaires Ema et coll., 2005 Lipase de Burkholderia cepacia KWI-56 F119A/L167M Sélectivité / esters à longues chaînes Yang et coll., 2002 Lipase de Humicola lanuginosa G225P Thermostabilité Svendsen et coll., 1992 Lipase de Pseudomonas aeruginosa S53P/L162G Enantiosélectivité / 2-méthyldécanoate de p-nitrophényl Reetz et coll., 2007 3.4.2. L approche aléatoire L approche aléatoire ou évolution moléculaire dirigée s inspire des mécanismes de l évolution Darwinienne basés sur la mutagénèse aléatoire, la recombinaison et la sélection de mutants. Il s agit de mimer en laboratoire et en accéléré les phénomènes naturels. Le principe, résumé dans la figure 21, est simple et ne nécessite pas a priori de connaissances de la structure, fonction ou du mécanisme de l enzyme (Jaeger et Reetz, 2000 ; Reetz et Jaeger, 2000). L évolution dirigée se fait en trois étapes : (i) la création d une banque de gènes mutés, (ii) son expression fonctionnelle et (iii) la sélection ou le criblage des mutants ayant les 61

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE propriétés désirées. Le ou les gènes codant pour une enzyme améliorée peuvent ensuite subir d autres cycles d évolution moléculaire pour améliorer encore les performances. Enzyme gène(s) Créer une banque par mutagenèse aléatoire et,ou par recombinaison ep-pcr, DNA-shuffling, StEP Identification des mutants ayant une meilleure énantiosélectivité UV, ph, HPLC-CD, SM 2 ème génération Identification de la mutation optimale Identification de la position de la mutation Séquençage des gènes mutés Figure 21 : Stratégie pour la création d enzyme énantiosélective par évolution dirigée (d après Jaeger et Reetz, 2000). Les principales techniques d évolution moléculaire dirigée sont présentées dans le tableau 4. Ces méthodes génèrent des banques comprenant entre 10 6-10 13 mutants. Plus le nombre de mutants sera élevé, plus les chances de trouver le mutant possédant la caractéristique désirée seront grandes mais plus celui-ci sera difficile à isoler. Il est donc primordial de mettre au point des techniques de sélection et/ou de criblage efficaces et à haut débit pour isoler les mutants améliorés. Cependant, ces techniques sont délicates à développer. Elles sont très souvent spécifiques de l amélioration recherchée et nécessitent une optimisation coûteuse pour éviter, en particulier, l isolement de faux positifs. 62

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE Tableau 4 : Techniques d évolution dirigée avec leurs principaux avantages et inconvénients (d après tten et Quax, 2005). Catégories Description Exemples de techniques Références Mutagénèses aléatoires Introduction au hasard de mutations PCR à erreurs Cadwell et Joyce, 1992 sur le gène d intérêt Mutagénèse chimique Singer et Kusmierek, 1982 Souches mutatrices Nguyen et Daugherty, 2003 Shuffling Recombinaison de petits fragments de gènes mutés basée sur de l homologie de séquence. Ces gènes mutés sont obtenus à partir de différentes stratégies de mutagenèse ou de différentes espèces ou souches. Ces techniques permettent d obtenir un fort taux de recombinaison mais il est difficile de séparer des mutations proches. Shuffling Family shuffling RPR RETT SCRATCHY Stemmer, 1994a,b Crameri et coll., 1998 Shao et coll., 1998 Lee et coll., 2003 Lutz et coll., 2001 Shuffling sur des gènes parentaux entiers Recombinaison de petits fragments de gènes issus de différentes origines en utilisant un ou plusieurs brins des gènes parentaux entiers comme matrice. Un fort taux de recombinaison peut être obtenu mais ces techniques sont délicates à mettre en œuvre. StEP RACHITT Zhao et coll., 1998 Coco et coll., 2001 Simple crossing-over Recombinaison de gènes nonhomologues par ligation de fragments N- et C-terminaux de deux gènes différents. La sélection des nouveaux gènes est basée sur la taille. La recombinaison entre des gènes peu ou pas homologues est possible, mais il n existe qu un seul point de recombinaison dans la séquence hybride. ITCHY SHIPREC SCRATCHY stermeier et coll., 1999 Sieber et coll., 2001 Lutz et coll., 2001 Échange de domaines Recombinaison de fragments de gènes basée sur des caractéristiques structurales ou fonctionnelles ou de fragments peu homologues issus de différentes espèces ou souches. La librairie de mutants obtenus permet d avoir accès à des enzymes plus actives mais comportant seulement quelques points de recombinaison souvent difficile à identifier. DGS SISDC YLBS SCPE Gibbs et coll., 2001 Hiraga et Arnold, 2003 Kitamura et coll., 2002 Maille et coll., 2002 Recombinaison in vivo Recombinaison en utilisant le système de recombinaison homologue (gaprepair) de la levure ou le système rece/rect d E. coli. Un fort rendement peut être obtenu, aucune étape de ligation n est nécessaire mais il faut disposer de vecteurs spécifiques. CLERY ET-recombination Abecassis et coll., 2000 Strausberg et coll., 1995 Shuffling synthétique Recombinaison de mutations connues ou non à l aide d oligonucléotides synthétiques. Cette technique permet de recombiner des mutations proches mais est onéreuse. DHR Synthetic shuffling AD Coco et coll., 2002 Ness et coll., 2002 Zha et coll., 2003 63

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE L évolution dirigée a donc émergé au cours de ces dernières années comme une approche alternative au modelage rationnel, permettant d améliorer les propriétés des enzymes (efficacité, thermostabilité, sélectivité) et leurs performances. Quelques exemples d amélioration des lipases par évolution dirigée sont reportés dans le tableau 5. Tableau 5 : Exemples de lipases améliorées par évolution dirigée. Lipases Propriété améliorée / Substrat Références Lipase de Pseudomonas aeruginosa Enantiosélectivité / esters chiraux Reetz et coll., 2004b Lipase de Trichosporon brassicae Enantiosélectivité / esters chiraux Wu et coll., 2003 Lipase B de Candida antarctica Thermostabilité Zhang et coll., 2003 Lipase de Bacillus subtilis Enantiosélectivité / 1,4-diacetoxycyclopent-2-one Zha et coll., 2003 Lipase de Bacillus subtilis Enantiosélectivité / 1-(2-naohtyl)ethyl acetate Funke et coll., 2005 Lipase de Bacillus subtilis Thermostabilité Acharya et coll., 2004 Lipase de Rhizopus arrhizus Thermostabilité Niu et coll., 2006 Lipase de Rhizopus niveus Thermostabilité Kohno et coll., 2001 Lipase de Thermomyces lanuginosa Stabilité dans les détergents Svendsen et coll., 1997 Avec l augmentation de la masse d information sur les structures tridimensionnelles et le développement des techniques de modélisation moléculaire, les perspectives en matière d évolution moléculaire dirigée s orientent de plus en plus vers des techniques semirationnelles d évolution (Voigt et coll., 2001 ; Chica et coll., 2005 ; Patrick et Firth, 2005 ; Braiuca et coll., 2006). 64

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE 3.4.3. Les techniques semi-rationnelles Les techniques d évolution dirigée introduisent des mutations de façon aléatoire le long d un gène d intérêt. Dans le(s) cas où il existe des informations structurales et/ou fonctionnelles sur l enzyme, il est avantageux d exploiter ces données pour créer de la diversité dans les zones prédites comme pouvant être les plus impliquées dans la propriété à modifier. 3.4.3.1 Identification des zones cibles Pour identifier les régions sur lesquelles il sera important de concentrer les efforts de mutagénèse, l analyse structurale combinée à des approches par modélisation moléculaire de complexe enzyme-ligand est incontestablement la méthode la plus utilisée au cours de ces dernières années (Koga et coll., 2003 ; Park et coll., 2005 ; Funke et coll., 2005 ; Reetz et coll., 2005, 2006a,b ; Reetz et Carballeira, 2007). Parallèlement, on voit se développer des approches chimiométriques qui permettent d identifier des corrélations entre séquence et activités. La chimiométrie est l'application d outils mathématiques et statistiques permettant l exploitation des données expérimentales afin d améliorer la compréhension des systèmes étudiés (Braiuca et coll., 2006). Cette discipline comprend un grand nombre de techniques parmi lesquelles (i) la méthodologie des plans d expériences, qui a pour objectif d'organiser mathématiquement les conditions expérimentales afin de choisir les plus informatives, ce qui permet de minimiser le nombre d'expériences tout en maximisant l'information obtenue, et (ii) les méthodes multivariées d analyse de données, qui permettent d'extraire l'information appropriée contenue dans un système complexe en le décrivant par un nombre étendu de variables (jusqu à plusieurs milliers). Le nombre d applications de la chimiométrie en biocatalyse a significativement augmenté au cours des dernières années, particulièrement dans le cadre de l optimisation de procédés industriels (Lee et coll., 2000a). Parmi ces approches, les méthodes 3D QSAR (three-dimensional quantitative structureactivity relationships) sont à l interface entre la modélisation moléculaire et la chimiométrie. Elles utilisent les données issues de la modélisation moléculaire comme variables d entrée pour les méthodes multivariées d analyse. Bien que les méthodes 3D QSAR soient 65

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE largement utilisées pour la synthèse de médicaments, l application de ces méthodes en biocatalyse n a été introduite que récemment via les études de Tomic et coll. Ces travaux portent sur la prédiction de l énantiosélectivité de la lipase de Burkholderia cepacia vis-à-vis d alcools secondaires (Tomic et Kojic-Prodic, 2002 ; Tomic et coll., 2004). 3.4.3.2 Génération de diversité sur les zones cibles La mutagénèse à saturation est la méthode de choix pour explorer la diversité sur des positions jouant un rôle clé. Elle désigne un ensemble de techniques mettant en œuvre des oligonucléotides dégénérés pour introduire toutes les mutations possibles sur un ou plusieurs codons choisis au préalable. Dans le tableau 6 ci-dessous sont référencés des exemples d amélioration des lipases par l utilisation de ces techniques. Tableau 6 : Exemples de lipases améliorées par l utilisation de techniques de mutagénèse à saturation. Lipases Propriété améliorée / Substrat Références Lipase de Pseudomonas aeruginosa Enantiosélectivité / esters chiraux Liebeton et coll., 2000 Reetz et coll., 2001, 2006c Lipase de Pseudomonas aeruginosa Spécificité / esters chiraux Reetz et coll., 2005, 2006c Lipase de Pseudomonas aeruginosa Enantiosélectivité / allènes racémiques Carballeira et coll., 2007 Lipase de Burkholderia cepacia KWI-56 Enantiosélectivité / esters chiraux Koga et coll., 2003 Lipase de Bacillus subtilis Thermostabilité Reetz et coll., 2006a Lipase de Bacillus subtilis Inversion d énantiosélectivité / 1-(2-naphtyl) acétate d éthyle Reetz et Carballeira, 2007 Funke et coll., 2005 66

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE 4. LIPASE DE BURKHLDERIA CEPACIA ATCC21808 (BCL) Les lipases appartenant aux genres Pseudomonas et Burkholderia sont parmi les plus grands groupes de lipases microbiennes compte tenu du nombre de publications parues sur leur isolement, leur production naturelle ou recombinante et leur purification. Ce sont les biocatalyseurs les plus utilisés pour la production énantiosélective d alcools, d amines et d acides carboxyliques (Gilbert, 1993 ; Soberon-Chavez et Palmeros, 1994 ; Svendsen et coll., 1995 ; Jaeger et coll., 1996 ; Reetz et Jaeger, 1998 ; Rosenau et Jaeger, 2000). 4.1. RIGINE Les lipases bactériennes sont classées en six familles selon leur homologie de séquence. La famille I ou famille dite des vraies lipases comprend au total vingt-deux lipases, ellesmêmes classées en six sous-familles (tableau 7). Les lipases issues des genres Pseudomonas et Burkholderia sont retrouvées dans les sous-familles I.1, I.2 et I.3. Parmi les lipases de la sous-famille I.2 se trouvent celles produites par différentes souches de la bactérie Gram négative Burkholderia cepacia (anciennement dénommée Pseudomonas cepacia), notamment B. cepacia ATCC 21808 (Kordel et coll., 1991), B. cepacia DSM 3959 (Jörgensen et coll., 1991), B. cepacia M-12-33 (Nakanishi et coll., 1989, 1991) et B. cepacia KWI-56 (Iizumi et coll., 1990, 1991). Au cours de cette étude, nous nous intéresserons à la lipase de B. cepacia ATCC21808. Pour plus de clarté, cette lipase sera nommée BCL dans la suite de l exposé. 67

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE Tableau 7 : Classification des lipases de la famille I en sous-familles selon leur homologie de séquence. Les lipases de structures tridimensionnelles connues sont indiquées par un astérisque (d après Arpigny et Jaeger, 1999). Sous-familles rigine microbienne des lipases Similarité (%) Famille Sous-familles 1 Pseudomonas aeruginosa* Pseudomonas fluorescens C9 Vibrio cholerae Acinetobacter calcoaceticus Pseudomonas fragi Pseudomonas wisconsinensis Proteus vulgaris 100 95 57 43 40 39 38 2 Burkholderia glumae* Chromobacterium viscosum* Burkholderia cepacia* Pseudomonas luteola 35 35 33 33 100 100 78 77 3 Pseudomonas fluorescens SIK W1 Serratia marescens 14 15 100 51 4 Bacillus subtilis Bacillus pumilus 16 13 100 80 5 Bacillus stearothermophilus Bacillus thermocatenulatus Staphylococcus hyicus Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis 15 14 15 14 13 100 94 29 28 26 6 Propionibacterium acnes Streptomyces cinnamoneus 14 14 100 50 4.2. CARACTERISTIQUES STRUCTURALES 4.2.1. Généralités BCL est une lipase de faible poids moléculaire (33 kda), constituée de 320 acides aminés et commercialisée par les sociétés Roche (Chirazyme L-1) et Amano (Amano P ou Amano PS). Sa structure cristallographique a été déposée dans la PDB sous différents codes : (i) 1IL (Kim et coll., 1997), (ii) 2LIP et 3LIP (Schrag et coll., 1997), (iii) 4LIP et 5LIP (Lang et coll., 1998), (iv) 1HQD (Luic et coll., 2001) et (v) 1YS1, 1YS2 (Mezzetti et coll., 2005). Notons que cette lipase a toujours été cristallisée sous forme ouverte. 68

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE La triade catalytique de BCL est constituée de la Sérine catalytique (Ser87), de l Histidine 286 et de l Acide Aspartique 264. BCL est une lipase de type GX dont le trou oxyanion est défini par la Leucine 17 et la Glutamine 88. De plus, la superposition des conformations fermées des lipases de B. glumae (Noble et coll., 1993) et de C. viscosum (Lang et coll., 1996) avec la conformation ouverte de BCL (Kim et coll., 1997) suggèrent que le sous-domaine, constitué des résidus 118 à 166, correspondrait à un volet amphiphile capable de se refermer sur le site actif (figure 22). La mobilité de ce sous-domaine a été mise en évidence par des études de dynamique essentielle (Lee et coll., 2000b). Figure 22 : Structure 3-D de BCL sous sa forme ouverte et montrant le repliement α/β hydrolase. Le sous-domaine en bleu pourrait constituer le volet amphiphile. Les résidus D264, H286, S87 forme la triade catalytique (Kim et coll., 1997). 4.2.2. Pont disulfure et site de liaison au calcium BCL présente un pont disulfure et un site de liaison au calcium, également retrouvés dans la sous-famille I.1 (figure 23) (Arpigny et Jaeger, 1999). 69

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE Figure 23 : Alignements de séquence entre les lipases des sous-familles I.1 et I.2. = acides aminés de la triade catalytique ; ο = résidus cystéines impliqués dans la formation de ponts disulfures ; = acides aspartiques impliqués dans le site de liaison au calcium (Arpigny et Jaeger, 1999). 4.2.2.1. Pont disulfure Le pont disulfure se situe entre les résidus Cys-190 et Cys-270 (Kim et coll., 1997). Les ponts disulfures sont généralement formés dans le périplasme bactérien, qui est un environnement oxydant, par l intermédiaire de disulfures oxydoréductases (Dsb) (Andersen et coll., 1997 ; Missiakas et Raina, 1997 ; Urban et coll., 2001). Des études menées sur les ponts disulfures des lipases de P. aeruginosa (Liebeton et coll., 2001) et B. glumae (El Khattabi et coll., 2000, 2003) ont mis en évidence qu ils n étaient essentiels ni à l activité enzymatique, ni au processus de repliement. Ils contribueraient principalement à la stabilisation de ces protéines. L absence de ponts disulfures entraîne in vivo une diminution de la quantité de lipase produite attribuée à une dégradation protéolytique des formes instables (Liebeton et coll., 2001 ; Urban et coll., 2001) 70

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE A l inverse, pour les lipases de B. cepacia DSM3959 et KWI-56, il semble que les ponts disulfures jouent un rôle important dans le repliement. Hobson et coll., (1995), ont démontré qu en présence d agents réducteurs, la lipase de B. cepacia DSM3959 ne pouvait être repliée. De même, la lipase de B. cepacia KWI-56, mutée sur l une des cystéines est très peu active probablement en raison d un mauvais repliement (Yang et coll., 2000). 4.2.2.2. Site de liaison au calcium La lipase de B. cepacia (BCL) possède également un site de liaison au calcium constitué des acides aminés Asp242, Asp288, Gln 292 et Val296 ainsi que de deux molécules d eau (Kim et coll., 1997). Cependant, le rôle du calcium dans les lipases n est pas parfaitement clair. Dans le cas de la lipase de B. cepacia KWI-56, la substitution des ligands du calcium (Asp242 et Asp288) par des résidus alanine prévient la formation d enzyme active, suggérant ainsi un rôle important dans la catalyse (Yang et coll., 2000). A l inverse, la distance entre l ion calcium et la sérine catalytique de BCL (Kim et coll., 1997 ; Schrag et coll., 1997) rend peu probable le rôle du calcium dans la catalyse. L ion jouerait plutôt un rôle au niveau structural. Le calcium joue également différents rôles dans les lipases de P. aeruginosa et B. glumae. En effet, celui-ci a été rapporté comme essentiel pour le repliement in vitro de la lipase de P. aeruginosa (Shibata et coll., 1998a) alors que la lipase de B. glumae peut se replier en l absence de calcium (El Khattabi et coll., 2003). Dans la lipase de P. aeruginosa, les ligands du calcium sont situés sur la même boucle que l histidine catalytique et la fixation de l ion pourrait affecter le positionnement de cette dernière (Nardini et coll., 2000). A l inverse, bien que la lipase de B. glumae ait une structure similaire (Noble et coll., 1993), le fait qu elle se replie en l absence de calcium suggère que l histidine catalytique est correctement positionnée même en l absence de calcium (El Khattabi et coll., 2003). 71

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE 4.2.3. Topographie du site actif Le site actif de BCL, en forme d entonnoir, est composé de trois poches (Schrag et coll., 1997). Selon la nomenclature de Lang et coll., (1998), ces trois poches sont: (i) la poche HA hydrophobe, dans laquelle se lie la partie acyle du substrat et qui est délimitée par les acides aminés Leu-17, Pro-113, Phe-119, Leu-164, Leu-167, Val-266 et Val-267; (ii) la poche HH hydrophobe/hydrophile, dans laquelle se lie la partie alkyle du substrat et qui est délimitée par les acides aminés Gln-16, Thr-18, Tyr-23, His-86, Leu-287, Ile-290, Gln-292 et Leu-293 et (iii) la poche HB correspond à la zone qui se situe entre les poches HA et HH (figure 24). Les acides aminés de la triade catalytique Ser-87 et His-286 ainsi que la Leu-17 sont situés à la jonction des poches HA et HH. Figure 24 : Vue de dessus du site actif de BCL. Représentation des différentes poches du site actif par calcul de la surface de Connolly (Guieysse et coll., 2003b). 72

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE 4.3. ETUDE DE L ENANTISELECTIVITE DE BCL Les lipases catalysent le dédoublement de trois types de substrats (figure 25). Les substrats de type I comme les acides carboxyliques racémiques, les substrats de type II comme les esters (ou amides) racémiques par leur partie alcool (ou amine) et les substrats de type III, correspondant au second substrat de la réaction : alcools ou amines racémiques. R* -X R -X* R -X substrat de type I substrat de type II E1 R* -ENZ R -ENZ R -ENZ + HX + HX* + HX E2 + Nu + Nu + Nu* substrat de type III R* -Nu R -Nu R -Nu* Figure 25 : Les différents types de dédoublement BCL est l un des catalyseurs les plus utilisés pour la résolution cinétique de mélanges racémiques d alcools primaires et secondaires et de leurs esters (Zuegg et coll., 1997 ; Lundwell et coll., 1998 ; Tuomi et Kazlauskas, 1999 ; Schulz et coll., 2000 ; Kamal et coll., 2002 ; Tomic et Kojic-Prodic, 2002 ; Ghanem et Schurig, 2003 ; Tomic et coll., 2004 ; Mezzzetti et coll., 2005 ; Tomic et Ramek, 2006 ; Chojnacka et coll., 2007) ainsi que d acides carboxyliques (Kalaritis et coll., 1990 ; Palomer et coll., 1993 ; Hagan et Rzepa, 1994 ; Jones et Williams, 1998 ; Sundholm et Kanerva, 1998 ; Miyazawa et coll., 2000 ; Tranel et Haufe, 2000 ; Guieysse et coll., 2001, 2003a,b). 73

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE 4.3.1. Cas du dédoublement des acides 2-substitués Le dédoublement d acides carboxyliques par les lipases est cinétiquement plus complexe que le dédoublement d alcool, car deux complexes acyl-enzymes peuvent se former : RC-Enz et SC-Enz, (figure 26). De plus, la formation et la rupture de l acyl-enzyme passent par des états de transition (RCR1--Enz et SCR1--Enz) possédant deux centres asymétriques pouvant être impliqués dans la discrimination des deux énantiomères. Ainsi, le dédoublement peut se produire au niveau de la première ou de la seconde étape de formation de l acyl-enzyme. Dans le cas idéal où l enzyme est totalement énantiosélective, il se forme un seul acyl-enzyme. Ce cas est cependant très rare et la majorité des dédoublements sont des dédoublements cinétiques. SCR 1 --Enz RCR 1 --Enz R 1 H R 1 H SCR 1 RCR 1 SC-Enz R 2 H ou H 2 SCH SCH--Enz Enz-H RCH RCH--Enz RC-Enz H 2 ou R 2 H Figure 26 : Représentation schématique du dédoublement d acide carboxylique catalysé par les lipases. Enz-H, enzyme avec la sérine catalytique. RC-Enz et SC-Enz, complexes acylenzyme avec les énantiomères R et S. RCR 1 et SCR 1, les deux énantiomères de l ester racémique ou acide si R 1 =H. Cette représentation est aussi valable pour une réaction d hydrolyse, d estérification qu une réaction de transestérification si l eau est remplacée par un alcool (R 2 H), (d après Hult et Holmquist, 1997). Ainsi, les étapes d acylation et de déacylation peuvent être responsables de l énantiosélectivité des lipases. Cela signifie que la partie acyle, la partie alcool du substrat, mais aussi le nucléophile utilisé dans le cas d une réaction autre qu une réaction d hydrolyse, sont susceptibles d influencer l énantiosélectivité de l enzyme. Parmi les acides 2-substitués, les acides 2-halogèno-carboxyliques interviennent notamment dans la synthèse de prostaglandines, de prostacyclines (vasodilatateur, antiagrégant plaquétaire, bronchodilatateur), (Kalaritis et coll., 1990 ; Tranel et Haufe, 2000), ou encore dans la synthèse de pénicillines semi-synthétiques, de sels de thiazolium antiulcéreux, (Bouisset et Radisson, 1991). 74

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE Kalaritis et coll., (1990), ont observé que BCL (Amano P-30) avait une bonne énantiosélectivité (E=36) pour le dédoublement du 2-fluoro hexanoate d éthyle en réaction d hydrolyse (ph 7). Le facteur qui contrôle l énantiosélectivité n est pas dans ce cas de nature stérique car le rayon de van der Waals d un atome de fluor (1,35 Å) est comparable à celui d un atome d hydrogène (1,2 Å). C est la présence de liaisons hydrogène ou d interactions dipôle-dipôle intervenant avec l atome de fluor qui stabiliserait le complexe et influencerait l énantiosélectivité de la lipase. Dasaradhi et Hagan, (1993), et Hagan et Rzepa, (1994), ont suggéré que le diastéréoisomère préférentiellement formé devait posséder un atome de fluor antipériplanaire à l attaque nucléophile de la sérine catalytique. Ainsi, le nucléophile (Ser- - ) serait stabilisé par l orbitale δ * (sigma) anti-liante de la liaison Carbone-Fluor (figure 27). Ce type d effet électronique peut contribuer significativement à l énantiosélectivité de la lipase. C H 3 F Et Lipase P-30 60 % conversion C H 3 ee > 99 % F H Figure 27 : Dédoublement de l acide 2-fluoro-hexanoique catalysé par BCL (Dasaradhi et Hagan, 1993). Tranel et Haufe, (2000), ont observé une énantiosélectivité maximale de valeur E=2 (ph 6), E=3,6 (ph 7) pour le dédoublement de l acide 2-fluoro-décanoique en réaction d hydrolyse d éthyl ester par BCL (Amano PS) et dans des conditions expérimentales similaires à celles de Kalaritis et coll., (1990). L énantiosélectivité de la réaction variait selon l ester utilisé (E=14,4 en présence du méthyl ester) et selon le type de réaction. En réaction d estérification BCL montre une énantiosélectivité égale à 19, en présence d octanol et de cyclohexane l activité de l eau étant contrôlée. Finalement, il n est pas possible d établir de conclusion claire sur la sélectivité de la lipase de B. cepacia (Amano) pour le dédoublement d acide 2-fluoro carboxylique, car il ne s agit pas exactement de substrat identique entre l étude de Kalaritis et coll., (1990), et de Tranel et Haufe, (2000), de plus la préparation enzymatique en l espace de dix années était certainement différente. 75

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE Concernant les interactions enzyme/substrat impliquées dans l énantiosélectivité de BCL lors du dédoublement d acides 2-substitué, une seule étude sur le dédoublement de substrats de type α-bromo-tolyl acétate d alkyle via des réactions de transestérification (réaction-1) est disponible (Guieysse et coll., 2001, 2003a,b). Br Br Br R 1 R 2 + R 3 + R 1 R 2 + R 2 -H R 3 -H R 1 (R,S) Réaction 1 (R) (S) Les auteurs ont dans un premier temps mis en évidence que l énantiosélectivité de BCL était faiblement influencée par les conditions expérimentales de la réaction telles que le solvant, l activité de l eau et la température (Guieysse et coll., 2001). L influence des parties acyle (- R 1, -X, tableau 8) et alkyle (-R 2, tableau 8) sur l énantiosélectivité ont été évaluée (Guieysse et coll., 2002, 2003a). Lorsque le substrat n est pas substitué sur le cycle aromatique ou lorsque la substitution est localisée en position méta ou para, la lipase est très énantiosélective. Au contraire, la substitution en ortho provoquerait une gêne stérique qui freinerait la discrimination entre les deux énantiomères. D autre part, la substitution de l atome de brome, présent sur le centre asymétrique, par un atome de chlore ou un atome de fluor indique que l énantiosélectivité de BCL diminue lorsque l halogène est plus petit et plus électronégatif (-X, tableau 8). Cependant, la substitution de l atome de brome par un groupement méthyle neutre a mis en évidence que l énantiosélectivité de BCL n était pas gouvernée par l électronégativité du substituant X présent sur le carbone asymétrique mais principalement par son encombrement stérique (tableau 8). En ce qui concerne la nature de la partie alkyle du substrat, plus celle-ci est chargée négativement (bon nucléophuge), plus l énantiosélectivité de la lipase diminue (-R 2, tableau 8). Guieysse et coll., (2003b), ont également mis en évidence que l énantiosélectivité de la réaction était principalement gouvernée par la première étape de la réaction (formation de l acyl-enzyme), car les concentrations et la nature des alcools (second substrat de la réaction, R 3 -H) testées ne se sont pas révélées influencer l énantiosélectivité (tableau 8). 76

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE Tableau 8 : Enantiosélectivité de la lipase de BCL lors du dédoublement de différents substrats de type α-bromo-tolyl acétate d alkyle par réaction de transestérification. R 1 R 2 R 3 -H -X E a Références Références 57 C H 3 -C 2 H 5 (n)-octanol - Br 4,3 Guieysse et coll., 2003a 59 C H 3 50 C H 3 -CH 3 58 -C 2 H 5 57 -(CH 2 ) 2 CH 3 39 -CH 2 (C 6 H 5 ) (n)-octanol - Br 18 Guieysse, 2002 -CH 2 -CH 2 -Cl 8 -CH 2 CF 3 4 -CH=CH 2 3 Butanol 70 Pentanol 63 -C 2 H 5 Hexanol - Br 64 Guieysse et coll., 2003b ctanol 57 Decanol 53 - Br 57 - C 2 H 5 (n)-octanol - Cl - F 26 1,5 Guieysse, 2002 - CH 3 35 (a) l énantiosélectivité (E) a été calculée selon le rapport des vitesses initiales d apparition des produits (R) et (S) : Vi R /Vi S. 77

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE Afin de mieux appréhender l influence des facteurs moléculaires responsables de l énantiosélectivité de BCL lors du dédoublement d acides 2-halogéno carboxyliques, Guieysse et coll., (2003b), ont modélisé le premier intermédiaire tétraédrique formé lors de la réaction de transestérification d un substrat modèle, l α-bromo phényl acétate d éthyle (réaction-2) Br Br Br -C 2 H 5 BCL C-C 8 H 17 + (n)-octanol + + ctane, 30 C (R,S) (R) (S) -C 2 H 5 C 2 H 5 -H Réaction 2 La modélisation de ces intermédiaires tétraédriques, formés avec chaque énantiomère, a révélé que les niveaux d énergie obtenus pour les deux complexes étaient équivalents, et que dans tous les cas, les liaisons hydrogène indispensables à la catalyse étaient formées. Ces résultats ne permettaient donc pas de rendre compte de la préférence de BCL pour l énantiomère (R) et semblaient indiquer que le positionnement de l un ou l autre des énantiomères était équivalent dans la poche du site actif. L approche s est donc révélée inadaptée à cet exemple (Guieysse et coll., 2003b). Les auteurs ont alors fait l hypothèse que l énantiopréférence pouvait intervenir chronologiquement en amont de l arrimage et de la formation de la liaison covalente par une différence d accessibilité du substrat dans le site actif de l enzyme. Dans ce cas, l accès préférentiel de l un des énantiomères contrôlerait la cinétique de la réaction. Ceci les a conduits à modéliser la trajectoire du substrat dans le site actif et à évaluer l énergie d interaction du couple enzyme-substrat. 78

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE 4.3.2. L accessibilité du substrat au site actif : un paramètre qui contribute à l énantiosélectivité? 4.3.2.1. Approche de pseudo-dynamique moléculaire Pour modéliser l accès du substrat, Guieysse et coll., (2003b), ont fait le choix de placer le substrat au cœur du site actif, et de le faire sortir par pas de 0,1 Å jusqu à l entrée du site actif. Il s agit donc de la trajectoire inverse à la trajectoire d entrée du substrat qui permet d initier le mouvement à partir d une position correcte et unique du substrat dans son site catalytique. A l extérieur du site actif, l environnement n étant pas contraint, il y aurait eu un nombre infini de positions possibles pour le substrat. A chaque déplacement du substrat, une procédure de dynamique moléculaire sous contrainte suivie d une optimisation de la structure par minimisation d énergie ont été combinées. La contrainte était celle d une distance appliquée entre le substrat et la sérine catalytique du site actif. La distance retenue à parcourir depuis le cœur du site actif jusqu à la surface de l enzyme était d environ 7,5 Å. Ainsi, la première contrainte de distance imposée était de 4,5 Å et la dernière de 12,15 Å. Pour chaque position du substrat à l intérieur du site actif, l énergie d interaction entre le substrat et le site actif de l enzyme a été calculée. L analyse des trajectoires des énantiomères R et S a mis en évidence que l énergie d interaction enzyme/substrat était systématiquement plus basse pour l énantiomère (R) que pour le (S), (figure 28). Cette observation soutient l hypothèse que l environnement du site actif était plus favorable au substrat (R). 79

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE Energie d' interaction (kcal/mol) 5 6 7 8 9 10-17 -22-27 -32 mode R I - R -37 mode S I - S -42 Distance enzyme-substrat (Å) Figure 28 : Energie d interaction entre chaque énantiomère et le site actif de l enzyme en fonction du positionnement du substrat dans le site actif (distance en Å) (Guieysse et coll., 2003b). Une analyse plus approfondie du site actif a révélé l existence d un réseau d acides aminés hydrophobes à chaîne latérale pivotante de type valine/leucine/isoleucine (figure 29). Ces acides aminés hydrophobes à têtes pivotantes sont suspectés de fonctionner de façon concertée, comme un mécanisme d horlogerie, entraînant le substrat à l intérieur du site actif. Figure 29 : Représentation du réseau d acides aminés hydrophobes à chaîne latérale pivotante du site actif de BCL. Le substrat est placé à l intérieur du site actif. Guieysse et coll., (2003b), ont alors identifié certains résidus hydrophobes interagissant avec le substrat dont la leucine 17 (à droite de la paroi du site actif) et la valine 266 (à gauche de la paroi du site actif). Ces deux acides aminés forment un goulot d étranglement et semblent contrôler l accessibilité du substrat au site actif (figure 30). 80

