U.F.R. des Sciences et Techniques

1 Année 2002 Université de Cergy-Pontoise U.F.R. des Sciences et Techniques Ecole doctorale des Sciences et Ingiénerie N d Ordre _ _ _ _ _ _ Thèse pour obtenir le grade de Docteur de l Université de Cergy-Pontoise Discipline : biochimie cellulaire présentée et soutenue publiquement par Laurent POULOUIN le 11 octobre 2002 Caractérisation de la fibronectine du plasma sanguin humain et de son fragment de 60kDa : purification, stabilité et analyse qualitative des glycosylations. Directeur de thèse : Pr. Jean-Marie Imhoff Jury M. Gaston Godeau, Université Paris V René Descartes, Rapporteur, M. William Hornebeck, Université de Reims, Rapporteur, Mme Halima Darbeïda, Université de Cergy-Pontoise, M. Jacques Chabbat, Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies, Les Ulis, M. Olivier Gallet, Université de Cergy-Pontoise, M. Jean-Marie Imhoff, Université de Cergy-Pontoise.

2 Les travaux présentés dans ce mémoire ont été réalisés au sein des Equipes de Recherche sur les Relations Matrice Extracellulaire-Cellule de l Université de Cergy-Pontoise. Ils font suite aux travaux de recherche menés dans le même laboratoire lors de la préparation de mon Diplôme d Etudes Approfondies Endocrinologie et Interactions Cellulaires dispensé par la faculté de Médecine du Kremlin-Bicêtre (Université de Paris-Sud / Orsay). Je souhaite remercier vivement Monsieur le Professeur Jean-Marie Imhoff pour la confiance qu il a témoigné à mon égard depuis le début de mes études universitaires. Sa sagesse et ses qualités humaines ont toujours représenté pour moi des idéaux à atteindre. Je suis très reconnaissant et remercie Monsieur Gaston Godeau, Professeur de l Université de Paris V René Descartes, et Monsieur William Hornebeck, Directeur de Recherche CNRS à l Université de Reims, qui ont accepté d être mes rapporteurs. Je souhaite remercier Monsieur Jacques Chabbat du Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies. Ces travaux n auraient jamais pu être réalisés sans le concours de ses services. Je le remercie d avoir accepté de faire partei de ce jury. Je remercie Madame le Professeur Halima Darbeïda pour les précieux conseils qu elle m a donné tout au long de mes travaux. Je souhaite remercier Madame Marie-France Breton et Monsieur Xavier Blondeau, qui m ont accompagné tout au long de mes travaux et qui m ont donné l opportunité d enseigner. L enseignement est ce qui m a fait rentrer à l université de Sciences en lieu et place de la faculté de médecine. A titre personnel, je ne saurais dissocier les activités de recherche de l enseignement universitaire. Je souhaite remercier tout particulièrement Madame Françoise Discala pour son aide et son soutien précieux. Je voudrais remercier Catherine Le Cœur avec qui j ai partagé les problèmatiques de purification de la fibronectine et pour l amitié qu elle a témoigné à mon égard. Qu elle soit persuadée de la mienne. Je tiens à exprimer toute ma gratitude à Madame le Docteur Jeanne Grosclaude et à Madame Suzanne Labiau du Laboratoire de Virologie et Immunologies Moléculaires de l Institut National de Recherche Agronomique de Jouy-en-Josas pour leur accueil, leur soutien tout le long de mes travaux et leurs aides précieuses lors de la préparations des sera poly et monoclonaux. Je remercie Franck Carreiras et Emmanuel Pauthe pour les analyses physiologiques et physicochimiques qu ils ont acceptés volontiers de faire. Je ne saurais oublier mes compagnons de paillasse : Hélène Boetti, Julie Huet et Hugues Berry, et l ensemble des équipes du laboratoire et du département de biologie de l université. Je tiens à remercier ma hiérarchie et mes collégues du centre de recherche de France Télécom pour leurs précieux encouragements lors de la rédaction de mon manuscrit. Enfin, je remercie Monsieur Olivier Gallet. L amitié que j ai pour lui n est ignorée de personne. Il a su m accompagner et m encourager depuis le début. Je reste persuadé que je n aurai jamais terminé, voire commencé, ces travaux sans lui. Qu il reçoive mon infinie reconnaissance.

