Cours Module L5-BH-05

Cours Module L5-BH-05 Régulation de l expression des génomes Mercredi de 13h30 à 15h30 & Jeudi de 8h00 à 10h00(sem. 0 à 5/6) S. Bourgerie Université d Orléans UFR Sciences & Centre de Biophysique Moléculaire UPR4301 *

Extrait du livret de l étudiant Code - Libellé SC-L5BH-05 Régulation de l Expression du Génome Nombre de crédits 6 ECTS Coefficient 2 Nom du Responsable Alain LEGRAND Programme Cours : 26h - TD : 14h -TP : 15h Mécanismes généraux de la régulation de la transcription et de la traduction chez les procaryotes. Notions de signaux exogènes et endogènes de la régulation. Etude détaillée de quelques systèmes de régulation chez les procaryotes : approches biologiques, physiologiques, génétiques et moléculaires. Mécanismes de régulation chez les eucaryotes : régulation transcriptionnelle : séquences régulatrices et facteurs de transcription. Complexes d'initiation de la transcription. Structure de la chromatine et expression génique. Régulation post-transcriptionnelle : modifications des ARNm (coiffe, épissage, polyadénylation), durée de vie des ARNm, régulation par les petits ARN. Régulation de l'initiation de la traduction. Régulation post-traductionnelle : modifications et durée de vie des protéines. Contrôle des connaissances 1è session : Cours : Contrôle terminal écrit (2h) + TP : CC 2è session : Cours : Contrôle terminal écrit (2h) + TP : Contrôle Terminal Coefficients de la note finale 1è session : a = 3 ; b = 0 ; c = 1 ; d = 0 2è session : a = 3 ; b = 0 ; c = 1 ; d = 0 Pré-requis Bases fondamentales de la biologie moléculaire Cours magistraux TD TP intervenants Legrand Bourgerie Mollet Normand Bourgerie

Cours magistraux TD TP Nombres d heures Part. 1 : 6 x 2h de S0 à S2 Part. 1 : 3 x 2h S3-S4-S5 3 x 5h de S9 à S12 Part. 2 : 6,5 x 2h Part. 2 : 4 x 2h (13h30 à 18h30) de S3 à S6 S6-S7-S8-S9 Ouvrage recommandé 1- Lewin «Gènes VI»

PLAN GENERAL 1- les stratégies de régulation 2- l opéron lactose 3- l opéron ara 4- l opéron tryptophane 5- les facteurs σ alternatifs 6- les gènes des aminoacyl-arnt synthétases 7- la réponse stringente 8- les gènes codant les protéines ribosomiques l opéron ermc 9- la réponse SOS 10- les riborégulateurs 11- la dégradation des ARNm 12- récapitulatif

PLAN des COURS n 1 & n 2 * 1- Introduction 1.1 pourquoi y-a-t-il régulation? 1.2 niveaux de régulation 1.3 quelques définitions 1.4 notion d opéron 2- Régulation de la transcription 2.1 stratégies de contrôle de l initiation de la transcription 2.2 contrôles positif-négatif 2.3 rappels sur l initiation de la transcription chez les procaryotes 3- Opéron lactose 3.1 organisation générale 3.2 phénomène d induction - inducteur 3.3 lacz - lacy - laca 3.4 mutants de l opéron 3.5 régulations 3.5.1 négative (répresseur) 3.5.1.1 expérience Pajamo 3.5.1.2 rôle du répresseur 3.5.1.3 structure du répresseur 3.5.1.4 opérateur 3.5.2 positive : répression catabolique 3.5.2.1 diauxie 3.5.2.2 AMPc 3.5.2.3 scénarios 3.5.2.4 structure-fonction CRP 3.5.2.5 opérateurs 3.6 récapitulatif

Introduction Pourquoi y-a-t-il régulation de l expression des gènes? Pour répondre aux conditions changeantes de l environnement immédiat Sept mécanismes susceptibles de modifier la concentration à l équilibre d une protéine ; Sites possibles de régulation : 1- synthèse du transcrit primaire 2- maturation post-transcriptionnelle de l ARNm 3- dégradation de l ARNm 4- synthèse protéique 5- modifications post-traductionnelles 6- ciblage et transport des protéines 7- dégradation des protéines *

1 2 3 4 5 6 7 *

Principalement, 3 niveaux de régulation de l expression des gènes chez les procaryotes : 1- transcription : phase d initiation (le plus souvent) ; phase de terminaison 2- maturation : stabilité du transcrit; 3- traduction : en général aux étapes d initiation et de terminaison