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE Figure 30 : Coupe du site actif de BCL. A la base du site actif se trouve la sérine catalytique (Ser-87 en rouge) avec à sa gauche l his-286 et l asp-264 de la triade catalytique. La leucine-17, située à droite de la paroi (jaune), et la valine-266, située à gauche de la paroi (violet), forment le goulot d étranglement du site actif (Guieysse et coll., 2003b). Pour valider cette interprétation, les auteurs ont travaillé sur le mutant PS-FVL de BCL, détenu par la société Amano. Il s agit d un triple mutant: V266L, L287I et F221L (Hirose et coll., 1995). Les acides aminés V266 et L287, impliqués dans l accessibilité du substrat au site actif, sont mutés respectivement par une leucine et une isoleucine, deux acides aminés à chaîne latérale plus encombrante. De ce fait, la mutation V266L réduit encore la taille du goulot d étranglement. Le mutant PS-FVL montre une excellente énantiosélectivité (E>200) pour le dédoublement du (R,S)-α-bromo phényl acétate d éthyle par rapport à l enzyme native (E=57). Ces résultats expérimentaux, en accord avec ceux attendus, viennent renforcer l idée que l accessibilité peut intervenir dans le contrôle de l énantiosélectivité. Cependant, cette approche de pseudo-dynamique moléculaire décrite par Guieysse et coll., (2003b), présente plusieurs limitations: (i) le calcul des trajectoires n est pas continu, (ii) les mouvements concertés de l enzyme et du substrat sont très difficiles à modéliser, (iii) la procédure n est pas automatique et (iv) les temps de calculs sont longs (plusieurs jours). Pour palier ces limitations, cette approche tout à fait novatrice, selon laquelle l accessibilité du substrat au site actif serait un facteur déterminant de l énantiosélectivité, a été enrichie par l emploi d un algorithme de planification de mouvements initialement développé pour le secteur de la robotique par le LAAS-CNRS. 81

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE 4.3.2.2. Approche robotique Dans cette approche robotique, les atomes du substrat et de l enzyme sont représentés par des sphères reliées. Le substrat est ainsi considéré comme un robot articulé se déplaçant dans un environnement également articulé, la protéine, dont les mouvements sont restreints par des contraintes géométriques permettant d éviter les conflits stériques entre les atomes. Cet algorithme de planification de mouvements permet donc de prendre en compte la flexibilité du substrat et la plasticité de l enzyme (Cortés et coll., 2005). La recherche des trajectoires du substrat dans le site actif de l enzyme se fait de façon aléatoire. L algorithme construit par incrémentation une structure arborescente qui étend ses branches vers des régions inconnues de l espace de recherche. Ceci permet une exploration complète de l espace géométrique contraint et enfoui du site actif (figure 31). Figure 31 : Représentation schématique de l exploration complète de l espace géométrique du site actif de BCL via l algorithme de planification de mouvements. Les courbes énergétiques obtenues via cette approche robotique sont comparables à celles obtenues via l approche de pseudo-dynamique moléculaire tout en réduisant les temps de calcul à seulement quelques minutes (figure 32). 82

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE (a) distance () distance () (b) 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 10,5-10 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 10,5-10 -15-15 -20-20 -25-25 -30-30 -35-40 energy-based approach R S -35-40 two-stage approach R S Figure 32 : (a) Trajectoires de chaque énantiomère du (R,S)-α-bromo phényl acétate d éthyle dans le site actif de BCL calculées par l approche de pseudo-dynamique moléculaire (Guieysse et coll., 2003b). (b) Trajectoires de chaque énantiomère du (R,S)-α-bromo phényl acétate d éthyle dans le site actif de BCL calculées par l approche de robotique (Cortés et coll., 2005). De plus, comme présenté dans le tableau 9, le rapport de temps de calcul moyen nécessaire pour obtenir 50 trajectoires avec les énantiomères (R) et (S) de l α-bromo phényl acétate d éthyle (E in-silico ) a pu être corrélé avec la valeur expérimentale de l énantiosélectivité (E exp ) (Cortés et coll., 2005). Ce résultat a également été étendu et validé à deux autres substrats (tableau 9). Tableau 9 : Comparaison des rapports des temps de calcul avec l énantiosélectivité expérimentale obtenus pour 3 substrats différents: (R,S)-α-bromo phényl acétate d éthyle [Ph(Br)Et], (R,S)-α-chloro phényl acétate d éthyle [Ph(Cl)Et], et (R,S)-α-fluoro phényl acétate d éthyle [Ph(F)Et] (Cortés et coll., 2005). (R,S)-ph(Br)Et (R,S)-ph(Cl)Et (R,S)-ph(F)Et Trajectoires (S/R) (sec.) Enantiosélectivité in silico (E in-silico ) 1840 / 29 63 306 / 18 17 18 / 17 1 Enantiosélectivité (vir/vis) expérimentale (E exp ) 57 (± 7) 26 (± 1) 1.5 (± 0.1) 83

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE L utilisation d un détecteur de collisions (Ruiz et coll., 2005), intégré à l algorithme de planification de mouvements, a permis d identifier les acides aminés contraignant le déplacement des énantiomères (R) et (S)-α-bromo phényl acétate d éthyle le long du site actif de BCL. 4.3.2.3. Mise en évidence de cibles de mutagénèse Guieysse et coll., (2003b), avaient identifié deux acides aminés clés, la valine 266 et la leucine 17, impliqués dans la discrimination des énantiomères. Ces acides aminés, qui forment un goulot d étranglement au milieu du site actif de BCL, seraient donc d éventuelles cibles de mutagénèse via lesquelles l énantiosélectivité de la lipase pourrait être modifiée. Ces cibles de mutagénèse ont ensuite été confirmées par l approche de robotique (Cortés et coll., 2005). En effet, l analyse des trajectoires calculées par l algorithme de planification de mouvements a permis de localiser les acides aminés impliqués dans la discrimination des énantiomères substrat. Le pourcentage de contact entre les acides aminés du site actif et chaque énantiomère en fonction de leur position dans le site actif de la lipase (depuis la sérine catalytique jusqu à l extérieur du site actif) a pu être déterminé (figure 33). n constate que ces collisions sont plus importantes dans le cas de l énantiomère (S) confirmant ainsi que l accessibilité du substrat au site actif est plus favorable à l énantiomère (R). Ces résultats sont en accord avec les temps de calcul nécessaires pour obtenir les trajectoires de cet énantiomère (tableau 9). 84

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE Figure 33 : Pourcentage de collisions détectées entre les atomes des acides aminés du site actif de BCL et les énantiomères (R) et (S) de l α-bromo phényl actétate d éthyle en fonction de la position du substrat à l intérieur du site actif. En mauve sont indiquées les collisions avec les squelettes des acides aminés du site actif et en bleu avec leurs chaînes latérales (Cortés et coll., 2005). Ces acides aminés clés ainsi identifiés au cours de l exploration apparaissent donc comme des cibles privilégiées de mutagénèse visant à modifier l énantiosélectivité du catalyseur. Pour tester l influence de ces positions de mutations sur l énantiosélectivité et poursuivre la validation du modèle selon lequel l accessibilité du substrat au site actif est un facteur déterminant de l énantiosélectivité, il est indispensable de générer des mutants ponctuels. Cependant, la construction de mutants ponctuels nécessite de disposer d un système efficace de production de BCL et d une méthode de purification. 85

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE 5. INGÉNIERIE DE LA LIPASE DE BURKHLDERIA CEPACIA ATCC21808 5.1. PRDUCTIN CHEZ L RGANISME NATUREL (PRDUCTIN HMLGUE) Le choix d un système d expression performant est indispensable pour la production fonctionnelle de lipases pures en grande quantité, et pour beaucoup de lipases, cette étape d expression n est pas triviale. En effet, la production et la sécrétion de lipases de type Pseudomonas et Burkholderia appartenant aux familles I.1 et I.2 sous forme actives requièrent (i) la présence d une protéine chaperonne ou Lif (Lipase-Specific Foldase) et (ii) l assistance d au moins trente protéines cellulaires, indiquant ainsi que le repliement et la sécrétion de ces lipases sont des processus hautement spécifiques (Rosenau et Jaeger, 2000). 5.1.1. Les protéines Lifs Les protéines Lifs représentent une famille unique de protéines classées en 4 familles distinctes selon leur homologie de séquence (tableau 10). Toutes les Lifs présentent une structure secondaire très similaire constituée presque exclusivement d hélices α (70%). Cette conservation au niveau de la structure peut indiquer non seulement une structure tridimensionnelle commune mais également un mécanisme d action identique (Rosenau et coll., 2004). Une autre caractéristique commune est la présence d une zone hydrophobe transmembranaire au niveau de leur domaine N-terminal. Celle-ci permet aux protéines Lifs de s ancrer à la membrane interne de la bactérie, évitant ainsi leur sécrétion dans le milieu extracellulaire (Frenken et coll., 1993a ; El Khattabi et coll., 1999). Les protéines Lifs, exprimées avec leurs lipases respectives sous forme d opéron, sont indispensables à l expression de ces dernières sous forme active (Hobson et coll., 1993 ; Aamand et coll., 1994 ; Jaeger et coll., 1994 ; Rosenau et Jaeger, 2000 ; Yang et coll., 2000 ; Rosenau et coll., 2004). En effet, elles sont impliquées dans la translocation et le repliement des lipases, via leur domaine C-terminal localisé dans le périplasme (Iizumi et coll., 1991 ; Jörgensen et coll., 1991 ; Chihara-Siomi et coll., 1992 ; Ihara et coll., 1992, 1995 ; Frenken et coll., 1993a,b ; Jaeger et coll., 1994 ; Shibata et coll., 1998b,c ; Quyen et coll., 1999). Elles agissent au niveau de structures conservées chez les lipases en formant avec celles-ci des complexes forts leur permettant d adopter une conformation active (Traub et coll., 2001 ; 86

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE Rosenau et coll., 2004). Cependant, le rôle des protéines Lifs in vivo est difficile à mettre en évidence car les processus de repliement et de sécrétion sont des processus cellulaires couplés. Tableau 10 : Classification des protéines Lifs selon leur homologie de séquence (d après Rosenau et coll., 2004). Familles rigine microbienne des protéines chaperonnes Identité (%) Nombre d acides aminés Composition en acides aminés (%) Hydrophobes Chargés (LIFVM) (KRED) 1 P. aeruginosa PA1 P. aeruginosa TE3285 P. pseudoalcaligenes P. mendocina P. wisconsinensis 100 100 55 51 30 340 340 344 335 352 25.0 24.7 25.3 26.9 24.1 26.2 26.2 24.4 25.1 25.6 2 B. glumae PG1 P. spec. KWI-56 P. fragi B. cepacia X. fastidosa Temicula 1 X. fastidosa 9a5c R. mmetallidurans 100 57 56 56 46 46 29 353 344 344 344 353 350 351 19.0 19.5 20.1 18.9 29.7 30.6 19.9 21.8 21.8 22.7 22.7 26.1 26.0 24.8 3 A. calcoaceticus BD413 A. calcoaceticus (RAG1) 100 32 343 346 25.4 28.3 21.6 21.4 4 V. cholerae EITor V. vulnificus CMCP6 P. spec. KFCC10818 100 41 33 284 280 279 24.3 27.5 30.1 21.8 28.2 26.5 La protéine Lif de B. cepacia ATCC21808 (Hp) est une protéine de 344 acides aminés soit 37,4 kda, présentant une forte homologie de séquence avec les protéines Lifs issues des souches de B. cepacia DSM 3959 (Jörgensen et coll., 1991), et B. cepacia KWI-56 (Iizumi et coll., 1991). Le gène hp contient 73% de bases GC, dont plus de 90% sont localisées dans les 250 premières paires de bases. Deux zones hydrophobes, localisées dans la région N- terminale de la protéine et correspondant à des points d ancrage de la protéine Hp dans la membrane interne, ont également été identifiées entre les résidus 14 et 34 et les résidus 50 et 70 (Quyen et coll., 1999). 87

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE 5.1.2. Mécanisme de sécrétion Les lipases appartenant aux familles I.1 et I.2 sont sécrétées dans le milieu extracellulaire par la voie de sécrétion de type II (Tommassen et coll., 1992 ; Pugsley, 1993 ; Filloux et coll., 1998 ; Rosenau et Jaeger, 2000). Ce mécanisme de sécrétion se décompose en deux étapes : (i) le passage de la membrane interne et (ii) la sécrétion au travers de la membrane externe (figure 34). Dans la première étape, la lipase est synthétisée sous forme de pré-protéine contenant une séquence signal en N-terminal reconnue par un complexe protéique de translocation appelé Sec. La lipase mature est alors sécrétée du cytoplasme vers l espace périplasmique. Pendant ou après cette translocation, la lipase est repliée dans une conformation active à l aide de sa protéine Lif (Frenken et coll., 1993b ; Jaeger et coll., 1994). Le ou les ponts disulfures sont formés via le système Dsb dans l espace périplasmique (Missiakas et Raina, 1997 ; Liebeton et coll., 2001 ; Urban et coll., 2001 ; Collet et Bardwell, 2002). La seconde et dernière étape est la translocation de la lipase dans le milieu extracellulaire grâce à un complexe protéique composé de quatorze protéines différentes (Pugsley, 1993 ; Sandkvist, 2001). Chez P. aeruginosa, ce complexe protéique de sécrétion, appelé Xcp, est localisé à la fois sur la membrane interne et sur la membrane externe, sur laquelle il forme un pore de 95Å (Bitter et coll., 1998 ; Filloux et coll., 1998). Figure 34 : Exemple du mécanisme de sécrétion chez Pseudomonas aeruginosa (Reetz et Jaeger, 1998). 88

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE 5.2. PRDUCTIN SUS FRME RECMBINANTE (PRDUCTIN HETERLGUE) La souche B. cepacia ATCC21808, comme d autres souches appartenant aux genres Pseudomonas et Burkholderia, est potentiellement pathogène. Ainsi, la production homologue de BCL nécessite des précautions de manipulation particulières pouvant être particulièrement gênantes à l échelle industrielle. De plus, l ingénierie de cette enzyme nécessite de pouvoir travailler à l aide de vecteurs appropriés. Son expression hétérologue chez Escherichia coli a donc été envisagée. 5.2.1. Production chez Escherichia coli La bactérie Gram négative E. coli est présente de nombreux avantages pour la production de protéines hétérologues. C est un micro-organisme génétiquement bien connu, pouvant croître à une haute densité cellulaire sur des substrats peu coûteux et pour lequel il existe un nombre important de vecteurs de clonage et d expression commerciaux (Das, 1990 ; Thomas et coll., 1997 ; Baneyx, 1999 ; Baneyx et Mujacic, 2004). Seuls les travaux de Quyen et coll., (1999), rapportent l expression hétérologue de BCL chez E. coli. Dans cette étude, les gènes codant pour BCL (lip) et sa protéine Lif (hp) ont été clonés sous forme d opéron sous le contrôle du promoteur fort λp RL, inductible à la température, dans le plasmide pt-mpa-lip-hp. La séquence signal mpa, fusionnée en N-terminal de BCL, permet d une part d augmenter les niveaux d expression des protéines chez E. coli, et d autre part, de les transloquer dans le périplasme bactérien via le système Sec (Baneyx, 1999 ; Baneyx et Mujacic, 2004). La translocation périplasmique présente plusieurs intérêts. Le périplasme est un environnement oxydant, riche en oxydoréductases catalysant la formation des ponts disulfures (Bardwell, 1994 ; Wulfing et Plückthun, 1994 ; Kadokura et coll., 2003). Il est moins riche en protéases que le cytoplasme et ne contient que 4% des protéines cellulaires totales ce qui peut faciliter la purification (Thomas et coll., 1997 ; Missiakas et Raina, 1997 ; Baneyx et Mujacic, 2004). 89

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE La production hétérologue de BCL chez E. coli a mis en évidence que la lipase était majoritairement produite sous forme de corps d inclusion inactifs (Quyen et coll., 1999). Il existe de nombreux autres exemples de lipases très faiblement exprimées sous forme active chez E. coli (Chung et coll., 1991 ; Iizumi et coll., 1991 ; Jörgensen et coll., 1991 ; Ihara et coll., 1992 ; Wohlfahrt et coll., 1992 ; Frenken et coll., 1993a,b ; shima-hirayama et coll., 1993 ; Traub et coll., 2001). Plusieurs facteurs peuvent favoriser la formation de ces corps d inclusion. Un des premiers facteurs est la faible expression des protéines Lifs chez E. coli (Frenken et coll., 1993a,b ; Hobson et coll., 1993, 1995 ; Aamand et coll., 1994 ; Iizumi et Fukase, 1994 ; Quyen et coll., 1999). Cependant, lorsque la protéine Hp était délétée de ses 70 premiers acides aminés, correspondant à ses deux points d ancrage membranaires, son niveau d expression augmente de 10% et jusqu à 40% lorsqu elle est en fusion avec la séquence signal mpa (Quyen et coll., 1999). Des résultats similaires ont été obtenus avec d autres protéines Lifs tronquées issues des souches de Burkholderia cepacia KWI-56, Chromobacterium viscosum et Pseudomonas aeruginosa TE3285 (Shibata et coll., 1998b ; Traub et coll., 2001). Un deuxième facteur est l augmentation de la concentration intracellulaire de la lipase en cours de synthèse qui favorise l agrégation de cette dernière. L utilisation de promoteurs plus faibles ainsi que la diminution de la concentration en inducteur et/ou de la température de culture permettent de réduire le taux de synthèse des protéines (Hockney, 1994 ; Georgiou, 1995 ; Georgiou et Valax, 1996 ; Weickert et coll., 1996 ; Baneyx et Mujacic, 2004). La formation de corps d inclusion chez E. coli peut également être réduite en (i) co-exprimant de protéines chaperonnes d E. coli telles que TF, GroEL-GroES et/ou DnaK-DnaJ (Nishihara et coll., 2000 ; Baneyx et Palumbo, 2003), (ii) exprimant la protéine hétérologue en fusion avec un peptide hydrosoluble (LaVallie et coll., 1993 ; Chopra et coll., 1994 ; LaVallie et McCoy, 1995 ; Makrides, 1996), (iii) en supplémentant le milieu de culture avec des sucres non métabolisables tels que le saccharose ou différents additifs tels que l éthanol ou NaCl (Blackwell et Hogan, 1991 ; Chopra et coll., 1994) ou encore (iv) en substituant les acides aminés impliqués dans l agrégation (Wetzel, 1994). Cependant, cette dernière stratégie peut poser certains problèmes d un point de vue pratique. En effet, une substitution d acides aminés nécessite, d une part d identifier ces derniers, et d autre part ce type de mutation peut entraîner des modifications au niveau de la fonction, la stabilité ou bien encore les propriétés physico-chimiques de la protéine. 90

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE 5.2.2. Repliement in vitro Afin de disposer de quantités suffisantes de la lipase de B. cepacia ATCC21808 sous forme active, Quyen et coll., (1999), ont développé un protocole de repliement in vitro de BCL. Au cours de ce protocole, la lipase est solubilisée et dénaturée à partir de ces corps d inclusion en présence d urée. Puis, elle est repliée sous forme active après 24 heures d incubation à 4 C en présence de la protéine Hp délétée de ses 70 premiers acides aminés. Le ratio lipase/lif permettant d obtenir un repliement in vitro maximum de BCL est 1/1 (Quyen et coll., 1999). Dans ces conditions, la quantité de lipase active obtenue est de 314 000 unités par gramme de cellules humides lors de l hydrolyse du para-nitrophényl palmitate. Le même ratio lipase/lif a été utilisé avec succès pour le renaturation in vitro des lipases de B. cepacia KWI-56, Chromobacterium viscosum et Ralstonia sp. M1 (Traub et coll., 2001 ; Quyen et coll., 2005). Cependant, le ratio optimum lipase/lif permettant d obtenir in vivo un rendement maximum de lipases sous forme active est encore à ce jour inconnu (Rosenau et Jaeger, 2000). Toutefois, ces protocoles de repliement in vitro sont coûteux, difficiles et doivent être optimisés au cas-par-cas (Georgiou et Valax, 1996 ; Thomas et coll., 1997). De plus, ils ne semblent pas adaptés à la production d une banque de mutants et à un criblage haut débit. Bien que la production de BCL soit très faible chez E. coli, cette bactérie Gram négative reste néanmoins un hôte de choix pour l expression et le criblage à haut débit de banques de mutants (Liu et coll., 2006 ; Pfeffer et coll., 2007). 5.3. PURIFICATIN 5.3.1. Techniques de purification des lipases Les techniques classiques de purification des lipases sont (i) la précipitation et (ii) les méthodes chromatographiques. La précipitation est habituellement utilisée au tout début des procédures de purification et est souvent suivie d une séparation par chromatographie. Les méthodes de précipitation sont généralement réalisées à 60% avec du sulfate d ammonium et 35% avec de l éthanol ou de l acétone (Saxena et coll., 2003). Ces méthodes permettent d obtenir des rendements moyens de 87% (Aires-Barros et coll., 1994). 91

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE Le plus souvent une seule étape de chromatographie n est pas suffisante pour permettre d obtenir un niveau de pureté suffisant. Ainsi, une combinaison d étapes chromatographiques est nécessaire. La chromatographie par échange d ions est la méthode chromatographique la plus utilisée. Parmi les matrices échangeuses d ions, les plus utilisées sont les groupements DEAE ou diethylaminoethyl (échangeuse d anions), CM ou carboxymethyl (échangeuse de cations) et Q-Sepharose. La seconde méthode la plus utilisée est la gel filtration, vient ensuite la chromatographie d affinité (Saxena et coll., 2003). Les procédures classiques de purification des lipases sont généralement longues, fastidieuses et conduisent à de faibles rendements. De nouvelles stratégies de purification ont donc été développées pour augmenter les rendements de purification et réduire le nombre d étapes dans le processus (Saxena et coll., 2003). Parmi ces nouvelles stratégies, l immunopurification est l une des techniques les plus efficaces et sélectives en raison de la très haute spécificité des réactions anticorps-antigène (Gupta et coll., 2004). La plupart des immunopurifications sont réalisées avec des anticorps monoclonaux ou des anticorps polyclonaux purifiés par affinité (Bandmann et coll., 2000). Cependant, en dépit de l extrême sélectivité et efficacité de cette technique de purification, les coûts de revient élevés en limitent l usage (Gupta et coll., 2004). Ainsi, très peu d exemples d immunopurification de lipases sont trouvés dans la littérature. 5.3.2. Purification des lipases de type Pseudomonas et Burkholderia Un grand nombre de publications sont dédiées à la purification et la caractérisation des lipases appartenant aux genres Pseudomonas et Burkholderia (Gilbert et coll., 1991 ; Chartrain et coll., 1993 ; Bornscheuer et coll., 1994 ; Kojima et coll., 1994, 2003 ; Sharon et coll., 1998 ; Dong et coll., 1999 ; Amada et coll., 2000 ; gino et coll., 2000 ; Singh et Banerjee, 2007). Dans le tableau 11, ci-dessous, sont reportés quelques exemples de purification de différentes lipases de type Pseudomonas et Burkholderia. 92

CHAPITRE I ETUDE BIBLIGRAPHIQUE Tableau 11 : Exemples de purification de lipases issues des genres Pseudomonas et Burkholderia Souches Technique de purification Rendement Références B. cepacia KWI-56 Précipitation à l acétone, gel filtration 4 % Iizumi et coll., 1990 P. aeruginosa LST-03 Chromatographies échangeuse d ions et d interactions hydrophobes 12 % gino et coll., 2000 P. luteola Chromatographies échangeuse d ions et d exclusion 16 % Liithauer et coll., 2002 P. aeruginosa HU380 Chromatographie échangeuse d ions, gel filtration 33 % Kojima et coll., 2003 P. fluorescens SIKW1 Gel filtration, chromatographie échangeuse d ions 0.7 % Kim et coll., 2005 P. sp. S5 Précipitation à l acétone, chromatographie échangeuse d ions, gel filtration 52 % Rahmann et coll., 2005 P. aeruginosa san-ai Précipitation au sulfate d ammonium, chromatographie d interactions hydrophobes, gel filtration 16 % Karadzic et coll., 2006 P. aeruginosa MTCC5113 Précipitation à l acétone, chromatographie échangeuse d ions, gel filtration 2 % Singh et Banerjee, 2007 Concernant BCL, une seule étude sur sa purification a été rapportée par Kordel et coll. (1991). Les auteurs ont purifié cette lipase par chromatographie échangeuse d anions, traitement au chlorure de calcium et chromatographie d interaction hydrophobe obtenant ainsi un rendement de 35% et une activité spécifique de 3,310 U/mg lors de l hydrolyse du paranitrophénylpalmitate (pnpp). La fusion de BCL avec une étiquette Histidine (His 6 ) en C- terminale de la protéine, qui aurait permis de la purifier ultérieurement par chromatographie d affinité, a révélée que celle-ci ne pouvait être repliée in vitro sous forme active (Quyen et coll., 1999) 93

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Chapitre II Matériels et méthodes 95

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CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES 1. CULTURES DE MICRRGANISMES 1.1. SUCHES Souches Génotypes Références E. coli DH5α Fφ80 dlaci q Z M15 (laczya-argf)u169 deor reca1 enda1 hsdr17(r - k,m + k) phoa supe44 λ -1 thi-1 gyra96 rela1 Gibco E. coli TP10 F - mcra (mrr-hsdrms-mcrbc) φ80lacz M15 lacx74 reca1 arad139 (ara-leu)7697 galu galk rpsl(str R ) enda1 nupg Invitrogen E. coli BL21(DE3)Star TM ompt hsds B (r - B m - B ) gal dcm rne131 (DE3) Novagen E. coli JM109 reca1, enda1, gyra96, thi, hsdr17, supe44, rela1, (lac-proab) F' [trad36, proab +, laci q, lacz M15 Promega Toutes ces souches d Escherichia coli sont utilisées pour l expression du gène lip codant pour la lipase de Burkholderia cepacia ATCC21808 (BCL) et du gène hp codant pour une protéine chaperonne nécessaire au repliement et à la sécrétion de BCL. La souche E. coli DH5α est utilisée pour l expression du plasmide pt-mpa-lip-hp. La souche E. coli TP 10 est utilisée dans les kits TP TA Cloning et TP TA Thiofusion Cloning. La souche E. coli BL21(DE3)Star TM est utilisée pour l expression du plasmide dérivé du vecteur d expression pet-21a(+) et la souche E. coli JM109 pour l expression du plasmide dérivé du vecteur d expression pflag-ats. 1.2. VECTEURS Dans le tableau 12 ci-dessous sont listés tous les vecteurs commerciaux ainsi que les plasmides construits au cours de l étude ayant servi ensuite de matrice pour la production recombinante de BCL. 97

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES Tableau 12 : Liste des vecteurs/plasmides utilisés ou construits au cours de cette étude. Plasmides Taille (pb) Caractéristiques Références pcytexp1 4985 pt-mpa-lip-hp 7416 [pbad/ TP] 4126 [pbad/ TP Thiofusion] 4454 pbad-mpa-lip-hp 6191 pbad-thi-mpa- Lip-Hp 6518 pet-21a(+) 5443 pet-mpa-lip-hp 7866 pflag-ats 5408 pflag-ats-lip-hp 7805 Résistance à l ampicilline; Promoteur fort λp RL inductible à la température Gènes lip et hp insérés sous forme d opéron dans le vecteur pcytexp1; séquence signal mpa en 5 du gène lip facilitant le transport périplasmique de la lipase Résistance à l ampicilline; promoteur arabinose; Epitope V5 et étiquette polyhistidine en fusion en 3 Résistance à l ampicilline; promoteur arabinose; Epitope V5 et étiquette polyhistidine en fusion en 3 ; Thioredoxine en fusion en 5 Gènes lip et hp insérés sous forme d opéron dans le vecteur pbad/tp; séquence signal mpa en 5 du gène lip; étiquette polyhistidine en 3 réprimée par insertion d un codon stop à la fin du gène hp amplifié par PCR (voir Amorces) Gènes lip et hp insérés sous forme d opéron dans le vecteur pbad/tp Thiofusion; séquence signal mpa en 5 du gène lip; étiquette thioredoxine en 5 de la séquence signal mpa; étiquette polyhistidine en 3 réprimée par insertion d un codon stop à la fin du gène hp amplifié par PCR (voir Amorces) Résistance à l ampicilline ; promoteur T7; Etiquettes T7 en fusion en 5 et polyhistidine en fusion en 3 Belev et coll., 1991 Quyen et coll., 1999 Invitrogen Invitrogen Cette étude Cette étude Novagen Gènes lip et hp insérés sous forme d opéron dans le vecteur pet-21a(+); séquence signal mpa en 5 du gène lip; étiquette T7 éliminée par le clonage de l insert mpa-lip-hp à l aide du site de restriction Cette étude NdeI; étiquette polyhistidine en 3 réprimée par insertion d un codon stop à la fin du gène hp amplifié par PCR (voir Amorces) Résistance à l ampicilline ; promoteur tac; séquence signal mpa et peptide FLAG en fusion en 5 et Sigma étiquette polyhistidine en fusion en 3 Gènes lip et hp insérés sous forme d opéron dans le vecteur pflag-ats; étiquette polyhistidine en 3 Cette étude réprimée par insertion d un codon stop à la fin du gène hp amplifié par PCR (voir Amorces) 98

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES 1.3. CNDITINS DE CULTURES Les souches d E. coli sont cultivées sur milieu Luria Bertani (LB) ou 2x YT. Ces milieux sont utilisés tels quels pour le stockage des souches ou pour les cultures. Pour les milieux solides, 20 g/l d agar sont rajoutés. LB 2x YT Bactotryptone 10 g/l 16 g/l Extrait de levures 5 g/l 10 g/l NaCl 5 g/l 5 g/l Lorsque les cellules E. coli sont transformées avec les différents plasmides, cités ci-dessus (tableau 12), les milieux utilisés sont supplémentés en ampicilline (100 µg/ml). 1.4. CNSERVATIN DES SUCHES Les souches d'e. coli sont conservées à 4 C sur milieux solides ou à 80 C dans le milieu liquide LB ou 2x YT contenant 15 % (v/v) de glycérol. 1.5. PREPARATIN DE CELLULES CHIMICMPETENTES Les souches d E. coli sont rendues compétentes par traitement au diméthylsulfoxide (DMS) selon le protocole établi par Inoue et coll., (1990). Les cellules à traiter sont cultivées à 18 C dans 50 ml de milieu SC, jusqu à ce que l absorbance à 600 nm atteigne 0,6. Les cellules sont alors maintenues dans la glace pendant 10 minutes, puis centrifugées (5000 g, 10 min, 4 C). Le culot est repris dans 14 ml de tampon TB glacé, puis incubé dans la glace pendant 15 minutes. Les cellules sont alors centrifugées (5000 g, 10 min, 4 C), puis le culot est resuspendu dans 4 ml de tampon TB glacé auxquels sont rajoutés 280 µl de DMS. La solution de cellules rendues compétentes est conservée dans la glace pendant 10 minutes avant d être aliquotée en lots de 50 µl et stockée à 80 C. Ce protocole permet d obtenir des efficacités de transformation de l ordre de 10 7 à 10 8 transformants par µg de plasmide. 99

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES Milieu SC: Tampon TB: Tryptone 20 g/l Pipes 10 mm Extrait de levure 5,5 g/l CaCl 2 15 mm NaCl 10 mm KCl 250 mm KCl 10 mm MnCl 2 55 mm Mg 2+ Glucose 10 mm rajoutés extemporanément 20 mm 2. TECHNIQUES DE BILGIE MLECULAIRE 2.1. EXTRACTIN D ADN PLASMIDIQUE L extraction et la purification du plasmide sont réalisées en utilisant le kit QIAprep, commercialisé par Qiagen, basé sur la méthode de la lyse alcaline (Sambrook et coll., 1989). Des cultures de 2 ml sont réalisées pendant 15 heures, en milieu LB supplémenté d ampicilline (100 µg/ml). Les cellules sont centrifugées pendant 5 minutes à 10 000 g. Elles sont ensuite resuspendues dans une solution isotonique et lysées par une solution de soude/sds (NaH 0,2 N, SDS 1 % (m/v)). Le SDS permet la solubilisation des phospholipides et des protéines de la membrane cellulaire. Le lysat est neutralisé puis est amené à de fortes concentrations salines. Ceci entraîne la précipitation des protéines, de l ADN chromosomique, des débris cellulaires et du SDS alors que les plasmides restent en solution. Le précipité est culoté par centrifugation (10 min à 10 000 g). Le surnageant est alors déposé sur une micro-colonne qui contient une membrane de silice sur laquelle l ADN plasmidique est retenu. La fixation de l ADN est suivie d une étape de lavage par une solution contenant 80 % (v/v) d éthanol. Le plasmide est élué par 50 µl d eau ou de tampon TE. Tampon TE 1X: Tris HCL ph 7,5 EDTA ph 8,0 10 mm 1 mm 100

