1 S TP 1.5 : INFLUENCE DU MILIEU SUR L EXPRESSION DES GENES Le phénotype ne dépend pas que du génotype : l activité des enzymes est modifiée par les conditions du milieu (TP 1.3). Le milieu pourrait aussi agir directement sur le gène, c'est-à-dire modifier sa transcription et sa traduction en protéine. On chercher à vérifier que l environnement peut modifier l expression d un gène? DEROULEMENT DU TP Cette étude s effectue sur une souche de levure mutée appelée ADE2-, car elle porte une mutation sur un gène de la chaine de synthèse de l adénine. Caractéristique de la levure Influence du milieu sur les gènes Les cultures de levure, comme toutes les cultures microbiennes, s effectuent dans des conditions de stérilité très strictes pour sa propre protection, pour éviter la contamination et la pollution du milieu. Conditions de stérilité La culture de levure est mise en place dans une première séance. Son développement nécessite une semaine à 28 C : le résultat s observe sur les colonies. Matériel et Protocole Résultats COMPTE RENDU Présenter en tableau les conditions expérimentales, les résultats et leur interprétation. Schématiser le résultat et l explication cellulaire de la coloration blanche des levures atour de l adénine. Par un court texte, expliquer comment le comprimé d adénine modifie l expression des gènes ; justifier. Schématiser l explication cellulaire de la coloration blanche (ou rose) sous la gélose.
CARACTERISTIQUES DE LA SOUCHE DE LEVURE Les levures sauvages (= non mutées) fabriquent l adénine grâce à une chaine d enzymes qui transforment un précurseur (P) en composés intermédiaires puis en adénine. L A.I.R. est un de ces intermédiaires. CHAINE DE SYNTHESE TRES SIMPLIFIEE DE LA LEVURE ADE (non mutée) G1 Cytoplasme de la levure G2 Noyau de la levure E1 E2 R... A.I.R Adénine Remarque : La chaine de biosynthèse comprend 12 gènes s exprimant en 12 enzymes transformant le précurseur en AMP (Adénosine mono phosphate) composé nucléotidique utilisé pour le nucléotide Adénine. P = précurseur = Phosphoribosylpyrophosphate A.I.R. = intermédiaire = Amino-Iminidazole-Robotide
Dans la levure mutée ADE2-, le gène 2 est modifié et s exprime avec un enzyme E2 non fonctionnel. En conséquence, le composé A.I.R. n est pas transformé et s accumule dans le cytoplasme. CHAINE DE SYNTHESE MODIFIEE DANS LA LEVURE ADE2- L allèle ADE2- s exprime mais l enzyme E2 ne fonctionne pas : l A.I.R. n est pas transformé en adénine. Il s accumule dans le cytoplasme. G1 G2 La couleur rouge d une colonie révèle la présence d A.I.R. oxygénée et la mutation des levures. E1 E2 P... A.I.R adénine En présence d O2, l A.I.R.prend une couleur rouge
INFLUENCE DU MILIEU SUR LES GENES Si le milieu contient un peu d adénine, les levures activent leur synthèse d adénine : les gènes s expriment et les précurseurs sont transformés en intermédiaires puis en adénine. Dans les levures sauvages, le précurseur est transformé en adénine. G1 G2 Dans les levures mutées, le précurseur est transformé en A.I.R qui colore la levure en rouge. G1 G2 E1 P A.I.R E2 Adénine E1 E2 P A.I.R adénine
Si le milieu contient beaucoup d adénine, les gènes ne s expriment pas : l adénine du milieu bloque leur transcription : les enzymes ne sont pas fabriqués : le précurseur n est pas transformé. Dans les levures mutées, le précurseur n est pas transformé en A.I.R : les levures restent blanches. L adénine est directement puisée dans le milieu. Dans les levures sauvages, le précurseur n est pas transformé et l adénine est puisée dans le milieu. ADENINE : Transcription bloquée G1 G2 Pas d enzyme 1 dans le cytoplasme : P non transformé : pas d A.I.R. Parentés entre les êtres vivants : En culture in vitro, une concentration importante d'adénine entraîne la dégénérescence des neurones. Le gène codant pour l'enzyme N 2 de cette chaîne est porté par le chromosome 21. Les trisomiques 21 portent donc 3 copies de ce gène. La synthèse de l'adénine est mal régulée chez ces personnes.