3 «L'important dans la recherche, c'est l'imprévisible» François Jacob. In memoriam Mélanie-Jeanne, A mes parents, A Eowald et à Sylvie, Avec tout mon amour.

4 Résumé Caractérisation de la fibronectine du plasma sanguin humain et de son fragment de 60kDa : purification, stabilité et analyse qualitative des glycosylations. La combinaison de trois étapes de chromatographie d affinité sur gélatine et sur héparine permet de purifier d importantes quantités de fibronectine à partir de cryoprécipité de plasma sanguin humain ou de plasma citraté. Les rendements obtenus sont de 7.00 +/- 0.77 milligrammes de fibronectine par gramme de cryoprécipité et de 0.16 milligramme de fibronectine par millilitre de plasma. En optimisant les conditions d élution, nous obtenons des fractions homogènes sur gels SDS-PAGE. L utilisation de sera polyclonaux en immunorévélation montre que notre fraction est homogène et qu elle n est contaminée ni par le fibrinogène ni par le facteur von Willebrand. Aucune activité protéolytique ne peut être détectée par zymographie sur gélatine ou après incubation jusqu à 456 heures à 37 C en présence de calcium, de zinc et de mercure. Les caractéristiques physicochimiques et physiologiques de la fibronectine purifiée par notre protocole en trois étapes, appelée highly purified fibronectin (hpfn), sont identiques aux préparations issues d autres protocoles. Nous pouvons purifier, avec une grande pureté, un fragment de 60kDa (F60) comportant les domaines de liaison aux collagènes (CBD) après hydrolyse de la fibronectine par la trypsine. Les cartographies qualitatives des glycosylations de la fibronectine et du fragment ont été réalisées grâce à des lectines végétales. Ces travaux permettent de proposer de nouvelles méthodes de purification ou d analyse des interactions entre la protéine et ses ligands. Les résultats obtenus par cette caractérisation et nos protocoles de purification permettent d envisager l étude des interactions cellulaires et moléculaires faisant intervenir la fibronectine et ses fragments. Nous proposons d ores et déjà un protocole original d étude des interactions entre la fibronectine et le collagène de type I basé sur l utilisation des lectines végétales.

5 SOMMAIRE 1 INTRODUCTION... 14 2 HISTORIQUE... 16 2.1 STRUCTURE ET PROPRIETES DE LA FIBRONECTINE... 16 2.1.1 De la Cold-insoluble-Globulin à la fibronectine... 16 2.1.2 La molécule de fibronectine... 17 2.1.3 Caractéristiques physico-chimiques... 23 2.1.4 Modifications post-traductionnelles de la fibronectine... 24 2.1.5 La fibrillogenèse... 25 2.1.6 La Fibronectine et ses ligands... 27 2.1.7 La Fibronectine et ses fragments... 30 2.2 INTERACTIONS ENTRE LA FIBRONECTINE ET LES RECEPTEURS CELLULAIRES... 31 2.2.1 Les intégrines... 31 2.2.2 Autres récepteurs... 34 2.2.3 Mécanismes de transduction... 35 2.3 RELATIONS ENTRE LA MATRICE ET L ORGANISME... 36 2.3.1 Influence de la cellule sur la matrice... 36 2.3.2 Influences sur la physiologie humaine... 39 3 MATERIELS ET METHODES... 45 3.1 MATERIELS... 45 3.1.1 Produits sanguins... 45 3.1.2 Réactifs... 45 3.1.3 Chaînes de chromatographie... 45 3.1.4 Résines de chromatographie... 46 3.1.5 Protéines et enzymes... 46 3.1.6 Dialyse... 46 3.1.7 Tampons... 46 3.2 METHODES... 49 3.2.1 Purification de protéines... 49 3.2.2 Méthodes analytiques... 62