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES 2.2. DIGESTIN ET VISUALISATIN DE L ADN, PURIFICATIN DES FRAGMENTS DIGERES Les digestions par enzymes de restriction sont réalisées suivant les recommandations du fournisseur (New England Biolabs). Les fragments d ADN (ou les plasmides) sont analysés par électrophorèse sur gel d agarose (0,8 % (p/v) dans du tampon TAE 0,5X). Les échantillons, déposés avec du tampon de charge 1X dans les puits, migrent 30 minutes, dans un champ électrique à 135 V. La taille des fragments d ADN des échantillons est déterminée à l aide de marqueurs de taille allant de 1 à 10 kb ( 1kb DNA step ladder, Promega). Le gel est coloré dans une solution de bromure d éthidium (0,5 µg/ml) pendant 20 minutes, afin de visualiser l ADN sous une lampe UV (λ=254 nm). Tampon TAE 50X Tampon de charge 10X Tris 24,2 % (p/v) Glycérol 50 % (v/v) Acide acétique glacial 5,71 % (p/v) Bleu de bromophénol 0,2 % (p/v) EDTA, 0,5M, ph 8,0 10 % (v/v) Xylène cyanol 0,2 % (p/v) Les électrophorèses sont réalisées avec une unité i-mupid commercialisée par Talron. La totalité de la solution de digestion est déposée sur un gel d agarose 0,8 % (p/v), afin de séparer les fragments d ADN. Pour éviter d abîmer l ADN à purifier, le gel est découpé de manière à n exposer au BET et aux UV qu une partie du gel contenant une piste avec les marqueurs de taille, et une extrémité du puits contenant les fragments séparés. Après avoir vérifié la bonne séparation/digestion de l ADN, une encoche sur le gel exposé aux UV permet de localiser le fragment à purifier correspondant sur le gel non exposé aux UV. La bande, découpée à l aveugle, est ensuite traitée avec le kit de purification sur colonne, QIAquick gel extraction kit, de Qiagen. 2.3. LIGATURES La procédure adoptée utilise l ADN ligase T4 (New Englad Biolabs) très concentrée (200U). Le tampon ligase est aliquoté, car l ATP, indispensable au fonctionnement de la ligase, est dégradé après plusieurs congélations/décongélations. 101

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES En ce qui concerne les inserts, si l amplification PCR génère une bande unique, ils sont purifiés directement sur colonne en suivant le protocole du fournisseur (Qiagen), afin d éliminer la polymérase. Ils sont ensuite digérés, puis purifiés à nouveau sur colonne pour éliminer les enzymes de restriction. Le milieu réactionnel typique est le suivant, pour un insert de 2,5 kb et un vecteur de 5 kb pour un volume final de 10 µl: Vecteur purifié (approx. 45 ng/µl) 4 µl Insert (approx. 15 ng/µl) 1 µl Tampon ligase (10X) 1 µl DNA Ligase T4 (400 U/µL) 0,5 µl Eau milliq Jusqu à 10 µl Les tubes sont placés dans un bain à 16 C pendant 15 heures jusqu à la transformation. 2.4. CNDITINS D AMPLIFICATIN PAR PCR DE LA LIPASE DE B. CEPACIA 2.4.1. Construction des plasmides d expression de la lipase de B. cepacia Pour la construction des différents plasmides d expression, les amplifications PCR ont été réalisées à partir du plasmide pt-mpa-lip-hp. L insert mpa-lip-hp (2061 pb) a été amplifié à l aide de deux oligonucléotides longs d environ 40 pb (synthétisés par la société Eurogentec), inverses complémentaires, qui vont venir s apparier sur chacun des deux brins du plasmide parental. Pour la construction du plasmide pflag-ats-lip-hp, seuls les gènes lip et hp ont été amplifiés, étant donné que la séquence signal mpa était déjà présente dans le vecteur d expression commercial pflag-ats (Sigma). Plasmide pt-mpa-lip-hp (extraction plasmidique dilué au 1/10 ème ) 2 µl Amorces directs et inverses (5 µm) 3 µl de chaque dntp (2,5 mm) 4 µl DMS (8 %) 4 µl Tampon Expand High Fidelity contenant MgCl 2 (10X) 5 µl Expand High Fidelity (3,5 U/µl) 1 µl Eau milliq stérile Jusqu à 50 µl 102

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES Le DMS est utilisé ici pour diminuer les amplifications non spécifiques qui peuvent avoir lieu durant les cycles PCR. Les amorces inverses correspondant au gène hp ont une température d hybridation spécifique (Tm) élevée, car celui-ci est très riche en GC (% GC > 90% sur les 250 premières paires de bases du gène), en comparaison aux amorces directes correspondant aux gènes ompa et lip qui ont un Tm plus faible. Ces différences importantes de Tm nous obligent à choisir une température d hybridation basse (en rapport avec le Tm des amorces directes), donc cela favorise les amplifications non spécifiques. Les cycles d amplification suivent le schéma suivant: Initiation 94 C 2 min 94 C 30 sec Cycles: x10 53 C 30 sec 72 C 2 min 94 C 30 sec Cycles: x20 53 C 30 sec 72 C 2 min* Terminaison 72 C 7 min 4 C * A chaque cycle, la durée de polymérisation est augmentée de 5 secondes Les amorces utilisées sont les suivantes: Constructions Amorces Séquences (5-3 ) pbad-mpa- pbad_dir ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGC Lip-Hp pbad_inv TCACTGCGCGCTGCCCGCGCCGCGATCGAGCGATGCCGC pbad-thi- pbad_dir ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGC mpa-lip-hp pbad_inv TCACTGCGCGCTGCCCGCGCCGCGATCGAGCGATGCCGC pet-mpa- pet_dir CTGGAGACTCATATGAAAAAGAC AGCTATCGCG ATTGC Lip-Hp pet_inv GTCGACTTACCTACTCAGAATTCA TCATTGACGGTCAC pflag-ats- pflag_dir GGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGAAGCTTGCCGAC Lip-Hp pflag_inv CGACTTACCTACTCAGAATTCATCATGGACGGTCACC 2.4.2. Constructions des mutants ponctuels par mutagénèse dirigée L insertion des mutations ponctuelles a été réalisée via le système Quick Change Sitedirected Mutagenesis, commercialisé par Stratagene. Il repose sur l amplification, par PCR inverse, du vecteur entier. Les étapes du protocole sont schématisées sur la figure 35. Toutes les cibles de mutagénèse sélectionnées dans cette étude se situent sur le gène de la lipase (lip). 103

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES La réaction nécessite l emploi de deux oligonucléotides longs d environ 40 pb, (synthétisés par la société Eurogentec), inverses complémentaires, portant chacun la mutation à introduire et qui vont venir s apparier sur chacun des deux brins du plasmide parental. Pour l amplification, le mélange réactionnel est le suivant: pflag-ats-lip-hp (extraction plasmidique diluée 1/10) 10 µl Amorces directes et inverses contenant la mutation (10 µm) 1,3 µl de chaque dntp (2,5 mm) 5 µl Tampon pfu turbo (10X) 5 µl Polymérase pfu turbo 2,5 U (Proméga) 1 µl Eau milliq Jusqu à 50 µl Les conditions d amplification sont: Initiation 95 C 2 min 95 C 30 sec Cycle: x16 55 C 1 min 68 C 8 min Terminaison 68 C 8 min 4 C L amplification PCR génère un mélange de molécules mutées linéaires et de plasmide matrice circulaire. Ce dernier est dégradé par l enzyme DpnI qui n agit que sur l ADN méthylé. En effet, la méthylation ayant lieu in vivo, les brins parentaux sont méthylés alors que les brins néoformés in vitro ne le sont pas. A l issue de cette digestion, l ADN linéaire néoformé est intact. Sa circularisation n aura lieu qu in vivo après transformation des cellules d E. coli. Vecteur contenant le gène avec la position à muter ( ) Dénaturation du vecteur et hybridation avec les amorces mutées ( ) Amplification du vecteur à partir des amorces mutées Digestion du vecteur matrice par Dpn I Transformation dans E. coli Figure 35 : Représentation schématique des étapes du protocole de mutagénèse dirigée par PCR inverse. 104

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES Les amorces utilisées pour la construction des mutants ponctuels sur la position Valine 266 sont les suivantes (les mutations sont indiquées en gras) : Mutants Amorces Séquences (5-3 ) V266A V266A_dir CCAGAACGACGGGGCCGTGTCGAAGTGCAGC V266A_inv GCTGCACTTCGACACGGCCCCGTCGTTCTGG V266L V266L_dir CCAGAACGACGGGCTCGTGTCGAAGTGCAGC V266L_inv GCTGCACTTCGACACGAGCCCGTCGTTCTGG V266I V266I_dir CCAGAACGACGGGATCGTGTCGAAGTGCAGC V266I_inv GCTGCACTTCGACACGATCCCGTCGTTCTGG V266P V266P_dir CCAGAACGACGGGCCCGTGTCGAAGTGCAGC V266P_inv GCTGCACTTCGACACGGGCCCGTCGTTCTGG V266M V266M_dir CCAGAACGACGGGATGGTGTCGAAGTGCAGC V266M_inv GCTGCACTTCGACACCATCCCGTCGTTCTGG V266F V266F_dir CCAGAACGACGGGTTCGTGTCGAAGTGCAGC V266F_inv GCTGCACTTCGACACGAACCCGTCGTTCTGG V266W V266W_dir GGGCCAGAACGACGGGTGGGTGTCGAAGTGCAGCGCG V266W_inv CGCGCTGCACTTCGACACCCACCCGTCGTTCTGGCCC V266G V266G_dir CCAGAACGACGGGGGCGTGTCGAAGTGCAGC V266G_inv GCTGCACTTCGACACGCCCCCGTCGTTCTGG V266S V266S_dir CCAGAACGACGGGTCCGTGTCGAAGTGCAGC V266S_inv GCTGCACTTCGACACGGACCCGTCGTTCTGG V266T V266T_dir CCAGAACGACGGGACCGTGTCGAAGTGCAGC V266T_inv GCTGCACTTCGACACGGTCCCGTCGTTCTGG V266C V266C_dir CCAGAACGACGGGTGCGTGTCGAAGTGCAGC V266C_inv GCTGCACTTCGACACGCACCCGTCGTTCTGG V266N V266N_dir CCAGAACGACGGGAACGTGTCGAAGTGCAGC V266N_inv GCTGCACTTCGACACGTTCCCGTCGTTCTGG V266Q V266Q_dir GGGCCAGAACGACGGGCAGGTGTCGAAGTGCAGCGCG V266Q_inv CGCGCTGCACTTCGACACGTCCCCGTCGTTCTGGCCC V266Y V266Y_dir CCAGAACGACGGGTACGTGTCGAAGTGCAGC V266Y_inv GCTGCACTTCGACACGTACCCGTCGTTCTGG V266K V266K_dir GGGCCAGAACGACGGGAAGGTGTCGAAGTGCAGCGCG V266K_inv CGCGCTGCACTTCGACACCTTCCCGTCGTTCTGGCCC V266R V266R_dir CCAGAACGACGGGCGCGTGTCGAAGTGCAGC V266R_inv GCTGCACTTCGACACGCGCCCGTCGTTCTGG V266H V266H_dir CCAGAACGACGGGCACGTGTCGAAGTGCAGC V266H_inv GCTGCACTTCGACACGTGCCCGTCGTTCTGG V266D V266D_dir CCAGAACGACGGGGACGTGTCGAAGTGCAGC V266D_inv GCTGCACTTCGACACGTCCCCGTCGTTCTGG V266E V266E_dir CCAGAACGACGGGGAGGTGTCGAAGTGCAGC V266E_inv GCTGCACTTCGACACCTCCCCGTCGTTCTGG 105

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES Les amorces utilisées pour la construction des mutants ponctuels sur la position Leucine 17 sont les suivantes (les mutations sont indiquées en gras) : Mutants Amorces Séquences (5-3 ) L17A L17A_dir CTCGTGCACGGGGCCACGGGCACCGAC L17A_inv GTCGGTGCCCGTGGCCCCGTGCACGAG L17V L17V_dir CTCGTGCACGGGGTCACGGGCACCGAC L17V_inv GTCGGTGCCCGTGACCCCGTGCACGAG L17I L17I_dir CTCGTGCACGGGATCACGGGCACCGAC L17I_inv GTCGGTGCCCGTGATCCCGTGCACGAG L17P L17P_dir CTCGTGCACGGGCCCACGGGCACCGAC L17P_inv GTCGGTGCCCGTGGGCCCGTGCACGAG L17M L17M_dir CTCGTGCACGGGATGACGGGCACCGAC L17M_inv GTCGGTGCCCGTCATCCCGTGCACGAG L17F L17F_dir CTCGTGCACGGGTTCACGGGCACCGAC L17F_inv GTCGGTGCCCGTGAACCCGTGCACGAG L17W L17W_dir CTCGTGCACGGGTGGACGGGCACCGACAAATACGC L17W_inv GCGTATTTGTCGGTGCCCGTCCACCCGTGCACGAG L17G L17G_dir CTCGTGCACGGGGGCACGGGCACCGAC L17G_inv GTCGGTGCCCGTGCCCCCGTGCACGAG L17S L17S_dir CTCGTGCACGGGAGCACGGGCACCGAC L17S_inv GTCGGTGCCCGTGCTCCCGTGCACGAG L17T L17T_dir CTCGTGCACGGGACCACGGGCACCGAC L17T_inv GTCGGTGCCCGTGGTCCCGTGCACGAG L17C L17C_dir CTCGTGCACGGGTGCACGGGCACCGAC L17C_inv GTCGGTGCCCGTGCACCCGTGCACGAG L17N L17N_dir CTCGTGCACGGGAACACGGGCACCGAC L17N_inv GTCGGTGCCCGTGTTCCCGTGCACGAG L17Q L17Q_dir CTCGTGCACGGGCAGACGGGCACCGAC L17Q_inv GTCGGTGCCCGTCTGCCCGTGCACGAG L17Y L17Y_dir CTCGTGCACGGGTACACGGGCACCGAC L17Y_inv GTCGGTGCCCGTGTACCCGTGCACGAG L17K L17K_dir CTCGTGCACGGGAAGACGGGCACCGACAAATACGC L17K_inv GCGTATTTGTCGGTGCCCGTCTTCCCGTGCACGAG L17R L17R_dir CTCGTGCACGGGCGCACGGGCACCGAC L17R_inv GTCGGTGCCCGTGCGCCCGTGCACGAG L17H L17H_dir CTCGTGCACGGGCACACGGGCACCGAC L17H_inv GTCGGTGCCCGTGTGCCCGTGCACGAG L17D L17D_dir CTCGTGCACGGGGACACGGGCACCGAC L17D_inv GTCGGTGCCCGTGTCCCCGTGCACGAG L17E L17E_dir CTCGTGCACGGGGAGACGGGCACCGACAAATACGC L17E_inv GCGTATTTGTCGGTGCCCGTCTCCCCGTGCACGAG 106

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES Les amorces utilisées pour la construction des mutants ponctuels sur la position Leucine 287 sont les suivantes (les mutations sont indiquées en gras) : Mutants Amorces Séquences (5-3 ) L287A L287A_dir CGAGCTACAAGTGGAACCATGCCGACGAGATCAACCAG L287A_inv CTGGTTGATCTCGTCGGCATGGTTCCACTTGTAGCTCG L287V L287V_dir CGAGCTACAAGTGGAACCATGTCGACGAGATCAACCAG L287V_inv CTGGTTGATCTCGTCGACATGGTTCCACTTGTAGCTCG L287I L287I_dir CGAGCTACAAGTGGAACCATATCGACGAGATCAACCAG L287I_inv CTGGTTGATCTCGTCGATATGGTTCCACTTGTAGCTCG L287P L2587P_dir CGAGCTACAAGTGGAACCATCCCGACGAGATCAACCAG L287P_inv CTGGTTGATCTCGTCGGGATGGTTCCACTTGTAGCTCG L287M L287M_dir CGAGCTACAAGTGGAACCATATGGACGAGATCAACCAGTTGC L287M_inv GCAACTGGTTGATCTCGTCCATATGGTTCCACTTGTAGCTCG L287F L287F_dir CGAGCTACAAGTGGAACCATTTCGACGAGATCAACCAG L287F_inv CTGGTTGATCTCGTCGAAATGGTTCCACTTGTAGCTCG L287W L287W_dir CGAGCTACAAGTGGAACCATTGGGACGAGATCAACCAGTTGC L287W_inv GCAACTGGTTGATCTCGTCCCAATGGTTCCACTTGTAGCTCG L287G L287G_dir CGAGCTACAAGTGGAACCATGGCGACGAGATCAACCAG L287G_inv CTGGTTGATCTCGTCGCCATGGTTCCACTTGTAGCTCG L287S L287S_dir CGAGCTACAAGTGGAACCATAGCGACGAGATCAACCAG L287S_inv CTGGTTGATCTCGTCGCTATGGTTCCACTTGTAGCTCG L287T L287T_dir CGAGCTACAAGTGGAACCATACCGACGAGATCAACCAG L287T_inv CTGGTTGATCTCGTCGGTATGGTTCCACTTGTAGCTCG L287C L287C_dir CGAGCTACAAGTGGAACCATTGCGACGAGATCAACCAG L287C_inv CTGGTTGATCTCGTCGCAATGGTTCCACTTGTAGCTCG L287N L287N_dir CGAGCTACAAGTGGAACCATAACGACGAGATCAACCAG L287N_inv CTGGTTGATCTCGTCGTTATGGTTCCACTTGTAGCTCG L287Q L287Q_dir CGAGCTACAAGTGGAACCATCAGGACGAGATCAACCAG L287Q_inv CTGGTTGATCTCGTCCTGATGGTTCCACTTGTAGCTCG L287Y L287Y_dir CGAGCTACAAGTGGAACCATTACGACGAGATCAACCAG L287Y_inv CTGGTTGATCTCGTCGTAATGGTTCCACTTGTAGCTCG L287K L287K_dir CGAGCTACAAGTGGAACCATAAGGACGAGATCAACCAGTTGC L287K_inv GCAACTGGTTGATCTCGTCCTTATGGTTCCACTTGTAGCTCG L287R L287R_dir CGAGCTACAAGTGGAACCATCGCGACGAGATCAACCAG L287R_inv CTGGTTGATCTCGTCGCGATGGTTCCACTTGTAGCTCG L287H L287H_dir CGAGCTACAAGTGGAACCATCACGACGAGATCAACCAG L287H_inv CTGGTTGATCTCGTCGTGATGGTTCCACTTGTAGCTCG L287D L287D_dir CGAGCTACAAGTGGAACCATGACGACGAGATCAACCAG L287D_inv CTGGTTGATCTCGTCGTCATGGTTCCACTTGTAGCTCG L287E L287E_dir CGAGCTACAAGTGGAACCATGAGGACGAGATCAACCAGTTG L287E_inv CAACTGGTTGATCTCGTCCTCATGGTTCCACTTGTAGCTCG 107

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES 2.5. TRANSFRMATIN DES CELLULES CMPETENTES La transformation des cellules se fait par choc thermique selon les étapes suivantes : - 30 minutes de contact cellules/adn sur glace - choc thermique à 42 C pendant 45 secondes - incubation des cellules transformées pendant 2 minutes sur la glace Les cellules sont alors incubées pendant 1 heure à 37 C dans 900 µl de milieu LB afin de développer la résistance à l ampicilline. Elles sont ensuite étalées sur milieu LB solide supplémenté d ampicilline afin d être isolées. Les cellules utilisées sont rendues chimio-compétentes par un protocole classique au CaCl 2 et DMS, ou commerciales pour avoir une efficacité de transformation plus importante (E. coli TP 10 chimio-compétentes ne Shot d Invitrogen ; E. coli BL21(DE3)Star TM chimiocompétentes de Novagen ; E. coli JM109 chimio-compétentes de Proméga). 2.6. ANALYSES DES SEQUENCES Les gènes ompa, lip et hp amplifiés à partir du plasmide pt-mpa-lip-hp pour la construction des différents vecteurs d expression ont été séquencés dans leur totalité. Concernant les mutants ponctuels, seul le gène lip a été séquencé. Les résultats obtenus ont été vérifiés par analyse des chromatogrammes. La localisation des cadres ouverts de lecture potentiels des gènes, la réalisation d alignement, la construction de cartes de restrictions et la traduction protéique ont été déterminées grâce au logiciel VectorNTI (InforMax, Inc). A ce jour, tous les mutants ponctuels V266 ont été séquencés. Le séquençage des mutants ponctuels L17 et L287 est en cours. 108

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES 3. PRDUCTIN DE PRTEINES RECMBINANTES 3.1. PRDUCTIN EN FILE D ERLENMEYER Les bactéries sont cultivées dans les milieux LB ou 2x YT supplémentés en ampicilline (100 µg/ml). Les cultures sont inoculées à D 600nm de 0,3 à partir d une préculture ayant atteint une absorbance D 600nm d au minimum 3 (il est préférable de les inoculer à moins de 10 %). Les cultures sont réalisées dans des fioles d Erlenmeyer bafflées, remplies au maximum à 1/5 de leur volume total et placées sous agitation (130 rpm) à la température désirée (de 18 C à 37 C). Lorsque la croissance cellulaire atteint une D 600nm de 0,8-0,9, les cultures sont induites avec différents inducteurs selon les plasmides d expression utilisés (tableau 13). Tableau 13 : Milieux de culture, température de culture, nature et concentration des inducteurs testés selon les différentes constructions plasmidiques Plasmides Milieux de culture Températures de culture Inducteurs Concentration d inducteur pt-mpa-lip-hp LB 30 C Choc thermique 42 C pbad-mpa-lip-hp LB 30 C L-arabinose 0,02% (m/v) LB 30 C L-arabinose 0,02% (m/v) LB 30 C L-arabinose 0,002% (m/v) pbad-thi-mpa-lip-hp LB 30 C L-arabinose 0,0002% (m/v) LB 18 C L-arabinose 0,02% (m:v) pet-mpa-lip-hp LB 30 C IPTG 1 mm LB 30 C IPTG 1 mm LB 37 C IPTG 1 mm pflag-ats-lip-hp 2X YT 37 C IPTG 1 mm 2X YT 37 C IPTG 0,1 mm Les cultures sont menées pendant 6 heures ou 22 heures après l induction selon les conditions testées. 3.1.1. Cassage des cellules par choc osmotique Le protocole de cassage des cellules par choc osmotique est une adaptation du protocole décrit par Iizumi et coll., (1991). En fin d induction, le milieu est centrifugé (15 min, 5000 g, 4 C). Le culot cellulaire est repris dans un volume de solution hypertonique, de manière à 109

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES obtenir une D 600nm finale de 40. Les cellules, ainsi remises en suspension, sont centrifugées (15 min, 3500 g, 4 C). Le culot est ensuite repris dans un volume de solution hypotonique, de manière à obtenir une D 600nm finale de 80. A la fin du protocole de choc osmotique, le culot est centrifugé (15 min, 3500 g, 4 C). Le surnageant correspond alors à la fraction protéique périplasmique. Le culot peut être re-suspendu dans un même volume de tampon Tris, HCl, (100 mm, ph 7,5) que la fraction protéique périplasmique. Il s agit de la fraction protéique cytoplasmique. Solution Hypertonique Solution Hypotonique Tampon Tris, HCl, ph = 8,0 30 mm H 2 milliq à 0 C Saccharose 500 mm EDTA 1 mm Ajuster le ph à 8 3.1.2. Cassage des cellules avec du cocktail de lyse En fin d induction, le milieu est centrifugé (15 min, 5000 g, 4 C). Le culot cellulaire est repris dans un volume de cocktail de lyse, de manière à obtenir une D 600nm finale de 80. Les cellules, ainsi remises en suspension, sont incubées 1 heure sur glace. Les cellules sont centrifugées (30 min, 20 000 g, 4 C). Le surnageant correspond alors à la fraction protéique soluble, contenant la lipase sous forme active. Le culot peut être re-suspendu dans un même volume de cocktail de lyse que la fraction protéique soluble. Il s agit de la fraction protéique insoluble, contenant la lipase sous forme de corps d inclusion inactifs. Cocktail de lyse Tampon Tris,HCl 100 mm, ph 7,5 Complete Mini EDTA free (Roche) Lysozyme DNAse BugBuster 100 mm 1 tablette pour 10 ml de cocktail de lyse 1 mg/ml 5 µg/ml 1 X 110

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES Le BugBuster (Novagen) est un cocktail de différents détergents de type anioniques et zwitterioniques. Le cocktail d anti-protéases commercialisé par Roche (Complete Mini EDTA Free) inhibe les protéases à cystéine et à serine. Ce cocktail d anti-protéases ne contient pas d EDTA. En effet, BCL possédant un site de liaison au calcium, l EDTA qui est un chélateur du calcium ne peut être rajouté à la préparation. 3.2. PRDUCTIN EN FRMAT MICRPLAQUES 3.2.1. Constitution des microplaques stock Des microplaques 96-puits stériles (Nunc TM Brand Products) sont remplies automatiquement avec 150 µl de 2x YT supplémentés en ampicilline (100 µg/ml) en utilisant le robot Biomek2000 pipettor (Beckman). Elles sont ensuite inoculées avec des colonies d E. coli JM109 transformées avec le plasmide pflag-ats-lip-hp sauvage ou muté. Après 24 heures de croissance à 30 C sous une agitation horizontale (150 rpm), ces microplaques sont répliquées automatiquement à l aide du robot QpixII dans de nouvelles microplaques 96- puits stériles (Nunc TM Brand Products) remplies avec 150 µl de milieu 2x YT supplémentés en ampicilline (100 µg/ml). Ces nouvelles microplaques sont remises à incuber 24 heures dans les conditions décrites ci-dessus. En fin de culture, 12,5 % de glycérol (v/v) est rajouté. Ces microplaques, référencées en tant que microplaques stock, sont congelées à -20 C. 3.2.2. Conditions de culture en format microplaque Les microplaques stock sont répliquées à l aide du robot QpixII dans des microplaques de pré-culture 96-puits stériles (Nunc TM Brand Products) remplies avec 200 µl de milieu 2x YT supplémentés en ampicilline (100 µg/ml). Ces microplaques de pré-culture sont incubées 24 heures à 30 C sous une agitation horizontale (150 rpm) et servent à inoculer des microplaques 96-puits stériles (Nunc TM Brand Products; 200 µl de 2x YT par puits) ou des deepwells 96- puits stériles (ABgene; 1,2 ml de 2x YT par puits) pour la production recombinante de BCL. Toutes les cultures ont été réalisées à 30 C. Les différentes conditions d induction sont référencées dans le tableau 14 ci-dessous. 111

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES Tableau 14 : Conditions d induction testées en fonction du type de microplaque utilisé. Format microplaque Microplaque 96-puits (Nunc TM Brand Products) Deepwell 96-puits (ABgene) Deepwell 96-puits (ABgene) Deepwell 96-puits (ABgene) Durée de la croissance avant l induction Concentration en inducteur (IPTG) Durée de la culture après induction 16 heures 100 µm 8 heures 16 heures 100 µm 8 heures - 100 µm 24 heures - 10 µm 24 heures En fin d induction, la croissance cellulaire est déterminée par la mesure de l absorbance à 600 nm sur un lecteur de microplaques VersaMax (Molecular Devices). Dans le cas des cultures en microplaques 96-puits (Nunc TM Brand Products), la mesure se fait directement dans la microplaque, par contre pour les cultures en deepwells 96-puits (ABgene), la mesure de la croissance cellulaire se fait à partir d un prélèvement de 200 µl de milieu de culture. Pour les cultures en microplaques 96-puits (Nunc TM Brand Products), 20 µl de cocktail de lyse sont ajoutés directement dans chaque puits et les microplaques sont congelées à -80 C sur une nuit. Dans le cas des cultures en deepwells 96-puits (ABgene), les cellules sont centrifugées (30 min, 3700 rpm, 4 C) et reprises dans 100 µl de cocktail de lyse par puits. Les cellules sont alors cassées par traitement aux ultrasons à l aide d un bain de sonication. L opération est effectuée en 4 cycles, chacun constitué de 2 minutes d impulsion, et 2 minutes d arrêt dans la glace. Le sonicat est ensuite congelé à 80 C sur une nuit. 3.3. ANALYSES DES PRTEINES PAR ELECTRPHRESE 3.3.1. Gels NuPage Bis-Tris 10%Novex Ces gels pré-coulés et commercialisés par Invitrogen procurent une meilleure résolution des bandes par rapport aux gels coulés au laboratoire. En effet, le ph neutre des gels NuPAGE permet une plus grande stabilité des protéines lors de la migration. Avec les gels classiques, dans lesquels le ph du tampon de séparation est de 8,8, les phénomènes de distorsion de bandes sont fréquents. Ces gels peuvent être utilisés en conditions natives ou dénaturantes 112

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES Dans notre étude, ces gels d électrophorèse ont été utilisés en conditions dénaturantes et réductrices. Les solutions de charge pour les échantillons et les tampons de migration adéquats ont été utilisés selon les recommandations du fournisseur. L appareil utilisé est le module Xcell SureLock d Invitrogen. Les migrations sont réalisées à un voltage constant de 150 V pendant 1h30. Des marqueurs de protéines allant de 6 à 200 kda (Invitrogen) ou de 25 à 250 kda (Biorad) sont ajoutés pour une estimation de la taille de BCL ainsi que de sa protéine chaperonne. Après migration, les gels peuvent être soumis à deux traitements différents : coloration des protéines totales au Bleu Colloïdal ou Western-Blot par réaction antigène-anticorps. 3.3.2. Coloration des protéines totales au Bleu Colloïdal La coloration au Bleu Colloïdal (Invitrogen) est plus sensible qu une coloration au bleu de Coomassie classique. Il en résulte une durée de coloration moins longue et un bruit de fond moindre par rapport à une coloration classique. Le gel est placé dans une solution composée de méthanol 20 % (v/v), de colorant A 20 % (v/v), et de colorant B 5 % (v/v). La coloration dure entre trois et douze heures. La décoloration est ensuite effectuée par lavages successifs du gel dans de l eau distillée. 3.3.3. Western Blot Les analyses des protéines par Western Blot ont été réalisées selon une adaptation du protocole décrit par Blank et coll., (2006). Le transfert des protéines sur membrane de nitrocellulose est effectué durant 1 heure dans du tampon de transfert NuPAGE, complémenté à 10% (v/v) de méthanol, sous tension constante de 30V. L appareil utilisé est le module Xcell II d Invitrogen. Tampon de transfert NuPAGE 1X, ph 7,2: Bicine 25 mm Bis-Tris 25 mm EDTA 1 mm Chlorobutanol 0,05 mm 113

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES La détection de l étiquette FLAG, présente dans le plasmide pflag-ats-lip-hp, est réalisée selon le protocole suivant: Etapes Tampons utilisés Durée Saturation de la membrane Tampon FLAG + BSA 3% 1 nuit Lavages Tampon FLAG + Tween-20 0,05% 3 x 15 min Dilution au 1/5 000 dans du Incubation avec l anticorps tampon FLAG + BSA 0,5% + primaire (anti-flag M2) Tween-20 0,05% 90 min Lavages Tampon FLAG + Tween-20 3 x 15 min Incubation avec l anticoprs secondaire couplé à la phosphatase alcaline (Sigma) 0,05% Dilution au 1/5 000 dans du tampon FLAG + BSA 0,5% + Tween-20 0,05% 90 min Lavages Tampon FLAG + Tween-20 0,05% 3 x 15 min Révélation BCIP/NBT (Sigma) Jusqu à la coloration désirée Tampon FLAG: Tris, Hcl ph=8,0 NaCl 50 mm 10 mm L anticorps primaire est un anticorps de souris (Sigma) et l anticorps secondaire est un anticorps anti-souris couplé à la phosphatase alcaline. 4. PURIFICATIN DE DE LA LIPASE DE B. CEPACIA La purification des extraits de BCL a été réalisée par immuno-affinité grâce à un anticorps monoclonal de souris dirigé contre le peptide FLAG (anticorps anti-flag M2, Sigma). Etant donné que nous cherchions à mettre au point un protocole de purification en accord avec la production à l échelle microplaque, nous avons choisi de réaliser les purifications en mode batch, plus facile à mettre en œuvre sur de très petits volumes. Toutes les étapes de purification ont été réalisées à 4 C. Le support utilisé est une résine d agarose, la résine M2 anti-flag commercialisée par Sigma. 114

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES 4.1. TAMPNS UTILISES La composition des différents tampons utilisés lors de ce protocole est indiquée ci-dessous. Tous ces tampons doivent être conservés à 4 C et maintenus dans la glace durant le procédé de purification. Tampon TBS Tampon Glycine-HCl Tris,HCl 50 mm Glycine 100 mm NaCl 150 mm Ajuster le ph à 3,5 Ajuster le ph à 7,4 Tampon TBS/D Tampon TBS/A Tris,HCl 50 mm Tris,HCl 50 mm NaCl 150 mm NaCl 150 mm Triton X-100 1% (v/v) Azide de sodium 0,02% (p/v) Tween-20 1% (v/v) Ajuster le ph à 7,4 Ajuster le ph à 7,4 4.2. PREPARATIN DE LA RESINE La résine (1 volume: 250 µl) est placée dans un eppendorf. Une première centrifugation de 25 secondes à 5000 g permet d éliminer le glycérol nécessaire à la conservation de la résine. La résine subit alors 2 cycles de lavages successifs. Un cycle se décompose de la façon suivante : - 2 lavages avec 4 volumes de tampon TBS à chaque lavage - 2 lavages avec 4 volumes de tampon Glycine-HCl à chaque lavage Entre chaque lavage, la résine est centrifugée 25 secondes à 5000 g. Puis, la résine est équilibrée par 2 lavages avec 4 volumes de tampon TBS. 115