CONDITIONS DE STERILITE Lorsque l'on manipule des micro-organismes, il faut prendre des précautions de 3 sortes : 1. se protéger des conditions de manipulation 2. ne pas contaminer la culture étudiée avec des souches externes 3. ne pas polluer l'environnement avec nos expériences. 1) Se protéger : S attacher les cheveux : NE PAS LES APPROCHER DE LA FLAMME Porter une blouse en coton, la fermer 2) Eviter la contamination de la culture Nettoyer la paillasse à l'eau de javel. ATTENTION AUX VETEMENTS. Se passer les mains à l'alcool, mais en aucun cas cela ne permet de toucher la partie du matériel qui sera en contact avec les levures. Travailler dans un rayon de 30 cm autour de la flamme : le matériel ne doit pas quitter ce rayon. Ne mettre en contact que des matériels stérilisés. Ne pas parler devant des boîtes ouvertes. Eviter les mouvements brusques. 3) Eviter la pollution de l environnement : pot avec javel pour récupérer le matériel usagé.
MATERIEL PAR BINOME 2 boîtes de pétri avec milieu YPG 1 ml de suspension C 1 compte-gouttes stérile 1 étaleur stérile 1 pastille d'adénine 1 scalpel à stériliser 1 pince à stériliser 1 bec bunsen (milieu de culture pour les levures). (contient les levures à ensemencer) (prélèvement de la suspension C). (pour ensemencer les levures de la suspension C). (à déposer sur une des 2 boites de culture). (découpe du carré de gélose). (dépôt de pastille d'adénine). (création de l espace stérile).
PROTOCOLE 1 SEANCE : 1) Couler la gélose dans la boite de péri ; laisser refroidir avant d ajouter les gouttes. 2) Déposer 2 gouttes de la suspension C sur les 2 boîtes de culture, à l'aide d'un compte-gouttes stérile. 3) Répartir la suspension sur la gélose de façon homogène avec l'étaleur stérile. attention à ne pas transpercer la gélose. agir par mouvements délicats de va-et-vient ou circulaires. 4) Laisser sécher les boîtes pendant 10 minutes. 5) Déposer une pastille d'adénine au centre d'une des deux boîtes de milieu, avec une pince stérile 6) Sur l'autre boîte, créer une zone de croissance anaérobiose (sans dioxygène) : Découper un carré de 2 centimètres de coté dans la gélose à l'aide d'un scalpel stérile. Soulever ce carré avec la lame et le ner en le rabattant sur le reste de la gélose. Attention, la lame reste brûlante quelques dizaines de secondes ; la manipuler à froid. 7) Incuber les boîtes 1 semaine à température ambiante, couvercle vers le bas.
RESULTATS à la 2 séance Réaliser l'observation et l'interprétation des résultats. Exemple de résultat obtenu avec pastille d adénine Photo extraite de sordalab Dans cette culture, l adénine diffuse de la pastille et crée un gradient de concentration sur la gélose : on observe alors un diamètre autour de la pastille à l intérieur duquel les levures restent blanches.
Dans le cas de l expérience proposée, un carré de gélose est découpé après ensemencement de la souche puis né pour créer une zone de croissance sans oxygène. Or, le rougissement nécessite de l oxygène. Sous le rabat, les levures ne rougissent quasiment pas, car leur cytoplasme ne contient pas de dioxygène : le composé A.I.R ne se colore pas. Photo extraite du document de Didier Prévost lycée Guy Mollet, Arras, académie de Lille