Quelques définitions Les séquences codant des produits agissant en trans Les séquences agissant en cis Un locus agit en cis sur un autre locus s il est sur la même molécule d ADN ; L opérateur est un élément d activation en cis car il fonctionne uniquement s il est fixé sur le gène dont il contrôle l expression. Un locus agit en trans s il peut contrôler un autre locus, même à partir d une molécule d ADN différente. Le gène du répresseur du lactose (laci) agit en trans car il peut réguler l expression de l opéron lactose même s il est enlevé du génome d E. coli et placé sur un plasmide. élément régulateur en cis : site pour une protéine de liaison à l ADN, situé en amont du gène régulé. élément agissant en trans : protéine elle-même, qui diffuse dans la cellule depuis son site de synthèse jusqu à son site de liaison sur l ADN. * 9

Quelques définitions (2) Gène structural gène qui code une protéine (ou un ARN) Gène régulateur gène structural qui code une protéine impliquée dans la régulation de l expression d autres gènes. *

Quelques définitions (3) OPERON Gènes structuraux organisés en groupes contenant des gènes codant des protéines dont les fonctions sont apparentées (gènes co-transcrits pour former une molécule d ARN polycistronique) À côté de ces gènes, on retrouve : - des séquences adjacentes requises pour la transcription (promoteurs, opérateurs) - des séquences impliquées dans la régulation. Exemple : Les gènes des enzymes successives d une voie métabolique *

Quelques définitions (4) REGULON réseau d opérons fonctionnant avec un régulateur commun Exemples de régulons : opérons codant pour les enzymes du métabolisme glucidique; le système des gènes de choc thermique qui répondent au changement de température; les gènes qui sont induits (chez E. coli) en réponse à des agents endommageant l ADN (appartenant à la réponse SOS).

Qu est-ce-que la REGULATION? Deux classes de mécanismes de régulation : 1- mécanismes opportunistes : 2- mécanismes généraux : Deux modes de régulation de l expression d un gène cible par une molécule régulatrice : 1- d une façon positive c est à dire que l interaction déclenche la transcription du gène 2- d une façon négative : l interaction empêche la transcription du gène

il existe deux modes principaux de terminaison. * Quelques rappels sur l initiation de la transcription chez les procaryotes «Idées fortes» l ARN polymérase copie en ARN un brin du duplex d ADN une unité de transcription est une séquence d ADN transcrite en un ARN unique, qui débute au niveau du promoteur et se termine au terminateur la transcription a lieu dans une «bulle», à l intérieur de laquelle l ARN est synthétisé par appariement des bases avec un brin d ADN de la région transitoirement déroulée au fur et à mesure de la progression de la bulle, le duplex d ADN se reforme après son passage. l ARN polymérase catalyse la formation d une liaison phosphodiester qui résulte d une attaque du groupement 3 -OH du dernier nucléotide de la chaîne sur le groupement 5-triphosphate du nucléotide entrant, ce qui s accompagne d une libération de pyrophosphate la transcription comprend 4 étapes qui impliquent différents types d interactions entre l ARN polymérase et l ADN : 1- reconnaissance de la matrice 2- initiation 3- élongation 4- terminaison le facteur σ contrôle la liaison à l ADN de l ARN polymérase. la reconnaissance du promoteur dépend de séquences consensus.

Promoteurs bactériens : organisation ARN polymérase β 155613 β 150618 σ 70263 α 36512 ω 10105 Schematic representation of the major form of E. coli RNA polymerase bound to DNA. *

* ARN polymérase : organisation - structure

Transcription chez les procaryotes * Initiation Elongation Terminaison

fixation de σ au cœur de l enzyme reconnaissance du promoteur (de Mooney et al. 1998)

1. Un organisme unicellulaire, avec un temps de génération très court, doit pouvoir répondre rapidement à des changements de son environnement. 2. Les demi-vies de la plupart des ARNm sont courtes (de l ordre de quelques minutes). 3. La transcription et la traduction sont couplées et se réalisent dans le même compartiment cellulaire. Ces constatations impliquent que la régulation génique doit prendre effet tôt, et il est effectivement constaté que le point de contrôle majeur est l initiation de la transcription.