6 4 RESULTATS ET DISCUSSION.... 73 4.1 PURIFICATION DE LA FIBRONECTINE... 73 4.1.1 Chromatographie d affinité à la gélatine... 73 4.1.2 Chromatographie d affinité à l héparine... 78 4.1.3 Rendements... 84 4.1.4 Critères de purification et contrôles... 85 4.2 PURIFICATION DES DERIVES DE FIBRONECTINE PRESENTANT LE SITE D AFFINITE A LA GELATINE... 92 4.2.1 Hydrolyse de la fibronectine... 92 4.2.2 Chromatographie d affinité à la gélatine... 92 4.2.3 Chromatographie d affinité à l héparine en perfusion... 95 4.2.4 Chromatographie échangeuse d anions en perfusion... 97 4.2.5 Rendements... 98 4.2.6 Critères de purification... 99 4.3 CARACTERISATIONS DES GLYCOSYLATIONS ET APPLICATIONS... 103 4.3.1 Analyse des glycosylations... 103 4.3.2 Mise en application... 113 5 CONCLUSION... 117 6 BIBLIOGRAPHIE... 121

7 TABLE DES FIGURES Figure 1 : Régulation de l expression du gène codant pour la fibronectine... 18 Figure 2 : Représentation des formes épissées de la fibronectine... 19 Figure 3 : Observation de la fibronectine... 20 Figure 4 : Représentation des domaines composant le monomère de fibronectine... 21 Figure 5 : Modèles tridimensionnels déterminés par résonance magnétique nucléaire des domaines de la fibronectine... 22 Figure 6 : Structures potentielles des chaînes de glycosylation de la fibronectine du plasma sanguin humain... 25 Figure 7 : Affinités entre les différents domaines de la fibronectine... 26 Figure 8 : Domaines d affinités de la fibronectine pour ses ligands... 27 Figure 9 : Domaines d affinités de la fibronectine pour la gélatine et les collagènes... 28 Figure 10 : Sites d interactions avec les intégrines portés par la fibronectine... 32 Figure 11 : Structures à trois dimensions des domaines III 7-10 présentant les séquences RGD et PHSRN... 33 Figure 12 : Protocole de purification de la fibronectine en trois étapes... 50 Figure 13 : Protocole de purification de la fibronectine en trois étapes... 52 Figure 14 : Protocole de purification de la fibronectine par le protocole de Le Cœur et al... 54 Figure 15 : Protocole de purification de la fibronectine sur Concanavaline A... 56 Figure 16 : Protocole de purification de F60 et de F160... 58 Figure 17 : schémas de congélation des échantillons avant lyophilisation... 61 Figure 18 : Comparaison SDS-PAGE des fibronectines plasmatiques humaines.... 73 Figure 19 : Elution de la fibronectine sur colonne d affinité à la gélatine... 75 Figure 20 : Purification de la fibronectine par chromatographie d affinité à la gélatine.... 77 Figure 21 : Analyse SDS-PAGE des étapes de purification de la fibronectine.... 79 Figure 22 : Analyse des étapes de purification de la fibronectine par zymographie.... 79 Figure 23 : Localisation des sites d affinité aux glycosaminoglycanes et à la gélatine portés par la fibronectine... 81 Figure 24 : Purification de la fibronectine par chromatographie d affinité à l héparine... 82 Figure 25 : Concentration de la fibronectine par chromatographie d affinité à la gélatine.... 83 Figure 26 : Analyse par SDS-PAGE et par immunorévélation de la stabilité d hpfn... 86 Figure 27 : Analyse SDS-PAGE et par immunorévélations des différentes préparations de fibronectine... 87

