JOURNEE «SANTE- ENVIRONNEMENT/SANTE» LILLE 30 NOVEMBRE 2010 IRENI Axe 2 : Impacts Sanitaires Action 3 : Écotoxicologie Les mycorhizes : agents de réhabilitation durable des sols contaminés par les HAP? Anissa Lounès-Hadj Sahraoui Maître de Conférences-HDR Unité de Chimie Environnementale et Interactions sur le vivant (UCEIV) Université du Littoral Côte d Opale CALAIS
INTRODUCTION
Evolution du nombre de sites pollués recensés en France Introduction 4845 pollués 5000 4000 3047 3548 3782 3905 4031 Nombre de sites 3000 2000 1000 107 200 553 669 894 0 1985 1989 1992 1994 1996 2001 2002 2004 2006 2007 2008 www.basol.environnement.gouv.fr
16% Introduction Répartition des sites pollués en France 14% 12% 10% 8% 6% 4% 2% 0% www.basol.environnement.gouv.fr
Introduction Schéma conceptuel général d exposition humaine à un sol pollué (Ineris, 2001)
Types de polluants rencontrés sur les sites pollués Introduction totaux www.basol.environnement.gouv.fr
Introduction Les Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP) H 2 C C H 2 H 2 C naphtalène acénaphtène acénaphtylène fluorène Polluants Organiques Persistants (POPs) Origine principalement anthropique phénanthrène anthracène fluoranthène formées d au moins 2 cycles benzéniques pyrène benzo(a)anthracène chrysène récalcitrants à la biodégradation benzo(a)pyrène benzo(b)fluoranthène benzo(k)fluoranthène Toxiques : mutagènes et/ou cancérigènes Homme Toxicité Environnement dibenzo(ah)anthracène indéno(1,2,3-cd)pyrène benzo(ghi)pérylène
Méthodes de dépollution des sols contaminés par les HAP Physico-chimiques Biologiques Introduction Adaptées aux polluants organiques Ecologiques Economiques
Agents de la bio-dépollution Introduction Bactéries Champignons Algues Plantes
Agents de la bio-dépollution Introduction Bactéries Champignons Algues Plantes
Avantages des champignons Introduction Propagation rapide et en profondeur dans les sols Enzymes à large spectre d action
Agents de la bio-dépollution Introduction Bactéries Champignons Algues Saprophytes Mycorhiziens Mycorhize Plantes Association symbiotique
Introduction Rappel : Structure des champignons endomycorhiziens Champignon extraracinaire Champignon intraracinaire
Introduction Phytoremédiation Méthode utilisant la capacité naturelle des plantes à contenir, biodégrader ou minéraliser les polluants Volatilisation Accumulation Ecologique Economique Facile à mettre en œuvre Stabilisation Dégradation Bonne acceptation par l opinion publique
Intérêt des mycorhizes à arbuscules Introduction Bénéfices pour le champignon Bénéfices pour la plante Meilleure nutrition hydrique et minérale Substances carbonées Eau Minéraux Meilleure résistance aux stress biotiques abiotiques Salinité Sècheresse Froid Pollution
Sècheresse Introduction Espèces Réactives de l Oxygène (ERO) Ozone Choc thermique Pesticides Sénescence Pathogènes Métaux lourds ERO Peroxyde d Hydrogène : H 2 O 2 Radical Hydroxyle : OH Radical Superoxyde : O - 2 Stress Oxydant Parent et al, 2008
Introduction Plante en absence de stress environnemental ERO Antioxydants Equilibre entre production et élimination d ERO
Introduction Plante en présence de stress environnemental Stress Environnemental ERO Antioxydants Surproduction d ERO Déséquilibre entre production et élimination d ERO
Dommages oxydatifs des biomolécules Introduction Lipides Acides Nucléiques Protéines
Systèmes enzymatiques et non enzymatiques de détoxification des ERO chez les plantes Noyau SOD, POD, AA, GSH Cytosol SOD, POD, CAT, AA, GSH Peroxysome POD Paroi Vacuole POD Apoplaste Chloroplaste Mitochondrie Membrane SOD, POD, AA, GSH SOD, POD, AA, GSH, Caroténoïdes SOD, POD, AA, GSH α-tocophérol
OBJECTIFS
Les mycorhizes à arbuscules : Agents de réhabilitation durable des sols contaminés par les HAP? Objectifs 1. Effet des HAP sur les deux partenaires la symbiose mycorhizienne? 2. Rôle de la mycorhization dans la tolérance à la toxicité des HAP? 3. Rôle des mycorhizes à arbuscules dans la dissipation des HAP?