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES 4.3. PRTCLE DE PURIFICATIN DE LA LIPASE DE B. CEPACIA L extrait protéique (1 volume, fraction soluble) est mis en contact avec la résine (1 volume), sous agitation douce (table agitante) pendant 1 heure à 4 C. Les effluents, contenant les protéines n ayant pas interagis avec la résine, sont éliminés par centrifugation 25 secondes à 5000 g. Les protéines fixées non spécifiquement sur le support sont éliminées en lavant la résine avec 4 volumes de tampon TBS et en la centrifugeant 25 secondes à 5000 g. L opération est renouvelée 9 fois. La protéine de fusion est enfin éluée avec 1 volume de peptide FLAG à 300 µg/ml en solution dans du tampon TBS/D. L opération est renouvelée 3 fois. L activité de chacune des fractions est dosée par la méthode au pnpb et la quantité de protéines totales est déterminée grâce à la méthode BCA. L enzyme purifiée est stockée à 4 C 4.4. REGENERATIN ET STCKAGE DE LA RESINE La résine peut être réutilisée 10 fois après régénération dans du tampon TBS/A et conservée à 4 C dans 4 volumes de tampon TBS/A. Pour 1 volume de résine, le procédé de régénération nécessite: - 2 lavages avec 4 volumes de tampon Glycine-HCl - 2 lavages avec 4 volumes de tampon TBS - 4 lavages avec 4 volumes de tampon TBS/A Entre chaque lavage, la résine est centrifugée 25 secondes à 5000 g. Les lavages avec les tampons Glycine-HCl et TBS sont renouvelés 2 fois. 5. REACTINS ENZYMATIQUES Tous les substrats utilisés au cours de cette étude étaient disponibles au laboratoire. Les réactions d hydrolyse ont été réalisées avec BCL recombinante tandis que les réactions de synthèse ont été mise en œuvre avec BCL commerciale (Chirazyme L-1, lyo., Roche). 116

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES 5.1. HYDRLYSE ENZYMATIQUE 5.1.1. Hydrolyse du para-nitrophényl butyrate (pnpb) Une unité lipase représente la quantité d enzyme qui libère une µmole de para-nitrophénol (pnp) par minute à une température donnée (30 C dans notre étude). L activité lipase est mesurée par la libération du pnp lors de l hydrolyse du para-nitrophényl butyrate (pnpb) en solution dans du 2-méthyl-2-butanol (2M2B) selon un protocole adapté de la méthode de Quinn et coll., (1982). Le pnpb est plus stable en solution dans du 2M2B que dans l acétonitrile, solvant utilisé dans le protocole original. Solutions stock : 40mM pnpb dans 2M2B Milieu réactionnel : 175 µl tampon Tris,HCl 100 mm ph 7,5 20 µl solution d'enzyme diluée convenablement 5 µl solution stock pnpb (concentration finale : 1 mm) Cinétique : L absorbance est suivie à 405 nm dans un lecteur de microplaques (VeraMax, Molecular Devices) pendant 10 minutes. Le milieu réactionnel est agité pendant 15 secondes entre chaque lecture. Chaque mesure d activité est répétée 5 fois afin d établir une moyenne et un écart-type lors de chaque dosage enzymatique. Le coefficient de variance (CV) est calculé selon la formule suivante: CV (%) = (écart-type/moyenne) x 100. Lors de chaque test, des mesures témoins, correspondant à des souches d E. coli transformées avec des plasmides ne contenant pas le gène lip, ont été réalisées afin de s assurer de l absence d activité estérase. 117

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES 5.1.2. Hydrolyse du (R,S)-α-bromo-phényl acétate de 2-chloro éthyle Les réactions d hydrolyse sont réalisées dans des tubes à vis. La réaction est réalisée avec 1 volume (250 µl) de phase organique (50 mm d ester en solution dans l octane) et 2 volumes d extrait enzymatique soluble. La réaction est thermostatée à 30 C, sous agitation magnétique à l aide d un barreau aimanté. Chaque tube à vis correspond à une seule mesure d énantiosélectivité. La réaction est arrêtée par ajout de 4 volumes de n-hexane/ipa 80/20 (v/v) puis le mélange est centrifugé 5 minutes à 13 000 rpm. La phase organique est alors prélevée, filtrée et analysée par chromatographie liquide à haute performance (CLHP). 5.2. SYNTHESE ENZYMATIQUE 5.2.1. Dosage et équilibre de l activité de l eau : aw a- Dosage : L activité de l eau est mesurée grâce à la combinaison d un capteur de mesure BS (Novasina) et d un indicateur digital Humidat IC (Novasina) associé à un enregistreur à deux voies. Les échantillons sont placés dans une coupelle introduite dans une chambre étanche de mesure. Un étalonnage préalable est effectué à l aide de sels saturés en eau, dont l activité de l eau est connue [LiCl (aw=0,11); Mg(N 3 ) 2, 6H 2 (aw=0,54); K 2 Cr 2 7 (aw=0,98)]. La détection est basée sur une variation de la conductivité d un gel en fonction de son état d hydratation. Cette méthode de mesure repose sur le principe que deux phases distinctes en équilibre ont la même activité quels que soient leurs volumes respectifs. Par exemple, une solution de sel saturée en eau aura la même activité de l eau indépendamment de la proportion en eau et en sel tant que les deux phases sont présentes. b- Equilibre à activité de l eau déterminée : Les préparations enzymatiques et les solvants organiques sont équilibrés séparément pendant au moins 4 jours à 4 C dans des enceintes hermétiques contenant des solutions saturées de sel d activité de l eau connue. Les sels utilisés sont : LiBr (aw=0,06), LiCl (aw=0,11), MgCl 2.6H 2 (aw=0,32), Mg(N 3 ) 2.6H 2 (aw=0,54), NaCl (aw=0,75), KN 3 (aw=0,92), K 2 Cr 2 7 (aw=0,98). Avec du tamis moléculaire 3Å (aw=0,04). 118

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES 5.2.2. Synthèse enzymatique : réaction de transestérification Les réactions de transestérification sont réalisées dans des tubes à vis. La réaction est réalisée dans 5 ml de solvant contenant 50 mm d ester, 150 mm d alcool et en présence de 5 mg/ml de lipase libre, thermostatée à 30 C, sous agitation magnétique à l aide d un barreau aimanté. Des prélèvements de 50 µl sont effectués à intervalles de temps réguliers, dilués dans l éluant destiné à l analyse, filtrés et analysés par chromatographie liquide à haute performance sur colonne chirale. 6. METHDES ANALYTIQUES 6.1. DSAGE DES PRTEINES Les protéines sont dosées par la méthode de Bradford (1976), basée sur le déplacement du maximum d absorption d une solution acide de bleu de Coomassie G250c de 465 nm à 595 nm provoquée par la présence de protéines. La technique du micro-bradford a été préférentiellement utilisée en raison des faibles quantités de protéines extraites. Ce dosage permet de doser des solutions contenant entre 0 et 25 mg/l de protéines. La courbe étalon est réalisée à l aide d une solution d albumine de sérum de bovin (BSA). Lorsque les fractions protéiques contiennent des détergents tels que le Triton X-100 ou le Tween-20, le dosage par la méthode de Bradford est faussé. Les dosages protéiques sont alors réalisés par la méthode BCA. Cette méthode est basée sur une réaction de Biuret (réduction des ions Cu 2+ en Cu + par les protéines dans une solution alcaline). Les ions Cu + réagissent alors spécifiquement avec un acide bicinchoninique, donnant une coloration plus ou moins violette en fonction de la concentration en protéine. Les absorbances sont mesurées à 562 nm. La gamme de linéarité de ce dosage est comprise entre 20 µg et 2 mg de protéines. La courbe étalon est réalisée à l aide d une solution d albumine de sérum de bovin (BSA). 119

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES 6.2. ANALYSES PAR CHRMATGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFRMANCE (CLHP) Toutes les analyses des réactions enzymatiques sont effectuées par Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP) sur colonne chirale à 254 nm. Le système (la pompe (1100), l injecteur automatique (1100), le système d acquisition et de traitement des données (HPChem), le système de détection U.V (1100) ) proviennent de Hewlett Packard. La colonne chirale utilisée est la colonne Chiralpack J, (4,6 x 250 mm de Daicel Chemical Industries Ltd, japon). Les conditions d analyse du mélange racémique sur cette colonne chirale sont les suivantes: - phase mobile : n-hexane/isopropanol - 80/20 (v/v) - débit : 1 ml/min - injection : 20 µl - UV : 254 nm - température : 30 C 7. DETERMINATIN DES EXCES ENANTIMERIQUES ET DE L ENANTISELECTIVITE 7.1. DETERMINATIN DES EXCES ENANTIMERIQUES A partir des résultats de la séparation par CLHP sur colonne chirale, les excès énantiomériques du substrat (e.e. s ) et les excès énantiomériques du produit (ee p ) sont calculés à partir des équations (1) et (2) ci-dessous. (R) et (S) représentent les énantiomères substrats. Le taux de conversion (c) de la réaction est calculé à partir de l équation (3). % e.e. s = (R-S) t x 100 (1) % e.e. p = (P-Q) (R+S) t x 100 (2) % c = 1 - t x 100 (3) (R+S) t (P+Q) t (R 0 +S 0 ) t=0 120

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES 7.2. DETERMINATIN DE L ENANTISELECTIVITE: E L énantiosélectivité représente la capacité de l enzyme à différencier les énantiomères (R) et (S). Dans cette étude, le ratio énantiomérique (E) a été calculé selon deux méthodes: (i) le rapport des vitesses initiales, et/ou (ii) la méthode des excès énantiomériques (Chen et Sih, 1989; Ducret et coll. 1998; Wu et Liu 2000). 8. MDELISATIN MLECULAIRE L étude de modélisation moléculaire est réalisée sur Intel Pentium4 PC avec un processeur 3.2GHz et sur la station de travail Silicon Graphics 2 R.10000, à l aide de logiciels Insight II, Builder, Biopolymer, Discover (Accelrys Inc, San Diego, USA). 8.1. CHAMPS DE FRCE CFF91 Rappelons qu en mécanique moléculaire on traite la molécule comme un ensemble d'atomes gouverné par une série de fonctions de potentiel. En mécanique moléculaire, seuls sont pris en compte les mouvements des noyaux alors que les électrons ne sont pas explicitement examinés. n suppose qu'ils vont trouver une distribution optimale autour des noyaux atomiques. Un champ de forces contient la totalité des fonctions énergétiques (décrivant les interactions entre atomes liés et non-liés) nécessaires pour calculer l énergie potentielle du système. Les interactions entre atomes liés correspondent à des énergies de déformation des liaisons, des angles de valence, des angles dièdres impropres et aux énergies de torsion. Les interactions entre atomes non-liés sont représentées par les énergies de van der Waals et électrostatiques ainsi que par l'énergie des liaisons hydrogène. E totale = E liés + E non-liés Dans un champ de deuxième génération, il y a des nouveaux termes croisés pour tenir compte d interactions mixtes. 121

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES Le champ de forces CFF91 est un champ de forces adapté à l étude conformationnelle des protéines, il est issu d un champ de forces de première génération CVFF (Consistence Valence ForceField) qui a déjà été testé sur de nombreuses molécules et qui garantit la fiabilité de CFF91. La figure 36 donne une illustration géométrique de la décomposition énergétique du champ de forces CFF91. n trouve les termes d élongation (1), de déformation d angle de valence (2) et dièdre (3), le terme (4) donne la valeur de l énergie de déformation hors du plan. Les expressions (5) à (11) qualifient les termes croisés. Elles prennent en compte, par exemple, l élongation de la liaison couplée à une déformation de l angle de valence adjacent (7) ou encore la torsion d un dièdre couplée à la déformation angulaire entre les mêmes atomes (8). Le terme (12) représente les interactions entre atomes non liés. L expression des interactions de van der Waals est formulée comme une somme de termes de Lennard-Jones répulsif et attractif, celle de l énergie électrostatique est de type coulombien. Dans les deux derniers cas, les expressions analytiques sont fonction des distances entre paires d atomes. Figure 36 : Représentation géométrique des différents termes du champ de forces CFF91. 122

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES 8.2. ALGRITHME DE MINIMISATIN STEEPEST DESCENT La mécanique moléculaire s intéresse aux calculs d énergie potentielle, avec le constat que toute modification géométrique de la molécule se répercute sur son énergie potentielle. Le principe de base de la minimisation consiste, à partir d'une géométrie approximative, à rechercher le jeu de coordonnées cartésiennes qui minimise la somme de toutes les contributions énergétiques dues aux déformations des coordonnées internes et aux interactions entre atomes non-liés. En d autres termes, tous les paramètres définissant la géométrie du système sont systématiquement modifiés par petits "incréments" jusqu'à ce que l'énergie potentielle moyenne atteigne un minimum local. Le but de l'exercice est donc d'atteindre un minimum local sur la surface de potentiel, le choix de l algorithme d optimisation, le contexte du calcul (nombre d atomes, degrés de liberté, ) influencent le temps de calcul total. L algorithme de minimisation que nous avons utilisé au cours de cette étude utilise la méthode de la plus grande pente steepest-descent. Après avoir calculé l'énergie correspondant à une géométrie initiale, il déplace chaque atome individuellement selon ses trois coordonnées cartésiennes et il recalcule l'énergie après chaque déplacement. Ceci revient à calculer la dérivée première uniquement. Ensuite il déplace tous les atomes sur une distance qui dépend de (de/dri), et ainsi de suite. Cet algorithme suivra donc la direction imposée par les forces interatomiques dominantes. C'est pourquoi il se révèle très efficace pour supprimer les mauvais contacts ou les principaux problèmes stéréochimiques qui existent dans les coordonnées brutes d'une structure, tout en perturbant très peu cette dernière. 8.3. MDELISATIN DES INTERMEDIAIRES TETRAEDRIQUES Le protocole utilisé pour modéliser les intermédiaires tétraédriques sera donné en utilisant comme exemple l α-bromo phényl acétate d éthyle. Tous les autres intermédiaires tétraédriques des substrats de cette étude, dérivés de l acide 2-bromo phényl acétate d éthyle, ont ensuite été obtenus par simple substitution des atomes. 123

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES 8.3.1. Construction de la structure protéique Les coordonnées cristallographiques de la lipase de Burkholderia cepacia (BCL) utilisées pour cette étude nous ont été gracieusement fournies par Miroslaw Cygler et Joseph Schrag du NRC Biotechnology Research Institute, Montréal (Canada). Cette structure, co-cristallisée avec un inhibiteur phosphate n est pas disponible dans la PDB (données non publiées). Cependant, la comparaison de la structure de B. cepacia co-cristallisée en présence de l inhibiteur avec celle de B. cepacia native sous forme ouverte, disponible dans la PDB sous le code 3LIP (Schrag et coll., 1997), n a pas révélé de différences structurales significatives, validant ces données structurales pour la suite de l étude. Le choix de cette structure co-cristallisée avec un inhibiteur, et plus particulièrement l orientation de l inhibiteur dans le site actif (figure 37), nous a servi de guide pour l arrimage du (R,S)-α-bromo-phényl acétate d éthyle dans le site actif de la lipase. Figure 37 : Données cristallographiques de BCL co-cristallisée en présence d inhibiteur (diéthylphosphate). Réseau de liaisons hydrogène du premier intermédiaire tétraédrique de la réaction catalysée par la lipase de B. cepacia. La triade catalytique est composée de Asp-264, His-286 et Ser- 87. Le trou oxyanion est composé de Leu-17 et Gln-88 (Kim et coll., 1997; Scharg et coll., 1997). 124

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES Dans un premier temps, à partir de la structure aux rayons-x de la lipase, les hydrogènes ont été ajoutés, les molécules d eau éliminées, l histidine catalytique (His 286) modifiée en histidine positive (His ). La liaison covalente entre l inhibiteur présent dans la structure et la sérine catalytique (Ser 87) a été recréée. La transformation de l histidine catalytique permet de représenter correctement le réseau de liaisons hydrogène de l intermédiaire tétraédrique de la réaction (figure 37). La position des atomes d hydrogène a été dans un premier temps optimisée séparément par une minimisation rapide (tous les atomes lourds étant fixes sauf ceux de l inhibiteur). La structure protéique a été ensuite soumise à une seconde optimisation par minimisation. Cela permet d affiner le positionnement des atomes lourds de la protéine en utilisant la contrainte de force ( tether de Discover ) sur les positions initiales égale à 200 kcal/å. Découpage de la protéine Pour des économies de temps de calcul, les optimisations des complexes enzyme/substrat n ont pas été effectuées avec la protéine entière mais avec un sous-ensemble de la protéine. Cette sous-structure comprend les acides aminés suivants: - Tous les acides aminés appartenant ou délimitant les parois du site actif ont été pris en compte, soit un ensemble de 43 résidus (tableau 15). - Parmi ces 43 acides aminés, si un acide aminé appartient à un élément de structure secondaire, un à deux acides aminés en amont et en aval ont été également pris en compte. - Si l acide aminé appartient à une boucle, la totalité des acides aminés de la boucle a été retenue, ainsi que ses extrémités correspondant à un élément de structure secondaire. Pour les calculs, lorsque qu un acide aminé appartient à un élément de structure secondaire, son squelette est considéré comme fixe et seule la chaîne latérale sera autorisée à fluctuer. Le découpage est résumé dans le tableau 15. Le schéma ci-dessous de BCL, permet de repérer les zones de découpage réalisées. 125

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES Schéma de la structure secondaire de BCL (Kim et coll., 1997). Tableau 15 : Découpage de BCL. Acides aminés délimitant les parois du site actif Prise en compte des acides aminés a *Gly-16, Leu-17, Thr-18, Tyr-23, Leu-27, Glu-28, Tyr-29 *Phe-52 *His-86, Ser-87, Gln-88 *Gly-111, Thr-112, Pro-113, Gly-116, Ser-117, Phe-119, Ala-120, - 14 à 33-46 à 62-85 à 91-110 à 150 Val-123, Leu-127, Ile-139, Phe-142, Val 143, Phe-146, Thr-150 *Ala-160, Leu-161, Ala-163, Leu-164, Leu 167 *Pro-243, Ser-244, Ala-247, Leu-248, Thr-251, Val-266, Val-267 *His-286, Leu-287, Ile-290, Gln-292, Leu-293, Leu-294-160 à 170-241 à 269-282 à 304 (a) le squelette des acides aminés appartenant à des éléments structuraux est gardé fixe durant les calculs. 126

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES 8.3.2. Construction de l intermédiaire tétraédrique : recherche des conformations de basse énergie Pour construire l intermédiaire tétraédrique qui correspond à la sérine catalytique (de configuration S) liée de manière covalente à l α-bromo-phényl acétate d éthyle (figure 38), nous avons utilisé les données cristallographiques de la lipase de B. cepacia cristallisée en présence de l inhibiteur diéthyl phosphate. Les valeurs des angles dièdres a, b, c, d et e de la sérine catalytique liée de manière covalente avec cet inhibiteur, ont été utilisées et considérées fixes pour la construction de l intermédiaire tétraédrique. A partir de cet intermédiaire, la recherche de conformations de basse énergie s est donc réduite à une recherche systématique des minima énergétiques par rotation des deux angles dièdres X et Y correspondant à la partie acyle du substrat (figure 38 a,b). (a) 127

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES (b) Figure 38 : (a) Représentation des intermédiaires tétraédriques (l atome de brome est représenté en jaune). A droite: données cristallographiques de la structure de BCL cristallisée en présence de l inhibiteur diéthyl phosphate. Représentation des principaux angles dièdres définis par la rotation autour des liaisons (a, b, c, d, e) de l intermédiaire tétraédrique. A gauche: Représentation générale de l intermédiaire tétraédrique en liaison covalente entre la sérine catalytique et l α-bromo phényl acétate d éthyle. Représentation des angles dièdres X et Y que l on fait tourner pour la recherche des minima énergétiques. C Br, dénote le carbone asymétrique de l α-bromo phényl acétate d éthyle, et C it, le carbone asymétrique formé lors de l attaque de la sérine catalytique sur la fonction carbonyle du substrat (α-bromo phényl acétate d éthyle). (b) Définition des angles dièdres X (C1, C2, C7, C8) et Y (C2, C7, C8, 9). utre les deux intermédiaires tétraédriques que l on peut former avec chaque énantiomère du (R,S)-α-bromo-phényl acétate d éthyle et noté C Br R ou C Br S, l attaque de la sérine catalytique sur la fonction carbonyle du substrat engendre la formation d un nouveau centre asymétrique, noté C it R ou C it S (figure 38), qu il faut prendre en compte. Finalement, quatre intermédiaires tétraédriques peuvent exister et se former, contenant chacun deux centres asymétriques. Il s agit des couples (C Br R, C it R), (C Br R, C it S), (C Br S, C it R), (C Br S, C it S). Pour chacun, nous avons recherché les conformations de basse énergie selon les angles dièdres X et Y. 128

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES Construction des cartes énergétiques 1) Dans un premier temps, une recherche systématique par pas de 10 degrés sur les angles dièdres X et Y est effectuée en utilisant la commande rotor de Discover. Pour chaque couple (X, Y), l énergie instantanée est calculée et les premiers contours isoénergétiques tracés. Le but essentiel de cette première étape est de localiser de manière approximative les principaux minima. 2) Dans un deuxième temps, à partir des principaux minima identifiés, une optimisation de la structure permet d affiner la géométrie des minima dans l espace (X, Y). Chaque conformation de basse énergie obtenue après cette seconde étape est considérée comme représentante du minimum local. 8.3.3. Arrimage des intermédiaires dans la lipase découpée Toutes les conformations initiales de basse énergie identifiées sont ensuite ancrées dans le site actif de BCL. Pour construire les complexes enzyme/α-bromo-phényl acétate d éthyle, l inhibiteur diéthyl phosphate présent dans la lipase découpée a été remplacé par les différentes conformations de chaque intermédiaire tétraédrique selon le schéma présenté figure 39. CH 3 - - - - HN C1 C CH CH 2 P + - + C2 H H 2 N C H C H 3 CH 2 - Br - - - - protéine HN sérine catalytique CH 3 inhibiteur co-cristallisé intermédiaire tétraédrique - - - - HN C CH 2 - - - - - CH HN C H 3 Br Figure 39 : Arrimage des intermédiaires à l intérieur du site actif: formation de la liaison covalente entre la sérine catalytique (C1) et l intermédiaire tétraédrique (C2). Les parties hachurées sont éliminées. 129

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES Les 16 différents complexes enzyme/substrat ainsi formés sont nommés comme suit: C Br (R), C it (R)-A; C Br (R), C it (R)-B; ; C Br (S), C it (R)-A ; C Br (S), C it (R)-B ; ; C Br (R), C it (S)-A; ; C Br (S), C it (S)-A ; ; où A, A, B, B représentent les différentes conformations de basse énergie (minima) déterminées à partir des cartes énergétiques. 8.3.4. Minimisation des complexes enzyme/substrat Chaque complexe enzyme/substrat est soumis à une procédure de trois minimisations successives. Les minimisations font intervenir le champ de forces CFF 91 et l algorithme de minimisation steepest descent. 1) La première minimisation (2000 itérations) est réalisée sur le complexe en fixant tous les atomes lourds de l enzyme découpée à l exception de ceux appartenant à la chaîne latérale de la sérine catalytique (Ser 87) et ceux appartenant au substrat. Le but de cette première étape est d adapter progressivement la géométrie initiale du substrat à son environnement et de supprimer tous les mauvais contacts générés au cours du processus d arrimage. 2) La seconde minimisation (10000 itérations) est réalisée en maintenant entièrement fixe le squelette partiel de la protéine et en laissant toutes les chaînes latérales des acides aminés libres de tout mouvement. Cette seconde étape, ou plus de liberté est laissée au système, permet d affiner le positionnement du substrat dans le site actif de l enzyme. 3) La troisième et dernière minimisation (50000 itérations) est réalisée en laissant plus de flexibilité au système. Seul le squelette des acides aminés faisant partie d éléments structuraux de la protéine (hélice α et feuillet β) est maintenu fixe dans le but de ne pas perdre la structure tridimensionnelle de la protéine (acide aminé fixe : c.f. découpage tableau 15). Cette troisième étape est un prolongement de la seconde étape, mais le système est moins contraint. 130

CHAPITRE II MATERIELS ET METHDES A l issu de cette procédure de minimisation, les différents complexes enzyme/substrat sont analysés et comparés entre eux. Deux critères ont été retenus : 1) l énergie potentielle étroitement liée aux interactions stériques entre les principaux acides aminés du site actif et l α-bromo-phényl acétate d éthyle, 2) le réseau de liaisons hydrogène stabilisant l intermédiaire tétraédrique. 8.4. CALCUL DES TRAJECTIRES DES ENANTIMERES La liaison covalente entre la sérine catalytique et le carbonyle du substrat est rompue afin de créer deux entités séparées, permettant ainsi le déplacement du substrat dans le site actif de BCL. Ces structures, dans lesquelles le substrat est dans une position catalytique non liée à l enzyme, sont ensuite minimisées afin de corriger l hybridation de la fonction carbonyle de sp 3 à sp 2 et générent les modèles moléculaires utilisés pour la recherche de trajectoires. En partant de la position d arrimage, les trajectoires des énantiomères sont calculées en utilisant l algorithme de planification de mouvements intégré au logiciel Biomove 3D, depuis le cœur jusqu à l entrée du site actif (Jaillet et Siméon, 2004). Le substrat et les chaînes latérales des 17 acides aminés tapissant les parois du site actif sont considérés comme flexibles. Au total, 68 degrés de liberté sont pris en compte pour le complexe enzyme/substrat (11 pour le substrat et 57 pour les chaînes latérales de l enzyme). Les atomes sont modélisés avec 80 % de leurs rayons de van der Waals. Afin de s assurer que l espace du site actif est complètement exploré au cours de la recherche de trajectoires, une première série de test comportant un nombre croissant de trajectoires (25, 50, 100, 500 et 1000) a été calculée pour chaque couple d énantiomères substrats. La moyenne des temps de calcul (CPU) montre que quelque soit le nombre de trajectoires calculées, les résultats obtenus sont similaires. Sur cette base, les calculs des trajectoires pour chaque couple d énantiomères substrats sont réalisés à partir de 5 séries de 100 trajectoires chacune. 131

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Chapitre III Evaluation in silico du rôle de l accès du substrat au site actif de lipase de B. cepacia par une approche robotique 133

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CHAPITRE III EVALUTAIN IN SILIC DU RLE DE L ACCES DU SUBSTRAT AU SITE ACTIF DE LA LIPASE DE B. CEPACIA PAR UNE APPRCHE RBTIQUE 1. INTRDUCTIN Ce chapitre a pour objet de poursuivre l investigation du rôle de l accessibilité dans l énantiosélectivité des lipases par des techniques de modélisation moléculaire. La réaction modèle choisie est le dédoublement d acides racémiques 2-substitués, tels que le (R,S)-2- bromo-phényl acétate d éthyle. La lipase de Burkholderia cepacia ATCC21808 (BCL) s est révélée être la plus énantiosélective pour ce type de réaction avec une préférence pour l énantiomère (R) (Guieysse et coll., 2001, 2003a). Le site catalytique de BCL se situe au fond d une poche hydrophobe enfouie et étroite. Etant donné la topologie contrainte de ce site actif, Guieysse et coll., (2003b), ont proposé que l énantiopréférence soit liée à une différence d accessibilité du substrat au site catalytique de l enzyme. Dans ce cas, l accès préférentiel de l un des énantiomères contrôlerait la cinétique de la réaction. Des études préliminaires de pseudo-dynamique moléculaire sous contrainte ont mis en évidence une différence d accessibilité des deux énantiomères au site actif de l enzyme via un réseau d acides aminés hydrophobes à chaînes latérales pivotantes (Guieysse et coll., 2003b). Néanmoins, la modélisation des trajectoires du substrat à l intérieur du site actif reste une tache ardue et coûteuse en temps de calcul, en particulier lorsqu il s agit de prendre en compte la flexibilité moléculaire. La plupart des approches de modélisation moléculaire ne tiennent compte que des propriétés statiques d interaction ligand-récepteur, et ce, en raison de la durée et de la complexité des calculs nécessaires pour simuler l accès du ligand au site actif de l enzyme. Pour poursuivre l étude du rôle de l accessibilité sur l énantiosélectivité de BCL, choisie comme enzyme modèle, nous avons développé une approche mixte couplant des techniques de modélisation moléculaire classiques à de nouvelles techniques algorithmiques de planification de mouvements issues de la robotique. Cette approche a fait l objet d une étroite collaboration avec le LAAS-CNRS dans le cadre du projet ALMA soutenu par l ITAV. Les algorithmes de planification de mouvements, destinés initialement à la recherche de trajectoires de robots articulés dans un environnement contraint, ont déjà été employés avec succès pour étudier différents problèmes de mouvements moléculaires tels que : (i) l arrimage (docking) de ligands et leur chemin d accès dans des récepteurs flexibles (Apaydin et coll., 2003 ; Cortés et coll., 2005), (ii) le repliement des protéines et de l ADN (Amato et coll., 135

CHAPITRE III EVALUTAIN IN SILIC DU RLE DE L ACCES DU SUBSTRAT AU SITE ACTIF DE LA LIPASE DE B. CEPACIA PAR UNE APPRCHE RBTIQUE 2003 ; Tang et coll., 2004), ou encore (iii) des changements conformationnels dus à des mouvements de boucles et de domaines protéiques (Cortés et coll., 2004 ; Kirillova et coll., 2007). Le principal avantage de cette approche mécanistique est qu elle combine l efficacité du traitement géométrique des principales contraintes (par exemple, l élimination des contraintes stériques et les contraintes structurales intervenant dans le modèle moléculaire) avec la performance des algorithmes de planification de mouvements conduisant ainsi à une exploration conformationnelle rapide (Jaillet et Siméon, 2004 ; Cortés et coll., 2005 ; Cortés et coll., 2007). Une telle combinaison permet notamment de prendre en compte la flexibilité moléculaire ainsi que les mouvements de large amplitude tout en limitant considérablement la durée des temps de calcul. Les travaux, présentés dans ce chapitre, visent à exploiter le potentiel de ces algorithmes de planification de mouvements pour aborder l influence de l accessibilité du substrat sur l énantiosélectivité de BCL. Plusieurs acides racémiques 2-substitués ont été testés en utilisant une version améliorée du logiciel prototype BioMove3D (Cortés et coll., 2005 ; Cortés et coll., 2007). Les différentes données obtenues in silico ont été analysées et comparées aux résultats expérimentaux. Les informations sur les distances atomiques entre l enzyme et le substrat, collectées durant la recherche de trajectoires à l aide du détecteur de collisions BioCD (Ruiz et coll., 2005), ont été utilisées pour identifier les acides aminés contraignant le déplacement des énantiomères (R) et (S) à l intérieur du site actif de BCL. Ces résultats fournissent un nouvel aperçu sur le lien existant entre la structure des énantiomères et la dynamique des mouvements combinés de l enzyme et du substrat lors de l étape d accessibilité. Le rôle de cette interaction synergique, en amont de la catalyse, sur la sélectivité de l enzyme ainsi que le potentiel de cette nouvelle approche de modélisation, employée comme étape de filtrage pour sélectionner ou améliorer un catalyseur donné lors de la résolution d un mélange racémique donné seront discutés. 136

CHAPITRE III EVALUTAIN IN SILIC DU RLE DE L ACCES DU SUBSTRAT AU SITE ACTIF DE LA LIPASE DE B. CEPACIA PAR UNE APPRCHE RBTIQUE 2. DEDUBLEMENT DE DIFFERENTS ACIDES RACEMIQUES 2-SUBSTITUTES Plusieurs couples d énantiomères, dérivés de l acide 2-bromo phényl acétate d éthyle, ont été synthétisés et testés en réactions de transestérification catalysées par BCL en présence d octanol et dans l octane (figure 40). L objectif était de disposer de données expérimentales pour différents substrats afin de comparer les résultats expérimentaux à ceux de la modélisation. X X X C 2H5 n-octanol C 2H5 C 8H17 R R,S BCL n-octane, 30 R S R R Figure 40 : Réactions de transestérification des esters dérivés de l acide 2-bromo phénylacétique catalysées par BCL. Pour toutes les réactions, une préférence pour l énantiomère (R) a été observée, avec des valeurs d énantiosélectivité (E) variant de 1,5 à 57 en fonction du substrat testé (tableau 16). Pour les substrats 1 à 4, qui diffèrent seulement par la position du groupement méthyle sur le noyau aromatique, les valeurs expérimentales de E mettent en évidence que BCL est énantiosélective pour les substrats non-substitutés ou substitués en position méta et para (substrats 1, 3 et 4) avec des valeurs de E égales respectivement à 57, 59 et 50. A l inverse, BCL est faiblement énantiosélective pour le substrat substitué en position ortho (substrat 2), et pour lequel le taux de conversion reste faible. Ces résultats expérimentaux indiquent que l énantiosélectivité de la lipase diminue progressivement avec la taille de l atome d halogène présent au niveau du carbone asymétrique. En effet, d une valeur E égale à 57 obtenue avec l atome de brome (substrat 1), l énantiosélectivité diminue avec l atome de chlore (substrat 5; E=26) et l atome de fluor (substrat 6; E=1,5). La contribution de l électronégativité de l atome d halogène sur l énantiosélectivité de BCL a été évaluée en remplaçant l atome de brome du substrat 1 (rayon de van der Waals de 1,90 Å) par un groupement méthyle (rayon de van der Waals de 2,0 Å; substrat 7). Bien que la vitesse de réaction diminue pour ce substrat, BCL reste sélective (E=35), suggérant ainsi que son énantiosélectivité est gouvernée par des contraintes stériques liées à la taille de l atome d halogène. Afin d évaluer le rôle de l accessibilité des substrats et de leurs positions à l intérieur du site actif sur 137