8 Figure 28 : Spectrophotométrie UV des préparations de fibronectine... 89 Figure 29 : Spectrofluorométrie des préparations de fibronectine... 90 Figure 30 : Adhésion des cellules IGROV1 sur les préparations de fibronectine et de F60... 91 Figure 31 : Carte d hydrolyse de la fibronectine... 93 Figure 32 : Analyse des profils d hydrolyse de hpfn par la trypsine... 94 Figure 33 : Purification des fragments de fibronectine par chromatographie d affinité à la gélatine.... 94 Figure 34 : Analyse SDS-PAGE des étapes de purification de F60.... 95 Figure 35 : Purification des fragments de fibronectine par chromatographie d affinité à l héparine... 96 Figure 36 : Purification des fragments de fibronectine par chromatographie échangeuse d anions... 97 Figure 37 : Analyse SDS-PAGE des étapes de purification de F60 sur Poros-HQ.... 98 Figure 38 : Analyse par immunorévélation de la stabilité de F60.... 100 Figure 39 : Dosage ELISA de hpfn et de F60 par des sera polyclonaux... 100 Figure 40 : Spectrophotométrie UV de F60.... 102 Figure 41 : Représentation du F60.... 102 Figure 42 : Détection de hpfn fixée sur membrane par les lectines biotinylées... 104 Figure 43 : Reconnaissance des structures polyholosidiques de la fibronectine par les lectines végétales.... 107 Figure 44 : Reconnaissance de préparations de fibronectine plasmatique humaine fixées sur membrane par les lectines biotinylées... 109 Figure 45 : Reconnaissance de hpfn fixée sur membrane de nitrocellulose ou sur plaque de microtitration par les lectines biotinylées... 110 Figure 46 : Reconnaissance de hpfn et de F60 fixés sur membrane par les lectines biotinylées.... 111 Figure 47 : Augmentation de l association des lectines sur F60 après dénaturation.... 112 Figure 48 : Comparaison de la réponse aux lectines biotinylées entre hpfn et Coll-I... 115 Figure 49 : Etude de la dissociation du complexe FN / Coll-I... 116

9 Table I: Différentes dénominations de la fibronectine... 16 Table II : Traduction de l'arnm précurseur de la fibronectine codant pour 2386 aminorésidus... 23 Table III : Distribution des mécanismes de reconnaissances pour les complexes intégrines.. 31 Table IV : Activités protéolytiques cryptiques portées par les fragments de fibronectine... 38 Table V : Caractéristiques des immunoglobulines utilisées... 47 Table VI : Caractéristiques des lectines utilisées... 48 Table VII : protocole de coloration des gels au nitrate d argent par oxydation des protéines au bichromate de potassium... 65 Table VIII : protocole de coloration des gels à l acide périodique, à la base de Schiff et au nitrate d argent... 65 Table IX : Immunorévélation des protéines fixées sur membrane... 69 Table X: Dosages immunologiques... 69 Table XI : Révélation des protéines fixées sur membrane grâce aux lectines marquées à la digoxigénine... 70 Table XII : Révélation des protéines grâce aux lectines biotinylées... 70 Table XIII: Etude des interactions Fibronectine Collagène avec la lectine de Ricinus communis... 72 Table XIV : Pureté, rendements et taux de purification de la fibronectine à partir de cryoprécipité de plasma sanguin humaine.... 85 Table XV : Reconnaissance par les lectines des structures glycosylées de hpfn.... 106 Une annexe «Comparaison des protocoles de purification de la fibronectine» est insérée entre les pages 134 et 135. Un CD-ROM comportant le présent manuscrit et le support de soutenance est attaché à la troisième de couverture.