DEMARCHE EXPERIMENTALE
Matériel biologique Matériel biologique: Cultures in vitro + = Racines transformées par Agrobacterium rhizogenes cultivées in vitro Colonisées par un champignon mycorhizien à arbuscules : Glomus irregulare Racine mycorhizée Intérêts : Obtention de matériel biologique dans des conditions contrôlées Sans limitation de quantité Pas d organismes contaminants ou telluriques
Matériel chimique Critères de choix des deux HAP testés Fréquemment rencontrés dans les sites et sols pollués Figurant dans la liste des HAP prioritaires de l EPA + HAP prioritaires PM (g/mol) Solubilité µg/l Toxicité Biodégradatio on ANTHRACÈNE Léger Lourd - - - - + _ BENZO[a]PYRÈNE
Démarche expérimentale Démarche expérimentale Racines de chicorée colonisées ou non Cultivées en absence (Témoin) et en présence Anthracène Benzo[a]pyrène 0 35 70 140 280 µm n=5 Incubation : 9 semaines Altérations Morphologiques Altérations cellulaires Dissipation Des HAP
Altérations morphologiques Effet des HAPs sur le développement de la racine et du champignon Biomasse racinaire Champignon extraracinaire Longueur hyphale Taux de sporulation Champignon intraracinaire Taux de Mycorhization
Altérations cellulaires Démarche expérimentale Peroxydation lipidique Dosage du malondialdéhyde (MDA) HPLC-UV Adduits oxydatifs à l ADN Dosage de la 8-Hydroxy-2 - desoxy-guanosine (8-OHdG) ELISA Enzymes Antioxydante Dosage de la Superoxyde dismutase (SOD) Spectrophotomètre Evaluation du stress oxydant
Dissipation des HAP Démarche expérimentale HAP Résiduel dans le milieu de culture HAP accumulé dans les racines Extraction Extraction au Soxhlet HPLC HPLC
QUELQUES RESULTATS
Principaux résultats: altérations morphologiques Impact des HAP sur le développement fongique (CMA) et racinaire
Principaux résultats: altérations morphologiques Effet des HAP sur la germination des spores du CMA Inhibition (25%) de la germination en présence d anthracène Control Mode de germination modifié en présence d anthracène
Principaux résultats: altérations morphologiques Effet des HAP sur le développement du CMA Colonisation hyphale Colonisation vésiculaire Hyphes extraracinaires Formation des spores
Principaux résultats: altérations morphologiques Bilan: Impact des HAP sur le développement de G. irregulare Racine Champignon Capacité de G. irregulare à accomplir un cycle de développement complet in vitro en présence d HAP A. Verdin et al., (2006) Mycorrhiza 16:397-405
Principaux résultats: altérations morphologiques Effet des HAP sue la croissance racinaire Effet négatif des HAP sur la croissance racinaire Effet négatif moins prononcé sur la croissance des racines mycorhizées
Principaux résultats: altérations cellulaires Altérations cellulaires induites par les HAP sur la symbiose mycorhizienne : G. irregulare/racines de chicorée
Principaux résultats: altérations cellulaires Induction du stress oxydant par les HAP (En collaboration de l UCEIV-Toxicologie, Pr P. Shirali) Peroxydation lipidique Altération de l ADN Enzyme antioxydante Malondialdéhyde 8-Hydroxy-2 -desoxy-guanosine Superoxyde dismutase Augmentation en présence d HAP Augmentation moins importante dans les RC Induction dans les RC D. Debiane et al., (2009) Phytochemistry 70 : 1421-1427
Principaux résultats: altérations cellulaires Bilan : Stress Oxydant HAP Induction d un stress oxydant Atténuation du stress oxydant par la mycorhization Effet protecteur de la symbiose mycorhizienne contre la toxicité des HAP
Principaux résultats: dissipation des HAP Dissipation des HAP par la mycorhize à arbuscules G. irregulare/racines de chicorée
Principaux résultats: dissipation des HAP Dissipation des HAP du milieu de culture Ex : l anthracène Dissipation de l anthracène du milieu de culture = 50% quantité initiale
Principaux résultats: dissipation des HAP Accumulation de l anthracène dans les globules lipidiques des racines et des structures fongiques 30 µm 60 µm 25 µm 25 µm A 30 µm A 1 B 1 C 1 60 µm 25 µm 25 µm B 30 µm A 2 B 2 C 2 C Coloration au Soudan III
Principaux résultats: dissipation des HAP Bilan : Dissipation de l anthracène par les mycorhizes à arbuscules Racines non colonisées (RNC) Racines colonisées (RC) 10% 24% 36% 54% 29% 47% Residual anthracene Bioaccumulation Biodegradation Residual antharcene Bioaccumulation Biodegradation Amélioration de la biodégradation de l anthracène par la mycorhization en absence de la flore tellurique A. Verdin et al., (2006) Mycorrhiza 16:397-405
Principaux résultats: dissipation des HAP Rappel : Dissipation des HAP par les mycorhizes in situ (Leyval et al., 1998, 2002) Mycorhization 2 Dissipation des HAP + Dissipation des HAP + +
CONCLUSIONS
HAP / Mycorhizes à Arbuscules / Dépollution Développement racinaire et fongique Conclusions racines mycorhization sporulation Hyphes extraracinaires Mycorhization 1. Meilleure tolérance des racines à la toxicité des HAP Mécanismes impliqués? MDA : protection des membranes 8-OHdG : protection de l ADN SOD : système antioxydant 2. Amélioration de la dissipation/biodégradation des HAP Outil potentiel de dépollution des sols contaminés par les HAP
PERSPECTIVES
Perspectives Etude du prélèvement et du transfert des HAP du milieu de culture vers la partie aérienne HAP dans le milieu Racines colonisées ou non feuilles Mesure des HAP contenus dans chacun des compartiments
Perspectives Perspectives Appliquées Utilisation des plantes endomycorhizées «in situ» pour la dépollution des sols contaminés par les HAP Développement d un test d écotoxicité basé sur G. irregulare comme bioindicateur de toxicité des sols contaminés par les HAP Paramètres de mycorhization Marqueurs biologiques de peroxydation lipidique
MERCI