CHAPITRE III EVALUTAIN IN SILIC DU RLE DE L ACCES DU SUBSTRAT AU SITE ACTIF DE LA LIPASE DE B. CEPACIA PAR UNE APPRCHE RBTIQUE l énantiosélectivité de BCL, une approche algorithmique a été développée pour simuler et comparer les trajectoires des énantiomères. Tableau 16 : Enantiosélectivité de BCL pour les substrats de type α-x-phényl acétate d alkyle : influence des substituants -X et R. Substrat E (vir/vis) Conversion (%) % ee s Numéro du composé X- R- 1 (a,b) Br H 57 (±7) 47 (84h) 77 2 (a,b) Br ortho-ch 3 4.3 (±0.5) 15 (120h) 10 3 (a,b) Br méta-ch 3 59 (±2) 46 (120h) 75 4 (a,b) Br para-ch 3 50 (±3) 41 (120h) 67 5 (b) Cl H 26 (±1) 48 (72h) 73 6 (b) F H 1.5 (±0.1) 54 (49h) 5 7 (b) CH 3 H 35 (±3) 29 (175h) 39 (a) Guieysse et coll., 2003a,b. (b) Guieysse, 2002. 3. CALCUL DE L ACCESSIBILITE DU SUBSTRAT VIA LES TRAJECTIRES D ACCES/SRTIE Afin d analyser les relations entre le chemin d accès au site actif, la topologie du substrat et l énantiosélectivité de BCL, le calcul des trajectoires a été réalisé en utilisant un modèle polyarticulé où tous les atomes du substrat et de l enzyme sont représentés par des sphères reliées entre elles par des liaisons rigides. Le substrat est ainsi considéré comme un robot articulé se déplaçant dans un environnement contraint représentant le site actif de l enzyme. Les mouvements du substrat et de la lipase sont restreints par des contraintes géométriques permettant d éviter les conflits stériques entre les atomes. Dans cette étude, le substrat et 17 chaînes latérales des acides aminés tapissant le site actif de BCL sont considérés flexibles, 138

CHAPITRE III EVALUTAIN IN SILIC DU RLE DE L ACCES DU SUBSTRAT AU SITE ACTIF DE LA LIPASE DE B. CEPACIA PAR UNE APPRCHE RBTIQUE tandis que les atomes du squelette de la lipase sont maintenus rigides. L intérêt majeur d une telle représentation est qu elle permet d effectuer des calculs de trajectoires extrêmement rapides à partir d une recherche conformationnelle prenant en compte les contraintes géométriques. Pour un couple enzyme-substrat donné, la trajectoire du substrat sera calculée à partir d une conformation productive depuis l intérieur du site actif jusqu à la surface de la protéine, en supposant que la difficulté géométrique rencontrée lors de la sortie du substrat est similaire à celle rencontrée lors de son entrée. L algorithme utilisé est une variante de l algorithme RRT (Rapidly-exploring Random Trees) spécialement conçu pour résoudre les problèmes de désassemblage moléculaire (Lavalle et Kuffner, 2001 ; Cortés et coll., 2007). L algorithme RRT, développé par le LAAS-CNRS, est un algorithme de recherche de trajectoires aléatoires qui construit par incrémentation une structure arborescente en étendant ses branches vers des régions inconnues de l espace de recherche, tout en satisfaisant des contraintes de mouvements (par exemple l élimination des collisions). Ses caractéristiques lui permettent d explorer rapidement l espace accessible à partir d une conformation initiale donnée (figure 41). Figure 41 : Projection tridimensionnelle d'un arbre de recherche RRT. Les petites armatures rouges sont des nœuds, correspondant aux conformations possibles du complexe enzyme-substrat. Les bords (lignes noires) correspondent aux transitions possibles. La projection de l arbre tend à couvrir le volume accessible au substrat à partir de sa position d arrimage, en considérant la flexibilité du substrat et des chaînes latérales de la protéine. 139

CHAPITRE III EVALUTAIN IN SILIC DU RLE DE L ACCES DU SUBSTRAT AU SITE ACTIF DE LA LIPASE DE B. CEPACIA PAR UNE APPRCHE RBTIQUE Le temps de calcul nécessaire à l algorithme RRT pour trouver une trajectoire de sortie est représentatif de la difficulté géométrique du problème. Lorsque les topologies du substrat et de la cavité du site actif sont bien adaptées, l algorithme RRT calculera une trajectoire de sortie avec un petit nombre d itérations. A l inverse, il lui faudra plus de temps pour calculer la trajectoire d un substrat pour lequel sa structure rend la sortie plus contraignante. La première étape, avant de calculer les trajectoires de sortie, est de déterminer la conformation du substrat à l intérieur du site actif en amont de la catalyse qui servira de point de départ pour l algorithme RRT. Les données de la littérature montrent que l intermédiaire tétraédrique de la réaction est généralement considéré comme étant le meilleur modèle de l état de transition (rrenius et coll., 1998b). Pour chaque énantiomère, les intermédiaires tétraédriques ont été construits en utilisant une procédure, basée sur la mécanique moléculaire, décrite par Guieysse et coll., (2003b). Un exemple des intermédiaires tétraédriques obtenus avec les énantiomères (R) et (S) du substrat 3 est représenté dans la figure 42. Cette recherche de conformation permet de sélectionner les conformations satisfaisant les conditions requises pour la catalyse : (i) la présence d un réseau de liaisons hydrogène assistant la réaction catalytique, et (ii) une énergie du complexe enzyme-substrat acceptable. Le groupement (Br, Cl, F, ou CH 3 ) présent au niveau du centre asymétrique de chaque énantiomère adopte deux orientations différentes. Dans le cas de l énantiomère (R), ce groupement est orienté vers la leucine 167, tandis que pour l énantiomère (S), il est orienté vers la valine 267. Dans une deuxième étape, la liaison covalente entre la sérine catalytique (Ser87) et le substrat a été rompue, créant ainsi deux entités moléculaires séparées, et représentant l étape précédant la catalyse. Enfin, le planificateur de mouvements intégré dans le logiciel, a été utilisé pour explorer l espace de toutes les trajectoires possibles des substrats 1 à 7 depuis le site catalytique jusqu à la surface de BCL. 140

CHAPITRE III EVALUTAIN IN SILIC DU RLE DE L ACCES DU SUBSTRAT AU SITE ACTIF DE LA LIPASE DE B. CEPACIA PAR UNE APPRCHE RBTIQUE R- S- L17 L17 V266 H286 V266 H286 Br Br L167 L167 V267 D264 V267 D264 Figure 42 : Intermédiaires tétraédriques du substrat 3 : l'atome de brome est orienté vers la leucine 167 pour l énantiomère (R) (à gauche), et vers la valine 267 pour l énantiomère (S) (à droite). La valine 266 et la leucine 17, en jaune, définissent un goulot d'étranglement dans le site actif. 4. ANALYSES DES TRAJECTIRES D ACCES/SRTIE DES SUBSTRATS En raison de la nature stochastique de l algorithme RRT, le tracé et le temps de calcul de la trajectoire de sortie d un substrat donné diffèrent d un calcul à l autre. Ces calculs doivent alors être répétés plusieurs fois afin d améliorer la précision sur les difficultés d accès du substrat. Pour raccourcir les temps de calculs, l algorithme annonce un échec si une trajectoire atteignant la surface de la protéine n est pas trouvée dans une limite de temps impartie. Les tableaux 17 et 18 indiquent la moyenne des temps de calcul (temps CPU) ainsi que le nombre d échecs rencontrés pour calculer les trajectoires de sortie de la poche catalytique pour chaque couple d énantiomères testé. Ces deux paramètres reflètent, dans une certaine mesure, la difficulté du problème à résoudre. Des variations significatives de la moyenne des temps CPU ont été observées pour les différents mélanges racémiques. En effet, la partie acyle du substrat a une influence sur l exploration géométrique, et par extension sur la recherche de trajectoires. Cependant, la moyenne des temps CPU nécessaires pour calculer les trajectoires des énantiomères (S) (de 3 à 104,9 secondes) est toujours supérieure à celle des 141

CHAPITRE III EVALUTAIN IN SILIC DU RLE DE L ACCES DU SUBSTRAT AU SITE ACTIF DE LA LIPASE DE B. CEPACIA PAR UNE APPRCHE RBTIQUE temps CPU nécessaires pour calculer les trajectoires des énantiomères (R) (de 1 à 3 secondes). Pour exemple, la figure 43 illustre les changements conformationnels intervenant tout au long des trajectoires des énantiomères (R) et (S) du dérivé meta-tolyl (substrat 3). Le substrat et les chaînes latérales de la lipase doivent adopter une conformation différente pour passer au travers du goulot d étranglement, formé par la valine 266 et la leucine 17. En effet, la cavité, rétrécie au niveau de ces positions, gêne fortement l accès de l énantiomère (S), tandis que l accès de l énantiomère (R) est peu contraint. Val266 ext int Leu17 Leu17 (a) R - R - Val266 Val266 int ext Leu17 Leu17 (b) S - S - Val266 Figure 43 : Changements conformationnels se produisant le long des trajectoires des énantiomères (R)-et (S) du bromo-méta-tolyl acétate d éthyle (substrat 3) représentés respectivement sur les images (a) et (b). A gauche : le site actif de BCL est représenté par la surface de Connoly tracée à l aide du module de MLCAD intégré dans Sybyl7.3 (Tripos, St Louis, M, USA). Les régions lipophiles du site actif de l enzyme sont représentées en brun et les régions polaires en bleu. A droite: vue des différentes conformations adoptées par les substrats le long de la trajectoire. La difficulté rencontrée par l algorithme de planification de mouvements pour calculer le déplacement des énantiomères (S) est clairement plus prononcée pour les substrats 1, 3 et 4. Cette difficulté est illustrée par le nombre d échecs rencontrés pour trouver une trajectoire de sortie pour ces substrats (tableau 17). En parallèle, les résultats expérimentaux indiquent une préférence pour l énantiomère (R). Par conséquent, nous pouvons suggérer qu un temps CPU 142

CHAPITRE III EVALUTAIN IN SILIC DU RLE DE L ACCES DU SUBSTRAT AU SITE ACTIF DE LA LIPASE DE B. CEPACIA PAR UNE APPRCHE RBTIQUE court, accompagné d un nombre faible d échecs, reflète une meilleure accessibilité, ce qui corrèle avec l énantiopréférence expérimentale. Au contraire, un temps CPU plus long et/ou un nombre d échecs plus important dus à un accès plus difficile pour un énantiomère sont corrélés à une réactivité plus faible de ce dernier. Sur cette base, ces deux paramètres, le temps CPU et le nombre d échecs, apparaissent comme des indicateurs qualitatifs de l énantiosélectivité de la lipase. Tableau 17 : Simulation des trajectoires des substrats différant par le substituant R sur le cycle phényl. Les valeurs présentées ci-dessous on été obtenues après cinq séries de cent calculs chacune. Substrat E expérime ntale (vir/vis) Moyenne des temps de calcul (sec.) Ratio CPU(S)/CPU(R) in silico Nombre d échecs R S R S Br C 2 H 5 1 57 (±7) 1.7 (±0.2) 24.0 (±1.3) 14 0 2 Br CH 3 C 2 H 5 2 4.3 (±0.5) 3.0 (±0.7) 7.6 (±1.0) 3 0 0 Br C 2 H 5 3 59 (±2) 1.7 (±0.4) 104.9 (±5.5) 61 0 197 CH 3 Br H 3 C C 2 H 5 4 50 (±3) 1.0 (±0.4) 39.0 (±3.4) 40 0 11 Le ratio CPU(S)/CPU(R) a également été déterminé pour chaque couple d énantiomères et comparé aux valeurs expérimentales de l énantiosélectivité. Pour les substrats 2 à 4, différant seulement par la présence ou la position du groupement méthyle sur le noyau aromatique, le ratio des temps CPU suit la même tendance que celle observée pour les valeurs expérimentales de l énantiosélectivité (tableau 17). n peut également noter que l algorithme de planification de mouvements n a jamais échoué lors du calcul des trajectoires des énantiomères (R) et (S) du substrat substitué en ortho- (substrat 2) alors qu il a échoué plusieurs fois lors du calcul des trajectoires de sortie des autres énantiomères (S). La présence du groupement méthyle en position ortho (substrat 2) ralentit le temps de calcul des 143

CHAPITRE III EVALUTAIN IN SILIC DU RLE DE L ACCES DU SUBSTRAT AU SITE ACTIF DE LA LIPASE DE B. CEPACIA PAR UNE APPRCHE RBTIQUE trajectoires de l énantiomère (R) (temps CPU plus important), mais accélère considérablement celui des trajectoires de l énantiomère (S), réduisant ainsi le ratio CPU(S)/CPU(R). Une corrélation entre le ratio CPU(S)/CPU(R) et les valeurs expérimentales de l énantiosélectivité est également observée pour la série de substrats portant un atome d halogène (-X) au niveau du carbone asymétrique (tableau 18). L analyse des trajectoires montre que les substrats portant des groupements encombrants au niveau de leur centre asymétrique, tels qu un atome de brome (substrat 1) ou un groupement méthyle (substrat 7), sont plus retenus au niveau du goulot d étranglement. Ainsi, l algorithme de planification de mouvements mettra plus de temps pour trouver une trajectoire de sortie pour l énantiomère (S). Cependant, le ratio des temps CPU ne peut pas être directement considéré en tant qu estimation quantitative des valeurs de l énantiosélectivité puisque celui-ci inclus un certain nombre de biais de calculs liés à l efficacité de la technique de planification de mouvements. Dans de précédents travaux, au cours desquels une version moins évoluée de BioMove3D avait été utilisée, différentes valeurs de ratio de temps CPU avaient été obtenues pour les substrats 1, 5 et 6 néanmoins, les mêmes tendances avaient été observées (Cortés et coll., 2005). Les résultats obtenus indiquent que le temps nécessaire pour calculer une trajectoire de sortie est un bon indicateur de l énantiopréférence de l enzyme. Cependant, les prédictions in silico basées sur le calcul des ratios de temps CPU ne corrèlent pas parfaitement avec l énantiosélectivité de BCL lors du dédoublement des mélanges racémiques différant seulement par la taille de l un des substituants. Ceci suggère que l énantiosélectivité de BCL est le résultat d une subtile balance entre des contributions thermodynamiques et cinétiques, et que l accessibilité ne peut être considérée comme le seul facteur impliqué dans l énantiosélectivité. Toutefois, dans quelques cas, particulièrement pour des topologies contraintes de site actif, nos résultats soulignent que l énantiosélectivité est influencée par l accès du substrat au site actif. Bien que des prédictions quantitatives ne soient pas encore réalisables, l introduction de calculs énergétiques au cours de la recherche de trajectoires, en particulier pour prendre en compte les attractions électrostatiques ou les répulsions, permettrait à terme d améliorer cette approche et la qualité des prédictions. 144

CHAPITRE III EVALUTAIN IN SILIC DU RLE DE L ACCES DU SUBSTRAT AU SITE ACTIF DE LA LIPASE DE B. CEPACIA PAR UNE APPRCHE RBTIQUE Tableau 18 : Simulation des trajectoires des substrats différant par le substituant halogéné présent au niveau du centre chiral. Les valeurs présentées ci-dessous on été obtenues après cinq séries de cent calculs chacune. Substrat E expérime ntale (vir/vis) Moyenne des temps de calcul (sec.) Ratio CPU(S)/CPU(R) in silico Nombre d échecs R S R S Br C 2 H 5 1 57 (±7) 1.7 (±0.2) 24.0 (±1.3) 14 0 2 Cl C 2 H 5 5 26 (±1) 1.7 (±0.2) 6.1 (±0.4) 4 0 0 F CH 2 C 2 H 5 6 1.5 (±0.1) 1.7 (±0.1) 3.0 (±0.7) 2 0 0 CH 3 C 2 H 5 7 35 (±3) 1.6 (±0.2) 8.1 (±0.3) 5 0 0 5. CARTGRAPHIE DES CLLISINS: UN UTIL PUR L INGENIERIE DES ENZYMES BioCD est un algorithme de détection de collisions et de calcul de distance intégré dans BioMove3D (Ruiz et coll., 2005). Cet algorithme a été utilisé pour identifier les acides aminés contraignant le déplacement des énantiomères (R) et (S) le long du site actif de BCL. Au cours de la trajectoire, on définit un contact lorsque la distance entre un atome du substrat et un atome de l enzyme est inférieure à 85 % de la somme de leurs rayons de van der Waals. Les contacts obtenus sont représentés sous la forme d un histogramme de collisions (figure 44). Un contact avec une fréquence de 100% pour un résidu donné signifie que les atomes du substrat et de ce résidu sont, à un moment donné, très proches pour toutes les trajectoires calculées. 145

CHAPITRE III EVALUTAIN IN SILIC DU RLE DE L ACCES DU SUBSTRAT AU SITE ACTIF DE LA LIPASE DE B. CEPACIA PAR UNE APPRCHE RBTIQUE Extérieur (surface de l enzyme) % contacts 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 Enantiomère (R) A247-Sc F142-Sc V123-Sc T251-Sc L248-Sc Q292-Sc L27-Sc F146-Sc F119-Sc L293-Sc L287-Sc Y23-Sc Y29-Sc T18-Sc V266-Sc L17-Sc L17-Bb H286-Sc L167-Sc L267-Sc goulot d étranglement Intérieur ( position de catalyse) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 Enantiomère (S) A247-Sc F142-Sc V123-Sc T251-Sc L248-Sc Q292-Sc L27-Sc F146-Sc F119-Sc L293-Sc L287-Sc Y23-Sc Y29-Sc T18-Sc V266-Sc L17-Sc L17-Bb H286-Sc L167-Sc L267-Sc Résidus Figure 44 : Histogramme représentant la fréquence relative des contacts entre les acides aminés de l enzyme et chaque énantiomère le long des trajectoires calculées sur 50 essais. Les contacts de plus de 50% sont indiqués en magenta, entre 30 et 50% en violet, et entre 15 et 30% en cyan. (Bb=Squelette, Sc= Chaîne latérales des acides aminés). Parmi les acides aminés tapissant les parois du site actif de BCL, 10 présentent une forte fréquence de contacts avec les énantiomères (R) et (S). Ces acides aminés peuvent être classés en trois groupes : (i) les acides aminés du site actif tels que l histidine catalytique 286, et les acides aminés formant le goulot d étranglement, la leucine 17 et la valine 266 ; (ii) les acides aminés localisés juste après le goulot d étranglement, entre 5Å et 8Å à partir du fond de la poche, tels que la thréonine 18, la tyrosine 29 et la leucine 287 ; et (iii) les acides aminés de la poche catalytique localisés près de la surface de la protéine tels que la tyrosine 23, la phénylalanine 146 et la leucine 293 (figure 45). Tous ces acides aminés sont très proches les uns des autres, ce qui implique que le mouvement d un acide aminé entraîne le mouvement des autres, tel un mécanisme d horlogerie. Les contacts sont principalement dus aux chaînes latérales de ces acides aminés, à l exception de la leucine 17, dont les atomes du squelette contribuent énormément à la topologie de la poche. Parmi les résidus listés dans la figure 44, quelques uns présentent de faibles fréquence de collisions, tels que la leucine 27, la thréonine 291, l alanine 247, la valine 123, la phénylalanine 142, la leucine 248, la thréonine 251 et la phénylalanine 146, reflétant ainsi leur localisation près de l entrée du site actif. 146

CHAPITRE III EVALUTAIN IN SILIC DU RLE DE L ACCES DU SUBSTRAT AU SITE ACTIF DE LA LIPASE DE B. CEPACIA PAR UNE APPRCHE RBTIQUE A) B) F142 Y23 T18 L17 Y29 S87 L287 H286 A247 F142 T18 T251 L248 L293 F146 L248 V266 L167 V123 F119 V266 T251 L17 L167 S87 H286 L267 Figure 45 : Représentation des principaux acides aminés identifiés par le détecteur de collision. (a) Vue de face du site actif de BCL. (b) Vue de profil du site actif montrant la forme d entonnoir du site actif et le goulot d étranglement formé de la valine 266 et de la leucine 17. La triade catalytique (Ser87, His286, Asp264) et le trou oxyanion (Gln88, Leu17) sont localisés au fond de la poche. Les quatre acides aminés présentant une forte fréquence de contacts ( 50%) avec les substrats sont représentés en magenta (Leu17, Thr18, Val266 et His286). Pour référence, la sérine catalytique Ser87 est en jaune. L analyse de l histogramme de collisions (figure 44) indique que, dans tous les cas, les énantiomères (S) sont plus souvent en contact avec les résidus du site actif que les énantiomères (R). Pour chaque substrat, la fréquence des contacts observée est en accord avec la moyenne des temps de calcul de l algorithme de planification de mouvements (temps CPU) et les énantiopréférences déterminées expérimentalement. Ces observations mettent en évidence la difficulté in silico de l accessibilité de l énantiomère (S) au site actif de BCL en comparaison à celle de l énantiomère (R) ainsi que les différences existant entre un site actif exposé à un solvant et un site actif enfoui. De plus, le nombre de contacts peut être relié à la difficulté de positionner un substrat donné dans une conformation productive au niveau du site catalytique. Une analyse structurale plus détaillée révèle que quatre acides aminés en particulier (His286, Val266, Thr18 et Leu17) sont principalement impliqués dans l accessibilité du substrat à l intérieur du site actif. En effet, les énantiomères (R) et (S) doivent passer au travers du goulot d étranglement (Val266, Leu17 et Thr18 voisine) afin d accéder au cœur de la poche 147

CHAPITRE III EVALUTAIN IN SILIC DU RLE DE L ACCES DU SUBSTRAT AU SITE ACTIF DE LA LIPASE DE B. CEPACIA PAR UNE APPRCHE RBTIQUE catalytique et former l intermédiaire tétraédrique. Ce goulot d étranglement, mis en évidence par le détecteur de collisions, a également été montré comme ayant une influence sur l énantiosélectivité de la lipase de Burkholderia cepacia KWI-56 (Koga et coll., 2003 ; Kato et coll., 2005). Des combinaisons de substitutions d acides aminés sur la phénylalanine 119 et les leucines 17, 167 et 266 se sont révélées être très efficaces pour modifier l énantiopréférence de B. cepacia KWI-56 lors du dédoublement du (R,S)-3-phénylbutyrate d éthyle. La combinaison de ces mutations pourrait ainsi induire des changements géométriques drastiques dans l espace du site actif. Cependant, l effet de mutations ponctuelles sur ces quatre positions n a pas été déterminé. La concordance de ces résultats démontre l intérêt de développer des outils, tels que BioMove3D, pour guider l ingénierie des enzymes. 6. CNCLUSIN De plus en plus d études expérimentales et de modélisation moléculaire ont révélé l importance de la dynamique des enzymes sur la catalyse, avec par exemple, la connexion entre les mouvements du site actif de l enzyme et le turn-over du substrat ou les effets de mutations éloignées du site actif (Agarwal et coll., 2002 ; Eisenmesser et coll., 2002 ; Benkovic et Hammes-Schiffer, 2003, 2006 ; Agarwal, 2005, 2006 ; Hammes-Schiffer et Benkovic, 2006 ; Wang et coll., 2006a,b,c). Les analyses théoriques de l énantiosélectivité des lipases sont généralement basées sur une description de la réaction en utilisant la théorie de l état de transition. Bien que les investigations thermodynamiques aient montré que les différences d énergie d activation libre entre les énantiomères sont dues à des variations à la fois des termes enthalpique et entropique, le rôle des mouvements dans l environnement de la réaction est souvent négligé (ttosson et coll., 2001, 2002a,b). Dans le cas des dédoublements cinétiques catalysées par les lipases ayant un site actif contraint et enfoui, la modélisation des trajectoires des substrats, en tenant compte de la flexibilité moléculaire, reste un exercice difficile au regard des techniques disponibles actuellement. Les simulations de dynamique moléculaire peuvent être appliquées pour modéliser les trajectoires des substrats mais fournissent des résultats seulement sur une échelle de temps de l ordre de la nano-seconde. Les algorithmes Monte-Carlo permettent de calculer de larges mouvements mais ne peuvent fournir une description chronologique continue de ces mouvements. 148

CHAPITRE III EVALUTAIN IN SILIC DU RLE DE L ACCES DU SUBSTRAT AU SITE ACTIF DE LA LIPASE DE B. CEPACIA PAR UNE APPRCHE RBTIQUE La dynamique pseudo-moléculaire sous contrainte nécessite des corrections manuelles pour orienter correctement les chaînes latérales de l enzyme et ainsi éliminer les conflits stériques. Cette procédure est, en outre, trop lourde pour être utilisée en routine. Par rapport à ces méthodes, la nouvelle approche proposée dans ce chapitre permet d une part de réduire les temps de calculs de quelques jours à seulement quelques heures, et d autre part, de prendre en compte simultanément la flexibilité du substrat et la mobilité des chaînes latérales de l enzyme. De plus, elle est très bien adaptée pour explorer des espaces conformationnels complexes. Les résultats obtenus in silico indiquent une corrélation qualitative entre le ratio de la moyenne des temps de calcul des trajectoires de chaque énantiomère (temps CPU) et les valeurs d énantiosélectivité de BCL. L analyse des trajectoires a également permis d identifier rapidement les acides aminés contraignant l accès des énantiomères au travers du site actif. Ces acides aminés apparaissent comme des cibles privilégiées de mutageénèse visant à modifier l énantiosélectivité de BCL. Afin de tester l influence de ces positions sur l énantiosélectivité de BCL et poursuivre la validation de ce modèle, il est indispensable de générer des mutants ponctuels. Trois acides aminés (Val-266, Leu-17 et Leu-287) ont donc été sélectionnés pour des expériences de mutagénèse dirigée. En effet, les substitutions de la valine 266 et de la leucine 17, formant un goulot d étrangement au niveau du site actif, ainsi que de la leucine 287, en amont du goulot d étranglement, par des acides aminés à chaîne latérale plus ou moins encombrante pourrait favoriser l accès d un énantiomère par rapport à l autre et ainsi modifier l énantiosélectivité de BCL. Ces résultats de mutagénèse dirigée permettront alors de mieux appréhender le rôle de l accessibilité du substrat sur l énantiosélectivité de BCL. Toutefois, la construction et la caractérisation de mutants nécessitent de disposer au préalable d un système efficace de production de la lipase et d une méthode de purification. 149

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Chapitre IV Production et purification de la lipase de B. cepacia 151

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CHAPITRE IV PRDUCTIN ET PURIFICATIN DE LA LIPASE DE B. CEPACIA 1. INTRDUCTIN La lipase de Burkholderia cepacia ATCC21808 (BCL), anciennement dénommée Pseudomonas cepacia, enzyme modèle de notre étude, est très attractive pour le dédoublement de nombreux intermédiaires organiques (Tranel et Haufe 2000 ; Kamal et coll., 2002 ; Guieysse et coll., 2001, 2003a ; Köhler et Wünsch 2006 ; Shah et Gupta 2007 ; Chojnacka et coll., 2007). Chez l organisme natif B. cepacia, le gène lip, codant pour la lipase extracellulaire, est présent sous forme d opéron avec le gène hp codant pour sa protéine Lif ou protéine chaperonne, essentielle à son repliement (Rosenau et Jaeger, 2000 ; Rosenau et coll., 2004). De nombreuses souches appartenant aux genres Pseudomonas et Burkholderia sont des souches pathogènes (McKenney et coll., 1995 ; Weingart et Hooke, 1999). Pour cette raison, l expression recombinante de lipases de type Pseudomonas et Burkholderia chez Escherichia coli a été développée (Chung et coll., 1991 ; Iizumi et coll., 1991 ; Jörgensen et coll., 1991 ; Ihara et coll., 1992 ; Wohlfahrt et coll., 1992 ; Frenken et coll., 1993a,b ; shima-hirayama et coll., 1993 ; Traub et coll., 2001 ; gino et coll., 2007). Cependant, l activité lipase observée est souvent faible, ces enzymes étant principalement produites sous forme de corps d inclusion inactifs. La production hétérologue de BCL chez E. coli a été étudiée par Quyen et coll., (1999). Le gène lip a été cloné sous le contrôle d un promoteur fort inductible à la température entre la séquence signal mpa, assurant la sécrétion de la lipase dans l espace périplasmique, et le gène hp. Cependant, l expression hétérologue de BCL a conduit à de très faibles quantités de lipase soluble, l enzyme étant principalement produite sous forme de corps d inclusion inactifs. Un protocole de repliement «in vitro» a alors été proposé (Quyen et coll., 1999). Toutefois, cette procédure est difficilement applicable à l expression de librairies de mutants car ces protocoles de repliement restent des opérations coûteuses qui doivent être optimisées au cas par cas (Georgiou et Valax, 1996 ; Thomas et coll., 1997 ; Hauke et coll., 1998). A ce jour, aucun autre essai de production recombinante de BCL chez E. coli, autre que les travaux de Quyen et coll., (1999), n a été décrit dans la littérature. 153

CHAPITRE IV PRDUCTIN ET PURIFICATIN DE LA LIPASE DE B. CEPACIA L objectif principal de ce chapitre est de développer un système efficace de production de BCL chez E. coli afin de permettre à terme d exprimer et cribler à haut-débit des librairies de mutants ciblés à partir des résultats issus de la modélisation moléculaire. Dans un premier temps, les gènes lip et hp ont été clonés dans différents vecteurs d expression et placés sous le contrôle de différents promoteurs afin d atteindre des niveaux d activité lipase compatibles avec une détection rapide à l échelle microplaque. Puis, afin de permettre, à terme, une purification générique des futurs mutants, un protocole de purification de BCL par chromatographie d affinité a été développé. 2. PRDUCTIN DE BCL VIA LE PLASMIDE DE REFERENCE PT-MPA-LIP-HP Le premier plasmide testé pour la production recombinante de BCL a été le plasmide pt- mpa-lip-hp gracieusement fourni par le Professeur Rolf D. Schmid de l Université de Stuttgart en Allemagne. Ce plasmide sera considéré comme le plasmide de référence pour la suite de notre étude. 2.1. DESCRIPTIN DE LA CNSTRUCTIN Le plasmide pt-mpa-lip-hp contient les gènes codant pour la séquence signal mpa, la lipase mature BCL (lip) et sa protéine chaperonne (hp) sous le contrôle du promoteur λp RL inductible à la température ainsi qu une cassette de résistance à l ampicilline permettant de sélectionner les clones transformés (Quyen et coll., 1999). Le gène lip (963 pb ; 320 acides aminés) est fusionné au gène de la séquence signal mpa (63 pb ; 21 acides aminés). Cette séquence signal permet d une part d augmenter les niveaux d expression, et d autre part, de transloquer la protéine dans le périplasme bactérien (Quyen et coll., 1999 ; Traub et coll., 2001). Le codon STP du gène lip et le codon START du gène hp (1035 pb ; 344 acides aminés) sont séparés par seulement 3 pb. Une séquence Shine-Dalgarno (GAAG) est présente en C-terminal du gène lip. 154

CHAPITRE IV PRDUCTIN ET PURIFICATIN DE LA LIPASE DE B. CEPACIA 2.2. EXPRESSIN RECMBINANTE DE BCL VIA LE PLASMIDE DE REFERENCE PT- MPA-LIP-HP Pour la production de BCL, nous avons cultivé les cellules d E. coli DH5α transformées avec le plasmide pt-mpa-lip-hp à 30 C en milieu LB. Lorsque la D 600nm atteint la valeur de 0,8, l induction de l expression du gène lip est réalisée par une élévation de température de la culture de 30 C à 42 C pendant 6 heures. Ensuite, les cellules sont récupérées par centrifugation et cassées à l aide du cocktail de lyse. Dans ces conditions, l activité lipase mesurée par hydrolyse du para-nitrophényl butyrate (pnpb) était de 1300 U/L de culture (soit 1333 U/g de cellules) après 3 heures d induction et 1997 U/L de culture (soit 1823 U/g de cellules) après 6 heures d induction. Les profils d expression de BCL ainsi que de sa protéine chaperonne ont été analysés sur gel d électrophorèse en conditions dénaturantes et réductrices et comparés au profil d expression de la souche E. coli DH5α non transformée (témoin négatif) (figure 46). BCL (33 kda) est majoritairement présente dans les fractions protéiques insolubles sous forme de corps d inclusion (figure 46, pistes 8 et 9). Aucune sur-expression de la lipase dans les fractions protéiques solubles n est visible sur le gel (figure 46, pistes 4 et 5). La protéine chaperonne Hp (37 kda) n est également pas sur-exprimée que ce soit au niveau des fractions protéiques solubles ou insolubles. Ces résultats sont similaires à ceux obtenus par Quyen et coll. (1999). Un premier facteur permettant d expliquer la tendance de BCL à s agréger sous forme de corps d inclusion inactifs est l induction à la température via le promoteur λp RL des gènes ompa, lip et hp du plasmide pt-mpa-lip-hp. Le promoteur λp RL est un promoteur difficilement contrôlable entraînant une forte dépense énergétique de la cellule. De plus, cette induction à la température de l opéron lipase déclenche la réponse heat-shock de l organisme hôte associée à une réponse SS et à l instabilité des protéines produites (Aris et coll., 1998 ; Hannig et Makrides, 1998). Un autre facteur est la faible production de la protéine chaperonne Hp. En effet, de nombreuses données bibliographiques montrent que les protéines chaperonnes de type Pseudomonas sont faiblement exprimées chez E. coli (Frenken et coll., 1993a,b ; Hobson et coll., 1993, 1995 ; Aamand et coll., 1994 ; Iizumi et Fukase, 1994 ; Rosenau et coll., 2004). 155