Stratégies de contrôle de l initiation de la transcription (chez les bactéries) 2 modes distincts de contrôle de l initiation de la transcription 1- un contrôle constitutif qui dépend de la structure du promoteur 2- un contrôle de régulation qui est sous la dépendance de protéines régulatrices CONTRÔLE CONSTITUTIF niveau de base de l initiation de la transcription déterminé par la structure du promoteur. variabilité dans la séquence consensus du promoteur : modification de l efficacité du promoteur

Comment la séquence du promoteur affecte l initiation? 3 hypothèses : 1- de la séquence de la boîte -35 dépend la reconnaissance par la sous-unité σ et donc le taux de fixation de l ARN polymérase 2- la transition du promoteur fermé au promoteur ouvert dépend de la boîte à -10 3- la fréquence des initiations avortées (c est à dire celles qui se terminent de manière prématurée) pourrait dépendre de la séquence au niveau du nucléotide +1 ou immédiatement en aval. Conséquences de ces variations de séquences Promoteurs FORTS FAIBLES : les plus efficaces induisent 1000 fois plus d initiation productives que les plus faibles TAUX de BASE : pour un gène donné niveau de transcription pré-programmé par la séquence de son promoteur

Autres types de régulation de l initiation de la transcription CONTRÔLE de REGULATION Principe de base de la régulation de la transcription : (déduit de l étude de l opéron lactose) La liaison d une protéine spécifique à un site donné de l ADN influence l ensemble des évènements composant l assemblage du complexe d initiation et\ou l initiation d une synthèse productive d ARN par l ARN polymérase.

INDUCTION LORSQUE LE CONTRÔLE DE LA TRANSCRIPTION EST NEGATIF : Répresseur : protéine qui empêche l expression d un gène. Opérateur : site cible de la protéine répresseur. Lorsque la protéine répresseur se fixe à l opérateur, l ARN polymérase ne peut plus initier la transcription ce qui empêche l expression n du gène. En vert : gène régulateur En bleu : gène structural Cas du répresseur lac avec l IPTG p.e. répresseur inducteur répresseur inactif * REPRIME INDUIT

CONTRÔLE NEGATIF DE LA TRANSCRIPTION REPRESSION répresseur actif Répresseur inactif corépresseur INDUIT REPRIME *

LORSQUE LE CONTRÔLE DE LA TRANSCRIPTION EST POSITIF : Un facteur de transcription doit assister l ARN polymérase pour l initiation au niveau du promoteur. INDUCTION activateur inactif inducteur activateur actif REPRIME INDUIT * Cas de la CRP associée au l AMPc

CONTRÔLE POSITIF DE LA TRANSCRIPTION REPRESSION activateur actif corépresseur activateur inactif INDUIT REPRIME *

En résumé Contrôle négatif : le répresseur inactive la transcription Contrôle positif : l'activateur active la transcription Opéron inductible : avec inducteur : activation de la transcription Opéron répressible : avec corépresseur : inhibition de la transcription Exemples de régulateurs positifs : métabolisme de l arabinose AraC métabolisme du maltose MalT métabolismes carbonés (opérons gal, lac ) CRP Exemples de régulateurs négatifs : AraC GalR

L opéron lactose (chez E. coli) un exemple d opéron inductible négativement régulé lactose : disaccharide pouvant être utilisé comme source de carbone unique pour la croissance d E. coli.

L opéron lac : organisation 1040 pb 3510 pb 780 pb 825 pb 3 gènes structuraux: z, y & a - codant pour les enzymes impliquées dans le métabolisme du lactose - sont exprimés continuellement à faible taux - sont induits environ 1000 fois quand le lactose est présent - sont modulés par le taux de glucose du milieu laci : un gène adjacent n appartenant pas à l opéron, codant pour le répresseur lac *

Opéron lactose : quelques détails d organisation fonction répresseur β-galactosidase perméase transacétylase polypep tide 360 38000 1021 116000 260 30000 275 30000 aa D a protéine Tétramère 152000 Tétramère 500000 Protéine membranaire 30000 Dimère 60000 D a

Prix Nobel de Physiologie & Médecine, 1965 (avec André Lwoff) Expériences de Jacob et Monod : élucidation du fonctionnement de l opéron lac (1 er article : 1960) François Jacob et Jacques Monod ont pu déduire l organisation et le fonctionnement de l opéron lactose en étudiant une série de mutations affectant la synthèse de la β-galactosidase et de la lactose perméase. Les mutations étaient introduites soit dans le chromosome bactérien, soit sur un facteur F plasmidien reproduisant l opéron. Les gènes de structure lac sont contigus sur le chromosome d E. coli. Ces gènes sont associés à des éléments de contrôle. Jacques Monod