10 Abréviations Ix IIx IIIx IIIcs αxβy ADN ADP ARNm BA BAEE βmsh C CAM CBD cjun CLHP CPSH CS Ct C1q Da DIG DEAE E.C. EDA EDB EDS EDTA EGF ELISA FAK FBG FBN Fc FN FXIII x ème domaine de type I de la fibronectine x ème domaine de type II de la fibronectine x ème domaine de type III de la fibronectine Segment de liaison des domaines de type III de la fibronectine Intégrine composée des sous-unités αx et βy Acide DéoxyriboNucléique Adénosine Di-Phosphate Acide RiboNucléique messager N-(α)-Benzoyl-L-arginine N-(α)-Benzoyl-L-arginine Ethyl Ester β-mercaptoethanol. Coefficient de maillage des gels de polyacrylamide (rapport bisacrylamide/acrylamide) Molécule d adhérence cellulaire Domaine de liaison aux collagènes de la fibronectine proto-ongogène humain jun Chromatographie liquide à hautes performance Cryoprécipité de plasma sanguin humain Segment de connection de la fibronectine Extrémité carboxy-terminale Protéine 1q du complément Dalton Digoxigenine Di-Ethyl-Amino-Ethyle Référence de la classification des enzymes Extra-Domaine A de type III de la fibronectine Extra-Domaine B de type III de la fibronectine Syndrome d'ehlers-danlos Sel tétrasodique de l acide éthyène diamino-tétracétique Facteur de croissance épithélial Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kinase des foci d adhérence Fibrinogène Fibrine Partie constante des immunoglobulines Fibronectine Transglutaminase plasmatique (Facteur de coagulation XIII)

11 F60 Fragment de fibronectine présentant les domaines I 6 II 1-2 I 7-9 III 1-2 F160 Fragment de fibronectine présentant les domaines I 6 II 1-2 I 7-9 III 1-10 HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid hpfn Fibronectine hautement purifiée HSPG Protéoglycanes à héparanes-sulfates H1 Domaine de la fibronectine présentant la séquence en acides aminés Ile-Asp-Ala ICAM Molécule d adhérence intercellulaire ICAP-1 Protéine associée au domaine cytoplasmique des intégrines-1 IFNγ Interferon γ Ig Immunoglobuline IgA Immunoglobuline de type A IgG Immunoglobuline de type G IgM Immunoglobuline de type M IL Interleukine ILK Kinase liée aux intégrines IRS-1 Premier substrat du récepteur à l insuline MMP Métallo-protéase de la matrice extracellulaire Nt Extrémité amino-terminale p/p Poids/poids PAL Phosphatase alcaline PAGE Gel d électrophorèse de polyacrylamide PECAM Molécule d adhérence cellulaire entre les plaquettes et les cellules endothéliales PI3K Phosphate-Inositol-3 Kinase PMN Neutrophile polymorphonucléaire PMSF Phenylmethylsulfonyl Fluoride PNGase F Glycopeptidase F PNPP Paranitrophenol phosphate RGD Séquence en acide aminés Arg-Gly-Asp RGDS Séquence en acide aminés Arg-Gly-Asp-Ser SDS Dodécyl sulfate de sodium SHx Séquence d homologie à l oncogène du sarcome de Rous de type x SRC Protéine oncogène du sarcome de Rous SU Sous-unité T Concentration totale en polyacrylamide TCA Acide trichloroacétique TGFβ Facteur de croissance tumoral β TEMED N, N, N, N -Tetramethylethylenediamine TLCK N-Tosyl-L-Lysine Chloromethyl Cétone TNFα Facteur de nécrose tumorale α TPCK N-Tosyl-L-Phenylalanine Chloromethyl Cétone Tris Tris(hydroxymethyl)aminoéthane

12 V VCAM v/v vwf Région de variabilité de la fibronectine Molécule d adhérence des cellules vasculaires Volume/volume Facteur von Willebrand