CHAPITRE IV PRDUCTIN ET PURIFICATIN DE LA LIPASE DE B. CEPACIA 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 200 kda 116,3 kda 97,4 kda 66,3 kda 55,4 kda 36,5 kda 31 kda 21,5 kda Figure 46 : Profils d expression de la souche E. coli DH5α seule (témoin) et de la souche E. coli DH5α transformée avec le plasmide pt-mpa-lip-hp (BCL) après 3 et 6 heures d induction. Piste M: Marqueur de taille (Invitrogen); Piste 1: BCL commerciale (Roche) à 325 mg/ml; Pistes 2 et 3: Fractions protéiques solubles témoin obtenues respectivement après 3 et 6 heures d induction; Pistes 4 et 5: Fractions protéiques solubles BCL obtenues respectivement après 3 et 6 heures d induction; Pistes 6 et 7: Fractions protéiques insolubles témoin obtenues respectivement après 3 et 6 heures d induction; Pistes 8 et 9: Fractions protéiques insolubles BCL obtenues respectivement après 3 et 6 heures d induction. Plusieurs stratégies permettent de limiter la formation de ces corps d inclusion : (i) réduire l expression du gène codant pour la protéine d intérêt par l utilisation de promoteurs faibles ou en diminuant la concentration d inducteur (Hockney, 1994 ; Georgiou, 1995 ; Baneyx et Mujacic, 2004), (ii) diminuer la température de culture (Georgiou et Valax, 1996 ; Weickert et coll., 1996 ; Baneyx et Mujacic, 2004), (iii) co-exprimer des protéines chaperonnes (Georgiou et Valax, 1996 ; Thomas et coll., 1997 ; Baneyx et Mujacic, 2004 ; de Marco, 2007), (iv) supplémenter le milieu de culture avec des sucres non métabolisables tels que le saccharose ou différents additifs tels que l éthanol ou NaCl (Blackwell et Hogan, 1991 ; Chopra et coll., 1994), et (v) exprimer la protéine d intérêt en fusion avec une étiquette soluble telle que la Thioredoxine ou la GST (LaVallie et coll., 1993 ; Chopra et coll., 1994 ; LaVallie et McCoy, 1995 ; Makrides, 1996). 156

CHAPITRE IV PRDUCTIN ET PURIFICATIN DE LA LIPASE DE B. CEPACIA Afin de contrôler au mieux l expression de BCL, sous forme soluble et active, quatre plasmides d expression différents ont été testés : (i) le plasmide pbad-mpa-lip-hp, (ii) le plasmide pbad-thi-mpa-lip-hp, (iii) le plasmide pet-mpa-lip-hp et (iv) le plasmide pflag-lip-hp. Dans les quatre constructions plasmidiques, la séquence signal mpa est présente. En effet, Quyen et coll., (1999), ont mis en évidence que l activité lipase obtenue en présence de la séquence signal mpa (plasmide pt-mpa-lip-hp) était 13 fois supérieure à celle obtenue en l absence de cette dernière (plasmide pt-lip-hp). Les caractéristiques des différents vecteurs et hôtes testés sont reportées dans le tableau 19 cidessous. Tableau 19 : Caractéristiques des différents hôtes et vecteurs testés. Souches Caractéristiques des souches Plasmides Caractéristiques des plasmides E. coli DH5α Souche couramment utilisée en laboratoire pour le clonage et l expression de différents plasmides pt-mpa-lip- Hp Résistance à l ampicilline; Promoteur fort λp RL inductible à la température; Gènes lip et hp insérés sous forme d opéron; séquence signal mpa en 5 du gène lip facilitant le transport périplasmique de la lipase E. coli TP10 Souche délétée d une partie de l opéron arabinose évitant ainsi la dégradation de l arabinose au cours de l induction pbad-mpa- Lip-Hp pbad-thi- mpa-lip-hp Résistance à l ampicilline; Promoteur P BAD inductible au L- arabinose; Gènes lip et hp insérés sous forme d opéron; séquence signal mpa en 5 du gène lip. Résistance à l ampicilline; Promoteur P BAD inductible au L- arabinose; Gènes lip et hp insérés sous forme d opéron; séquence signal mpa en 5 du gène lip; étiquette thioredoxine en 5 de la séquence signal mpa. E. coli BL21 (DE3)Star TM Souche délétée de l enzyme RNAseE afin d augmenter la stabilité des ARN messagers. Toutes les souches BL21 sont déficientes en protéases. pet-mpa-lip- Résistance à l ampicilline ; Hp Promoteur T7 inductible à l IPTG; Gènes lip et hp insérés sous forme d opéron; séquence signal mpa en 5 du gène lip. E. coli JM109 Souche couramment utilisée en laboratoire pour le clonage et l expression de différents plasmides pflag-ats- Lip-Hp Résistance à l ampicilline ; promoteur tac inductible à l IPTG; Gènes lip et hp insérés sous forme d opéron; séquence signal mpa et peptide FLAG en fusion en 5 du gène lip; Purification par chromatographie d affinité anti- FLAG. 157

CHAPITRE IV PRDUCTIN ET PURIFICATIN DE LA LIPASE DE B. CEPACIA 3. PRDUCTIN DE BCL VIA LES VECTEURS PBAD 3.1. PLASMIDE PBAD-MPA-LIP-HP Le plasmide pbad-mpa-lip-hp a été le premier plasmide d expression testé. La séquence ompa-lip-hp a été placée sous le contrôle du promoteur arabad dans le vecteur d expression commercial pbad/tp. Le promoteur arabad est un promoteur finement régulé grâce à une induction au L-arabinose et est préconisé pour contrôler les niveaux d expression (Guzman et coll., 1995). Les cellules d E. coli TP10 transformées avec le plasmide pbad- mpa-lip-hp ont été cultivées en milieu LB à 30 C. Lorsque la D 600nm atteint la valeur de 0,8, l induction de l expression du gène lip est réalisée par ajout de 0,02% de L-arabinose (p/v). Dans ces conditions, l activité lipase obtenue après cassage des cellules avec du cocktail de lyse et mesurée par hydrolyse du pnpb était seulement de 259 U/L de culture (soit 424 U/g de cellules) après 6 heures d induction indiquant un niveau d expression très inférieur à celui obtenu avec le plasmide de référence 3.2. PLASMIDE PBAD-THI-MPA-LIP-HP La séquence ompa-lip-hp a alors été clonée dans le vecteur commercial pbad/tp - Thiofusion en fusion avec le gène codant pour la Thioredoxine. Cette protéine est très bien exprimée et reconnue chez E. coli. De plus, la Thioredoxine permet une détection de BCL par Western Blot ainsi que sa purification ultérieure par chromatographie d affinité. Comme précédemment, l expression a été induite à une D 600nm de 0,8 avec 0,02% de L- arabinose (p/v) dans le milieu LB à 30 C et l activité lipase obtenue a été mesurée par hydrolyse du pnpb. Le niveau d activité maximal obtenu après 6 heures d induction, grâce à cette nouvelle construction, était de 1945 U/L de culture (soit 2132 U/g de cellules). La Thioredoxine favorise probablement la solubilité de la lipase permettant ainsi d augmenter l activité catalytique d un facteur 7,5 par rapport à l activité obtenue avec le plasmide pbad- mpa-lip-hp. Cependant, BCL était toujours produite majoritairement sous forme de corps d inclusion (figure 47). Le haut poids moléculaire observé (48 kda) correspond à la protéine de fusion Thio-mpA-Lip (figure 47, pistes 7,8 et 9). Aucune expression de la chaperonne n a pu être détectée à 37 kda. 158

CHAPITRE IV PRDUCTIN ET PURIFICATIN DE LA LIPASE DE B. CEPACIA Dans ces conditions d expression, les résultats obtenus avec le plasmide pbad-thi-mpa- Lip-Hp sont similaires à ceux obtenus précédemment avec le plasmide pt-mpa-lip-hp. 200 kda 116,3 kda 97,4 kda 66,3 kda 55,4 kda 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 36,5 kda 31 kda 21,5 kda Figure 47 : Profils d expression de la souche E. coli TP10 transformée avec le plasmide pbad- THI-mpA-Lip-Hp. Piste M: Marqueur de taille (Invitrogen); Piste 1: BCL commerciale (Roche) à 325 mg/ml; Pistes 2, 3, 4 et 5: Fractions protéiques solubles obtenues respectivement avant l induction et après 2, 4 et 6 heures d induction; Pistes 6, 7, 8, et 9: Fractions protéiques insolubles obtenues respectivement avant l induction et après 2, 4 et 6 heures d induction. 3.2.1. Influence de la température de culture Afin de mieux contrôler l expression de BCL via le plasmide pbad-thi-mpa-lip-hp et limiter l agrégation, la température de culture a été diminuée de 30 C à 18 C en conservant la concentration d inducteur précédemment utilisée (0,02% de L-arabinose). La culture a été prolongée sur 22 heures afin de voir l influence d une faible température sur la formation des corps d inclusion tout en atteignant des niveaux de croissance similaires à ceux obtenus à 30 C. L expression de gènes à de faibles températures est basée sur l hypothèse que la vitesse de repliement des protéines ne sera que légèrement affectée entre 15 C et 20 C, tandis que les vitesses de transcription et traduction vont diminuer, laissant ainsi un temps suffisant pour le repliement correct des protéines. Ainsi, la formation de protéines agrégées sous forme inactives, tels que les corps d inclusion, diminue au profit de la formation de protéines actives (Makrides, 1996). 159

CHAPITRE IV PRDUCTIN ET PURIFICATIN DE LA LIPASE DE B. CEPACIA Une influence positive de la diminution de la température de culture sur les niveaux d expression de lipases fonctionnelles a déjà été rapportée (Tang et coll., 2000 ; Blank et coll., 2006 ; Liu et coll., 2006 ; Pfeffer et coll., 2007). A 18 C et après 22 heures d induction, le niveau d activité lipase mesuré par hydrolyse du pnpb était seulement de 373 U/L de culture (ou 619 U/g de cellules), soit un niveau d activité 5 fois inférieur à celui obtenu lors d une culture à 30 C. Comme le démontre ce faible niveau d activité lipase obtenu, aucune sur-expression de BCL sous forme soluble n a été observée (figure 48, pistes 1 et 3). La comparaison des profils d induction obtenus à 18 C et 30 C montrent qu à 18 C, BCL est toujours présente dans les fractions protéiques insolubles sous forme de corps d inclusion (figure 48, pistes 2 et 4). Cependant, l intensité des bandes correspondant aux corps d inclusion diminue avec la température (figure 48, pistes 2, 4 et 7). M 1 2 3 4 5 6 7 250 kda 150 kda 100 kda 75 kda 50 kda 37 kda 25 kda 15 kda 10 kda Figure 48 : Comparaison des profils d expression de la souche E. coli TP10 transformée avec le plasmide pbad-thi-mpa-lip-hp à 18 C et 30 C. Piste M: marqueur de taille (Biorad); Pistes 1 et 3: Fractions protéiques solubles obtenues respectivement à 18 C après 6 et 22 heures d induction; Pistes 2 et 4: Fractions protéiques insolubles obtenues respectivement à 18 C après 6 et 22 heures d induction; Piste 5: BCL commerciale (Roche) à 325 mg/ml; Pistes 6 et 7: Fractions protéiques solubles et insolubles obtenues à 30 C après 6 heures d induction. 160

CHAPITRE IV PRDUCTIN ET PURIFICATIN DE LA LIPASE DE B. CEPACIA 3.2.2. Influence de la concentration en inducteur (L-arabinose) Différents pourcentages de L-arabinose ont également été testés (de 0,02% à 0,0002%) lors de cultures à 30 C. Les résultats du tableau 20 indiquent que la diminution du pourcentage d inducteur ne permet pas d augmenter les niveaux d activité mesurés par hydrolyse du pnpb dans les fractions protéiques solubles. Comme dans le cas des cultures à 18 C, la cinétique a été prolongée sur 22 heures afin de voir l influence d un faible pourcentage d inducteur sur la formation des corps d inclusion. Tableau 20 : Influence de la concentration d inducteur (L-arabinose) sur l activité lipase mesurée par hydrolyse du para-nitrophényl butyrate dans les fractions protéiques solubles. Milieu de culture Induction Activité lipase (U/L de culture) Activité lipase (U/g de cellules) LB 0.02% L-arabinose (1) 1945 2132 LB 0.002% L-arabinose (1) 740 902 LB 0.0002% L-arabinose (2) 46 72 (1) Les cellules ont été cultivées pendant 6 heures après induction. (2) Les cellules ont été cultivées pendant 22 heures après induction. Les profils d expression montrent que quels que soient les pourcentages d inducteur utilisés, la lipase est toujours présente dans les fractions protéiques insolubles sous forme de corps d inclusion (figure 49; pistes 2, 4, 6 et 8). Cependant, comme observé précédemment lors des cultures à 18 C, l intensité des bandes correspondant aux corps d inclusion diminue avec le pourcentage d inducteur. Bien qu un meilleur contrôle de l induction et une diminution de la température de culture aient été testés, les plasmides de type pbad n ont pas permis d augmenter la solubilité de BCL, et de ce fait, le niveau d activité lipase obtenu dans les fractions protéiques solubles par rapport au niveau d activité obtenu initialement avec le plasmide pt-mpa-lip-hp. De plus, quels que soient les plasmides ou les conditions d expression testées, la protéine chaperonne Hp (37 kda) n a jamais été détectée sur les gels d électrophorèse réalisés. 161

CHAPITRE IV PRDUCTIN ET PURIFICATIN DE LA LIPASE DE B. CEPACIA M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 250 kda 150 kda 100 kda 75 kda 50 kda 37 kda 25 kda 15 kda 10 kda Figure 49 : Comparaison des profils d expression de la souche E. coli TP10 transformée avec le plasmide pbad-thi-mpa-lip-hp pour des cultures induites avec différents pourcentages de L- arabinose (0,02% à 0,0002%). Piste M: Marqueur de taille (Biorad); Pistes 1 et 2: Fractions protéiques solubles et insolubles respectivement obtenues après 6 heures d induction avec 0,02% de L-arabinose; Pistes 3 et 4: Fractions protéiques solubles et insolubles respectivement obtenues après 6 heures d induction avec 0,002% de L-arabinose; Pistes 5 et 6: Fractions protéiques solubles et insolubles respectivement obtenues après 6 heures d induction avec 0,0002% de L-arabinose; Pistes 7 et 8: Fractions protéiques solubles et insolubles respectivement obtenues après 22 heures d induction avec 0,0002% de L-arabinose; Piste 9: BCL commerciale (Roche) à 325 mg/ml. La faible production de la protéine chaperonne semble donc être l étape limitante pour la production de BCL sous forme soluble. Cependant, le ratio lipase/chaperonne in vivo nécessaire au repliement des lipases sous forme active n est pas connu (Rosenau et Jaeger, 2000). Les différentes expériences de repliement in vitro décrites dans la littérature montrent que le ratio optimal lipase/chaperonne peut varier de 1/1 à 1/4 (Ihara et coll., 1995 ; Quyen et coll., 1999, 2005 ; Traub et coll., 2001). 162

CHAPITRE IV PRDUCTIN ET PURIFICATIN DE LA LIPASE DE B. CEPACIA 4. PRDUCTIN DE BCL A PARTIR DES PLASMIDES PET ET PFLAG Afin d augmenter l expression de la chaperonne, les gènes lip et hp ont été placés sous le contrôle de promoteurs forts, les promoteurs T7 et tac, dans les constructions plasmidiques pet-mpa-lip-hp et pflag-ats-lip-hp. De hauts niveaux d expression de lipases fonctionnelles chez E. coli en utilisant un promoteur fort ont été déjà été rapportés dans la littérature (Kim et coll., 2000 ; Nthangeni et coll., 2001). 4.1. CHIX ENTRE LES PLASMIDES PET ET PFLAG Les plasmides pet-mpa-lip-hp et pflag-ats-lip-hp ont été respectivement exprimés chez E. coli BL21Star(DE3) TM et E. coli JM109. La production de BCL a été réalisée en milieu LB à 30 C et induite avec 1 mm d IPTG pendant 6 heures. Comme indiqué dans le tableau 21, le meilleur niveau d activité lipase déterminé dans la fraction protéique soluble a été obtenu avec le plasmide pflag-ats-lip-hp (3812 U/L de culture soit 3710 U/g de cellules). L activité obtenue par mesure de l hydrolyse du pnpb avec le plasmide pflag-ats-lip-hp est 2 fois supérieure à celle obtenue avec le plasmide de référence pt-mpa-lip-hp dans des conditions similaires de croissance. La présence du peptide FLAG a permis d augmenter la production de lipase soluble. Les niveaux obtenus avec la construction pet-mpa-lip-hp étant inférieurs, cette construction n a donc pas été retenue. Tableau 21 : Comparaison des activités enzymatiques mesurées par hydrolyse du para-nitrophényl butyrate dans les fractions protéiques solubles obtenues à partir des plasmides pet-mpa-lip-hp et pflag-ats-lip-hp. Plas mides pet-mpa- Lip-Hp pflag-ats-lip-hp Activité lipase (U/L de culture) 1868 3812 Activité lipase (U/g de cellules) 2942 3710 163

CHAPITRE IV PRDUCTIN ET PURIFICATIN DE LA LIPASE DE B. CEPACIA 4.2. PTIMISATIN DES CNDITINS D EXPRESSIN DU PLASMIDE PFLAG-ATS- LIP-HP L optimisation des conditions de croissance par l enrichissement du milieu de culture (milieu 2x YT), la culture des cellules E. coli JM109 à 37 C ainsi que la diminution de la concentration en inducteur (0,1 mm d IPTG) ont permis d atteindre de plus hautes densités cellulaires. Le niveau d activité lipase (6679 U/L de culture, soit 3711 U/g de cellules) a été ainsi multiplié d un facteur 3 par rapport à celui obtenu avec le plasmide pt-mpa-lip-hp (tableau 22). Tableau 22 : ptimisation des conditions d expression du plasmide pflag-ats-lip-hp Milieu de culture Température de culture Induction Activité lipase (U/L de culture) Activité lipase (U/g cellules) LB 30 C 1 mm IPTG 3812 3710 LB 37 C 1 mm IPTG 3204 2939 2x YT 37 C 1 mm IPTG 6185 3299 2x YT 37 C 0.1 mm IPTG 6679 3711 Afin de déterminer la localisation cellulaire de la lipase produite à partir du plasmide pflag- ATS-Lip-Hp, les cellules ont d abord été cassées par choc osmotique dans le but de libérer le contenu périplasmique, puis, à l aide du cocktail de lyse, afin d analyser la fraction cytoplasmique. La lipase a pu être détectée dans les différentes fractions cellulaires par western blot à l aide de l anticorps anti-flag (figure 50). En dépit de la présence de la séquence signal mpa, impliquée dans la translocation de BCL dans le périplasme, seulement 5% de l activité enzymatique a été retrouvée dans la fraction périplasmique. Les 95% restant sont présents dans la fraction cytoplasmique. De plus, malgré l augmentation significative de la quantité de lipase soluble produite grâce au plasmide pflag-ats-lip-hp, la majeure partie de l enzyme produite est toujours localisée dans la fraction cytoplasmique insoluble (figure 50, piste I). 164

CHAPITRE IV PRDUCTIN ET PURIFICATIN DE LA LIPASE DE B. CEPACIA M P S I 250 kda 150 kda 100 kda 75 kda 50 kda 37 kda 25 kda 20 kda 15 kda Figure 50 : Western blot anti-flag montrant les niveaux d expression de BCL dans les différentes fractions cellulaires. Piste P: fraction périplasmique; Piste S: Fraction cytoplasmique soluble; Piste I: fraction cytoplasmique insoluble. Le plasmide pflag-ats-lip-hp est donc le meilleur système d expression testé puisqu il permet d atteindre le plus haut niveau d activité enzymatique sous forme soluble jamais décrit dans la littérature concernant la lipase de B. cepacia ATCC21808. De plus, ces travaux rapportent pour la première fois l utilisation du vecteur pflag-ats pour l expression recombinante de lipases bactériennes. En effet, les données de la littérature montrent que celui-ci est principalement utilisé pour l expression et la purification de protéines eucaryotes chez E. coli (Bergstrom et coll., 1995). 165

CHAPITRE IV PRDUCTIN ET PURIFICATIN DE LA LIPASE DE B. CEPACIA 5. PURIFICATIN DE LA LIPASE BCL RECMBINANTE PAR CHRMATGRAPHIE D AFFINITE La fusion de BCL avec le peptide FLAG (plasmide pflag-ats-lip-hp) offre l avantage supplémentaire de permettre une purification par chromatographie d affinité en une seule étape. La comparaison de différentes étiquettes d affinité pour la purification d une dihydrofolate réductase (DHFR) produites dans des cellules procaryotes ou eucaryotes a mis en évidence que le peptide FLAG permettait d obtenir le plus haut degré de pureté quelque soit l extrait cellulaire testé (Lichty et coll., 2005). Les travaux de Blank et coll., (2006), rapportent l utilisation du peptide FLAG ainsi que d une étiquette Histidine pour la purification de la lipase B de Candida antarctica par 2 chromatographies d affinité successives. Les fractions d élution, analysées sur gel d électrophosèse, révèlent la présence d une seule bande de 35 kda correspondant à la taille de la lipase en fusion avec les 2 étiquettes. Les premiers essais de purification ont été réalisés en suivant les recommandations du fabricant (Sigma-Aldrich, USA). Un rendement global de purification de seulement 40% a été atteint bien qu aucune perte de protéines n ait été observée au niveau des effluents ou des lavages. Ces pertes observées au niveau du rendement peuvent être attribuées à une agrégation de la lipase sous forme inactive. Afin de limiter ces possibles phénomènes d agrégation, la purification a été réalisée en utilisant le tampon TBS supplémenté avec des détergents : 1% de Triton X-100 et 1% de Tween-20. Dans ces conditions, le rendement global de purification atteint 62% et le facteur de purification est de 2,1 (tableau 23). Les travaux de Mosbah et coll., (2006), ont mis en évidence que l ajout de 1% de Triton X-100 dans le tampon de purification permettait de maintenir la stabilité de la lipase de Staphylococcus xylosus et de son mutant Asp290Ala. Une étude sur la lipase LipA de Ralstonia sp. M1, appartenant à la sous-famille 2 de vraies lipases comme BCL, a également mis en évidence que l ajout de 0,2 à 1% de Triton X-100 avait un effet positif sur l activité enzymatique (Quyen et coll., 2005). 166

CHAPITRE IV PRDUCTIN ET PURIFICATIN DE LA LIPASE DE B. CEPACIA Tableau 23 : Purification de BCL par chromatographie d affinité Fractions Volumes (ml) Activité lipase (U/ml) Activité (U) Concentration protéique (mg/ml) Activité spécifique (U/mg) Facteur de purification Rendement protéique Extrait enzymatique (fraction soluble) 0.25 65.2 16.3 4.92 13.2-100 Effluents 0.25 6.92 1.73 3.52 1.96-71 Lavages 9 0.2 1.76 0 0-0 Elutions 0.75 13.52 10.14 0.49 27.5 2.1 30 Le gel d électrophorèse réalisé sur les différentes fractions de la purification en présence de 1% de Triton X-100 et 1% de Tween-20 montre que la fraction d élution contient deux bandes majeures à 34 kda et 36 kda correspondant aux formes FLAG-Lip et mpa-flag-lip (figure 51, piste 4). L étiquette FLAG a pu être partiellement clivée grâce à un traitement par entérokinase de la protéine FLAG-Lip. Cependant, ce traitement reste inefficace pour cliver la séquence mpa-flag (figure 51, piste 6). L optimisation du traitement à l entérokinase suivie d une deuxième purification d affinité devrait nous permettre à terme de séparer la forme Lip pure de la forme mpa-flag-lip. M 1 2 3 4 5 6 250 kda 150 kda 100 kda 75 kda 50 kda 37 kda 25 kda 20 kda 15 kda Figure 51 : Gel d électrophorèse des différentes fractions issues de la procédure de purification avec le tampon TBS supplémenté avec 1% de Triton X-100 et 1% de Tween-20. Piste 1: Extrait cellulaire soluble ; Piste 2: Effluents; Piste 3: Lavages; Piste 4: Fractions d élution; Piste 5: BCL commerciale (Roche) à 325 mg/ml; Piste 6: Digestion de la fraction d élution avec l entérokinase. 167

CHAPITRE IV PRDUCTIN ET PURIFICATIN DE LA LIPASE DE B. CEPACIA 6. CNCLUSIN Seuls les travaux de Quyen et coll., (1999), décrivent l expression recombinante de la lipase de Burkholderia cepacia ATCC21808 (BCL) chez E. coli via le plasmide pt-mpa-lip-hp. Comme de nombreuses autres lipases exprimées chez E. coli, BCL est majoritairement produite sous forme de corps d inclusion inactifs. Afin de disposer d un système efficace de production recombinante de BCL permettant à terme d exprimer et cribler à haut-débit des librairies de mutants, 4 constructions ont été testées : (i) pbad-mpa-lip-hp, (ii) pbad- THI-mpA-Lip-Hp, (iii) pet-mpa-lip-hp et (iv) pflag-ats-lip-hp. Les conditions d expression testées et les niveaux d activité lipase obtenus avec ces différents plasmides au cours de cette étude sont résumés dans le tableau 24 ci-dessous. Tableau 24 : Conditions d expression testées et mesures des activités lipases obtenues avec les différentes constructions plasmidiques testées au cours de cette étude. Vecteur d expression Milieu de culture Température de culture Induction Activité lipase (U/L de culture) Activité lipase (U/g cellules) pt-mpa-lip-hp LB 30 C (1) Choc thermique (42 C) 1997 1823 pbad-mpa-lip-hp LB 30 C (1) 0.02% L-arabinose 259 424 pbad-thi-mpa-lip-hp LB 30 C (1) 0.02% L-arabinose 1945 2132 LB 30 C (1) 0.002% L-arabinose 740 902 LB 30 C (2) 0.0002% L-arabinose 46 72 LB 18 C (2) 0.02% L-arabinose 373 619 pet-mpa-lip-hp LB 30 C (1) 1 mm IPTG 1868 2942 pflag-ats-lip-hp LB 30 C (1) 1 mm IPTG 3812 3710 LB 37 C (1) 1 mm IPTG 3204 2939 2x YT 37 C (1) 1 mm IPTG 6185 3299 2x YT 37 C (1) 0.1 mm IPTG 6679 3711 (1) Les cellules ont été cultivées pendant 6 heures après induction. (2) Les cellules ont été cultivées pendant 22 heures après induction. 168

CHAPITRE IV PRDUCTIN ET PURIFICATIN DE LA LIPASE DE B. CEPACIA Les niveaux d activité obtenus avec les deux plasmides de type pbad étaient inférieurs ou similaires à ceux obtenus avec le plasmide pt-mpa-lip-hp. L optimisation des conditions d expression, telles que la diminution de la température de culture et du pourcentage d inducteur, n a pas permis d augmenter de la quantité de lipase sous forme soluble. De plus, la protéine chaperonne Hp, nécessaire au repliement de BCL sous sa forme active, n a jamais été détectée sur les différents gels d électrophorèse réalisés. Deux autres plasmides d expression ont donc été construits et testés : pet-mpa-lip-hp et pflag-ats-lip-hp dans lesquels les gènes codant pour BCL et sa chaperonne ont été placés respectivement sous le contrôle des promoteurs forts T7 et tac. Et ce, dans le but, d augmenter la quantité de protéine chaperonne produite. Seul le plasmide pflag-ats-lip-hp a permis d obtenir, après l optimisation des conditions de croissance des cellules d E. coli JM109, le plus haut niveau d activité lipase sous forme soluble jamais décrit dans la littérature concernant la lipase de B. cepacia ATCC21808 (6679 U/L de culture). La présence de l étiquette FLAG dans ce système d expression a permis d initier la purification de BCL par chromatographie d affinité avec un rendement global de 62% et un facteur de purification de 2,1. Toutefois, la protéine Hp n a jamais été sur-produite. Pour améliorer l expression, nous pourrions envisager de placer le gène hp sous le contrôle d un autre promoteur sur le même plasmide. La transformation de la souche avec un plasmide dédié spécifiquement à l expression de la chaperonne pourrait être une autre alternative. Un exemple est la production sous forme active de la lipase de B. cepacia DSM3959 (Aamand et coll., 1994). Les gènes codant pour la lipase et sa protéine chaperonne ont été induit séparément. La protéine chaperonne a été synthétisée en premier, puis avec un délai de 45 minutes, l expression de la lipase a ensuite été induite. Cependant dans le cadre de notre étude, ces approches n ont pas été envisagées. En effet, le niveau d expression obtenu en lipase soluble porteuse de l étiquette pflag devrait permettre d exprimer et de comparer l énantiosélectivité de différents mutants ponctuels ciblés par modélisation. De plus, il semble suffisamment élevé pour pouvoir envisager un protocole de production en microplaque adapté à un criblage haut-débit de plus larges banques de mutants. Le chapitre suivant est dédié à la présentation de ces résultats. 169

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Chapitre V Etude préliminaire des mutants ponctuels : caractérisation de l énantiosélectivité 171

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CHAPITRE V ETUDE PRELIMINAIRE DES MUTANTS PNCTUELS : CARACTERISATIN DE L ENANTISELECTIVITE 1. INTRDUCTIN Les précédents travaux de modélisation moléculaire ont permis d identifier des acides aminés contraignant l accès des énantiomères au travers du site actif de BCL. Ces acides aminés apparaissent comme des cibles privilégiées de mutagénèse visant à modifier l énantiosélectivité de la lipase, parmi lesquelles on trouve notamment la valine 266 et les leucines 17 et 287. Comme nous l avons vu, les acides aminés valine 266 et leucine 17 forment un goulot d étranglement qui contraint l accès des substrats et notamment celui de l énantiomère S. La leucine 287 se situe en amont de ce goulot d étranglement, et est plus distante de la poche catalytique. Nous avons donc sélectionné ces trois acides aminés comme cibles de mutagénèse pour tester l effet des mutations sur l énantiosélectivité de l enzyme et poursuivre la recherche d une éventuelle corrélation entre l énantiosélectivité et l accès au site actif de la lipase. Ainsi, dans un premier temps, différents mutants ponctuels ont été construits par mutagénèse dirigée sur les positions 17, 266 et 287. Ces mutants ont été produits par E. coli JM109 transformée avec le plasmide pflag-ats-lip-hp. Leurs activités lipase et leurs énantiosélectivités ont été respectivement mesurées lors de l hydrolyse du para-nitrophényl butyrate (pnpb) et du (R,S)-α-bromo phényl acétate de 2-chloro éthyle. Le mutant ponctuel V266G, ayant conduit à une inversion de l énantiopréférence, a été modélisé et analysé. Enfin, un protocole de production en microplaque a été développé et validé sur une banque de mutants ponctuels, afin de disposer d un outil facilitant le criblage à haut débit des futures banques de mutants créés par recombinaison. 173

CHAPITRE V ETUDE PRELIMINAIRE DES MUTANTS PNCTUELS : CARACTERISATIN DE L ENANTISELECTIVITE 2. STRATEGIE DE MUTAGENESE 2.1. LCALISATIN DES CIBLES DE MUTAGENESE En partant du cœur du site actif de BCL et en se dirigeant vers l extérieur, on trouve successivement les trois cibles de mutagénèse retenues, la valine 266 et les leucines 17 et 287 (figure 52). La leucine 17 (Leu-17) et la valine 266 (Val-266), situées à l entrée de la poche où se loge la partie acyle du substrat, forment un goulot d étranglement. La leucine 287 (Leu- 287) est localisée en amont de ce goulot d étranglement, dans une zone où le substrat dispose de plus d espace. Figure 52 : Localisation des 3 cibles de mutagénèse dans le site actif de BCL. Le substrat (α-bromo phényl acétate de 2-chloro éthyle) est représenté en orange. Les résidus catalytiques (Ser-87 et His- 286) sont également indiqués. Les acides aminés Val-266 et Leu-17 sont localisés au niveau de la poche HA hydrophobe du site actif de BCL (Lang et coll., 1998). La Val-266 est située sur la même boucle que l Asp- 264 de la triade catalytique entre les hélices α9 et α10. La mobilité de cette boucle (10 acides aminés) est réduite du fait de la formation d un pont disulfure (Cys-190 - Cys-270) entre l hélice α10 et la boucle en N-terminale du feuillet β6 (figure 53). La Leu-17 est également située sur une boucle (7 acides aminés) à l extrémité C-terminale du feuillet β1 (figure 53). 174