Lactose Glucose Lactose Glucose Glucose-6P glycolyse Galactose Galactose-1P Glucose-1P Croissance d E. coli sur un mélange de glucose et lactose *

Les enzymes du métabolisme du lactose sont inductibles Cinétique d induction de l activité β-galactosidase chez E. coli (d après Cohn, M. J. Bacteriol. (1957) 21, 156) *

Les inducteurs de l opéron lac OH OH Lactose, (substrate de l opéron), converti en son isomère (par transglycosylation), l allolactose. Allolactose, inducteur naturel (ou inducteur physiologique, isomère du lactose). inducteur gratuit : induit l opéron mais pas métabolisé. Par exemple : isopropylthiogalactoside (IPTG) OH OH OH O O O HO OH O HO OH OH HO OH O O lactose HO HO OH OH OH O allolactose OH CH 3 HO OH S C H CH 3 IPTG ou isopropylthiogalactoside *

lacz code l enzyme β-galactosidase dont la forme active est un tétramère d environ 500kDa Réaction catalysée : coupe les β-galactosides et libère les sucres qui les constituent Exemple : le lactose est hydrolysé en glucose et galactose Equation de la réaction catalysée par la β-galactosidase *

organisation de l opéron lac lacy code la β-galactoside perméase, une protéine de 30kDa liée à la membrane (protéine transmembranaire); elle transporte les β-galactosides dans la cellule La lactose perméase : - utilise le gradient de protons à travers la membrane de la cellule bactérienne pour co-transporter H + et le lactose (le gradient de protons résulte du métabolisme oxydatif) - présente 2 états conformationnels principaux : E-1 : caractérisé par un site de liaison de faible affinité pour le lactose, orienté vers l intérieur de la cellule E-2 : caractérisé par un site de liaison à haute affinité pour le lactose, orienté vers l extérieur de la cellule.

organisation de l opéron lac Structure de la β-galactoside perméase protéine monomérique enchassée dans la membrane (12 hélices α transmembranaires) Abramson J, Smirnova I, Kasho V, Verner G, Kaback HR, Iwata S. Science. 2003 301(5633):610-5 Structure and mechanism of the lactose permease of Escherichia coli.

Ext. CYCLE de TRANSPORT Membrane Int. lactose H+ E2 E1 H + + lactose E2-H + -lactose E1-H + -lactose *

organisation de l opéron lac laca code la β-galactoside transacétylase, une enzyme qui transfère un groupement acétyle de l acétyl-coa aux β-galactosides (comme l IPTG). Le métabolisme du lactose ne nécessitant pas de thiogalactoside transacétylase, le rôle physiologique de cette enzyme demeure inconnu.

Les mutants de l opéron lac Analyse génétique de l opéron Quels sont les éléments essentiels du système de régulation?

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Le répresseur ACTIF ne peut se fixer à l opérateur mutant O c laci promoteur/opérateur Opérateur MUTANT O c lacz lacy laca L opéron est transcrit puis traduit

Le gène laci- commande la synthèse d un répresseur défectueux qui ne se fixe pas à l ADN. laci - promoteur/opérateur lacz lacy laca L opéron est transcrit puis traduit

Utilisation de diploïdes partiels

Conjugaison : transfert de matériel génétique (2) F-pilus (1) (3)

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Le gène laci- conduit à la synthèse d un répresseur qui ne se fixe pas à l ADN. laci - laci + promoteur/opérateur lacz lacy laca Le gène laci+ conduit à la synthèse d un répresseur de type sauvage qui se fixe à l opérateur L inducteur déplace le répresseur de type sauvage de l opérateur

Le gène laci s conduit à la synthèse d un répresseur qui ne peut fixer l inducteur; il est donc fixer en permanence à l opérateur laci s lacz lacy laca promoteur/opérateur laci + Le répresseur de type sauvage n influence pas la liaison à l ADN du répresseur laci s Les mutations non inductibles laci s sont dominantes

mutations O c Les mutations de l opérateur sont constitutives, car le promoteur est incapable de fixer la protéine répresseur; Ceci permet à l ARN polymérase d avoir libre accès au promoteur. Les mutations O c agissent en cis, car elles ne touchent que les gènes structuraux qui leur sont contigus. mutations du type laci - Les mutations qui inactivent le gène laci entraînent l expression constitutive de l opéron, car la protéine du répresseur mutant ne peut plus se fixer sur l opérateur. Les mutations constitutives du gène laci sont récessives. Les mutations non inductibles laci S sont dominantes. *