CHAPITRE V ETUDE PRELIMINAIRE DES MUTANTS PNCTUELS : CARACTERISATIN DE L ENANTISELECTIVITE Cette boucle est également peu mobile car le squelette protéique de Leu-17 et celui de Gln-88 forment le trou oxyanion. La Gln-88 est localisée en aval de la sérine catalytique (Ser-87) entre le feuillet β3 et l hélice α3. La Leu-287, localisée dans la poche HH hydrophobe/hydrophile (Lang et coll., 1998), est située sur une boucle (5 acides aminés) en C-terminal du feuillet β6 en aval de l Histidine catalytique 286 (figure 53). Cette région est relativement rigide en raison de la proximité du site de liaison au calcium, constitué des acides aminés Asp242, Asp288, Gln 292 et Val296 ainsi que de deux molécules d eau (Kim et coll., 1997). Ces trois boucles portant les résidus 17, 266 et 287 sont donc très peu flexibles puisqu elles incluent des acides aminés catalytiques. Figure 53 : Diagramme topologique de BCL. Asp264, His286 et Ser87, indiqués par des cercles noirs, forment la triade catalytique de la lipase. Les feuillets β sont représentés par des flèches et les hélices α par des rectangles (Kim et coll., 1997). Dans la LED (Lipase Engineering Database : Pleiss et coll., 2000a ; Fischer et Pleiss, 2003), l alignement des séquences de lipases de la famille Burkholderia cepacia montrent que ces 3 acides aminés sont hautement conservés (figure 54). 175

CHAPITRE V ETUDE PRELIMINAIRE DES MUTANTS PNCTUELS : CARACTERISATIN DE L ENANTISELECTIVITE Figure 54 : Alignements de différentes lipases appartenant à la famille Burkholderia cepacia réalisées d après la LED. Les lipases (autres que BCL) sont référencées sur la figure par leur numéro d accession. Les résidus catalytiques, acide aspartique et histidine, sont surlignés en rouge. Les résidus correspondant à Leu-17, Val-266 et Leu-287 dans BCL sont respectivement surlignés en bleu, jaune et vert. 2.2. CHIX DE LA TECHNIQUE DE MUTAGENESE Deux stratégies de mutagénèse sont envisageables pour construire les mutants ponctuels : (i) la mutagénèse dirigée et (ii) la mutagénèse à saturation. La mutagénèse à saturation permet de substituer une ou plusieurs positions cibles données par les 19 autres acides aminés possibles. Cependant, cette technique nécessite de cribler entre 300 et 400 clones afin de disposer d une représentation des 20 mutants possibles pour une position donnée (Reetz et Jaeger, 1999), elle est donc coûteuse en séquençage. De plus elle ne garantit pas que toutes les possibilités de mutation soient identifiées. 176

CHAPITRE V ETUDE PRELIMINAIRE DES MUTANTS PNCTUELS : CARACTERISATIN DE L ENANTISELECTIVITE Nous avons donc préféré la mutagénèse dirigée. Chacun des trois acides aminés clés a ainsi été remplacé par les 19 autres acides aminés possibles en utilisant la technique de PCR inverse (chman et coll., 1988). Ainsi, au total, 57 mutants ponctuels ont été créés. L intérêt de cette technique est de mesurer l influence de chaque position mutée sur l activité lipase et l énantiosélectivité. De plus, tous les résultats, qu ils soient positifs ou négatifs, pourront ainsi être pris en compte pour la recherche de corrélation entre énantiosélectivité et l accès au site actif de la lipase. 3. DETERMINATIN DE L ACTIVITE LIPASE ET DE L ENANTISELECTIVITE DES MUTANTS PNCTUELS Les mutants ponctuels construits sur les trois positions clés Val-266, Leu-17 et Leu-287 ont été produits chez E. coli JM109 transformée avec le plasmide pflag-ats-lip-hp dans les conditions de cultures décrites dans le chapitre précédent. Afin de disposer de quantités suffisantes de lipase quel que soit le mutant ponctuel produit, les productions ont été réalisées en erlenmeyers sur des volumes de culture de 20 ml. Toutes les mesures d activité lipase et d énantiosélectivité ont été réalisées en utilisant comme source d enzyme les fractions solubles obtenues à l issue de ces cultures. 3.1. DETERMINATIN DE L ACTIVITE LIPASE DES MUTANTS PNCTUELS L activité lipase des différents mutants ponctuels Val-266, Leu-17 et Leu-287 a été déterminée lors de l hydrolyse du para-nitrophényl butyrate (pnpb) (tableau 25). 177

CHAPITRE V ETUDE PRELIMINAIRE DES MUTANTS PNCTUELS : CARACTERISATIN DE L ENANTISELECTIVITE Tableau 25 : Activités lipase des mutants ponctuels mesurées lors de l hydrolyse du para-nitrophényl butyrate. L acticité lipase de BCL sauvage dans les mêmes conditions de culture est de 5 800 U/L de culture. Nature des mutations Mutations Activité lipase (U/L de culture) Position 266 Position 17 Position 287 Acides aminés non polaires hydrophobes A L (a) /V (b) I P M F W 8917 (± 1826) 15215 (± 1864) (a) 3863 (± 368) 159 (± 10) 3615 (± 518) 3218 (± 374) 10676 (± 1603) 6028 (± 749) 1340 (± 118) (b) 489 (± 15) < 5 2307 (± 190) 1929 (± 100) 1549 (± 288) 2688 (± 72) 3807 (± 76) (b) 3614 (± 262) 16 (± 1) 968 (± 63) 2486 (± 205) 304 (± 27) Acides aminés hydrophiles neutres G S T C N Q Y 2475 (± 444) 7956 (± 963) 12807 (± 280) 10659 (± 1023) 16791 (± 1196) 13525 (± 1691) 11256 (± 931) 189 (± 5) 1850 (± 56) 302 (± 43) 6336 (± 85) 1061 (± 21) 242 (± 9) 5868 (± 163) 2971 (± 110) < 5 3065 (± 56) 549 (± 25) 3536 (± 181) 1891 (± 107) 287 (± 24) Acides aminés hydrophiles basiques K R H 7573 (± 1361) 277 (± 6) 1369 (± 18) 748 (± 22) 233 (± 15) 926 (± 34) 368 (± 24) < 5 4909 (± 457) Acides aminés hydrophiles acides D E 159 (± 6) 1106 (± 16) 26 (± 1) < 5 147 (± 3) 1147 (± 49) (a) la valine 266 est mutée par une leucine. (b) les leucines 17 et 287 sont mutées par des valines. Ces différents mutants ponctuels présentent d importantes variations d activité lipase. Dix mutants V266 ont un niveau d activité supérieur à celui de l enzyme sauvage. L analyse sur gel d électrophorèse des niveaux d expression correspondant aux 5 meilleurs et aux 5 plus mauvais producteurs de lipase (V266N, V266L, V266Q, V266C, V266W, V266P, V266R, V266M, V266D, V266E ; figure 61) révèle que les variations des niveaux d activité lipase peuvent être préférentiellement attribuées à des variations d activité spécifique. En toute rigueur, ceci ne pourra être vérifié qu après purification de tous les mutants ponctuels. En admettant cette hypothèse, nous avons également comparé les niveaux d activité lipase des mutants L17 et L287 avec celui de BCL sauvage. Sur les 19 mutants L17 construits, les niveaux d activité lipase obtenus pour 16 d entre eux se révélés être inférieurs à celui de BCL. Ce résultat ne semble pas surprenant étant donné que la Leu-17, appartenant au trou oxyanion, intervient dans la catalyse enzymatique. 178

CHAPITRE V ETUDE PRELIMINAIRE DES MUTANTS PNCTUELS : CARACTERISATIN DE L ENANTISELECTIVITE Dans le cas de BCL, la Leu-17 interagit par le biais d interactions hydrophobes avec un résidu d ancrage, la Leu-167 (figure 55). n peut alors supposer que les substitutions réalisées sur la position 17 déstabilisent cette interaction entraînant ainsi une diminution de l activité lipase. Cet effet a déjà été observé pour les lipases appartenant au genre Pseudomonas (Pleiss et coll., 2000a). Figure 55 : Positions de la Leu-17 ( trou oxyanion ) et de la Leu-167 ( résidu d ancrage ) dans le site actif de BCL. Ces deux résidus interagissent par le biais d interactions hydrophobes (Pleiss et coll., 2000a). Le substrat (α-bromo phényl acétate de 2-chloro éthyle) en liaison covalente avec la sérine catalytique (Sert-87) est représenté en orange. Concernant les mutants ponctuels L287, leurs niveaux d activité lipase sont tous inférieurs à celui de BCL sauvage. La substitution de cet acide aminé, proche de l Histidine catalytique 286, peut influencer la topologie de cet acide aminé catalytique, et par conséquent le transfert de protons entre les acides aminés de la triade catalytique (Ser-87, Asp-264, His-286), indispensable à la catalyse. Au regard de ces différents niveaux d activité lipase, nous avons concentré nos travaux sur les mutants V266, pour lesquels les meilleurs niveaux d activité sur le pnpb ont été obtenus. Leurs vitesses d hydrolyse sur substrat racémique ont été mesurées, comparées à celles obtenues lors de l hydrolyse du pnpb, et leurs énantiosélectivités ont été déterminées. Les réactions d hydrolyse ont été préférées aux réactions de synthèse pour des raisons de commodité expérimentale. 179

CHAPITRE V ETUDE PRELIMINAIRE DES MUTANTS PNCTUELS : CARACTERISATIN DE L ENANTISELECTIVITE 3.2. CARACTERISATIN DE L ENANTISELECTIVITE DES MUTANTS PNCTUELS SUR LA PSITIN 266 La réaction modèle choisie est l hydrolyse du (R,S)-α-bromo phényl acétate de 2-chloro éthyle (réaction-1). En comparaison à l α-bromo phényl acétate d éthyle, le 2-chloroéthanol est un meilleur nucléofuge que l éthanol, conduisant ainsi à des vitesses de réactions plus rapides. Ces réactions d hydrolyse ont été réalisées à 30 C, sous agitation magnétique dans un système bi-phasique. Le substrat, solubilisé dans l octane, constitue la phase organique et l enzyme, dans du tampon Tris,HCl, ph=7,5, la phase aqueuse. Le rapport phase aqueuse/phase organique utilisé est de 2/1 (v/v). Les vitesses de réaction ont été déterminées par la mesure de la disparition des énantiomères substrats. Br R,S CH2 CH 2 Cl BCL 30 C, H 2 30 C Tris,HCl / octane R Br H + Br S CH 2 CH 2 Cl + Cl - CH 2 - CH 2 - H Réaction-1 Les vitesses relatives d hydrolyse du (R,S)-α-bromo phényl acétate de 2-chloro éthyle obtenus avec BCL sauvage et 18 mutants ponctuels V266 ont été comparées à celles du pnpb et sont présentées dans le tableau 26. Lorsque les données expérimentales le permettaient, le ratio énantiomérique (E) a été calculé. Les vitesses relatives d hydrolyse du (R,S)-α-bromo phényl acétate de 2-chloro éthyle sont inférieures ou au mieux équivalentes à celles obtenues avec le pnpb, à l exception des mutants V266P, V266G et V266D. Un exemple inattendu est celui des mutants substitués par un acide aminé hydrophile neutre. Leurs vitesses d hydrolyse du substrat racémique, à l exception de la glycine, sont plus lentes que celles obtenues lors de l hydrolyse du pnpb (tableau 26). L encombrement stérique apporté par ces mutations semble jouer un rôle sur l accès du substrat au site catalytique et/ou sur la formation de l intermédiaire tétraédrique. Le mutant V266G, pour lequel l encombrement stérique est moindre, a une vitesse d hydrolyse du racémique jusqu à 3 fois supérieure à celles des autres mutations hydrophiles neutres (tableau 26). 180

CHAPITRE V ETUDE PRELIMINAIRE DES MUTANTS PNCTUELS : CARACTERISATIN DE L ENANTISELECTIVITE Tableau 26 : Vitesses relatives d hydrolyse du para-nitrophényl butyrate (pnpb) et du (R,S)-α-bromo phényl acétate de 2-chloro éthyle, et ratio énantiomérique (E) obtenus avec BCL sauvage et 18 mutants ponctuels V266. Nature des mutations Mutants Vitesses relatives (µmoles/min/ml d enzyme) pnpb Substrat racémique Conversion (%) ee s (%) Enantiopréférence E (a), (b) BCL sauvage 100 100 62 (49 h) 94 R 12 (a), 11 (b) Acides aminés non polaires hydrophobes V266A V266L V266I V266P V266M V266F V266W 150 262 74 3 73 61 205 73 209 56 27 54 73 285 64 (69h) 66 (24h) 69 (96h) 24 (69h) 66 (96h) 45 (49h) 88 (24h) 89 97 98 2 97 28 21 R R R R R R R 8 (a) 12 (a) 10 (a) - 11 (a) - 1,2 (a) Acides aminés hydrophiles neutres V266G V266S V266T V266C V266N V266Q V266Y 42 156 212 188 286 226 188 181 79 69 63 63 72 111 55 (24h) 30 (30h) 43 (49h) 42 (53h) 19 (24h) 22 (24h) 42 (30h) 89 38 36 54 10 11 69 S R R R R R R 18 (a), 16 (b) - - - - - - Acides aminés hydrophiles basiques V266R V266H 4,5 26 5 22 5 (72h) 20 (72h) 0 0 - - - - Acides aminés hydrophiles acides V266D V266E 3 18 12 13 11 (72h) 12 (72h) 0 1 - R - - (a) méthode des excès énantiomériques (Chen et Sih, 1989). (b) disparition du substrat (Wu et Liu, 2000). rapport des vitesses initiales de La lipase de B. cepacia sauvage est peu énantiosélective pour ce substrat racémique (E=12) avec une préférence pour l énantiomère (R). L intermédiaire tétraédrique formé avec ce substrat est identique à celui formé avec l α-bromo phényl acétate d éthyle. Ces deux substrats ne diffèrent que par leur groupement partant (premier produit de la réaction), où un atome d hydrogène a été substitué par un atome de chlore. La première étape du mécanisme d action catalytique (acylation) conduira donc à la formation du même acyl-enzyme. L étape limitante reste donc cette première étape. 181

CHAPITRE V ETUDE PRELIMINAIRE DES MUTANTS PNCTUELS : CARACTERISATIN DE L ENANTISELECTIVITE Les trajectoires des énantiomères (R) et (S) de l α-bromo phényl acétate de 2-chloro éthyle dans le site actif de BCL ont été modélisées en utilisant le logiciel BioMove3D. Une corrélation positive entre le ratio des temps de calcul ((CPU(S)/CPU(R) = 16) et la valeur expérimentale de l énantiosélectivité (E=12) a été observée. Les acides aminés c contraignant le déplacement des énantiomères substrats le long du site actif de BCL ont été identifiés à l aide du détecteur de collisions BioCD (figure 56). 90,00 80,00 % de contacts 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 R S 20,00 10,00 0,00 L267-Sc L167-Sc H286-Sc L17-Bb L17-Sc V266-Sc T18-Sc Y29-Sc Y23-Sc Résidus L287-Sc L293-Sc F119-Sc F146-Sc L27-Sc Q292-Sc L248-Sc T251-Sc V123-Sc F142-Sc A247-Sc Figure 56 : Histogramme représentant la fréquence relative des contacts entre les acides aminés du site actif de l enzyme et chaque énantiomère au cours des trajectoires (Bb=Squelette, Sc= Chaîne latérales des acides aminés). La fréquence relative des contacts entre la chaîne latérale de la valine 266 et l énantiomère (S) est nettement supérieure à ceux détectés pour l énantiomère (R). La variation de l encombrement stérique sur cette position devrait jouer un rôle sur la sélectivité de l enzyme. Cependant, les valeurs d excès énantiomériques substrat (ee s ) et les taux de conversion indiquent que ces mutants V266 sont peu énantiosélectifs vis-à-vis de l α-bromo phényl acétate de 2-chloro éthyle, et ce, quel que soit l encombrement stérique apporté par la mutation (tableau 26). Seul, le mutant V266G présente une inversion d énantiosélectivité (E=18). En effet, la vitesse de consommation de l énantiomère (S) par le mutant V266G est augmentée d un facteur 56 en comparaison à celle obtenue pour BCL sauvage. 182

CHAPITRE V ETUDE PRELIMINAIRE DES MUTANTS PNCTUELS : CARACTERISATIN DE L ENANTISELECTIVITE Pour l énantiomère (R), la vitesse obtenue avec le mutant est réduite d un facteur 3 par rapport à l enzyme sauvage (tableau 27). Tableau 27 : Vitesses initiales de consommation des énantiomères (R) et (S) de l α-bromo phényl acétate de 2-chloro éthyle obtenues avec BCL sauvage et le mutant ponctuel V266G. Vitesses initiales ( µmol/min/ml d enzyme) énantiomère (R) énantiomère (S) BCL sauvage 14.10-3 1,34.10-3 Mutant V266G 4,65.10-3 76.10-3 Le positionnement de l énantiomère (S) dans le site actif du mutant V266G a été analysé par modélisation moléculaire (figure 57). Pour se placer dans le site catalytique de BCL, les énantiomères (R) et (S)-α-bromo phényl acétate de 2-chloro éthyle doivent franchir la barrière stérique formée par Val-266 et Leu-17. Le docking de l énantiomère (S) dans le site actif de BCL montre que son atome de brome, porté par le centre asymétrique, est en interaction avec la chaîne latérale de la valine 266 (figure 57a). Ainsi, comme dans le cas de l α-bromo phényl acétate d éthyle, pour accéder au fond de la poche de BCL, il devra se déplacer vers la leucine 17. A l inverse, dans le site actif du mutant V266G, l absence de chaîne latérale sur la glycine diminue l encombrement stérique au niveau de la position 266 permettant ainsi à l énantiomère (S) soit d accéder plus facilement au site catalytique, soit de mieux se positionner pour former l intermédiaire tétraédrique (figure 57b). 183

CHAPITRE V ETUDE PRELIMINAIRE DES MUTANTS PNCTUELS : CARACTERISATIN DE L ENANTISELECTIVITE (a) (b) Figure 57 : Docking de l énantiomère (S)-α-bromo phényl acétate de 2-chloro éthyle dans (a) le site actif de BCL sauvage où la valine 266 est représentée en rose et (b) le site actif du mutant ponctuel V266G où la glycine 266 est également en rose. L atome de brome porté par le carbone asymétrique du substrat est en jaune. La modélisation des trajectoires des substrats dans le site actif du mutant V266G devra être effectuée pour déterminer les fréquences de contact entre l énantiomère (S) et la glycine 266. Elle devrait être inférieure à celle obtenue dans le cas de BCL sauvage. Cela nous permettra d évaluer le potentiel prédictif du modèle sur un mutant présentant des propriétés très différentes. En conclusion, ces premiers résultats tendent à démontrer que la position 266 seule ne joue pas un rôle prépondérant sur la sélectivité de BCL. En effet, nous pensions que l encombrement apporté par certaines mutations aurait influencé de manière plus marquée l énantiosélectivité. Les différents exemples de la littérature sur l amélioration de l énantiosélectivité des lipases montrent que celle-ci résulte souvent de l effet additif ou coopératif de plusieurs mutations (Bocola et coll., 2004 ; Reetz, 2004b ; Reetz et coll., 2006c, 2007). 184

CHAPITRE V ETUDE PRELIMINAIRE DES MUTANTS PNCTUELS : CARACTERISATIN DE L ENANTISELECTIVITE 4. PRDUCTIN DE BCL A L ECHELLE MICRPLAQUE En parallèle à ces travaux, un protocole de production de BCL à l échelle microplaque a été développé et validé sur la banque des mutants V266, afin de disposer d un outil nous permettant à terme de cribler de plus larges banques de mutants créées par évolution dirigée. 4.1. PTIMISATIN DES CNDITINS DE CULTURE PUR L EXPRESSIN DE BCL EN FRMAT 96-PUITS Les différents protocoles testés pour la production recombinante de BCL via le plasmide pflag-ats-lip-hp en format 96-puits sont décrits dans la figure 58. Les microplaques de stockage ont été inoculées avec 80 clones BCL sauvage et 8 clones témoins correspondant à la souche E. coli JM109 transformée avec le plasmide pflag-ats. Les 8 derniers puits contiennent seulement du milieu de culture 2x YT et servent de témoins négatifs de croissance. Les cultures en format 96-puits ont été inoculées à partir de précultures, obtenues après 24 heures de croissance à 30 C par réplication des microplaques de stockage. Toutes les cultures ont été réalisées à 30 C afin de limiter l évaporation du milieu de culture. Dans le but d optimiser la production de BCL en format 96-puits, plusieurs paramètres ont été testés : (i) le type de microplaques (les microplaques 96-puits et les deepwells 96-puits) (ii) la durée de l induction (iii) la concentration en inducteur Pour chaque condition testée, la croissance bactérienne (mesurée par l absorbance à 600 nm) et les niveaux d expression de protéines solubles (déterminés à partir des vitesses initiales mesurée lors de l hydrolyse du pnpb) ont été mesurés dans chaque puits. La variabilité de ces deux paramètres pour une culture donnée est représentée par le coefficient de variance (CV) calculé à partir de deux essais de culture (soit n = 160 puits). 185

CHAPITRE V ETUDE PRELIMINAIRE DES MUTANTS PNCTUELS : CARACTERISATIN DE L ENANTISELECTIVITE Microplaque de stockage Replication Pré-culture 200 µl 2x YT 30 C 24 h Réplication Production Microplaque 96 puits (Nunc TM Brand Product) 200 µl 2x YT 30 C 16h de croissance 8h induction - 0.1 mm IPTG Deepwell 96 puits (ABgene) 1.2 ml 2x YT 30 C (a) (b) 16h de croissance - 8h induction 0.1 mm IPTG 24h induction 0.01 mm IPTG Centrifugation 20 µl de cocktail de lyse -80 C 8 à 12 h Dilution 100 µl of cocktail de lyse sonication -80 C 8 à 12 h Dilution Hydrolyse du pnpb (405 nm) Figure 58 : Protocoles de production de BCL en microplaques et en deepwell 96-puits. Dans un premier temps, les cultures en microplaques et en deepwells ont été induites avec 0,1 mm d IPTG après 16 heures de croissance à 30 C. Les cultures ont été de nouveau incubées pendant 8 heures à 30 C. 186

CHAPITRE V ETUDE PRELIMINAIRE DES MUTANTS PNCTUELS : CARACTERISATIN DE L ENANTISELECTIVITE Dans les microplaques, la croissance bactérienne moyenne était de 0,79 avec un CV de 11%, et le niveau de production moyen de BCL de 770 U/L de culture avec un CV de 12% (figure 59a). Dans les deepwells, bien que la croissance bactérienne moyenne soit plus faible (0,51 avec un CV de 18%), les niveaux de production de BCL ont augmenté d un facteur 2 (1300 U/L de culture) avec un CV de 25% (n = 160 puits ; figure 59b). De plus, dans le protocole de production en deepwells, une étape de centrifugation a été introduite, ce qui permet de concentrer l extrait enzymatique d un facteur 10 (13000 U/L d extrait enzymatique). Afin de simplifier le protocole de production en format deepwell, une induction directe dès le début de la culture a été testée. Aucune activité lipase n a pu être détectée lorsque les cultures sont directement induites avec 0,1 mm d IPTG. Ceci peut être dû à l accumulation de BCL majoritairement sous forme de corps d inclusion. Cependant, lorsque l on diminue d un facteur 10 la concentration d inducteur (0,01 mm), la croissance bactérienne (0,74 avec un CV de 18%) et le niveau de production de BCL (1300 U/L de culture avec un CV de 27%) sont équivalents à ceux obtenus pour une induction avec 0,1 mm d IPTG après 16 heures de croissance (figure 59c). Cependant, pour toutes les cultures, la normalisation des niveaux de production par rapport à la croissance n a pas permis de réduire les coefficients de variance. (a) Vitesses initiales (mud/min - 405 nm) 1200 1000 800 600 400 200 0 A1 E1 A2 E2 A3 E3 A4 E4 A5 E5 A6 E6 A7 E7 A8 E8 A9 E9 A10 E10 Position des clones dans la microplaque 96-puits 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Absorbance (600 nm) 187

CHAPITRE V ETUDE PRELIMINAIRE DES MUTANTS PNCTUELS : CARACTERISATIN DE L ENANTISELECTIVITE (b) 1200 2,0 Vitesses initiales (mud/min - 405 nm) 1000 800 600 400 200 0 A1 E1 A2 E2 A3 E3 A4 E4 A5 E5 A6 E6 A7 E7 A8 E8 A9 E9 A10 E10 Position des clones dans la deepw ell 96-puits 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Absorbance (600 nm) (c) 1200 2,0 Vitesses initiales (mud/min - 405 nm) 1000 800 600 400 200 0 A1 E1 A2 E2 A3 E3 A4 E4 A5 E5 A6 E6 A7 E7 A8 E8 A9 E9 A10 E10 Position des clones dans la deepwell 96-puits 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Absorbance (600 nm) Figure 59 : Comparaison des productions recombinantes de BCL sauvage en microplaques 96-puits (a) et en deepwells 96-puits (b et c). La croissance bactérienne (D 600nm ) est représentée par des points noirs en fonction de la position du clone dans la plaque 96-puits. Les valeurs des vitesses initiales correspondantes sont représentées par des colonnes blanches. (a) Production de recombinaison de BCL en microplaque 96-puits (Nunc TM Brand Products), induction avec 0,1 mm d IPTG après 16 heures de croissance. (b) Production de recombinaison de BCL en deepwell 96-puits (ABgene) dans les mêmes conditions de culture que (a). (c) Production de recombinaison de BCL en deepwell 96- puits (ABgene), induction avec 0,01 mm d IPTG au début de la culture. Le protocole proposé ici est la première description d'une production hétérologue miniaturisée de BCL. La mesure des niveaux de production lors de l hydrolyse du pnpb permet de cribler 80 clones en moins de 10 minutes. Ceci représente une cadence de 6 000 clones par semaine. 188

CHAPITRE V ETUDE PRELIMINAIRE DES MUTANTS PNCTUELS : CARACTERISATIN DE L ENANTISELECTIVITE 4.2. VALIDATIN DU PRTCLE DE PRDUCTIN RECMBINANTE DE BCL EN DEEPWELL SUR UNE BANQUE DE MUTANTS Le protocole de production recombinante de BCL en format 96-puits a été validé en criblant la banque de mutants construite sur la position 266. Lors de la production recombinante des mutants ponctuels V266 en erlenmeyer, de grandes variations des activités lipase par rapport à l activité lipase de l enzyme sauvage ont été observées. La banque de mutants ponctuels V266 semble donc être un bon exemple pour valider le protocole de production développé en deepwell 96-puits. Les microplaques de stockage ont été inoculées avec 8 clones de chaque mutant ponctuel V266, 16 clones de BCL sauvage (qui seront employés comme référence) et 8 clones témoins correspondant à la souche E. coli JM109 transformée avec le plasmide pflag-ats. Les 8 derniers puits contiennent seulement du milieu de culture 2x YT et servent de témoins négatifs de croissance. Les pré-cultures, inoculées à partir des microplaques de stockage, ont été répliquées dans des deepwells 96-puits. Les mutants V266 ont été produits dans le milieu de 2x YT pendant 24 heures à 30 C en présence de 0,01 mm d IPTG. L activité lipase des extraits enzymatiques obtenus lors des cultures en deepwell a été dosée en utilisant comme substrat le pnpb, et comparée à l activité lipase des extraits enzymatiques obtenus lors des cultures en erlenmeyer. Le graphique de la figure 60 représente les valeurs des activités lipase obtenues lors de culture en deepwell en fonction de celles obtenues lors des cultures en erlenmeyer. La corrélation positive obtenue entre ces deux procédés de production valide le protocole de production recombinante de BCL développé en deepwells. 9000 Activités lipase issues des cultures en deepwells (U/L de culture) 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 y = 0,27x R 2 = 0,73 0 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 Activités lipase issues des cultures en fiole d'erlenmeyer (U/L de culture) Figure 60 : Corrélation entre les activités lipase (U/L de culture) obtenues lors des cultures en deepwells et les activités lipase (U/L de culture) obtenues lors des cultures en erlenmeyer. 189

CHAPITRE V ETUDE PRELIMINAIRE DES MUTANTS PNCTUELS : CARACTERISATIN DE L ENANTISELECTIVITE Comme dans le cas des activités lipase obtenues à partir de culture en erlenmeyer, les activités lipase des mutants ponctuels V266 produits en deepwells varient considérablement (de 50 à 8180 U/L de culture). Afin de déterminer si ces variations sont liées à l expression ou l activité catalytique, les niveaux d expression enzymatique de 10 mutants V266 ont été évalués par analyse d image de gel SDS-PAGE (figure 61). V266N V266L V266Q V266C V266W V266P V266R V266M V266D V266E BCL commerciale (Roche) 250 kda 150 kda 100 kda 75 kda 50 kda 37 kda 25 kda 20 kda 15 kda Figure 61 : Profils d expression de 10 mutants V266 (encadrés en blanc). Ces mutants V266 ont été produits en deepwells en utilisant le plasmide pflag-ats-lip-hp. La différence de 3 kda observée entre BCL commerciale et les mutants V266 correspond à la séquence mpa-flag. Ces mutants correspondent aux 5 meilleures et aux 5 plus mauvaises productions de lipase en deepwells. Les valeurs des niveaux d expression relatifs estimés sont reportées dans le tableau 28. Les niveaux d expression sont équivalents pour tous les mutants, suggérant que les différences d'activités lipase sont préférentiellement dues à des différences d efficacité catalytique. 190

CHAPITRE V ETUDE PRELIMINAIRE DES MUTANTS PNCTUELS : CARACTERISATIN DE L ENANTISELECTIVITE Tableau 28 : Estimation des niveaux d expression pour 10 mutants ponctuels V266 Mutants ponctuels V266 Activité lipase mesurée lors des cultures en deepwells (U/L de culture) Niveaux d expression relatifs des mutants ponctuels (a) V266N V266L V266Q V266C V266W V266M V266E V266R V266D V266P 8180 3710 3620 2760 2450 510 320 220 200 50 1.00 0.97 0.97 0.97 0.91 1.08 0.85 0.98 1.05 0.93 (a) les niveaux d expression relatifs ont été déterminés par analyse d image SDS-PAGE par rapport au niveau d expression obtenu pour le mutant V266N. 5. CNCLUSIN Afin de valider par des résultats expérimentaux l hypothèse selon laquelle l accessibilité pourrait être un facteur déterminant de l énantiosélectivité, des mutants ponctuels ont été construits par mutagénèse dirigée sur les positions Leu-17, Val-266 et Leu-287, ciblées d après les travaux de modélisation moléculaire. Un premier criblage au pnpb a mis en évidence que les activités lipase des mutants ponctuels V266 étaient supérieures à celle de BCL sauvage et des mutants L17 et L287. Les mutants V266 ont donc été sélectionnés, dans un premier temps, afin de mesurer leurs énantiosélectivité lors de l hydrolyse du (R,S)-α-bromo phényl acétate de 2-chloro éthyle. Comme BCL sauvage, ces mutants se sont révélés être peu énantiosélectifs. 191

CHAPITRE V ETUDE PRELIMINAIRE DES MUTANTS PNCTUELS : CARACTERISATIN DE L ENANTISELECTIVITE Seul le mutant V266G présentait une inversion complète d énantiosélectivité en faveur de l énantiomère (S). La vitesse initiale de consommation de cet énantiomère, dans le cas du mutant, est 56 fois supérieure à celle de l enzyme sauvage. L analyse moléculaire du positionnement du substrat dans le site actif du mutant V266G montre que la diminution de l encombrement stérique au niveau de la position 266 peut favoriser l accessibilité de l énantiomère (S) au site catalytique ou un meilleur positionnement du substrat pour former l intermédiaire tétraédrique. Ces premiers résultats montrent qu il n est pas aisé d établir un lien entre l énantiosélectivité et l encombrement stérique du site actif de BCL. La mutation de la position 266 seule ne semble pas suffisante pour influencer l énantiosélectivité de BCL. Cependant, ces travaux préliminaires sur l énantiosélectivité des mutants V266 nous a permis de poser les bases de ce qui sera le travail visant à évaluer le rôle du positionnement dans le site actif et de l accès sur l énantiosélectivité. La modélisation des trajectoires du substrat dans leurs sites actifs devrait nous permettre de mieux appréhender les facteurs structuraux influençant l énantiosélectivité de ces mutants. De plus, les mutants Leu17 et Leu287 devront également être testés expérimentalement et in silico. En effet, comme nous l avons vu sur l histogramme des fréquences relatives de contacts, les chaînes latérales de ces deux acides aminés contraignent le déplacement des énantiomères substrats dans le site actif de BCL sauvage. Dans le cas de Leu-17, son squelette est également impliqué dans cette discrimination. A terme, il sera intéressant de combiner ces différents mutants entre eux soit de façon rationnelle soit aléatoire. En parallèle, un protocole de production de BCL à l échelle microplaque a été développé et validé sur la banque des mutants ponctuels V266, nous permettant ainsi de disposer d un outil pour cribler de plus larges banques de mutants créées par évolution dirigée. Les clones actifs seront dans un premier temps sélectionnés par hydrolyse du pnpb, leur énantiosélectivité pourra ensuite être déterminée par une analyse LC-MS. Cette technique permettra de détecter de faibles concentrations de substrats ou de produits (de l ordre de la picomole) pour déterminer les excès énantiomériques et calculer les ratios énantiomériques (E). 192

Conclusion générale 193

194

CNCLUSIN GENERALE Nos travaux de recherche, financés par sanofi-aventis, ont eu pour principal objectif de développer un modèle capable de prédire l énantiosélectivité de lipases dotées d un site actif enfoui à partir d un modèle préliminaire proposé par Guieysse et coll., (2003b). En confrontant les résultats obtenus in silico aux résultats expérimentaux, ces travaux ont eu pour visée d approfondir le rôle de l accessibilité des substrats au site actif sur l énantiosélectivité des lipases. Les substrats modèles de cette étude sont des acides 2-halogéno-carboxyliques, intervenant dans la synthèse de molécules thérapeutiques. Quant à l enzyme modèle choisie pour cette étude, il s agit de la lipase de Burkholderia cepacia ATCC21808 (BCL), une lipase de structure tridimensionnelle connue et présentant un site actif enfoui et contraint. Pour atteindre nos objectifs, notre approche a consisté à : 1- Développer une méthode en collaboration avec les roboticiens du LAAS-CNRS permettant de modéliser les trajectoires des énantiomères dans le site actif de la lipase pour tenter d évaluer le rôle de l accès au site actif sur l énantiosélectivité de BCL lors du dédoublement de différents esters dérivés de l acide 2-bromo phényl acétate d éthyle. 2- Développer un système d expression recombinante de BCL chez E. coli et une méthode de purification afin de permettre à terme d exprimer, cribler à haut-débit et caractériser des librairies de mutants ciblées d après les travaux de modélisation moléculaire. 3- Construire et caractériser des mutants ponctuels. 4- Développer un protocole de production de BCL recombinante à l échelle microplaque, afin de disposer d un outil pour cribler à terme de plus larges banques de mutants créées par évolution dirigée. Nous nous proposons donc de dresser le bilan de ces travaux, et d en dégager les perspectives. Evaluation in silico du rôle de l accès au site actif sur l énantiosélectivité de BCL La modélisation des trajectoires d un substrat à l intérieur d un site actif reste une tache ardue et coûteuse en temps de calcul, en particulier lorsqu il s agit de prendre en compte la flexibilité moléculaire. La plupart des approches de modélisation moléculaire ne tiennent compte que des propriétés statiques d interaction ligand-récepteur, et ce, en raison de la durée et de la complexité des calculs nécessaires pour simuler l accès du ligand au site actif de l enzyme. 195

CNCLUSIN GENERALE Pour poursuivre l étude du rôle de l accessibilité sur l énantiosélectivité de BCL, nous avons développé une approche mixte couplant des techniques de modélisation moléculaire classiques à de nouvelles techniques algorithmiques de planification de mouvements issues de la robotique. Cette nouvelle approche, développée dans le cadre du projet ALMA soutenu par l ITAV, a permis d une part de réduire les temps de calculs de quelques jours à seulement quelques heures, et d autre part, de prendre en compte simultanément la flexibilité du substrat et de l enzyme. Les trajectoires de 7 dérivés de l acide 2-bromo phényl acétate d éthyle à l intérieur du site actif de BCL ont été calculées en utilisant cette approche mixte. Les résultats in silico obtenus ont ensuite été confrontés aux résultats expérimentaux de l énantiosélectivité de BCL. Une corrélation qualitative entre le ratio de la moyenne des temps de calcul des trajectoires de chaque énantiomère et les valeurs d énantiosélectivité de BCL a pu être mise en évidence indiquant un possible lien entre accès et énantiosélectivité. Cependant, notre modèle repose sur des hypothèses dont il est nécessaire de rappeler les limites pour donner des perspectives d amélioration. D une part, nous avons calculé les trajectoires inverses de celles adoptées par le substrat en postulant l équivalence entre les trajectoires d entrée et de sortie des substrats. Cette hypothèse devra être vérifiée et les algorithmes améliorés pour calculer les trajectoires d entrée qu il faudra comparer à celle de sortie. Il faudra aussi évaluer l impact de la position initiale productive choisie sur le calcul des trajectoires. D autre part, ces dernières ont été calculées en utilisant des rayons de van der waals représentant 80 % de la valeur théorique et en autorisant la flexibilité de 17 chaînes latérales tapissant le site actif de la protéine. De plus, le modèle est géométrique et ne prend en compte aucun calcul d énergie, notamment électrostatique, qu il faudra vraisemblablement introduire pour prendre en compte ces forces. Si les difficultés d accès sont corrélées dans cette étude à l énantiosélectivité, elles devraient aussi corréler les constantes d association et dissociation du substrat. Pour valider le modèle sur le plan de la cinétique enzymatique, il faudra donc démontrer que l accès est limitant sur le plan cinétique en procédant aux déterminations de Km apparent et de calcul des constantes de dissociation. Ceci pourrait permettre de préciser les limites de la théorie de l état stationnaire lorsque qu il concerne des réactions lentes catalysées par des enzymes possédant un site actif enfoui et montrerait que les états de transitions et l acte purement catalytique ne sont pas les seuls impliqués dans l énantiosélectivité. 196

CNCLUSIN GENERALE utre son efficacité sur le plan calculatoire, l un des aspects les plus intéressants de la méthode est qu elle permet par l analyse des trajectoires d identifier des résidus entrant souvent en collision avec les substrats qui sont des cibles potentielles de mutagénèse. Nous avons donc choisi certaines de ces cibles pour caractériser l énantiosélectivité des mutants. Toutefois, la construction et la caractérisation de ces mutants nécessitaient de disposer au préalable d un système efficace de production de la lipase et d une méthode de purification. Production recombinante de BCL chez E. coli et purification. L expression recombinante de lipases de type Pseudomonas et Burkholderia chez Escherichia coli a révélé que ces enzymes étaient principalement produites sous forme de corps d inclusion inactifs. En effet, leur expression sous forme active nécessite la présence d une protéine Lif ou protéine chaperonne, essentielle à leur repliement (Rosenau et Jaeger, 2000 ; Rosenau et coll., 2004). Chez l organisme natif B. cepacia, le gène lip, codant pour la lipase extracellulaire, est présent sous forme d opéron avec le gène hp codant pour sa protéine chaperonne. A ce jour, seuls les travaux de Quyen et coll., (1999), décrivent l expression recombinante BCL chez E. coli via le plasmide pt-mpa-lip-hp. Cependant, comme de nombreuses autres lipases exprimées chez E. coli, l expression hétérologue de BCL a conduit à de très faibles quantités de lipase soluble, l enzyme étant principalement produite sous forme de corps d inclusion inactifs (Quyen et coll., 1999). Les gènes lip et hp ont donc été clonés dans différents vecteurs d expression et placés sous le contrôle de différents promoteurs afin d atteindre des niveaux d activité lipase compatibles avec une détection rapide à l échelle microplaque. Au total, 4 constructions ont été testées : (i) pbad-mpa-lip-hp, (ii) pbad-thi-mpa-lip-hp, (iii) pet-mpa-lip-hp et (iv) pflag-ats-lip-hp. Seul le plasmide pflag-ats-lip-hp a permis d obtenir, après optimisation des conditions de croissance des cellules d E. coli, le plus haut niveau d activité lipase sous forme soluble jamais décrit dans la littérature concernant BCL (6679 U/L de culture). Toutefois, la protéine chaperonne Hp n a jamais été sur-produite. Pour améliorer son expression, nous aurions pu envisager de placer le gène hp sous le contrôle d un autre promoteur sur le même plasmide ou de transformer une souche avec un plasmide dédié spécifiquement à son expression. Cependant, le niveau d expression obtenu nous a semblé suffisamment élevé pour : (i) exprimer et comparer l énantiosélectivité de différents mutants ponctuels ciblés par modélisation, et (ii) envisager un protocole de production en microplaque adapté à un criblage haut-débit de plus larges banques de mutants. 197

CNCLUSIN GENERALE La présence de l étiquette FLAG dans ce système d expression a permis d initier la purification de BCL par chromatographie d affinité avec un rendement global de 62% et un facteur de purification de 2,1. Construction et caractérisation des mutants ponctuels Les mutants ponctuels ont été construits par mutagénèse dirigée sur les positions Leu-17, Val- 266 et Leu-287, ciblées d après les travaux de modélisation moléculaire. Trois banques de mutants ponctuels ont ainsi été construites en remplaçant chaque position par les 19 autres acides aminés possibles. Ainsi, au total, 57 mutants ponctuels ont été créés. L intérêt était de pouvoir mesurer l influence de chaque position mutée sur l activité lipase et l énantiosélectivité et de pouvoir analyser tous les résultats, qu ils soient positifs ou négatifs. Un premier criblage au pnpb a mis en évidence que les activités lipase des mutants ponctuels V266 étaient supérieures à celle de BCL sauvage et des mutants L17 et L287. Les mutants V266 ont donc été sélectionnés, dans un premier temps, afin de mesurer leurs énantiosélectivité lors de l hydrolyse du (R,S)-α-bromo phényl acétate de 2-chloro éthyle. Ces mutants se sont révélés être peu énantiosélectifs en comparaison à BCL sauvage. Il sera nécessaire maintenant de calculer les trajectoires de tous ces mutants pour évaluer l impact de l accès et pouvoir confronter le modèle à l expérience sur ces nouveaux exemples. De même, il faudra déterminer l enantiosélectivité des autres mutants L17 et L287. En particulier, le mutant V266G présente une inversion d énantiosélectivité. L analyse moléculaire du positionnement du substrat dans le site actif du mutant V266G a montré que la diminution de l encombrement stérique au niveau de la position 266 pouvait favoriser à la fois l accessibilité de l énantiomère (S) au site catalytique et son positionnement dans le site. Ces premiers résultats montrent qu il n est pas facile d établir un lien entre l énantiosélectivité et l encombrement stérique du site actif de BCL pour prévoir les mutations. Après avoir testé individuellement l énantiosélectivité des mutants L17 et L287, il sera donc intéressant de combiner tous ces mutants rationnels par une approche combinatoire afin de moduler l énantiosélectivité et affiner la construction de notre modèle à partir d un jeu plus large de données. Nos travaux ont permis d établir les protocoles expérimentaux qui devront être développés pour les approches combinatoires. 198

CNCLUSIN GENERALE Protocole de production de BCL à l échelle microplaque Un protocole de production de BCL à l échelle microplaque a été établi et validé sur la banque des mutants ponctuels V266. Plusieurs paramètres ont été testés : (i) le type de microplaques (les microplaques 96-puits et les deepwells 96-puits), (ii) la durée de l induction et (iii) la concentration en inducteur. Pour chaque condition testée, la croissance bactérienne (mesurée par l absorbance à 600 nm) et les niveaux d expression de protéines solubles (déterminés à partir des vitesses initiales mesurée lors de l hydrolyse du pnpb) ont été mesurés dans chaque puits. La variabilité de ces deux paramètres pour une culture donnée est représentée par le coefficient de variance (CV) calculé à partir de deux essais de culture (soit n = 160 puits). Après 24 heures de production de BCL en deepwell-96 puits en induisant directement le milieu de culture avec 0,01 mm d IPTG, le niveau d activité lipase obtenu était de 1300 U/L de culture avec un CV de 27%. Ce protocole de production recombinante de BCL en format 96-puits a ensuite été validé en criblant la banque de mutants construite sur la position 266. Les niveaux d activité lipase obtenus pour ces mutants cultivés en erlenmeyer ont été comparés aux niveaux d activité lipase obtenus en deepwell-96 puits dans les conditions décrites ci-dessus. La corrélation positive obtenue entre ces deux procédés de production a validé le protocole de production recombinante de BCL développé en deepwells. Le protocole proposé ici est la première description d'une production hétérologue miniaturisée de BCL, nous permettant ainsi de disposer d un outil pour cribler de plus larges banques de mutants créées par évolution dirigée. Les clones actifs pourront dans un premier temps être sélectionnés par hydrolyse du pnpb, leur énantiosélectivité pourra ensuite être déterminée par une analyse LC-MS. Cette technique permettra de détecter de faibles concentrations de substrats ou de produits (de l ordre de la picomole) pour déterminer les excès énantiomériques et calculer les ratios énantiomériques (E). Le modèle in silico sera alors testé en prenant compte de ces mutations. 199

CNCLUSIN GENERALE En conclusion, notre étude a permis de calculer pour la première fois des trajectoires de substrats dans le site actif d une enzyme flexible en prenant en compte 68 degrés de liberté avec des temps de calcul très courts. Le fait de disposer de cet outil nous a permis de comparer les trajectoires empruntées par des couples d énantiomères. Cette approche pourra être étendue à l étude d autres enzymes présentant une topologie du site actif comparable. Les algorithmes devraient aussi permettre à plus long terme de prendre en compte des changements conformationnels plus importants tels que des mouvements de boucle, pour analyser leurs effets sur les trajectoires des substrats et mieux comprendre la dynamique fonctionnelle des enzymes. Concernant le rôle de l accès au site actif sur l énantiosélectivité, il faudra poursuivre l analyse des résultats des mutations rationnelles et combinatoires et disposer de plus de données cinétiques pour conforter ou fixer les limites de nos conclusions. 200

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Annexes 235

236

ANNEXES SEQUENCE NUCLETIDIQUE ET PRTEIQUE DE LA LIPASE DE B. CEPACIA ATCC21808 ET DE SA PRTEINE CHAPERNNE HP - La séquence du gène lip de la lipase mature de B. cepacia est indiquée en noir. - La séquence de sa protéine chaperonne hp est indiquée en bleue. - Les acides aminés de la triade catalytique (Ser-87, Asp-264, His-286) sont coloriés en rouge - Les acides aminés formant le trou oxyanion sont indiqués par un point noir ( ) - Les acides aminés constituant le site de liaison au calcium sont indiqués par un triangle ( ) - Les acides aminés du pont disulphure (Cys-190 et Cys-270) sont coloriés en jaune - La séquence Shine-Dalgarno (GAAG) située en C-terminale de la lipase est encadrée en noir. A D N Y A A T R Y P I I L V H G L T 18 GCC GAC AAC TAC GCG GCG ACG CGT TAT CCG ATC ATT CTC GTG CAC GGG CTC ACG 54 G T D K Y A G V L E Y W Y G I Q E D 36 GGC ACC GAC AAA TAC GCA GGT GTG CTC GAG TAC TGG TAC GGG ATC CAG GAG GAC 108 L Q Q R G A T V Y V A N L S G F Q S 54 CTG CAG CAG CGT GGC GCG ACC GTC TAT GTC GCT AAC CTG TCG GGC TTC CAG AGC 162 D D G P N G R G E Q L L A Y V K T V 72 GAC GAC GGC CCG AAC GGG CGC GGC GAA CAG TTG CTG GCC TAC GTG AAG ACG GTG 216 L A A T G A T K V N L V G H S Q G G 90 CTC GCC GCG ACG GGG GCG ACC AAG GTC AAC CTC GTC GGC CAC AGC CAG GGC GGG 270 L T S R Y V A A V A P D L V A S V T 108 CTG ACG TCG CGC TAT GTC GCG GCC GTC GCG CCC GAT CTG GTC GCG TCG GTG ACG 324 T I G T P H R G S E F A D F V Q G V 126 ACG ATC GGC ACG CCG CAT CGC GGC TCC GAG TTC GCC GAC TTC GTG CAG GGC GTG 378 L A Y D P T G L S S T V I A A F V N 144 CTC GCG TAC GAT CCG ACC GGG CTG TCG TCG ACG GTG ATC GCC GCG TTC GTC AAT 432 V F G I L T S S S N N T N Q D A L A 162 GTG TTC GGA ATC CTC ACG AGC AGC AGC AAC AAC ACG AAC CAG GAC GCG CTC GCG 486 A L K T L T T A Q A A T Y N Q N Y P 180 GCG CTG AAG ACG CTG ACG ACC GCG CAG GCC GCC ACG TAC AAC CAG AAC TAC CCT 540 S A G L G A P G S C Q T G A P T E T 198 AGC GCG GGC CTC GGC GCG CCG GGC AGT TGC CAG ACC GGC GCG CCG ACG GAA ACC 594 V G G N T H L L Y S W A G T A I Q P 216 GTC GGC GGC AAC ACG CAT CTG CTG TAT TCG TGG GCC GGC ACG GCG ATC CAG CCG 648 T I S V F G V T G A T D T S T I P L 234 ACG ATC TCC GTG TTC GGC GTC ACG GGT GCG ACG GAT ACG AGC ACC ATT CCG CTC 702 V D P A N A L D P S T L A L F G T G 252 GTC GAT CCG GCG AAC GCG CTC GAC CCG TCG ACG CTC GCG CTG TTC GGC ACC GGC 756 T V M V N R G S G Q N D G V V S K C 270 ACG GTG ATG GTC AAC CGC GGT TCG GGC CAG AAC GAC GGG GTC GTG TCG AAG TGC 810 S A L Y G Q V L S T S Y K W N H L D 288 AGC GCG CTG TAC GGC CAG GTG CTG AGC ACG AGC TAC AAG TGG AAC CAT CTC GAC 864 E I N Q L L G V R G A N A E D P V A 306 GAG ATC AAC CAG TTG CTC GGC GTG CGC GGC GCG AAT GCG GAA GAT CCG GTC GCG 918 V I R T H A N R L K L A G V * S M T 324 GTG ATC CGC ACG CAT GCG AAC CGG CTG AAG CTC GCG GGC GTG TGA TCG ATG ACG 972 A R E G R A P L A R C A V V Y G V V 342 237

ANNEXES GCA CGT GAA GGG CGC GCG CCG CTG GCG CGG CGC GCT GTG GTC TAC GGT GTC GTG 1026 G L A A I A G V A M W S G A G W H R 360 GGG CTG GCG GCG ATC GCC GGC GTC GCG ATG TGG AGC GGT GCG GGA TGG CAT CGC 1080 G T G T A G E L P D A A A A G G A A 378 GGG ACG GGC ACG GCC GGC GAG TTG CCG GAC GCG GCA GCG GCA GGC GGG GCG GCT 1134 A A P P Q A A L P A S T G L P S S L 396 GCC GCA CCG CCG CAG GCC GCT CTG CCG GCG AGC ACG GGC CTG CCG TCG TCG CTG 1188 A G S S A P R L P L D A G G H L A K 414 GCC GGC TCC AGT GCG CCG CGG CTG CCG CTC GAT GCC GGC GGC CAT CTT GCG AAG 1242 S R A V R D F F D Y C L T A Q S D L 432 TCG CGC GCG GTG CGC GAT TTC TTC GAC TAC TGC CTG ACC GCG CAG AGT GAC CTG 1296 S A A A L D A F V V R Q I A A Q L D 450 AGC GCG GCC GCG CTC GAT GCG TTC GTC GTA CGC CAG ATC GCC GCG CAG CTC GAC 1350 G T V A Q A E A L D V W H R Y R A Y 468 GGC ACG GTC GCG CAG GCC GAG GCG CTC GAC GTC TGG CAC CGG TAC CGC GCG TAT 1404 L D A L A K L R D A G A V D K S D L 486 CTC GAC GCG CTC GCG AAG TTG CGC GAT GCC GGC GCG GTC GAC AAG TCC GAC CTG 1458 G A L Q L A L D Q R A S I A Y R T L 504 GGT GCG CTG CAG CTC GCG CTC GAC CAG CGC GCG TCG ATC GCG TAC CGC ACG CTC 1512 G D W S Q P F F G A E Q W R Q R Y D 522 GGC GAC TGG AGC CAG CCG TTT TTC GGC GCG GAG CAG TGG CGG CAG CGC TAC GAT 1566 L A R L K I A Q D R T L T D A Q K A 540 CTC GCG CGA CTG AAG ATC GCG CAG GAT CGT ACG CTG ACG GAT GCG CAG AAG GCC 1620 E R L A A L E Q Q M P A D E R A A Q 558 GAG CGG CTC GCG GCG CTT GAG CAG CAG ATG CCA GCC GAC GAA CGC GCG GCG CAG 1674 Q R V D Q Q R A A I D R I A Q L Q K 576 CAG CGG GTC GAC CAG CAG CGG GCC GCG ATC GAC CGG ATC GCG CAA CTG CAG AAG 1728 S G A T P D A M R A E L T Q T L G P 594 AGC GGC GCG ACG CCC GAT GCG ATG CGC GCG CAA CTG ACG CAG ACG CTC GGC CCG 1782 E A A A R V A Q M Q Q D D A S W Q S 612 GAA GCC GCC GCG CGC GTC GCG CAG ATG CAG CAG GAC GAC GCA TCG TGG CAG AGC 1836 R Y A D Y A T Q R A E I E S A G L S 630 CGC TAC GCG GAC TAT GCG ACG CAG CGT GCG GAG ATC GAG TCG GCC GGC CTG TCG 1890 P Q D R D A Q I A A L R Q R T F T K 648 CCG CAG GAT CGC GAC GCC CAG ATC GCC GCA TTG CGG CAG CGC ACG TTC ACG AAA 1944 P G E A V R A A S L D R G A G S A Q 666 CCC GGC GAA GCG GTG CGG GCG GCA TCG CTC GAT CGC GGC GCG GGC AGC GCG CAG 1998 * 667 TGA 2001 238

ANNEXES LISTE DES ABREVIATINS a.c ADN ALMA ARN a w BCL BET bp CLHP CPU CV D E EMEA ee p ee s FDA Hp hp IPTG ITAV kb k cat kda Km LC-MS Lif lip PCR PDB pnpb RRT U vdw vi vi R vi S auxiliaire chiral acide désoxyribonucléique Algorithmique du mouvement et des interactions macromoléculaires acide ribonuléique activité de l eau lipase de Burkholderia cepacia bromure d éthidium paires de bases chromatographie liquide haute performance computing coefficient de variancce densité optique énantiosélectivité Agence Européenne pour l Evaluation des Médicaments excès énantiomèrique du produit excès énantiomérique du substrat Food and Drug Administration protéine chaperonne de la lipase de Burkholderia cepacia gène codant pour la protéine chaperonne de la lipase de Burkholderia cepacia Isopropyl-beta-thio-galactoside Institut des Technologies Avancées en Sciences du Vivant kilo paires de bases constante catalytique kilodalton constante de Michaelis-Menten Liquide Chromatographie Masse Spectrométrie Lipase-Specific Foldase gène codant pour la lipase de Burkholderia cepacia polymerase chain reaction Protein Data Bank para-nitrophényl butyrate Rapidly-exploring Random Trees unité de mesure d activité enzymatique van der Waals vitesse initiale vitesse intiale de l énantiomère (R) vitesse initiale de l énantiomère (S) 239

240

Tables des illustrations 241

242

TABLES DES ILLUSTRATINS TABLE DES FIGURES Figure 1 : (a) exemple de molécule chirale, (*)=carbone asymétrique. (b) exemple d un objet chiral: la coquille d escargot....29 Figure 2 : Exemples de molécules chirales dont les propriétés dépendent de leur configuration absolue.....31 Figure 3 : Acides α-arylpropioniques : anti-inflammatoires non-stéroïdiens...33 Figure 4 : Acides α-aryloxypropioniques : herbicides...34 Figure 5 : Formule semi-développée de l α-bromo phényl acétate de 2-chloro éthyle....34 Figure 6 : Structure du Taxol, du Taxotère et de la Baccatin III...35 Figure 7 : Synthèse de composés énantiomériquement purs à partir de réactifs prochiraux et d auxiliaires chiraux...36 Figure 8 : Synthèse du (S)-naproxen : procédé Zambon...37 Figure 9 : Synthèse d un intermédiaire de synthèse du Motelukast....37 Figure 10 : Dédoublement de racémiques par précipitation diastéréosélective....39 Figure 11 : Principe du dédoublement de mélanges racémiques catalysé par des hydrolases....41 Figure 12 : Diagramme schématique du repliement des α/β hydrolases...45 Figure 13 : Représentation schématique des sites actifs des lipases de CAL-B, de BCL, de RML, et de CRL...47 Figure 14 : Topologie des sites actifs de CRL, de BCL et CALB...48 Figure 15 : Mécanisme d action catalytique des lipases...49 Figure 16 : Dédoublement enzymatique.....50 Figure 17 : Variation des excès énantiomériques en fonction du taux de conversion de la réaction dans le cas d une réaction irréversible....50 Figure 18 : Diagrammes d énergies d une réaction énantiosélective catalysée par une enzyme...52 Figure 19 : Variation de l énantiosélectivité de différentes enzymes en fonction du log P des solvants organiques pour diverses réactions...55 Figure 20 : Représentation schématique de l intermédiaire tétraédrique...58 Figure 21 : Stratégie pour la création d enzyme énantiosélective par évolution dirigée...62 Figure 22 : Structure 3-D de BCL sous sa forme ouverte...69 Figure 23 : Alignements de séquence entre les lipases des sous-familles I.1 et I.2...70 Figure 24 : Vue de dessus du site actif de BCL...72 Figure 25 : Les différents types de dédoublement...73 Figure 26 : Représentation schématique du dédoublement d acide carboxylique catalysé par les lipases....74 Figure 27 : Dédoublement de l acide 2-fluoro-hexanoique catalysé par BCL...75 Figure 28 : Energie d interaction entre chaque énantiomère et le site actif de l enzyme en fonction du positionnement du substrat dans le site actif...80 Figure 29 : Représentation du réseau d acides aminés hydrophobes à chaîne latérale pivotante du site actif de BCL....80 Figure 30 : Coupe du site actif de BCL...81 Figure 31 : Représentation schématique de l exploration complète de l espace géométrique du site actif de BCL via l algorithme de planification de mouvements....82 Figure 32 : (a) Trajectoires de chaque énantiomère du (R,S)-α-bromo phényl acétate d éthyle dans le site actif de BCL calculées par l approche de pseudo-dynamique moléculaire. (b) Trajectoires de chaque énantiomère du (R,S)-α-bromo phényl acétate d éthyle dans le site actif de BCL calculées par l approche de robotique...83 Figure 33 : Pourcentage de collisions détectées entre les atomes des acides aminés du site actif de BCL et les énantiomères (R) et (S) de l α-bromo phényl actétate d éthyle...85 Figure 34 : Exemple du mécanisme de sécrétion chez Pseudomonas aeruginosa...88 243

TABLES DES ILLUSTRATINS Figure 35 : Représentation schématique des étapes du protocole de mutagénèse dirigée par PCR inverse....104 Figure 36 : Représentation géométrique des différents termes du champ de forces CFF91...122 Figure 37 : Données cristallographiques de BCL co-cristallisée en présence d inhibiteur (diéthylphosphate)...124 Figure 38 : (a) Représentation des intermédiaires tétraédriques. (b) Définition des angles dièdres X (C1, C2, C7, C8) et Y (C2, C7, C8, 9)...128 Figure 39 : Arrimage des intermédiaires à l intérieur du site actif...129 Figure 40 : Réactions de transestérification des esters dérivés de l acide 2-bromo phénylacétique catalysées par BCL...137 Figure 41 : Projection tridimensionnelle d'un arbre de recherche RRT...139 Figure 42 : Intermédiaires tétraédriques du bromo-méta-tolyl acétate d éthyle...141 Figure 43 : Changements conformationnels se produisant le long des trajectoires des énantiomères (R)-et (S) du bromo-méta-tolyl acétate d éthyle...142 Figure 44 : Histogramme représentant la fréquence relative des contacts entre les acides aminés de l enzyme et chaque énantiomère le long des trajectoires calculées sur 50 essais....146 Figure 45 : Représentation des acides aminés identifiés par le détecteur de collision...147 Figure 46 : Profils d expression de la souche E. coli DH5α seule et de la souche E. coli DH5α transformée avec le plasmide pt-mpa-lip-hp (BCL) après 3 et 6 heures d induction...156 Figure 47 : Profils d expression de la souche E. coli TP10 transformée avec le plasmide pbad- THI-mpA-Lip-Hp...159 Figure 48 : Comparaison des profils d expression de la souche E. coli TP10 transformée avec le plasmide pbad-thi-mpa-lip-hp à 18 C et 30 C....160 Figure 49 : Comparaison des profils d expression de la souche E. coli TP10 transformée avec le plasmide pbad-thi-mpa-lip-hp pour des cultures induites avec différents pourcentages de L-arabinose (0,02% à 0,0002%)....162 Figure 50 : Western blot anti-flag....165 Figure 51 : Gel d électrophorèse des fractions issues de la procédure de purification...167 Figure 52 : Localisation des 3 cibles de mutagénèse dans le site actif de BCL....174 Figure 53 : Diagramme topologique de BCL.....175 Figure 54 : Alignements de différentes lipases appartenant à la famille Burkholderia cepacia réalisées d après la LED...176 Figure 55 : Positions de la Leu-17 ( trou oxyanion ) et de la Leu-167 ( résidu d ancrage ) dans le site actif de BCL....179 Figure 56 : Histogramme représentant la fréquence relative des contacts entre les acides aminés du site actif de l enzyme et chaque énantiomère au cours des trajectoires....182 Figure 57 : Docking de l énantiomère (S)-α-bromo phényl acétate de 2-chloro éthyle dans le site actif de BCL sauvage et le site actif du mutant ponctuel V266G...184 Figure 58 : Protocoles de production de BCL en microplaques et en deepwell 96-puits...186 Figure 59 : Comparaison des productions recombinantes de BCL sauvage en microplaques 96- puits et en deepwells 96-puits...188 Figure 60 : Corrélation entre les activités lipase obtenues lors des cultures en deepwells et les activités lipase obtenues lors des cultures en erlenmeyer...189 Figure 61 : Profils d expression de 10 mutants V266...190 244

TABLES DES ILLUSTRATINS TABLE DES TABLEAUX Tableau 1 : Marché mondial des énantiomères purs en milliards de dollars...32 Tableau 2 : Exemples de dédoublements de mélanges racémiques catalysés par des hydrolases..42 Tableau 3 : Exemples de propriétés de lipases améliorées par mutagénèse dirigée...61 Tableau 4 : Techniques d évolution dirigée avec leurs principaux avantages et inconvénients...63 Tableau 5 : Exemples de lipases améliorées par évolution dirigée...64 Tableau 6 : Exemples de lipases améliorées par l utilisation de techniques de mutagénèse à saturation....66 Tableau 7 : Classification des lipases de la famille I en sous-familles selon leur homologie de séquence...68 Tableau 8 : Enantiosélectivité de la lipase de BCL lors du dédoublement de différents substrats de type α-bromo-tolyl acétate d alkyle par réaction de transestérification...77 Tableau 9 : Comparaison des rapports des temps de calcul avec l énantiosélectivité expérimentale obtenus pour Ph(Br)Et, Ph(Cl)Et et Ph(F)Et...83 Tableau 10 : Classification des protéines Lifs selon leur homologie de séquence...87 Tableau 11 : Exemples de purification de lipases issues des genres Pseudomonas et Burkholderia...93 Tableau 12 : Liste des vecteurs/plasmides utilisés ou construits au cours de cette étude....98 Tableau 13 : Milieux de culture, température de culture, nature et concentration des inducteurs testés selon les différentes constructions plasmidiques...109 Tableau 14 : Conditions d induction testées en fonction du type de microplaque utilisé...112 Tableau 15 : Découpage de BCL...126 Tableau 16 : Enantiosélectivité de BCL pour les substrats de type α-x-phényl acétate d alkyle. 138 Tableau 17 : Simulation des trajectoires des substrats différant par le substituant R sur le cycle phényl...143 Tableau 18 : Simulation des trajectoires des substrats différant par le substituant halogéné présent au niveau du centre chiral.....145 Tableau 19 : Caractéristiques des différents hôtes et vecteurs testés....157 Tableau 20 : Influence de la concentration d inducteur (L-arabinose) sur l activité lipase mesurée par hydrolyse du para-nitrophényl butyrate dans les fractions protéiques solubles...161 Tableau 21 : Comparaison des activités enzymatiques mesurées par hydrolyse du para-nitrophényl butyrate dans les fractions protéiques solubles obtenues à partir des plasmides pet-mpa-lip- Hp et pflag-ats-lip-hp....163 Tableau 22 : ptimisation des conditions d expression du plasmide pflag-ats-lip-hp...164 Tableau 23 : Purification de BCL par chromatographie d affinité...167 Tableau 24 : Conditions d expression testées et mesures des activités lipases obtenues avec les différentes constructions plasmidiques testées au cours de cette étude...168 Tableau 25 : Activités lipase des mutants ponctuels mesurées lors de l hydrolyse du paranitrophényl butyrate...178 Tableau 26 : Vitesses relatives d hydrolyse du para-nitrophényl butyrate du (R,S)-α-bromo phényl acétate de 2-chloro éthyle, et ratio énantiomérique (E) obtenus avec BCL sauvage et 18 mutants ponctuels V266...181 Tableau 27 : Vitesses initiales de consommation des énantiomères (R) et (S) de l α-bromo phényl acétate de 2-chloro éthyle obtenues avec BCL sauvage et le mutant ponctuel V266G...183 Tableau 28 : Estimation des niveaux d expression pour 10 mutants ponctuels V266...191 245