13 Résidus holosidiques Fuc Gal GalNAc Glc GlcA GlcNAc IdoA Man NeuA Fucose Galactose N-acétyl-galactosamine Glucose Acide glucuronique N-acétyl-glucosamine Acide iduronique Mannose Acide neuramidique (acide sialique) Lectines végétales ConA DBA DSA GNA GSL-I LCA MAA PHA-E PHA-L PNA PSA RCA 120 SBA SJA SNA UEA-I WGA swga Agglutinine issue de Canavalia ensiformis Agglutinine issue de Dolichos biflorus Agglutinine issue de Datura stramonium Agglutinine issue de Galanthus nivalis Agglutinine de type I issue de Griffonia simplicifolia Agglutinine issue de Lens culinaris Agglutinine issue de Maackia amurensis Erythroagglutinine issue de Phaseolus vulgaris Leucoagglutinine issue de Phaesolus vulgaris Agglutinine issue de Arachis hypogaea Agglutinine issue de Pisum sativum Agglutinine de 120 kda issue de Ricinus communis Agglutinine issue de Glycine max Agglutinine issue de Sophorica japonica Agglutinine issue de Sambucus nigra Agglutinine issue de type I issue de Ulex europaeus Agglutinine issue de Triticum vulgaris Agglutinine succinylée issue de Triticum vulgaris

14 1 INTRODUCTION Le développement et le fonctionnement de tous les types cellulaires d un individu dépendent des interactions que ces cellules développent avec leur environnement. Les principales molécules indispensables à la régulation du développement et de la différenciation cellulaire sont soit des facteurs de croissance ou de différenciation, soit des hormones, soit des éléments de la matrice extracellulaire. Pendant longtemps, les éléments de la matrice extracellulaire furent considérés comme des agents ayant peu d importance pour la vie cellulaire. La matrice extracellulaire participait alors uniquement à l organisation d un individu, à son intégrité mécanique, aux caractères de rigidité et/ou d élasticité de la peau, des os, des voies vasculaires, des poumons et des autres organes. Des protéines dites d adhérences - comme la fibronectine permettent aux cellules de se fixer sur les éléments des différents tissus conjonctifs. Il apparaît désormais évident que les interactions entre les cellules et les protéines d'adhérence au tissu conjonctif sont à l origine et permettent l'émission de signaux qui affectent la morphologie, l'expression protéique et la survie des cellules. Les propriétés d adhérence de la fibronectine sont dues à différentes séquences aminées distinctes pouvant porter des chaînes de glycosylation. Afin de pouvoir caractériser les interactions entre la fibronectine et ses ligands plasmatiques (la fibronectine est retrouvée dans les plasmas), extracellulaires ou cellulaires, nous avons orienté nos travaux sur l analyse qualitatives et dynamiques de ces glycosylations portées par la glycoprotéine. Dans une première partie, nous décrivons un protocole de purification en trois étapes qui permet d obtenir des préparations de fibronectine pure, stables dans le temps et non dénaturées par la méthode de purification proposée. Cette fibronectine nous permet de purifier un fragment d intérêt de 60kDa présentant le domaine glycosylé de liaison aux collagènes. Le protocole décrit dans une seconde partie permet d obtenir des lots du fragment purs par analyse SDS-PAGE et stables dans le temps. A partir de ces fractions protéiques homogènes, l utilisation de lectines végétales nous permet de réaliser une analyse dynamique par cartographie d accessibilité des structures glycosylées de la fibronectine et du fragment de 60kDa, décrite dans une troisième partie. Nos résultats

15 nous permettent d envisager de nouveaux protocoles de purification de la fibronectine et de ses dérivés. De plus, ces cartographies nous permettent de proposer de nouveaux protocoles d études des interactions entre la fibronectine et ses ligands.

16 2 HISTORIQUE 2.1 Structure et propriétés de la fibronectine 2.1.1 De la Cold-insoluble-Globulin à la fibronectine En 1948, une protéine, dénommée cold insoluble globulin (globuline insoluble à froid) pour sa capacité à précipiter à froid, fût mise en évidence par co-précipitation avec le fibrinogène à partir du plasma sanguin (Morrison et al., 1948 : cf. Table I). Présente dans le plasma sanguin à une concentration élevée (370 mg/l chez l'homme, 285 mg/l chez la femme), elle fût longtemps assimilée à une forme dérivée du fibrinogène (Edsall et al., 1955). Une première purification de la protéine en 1970 dénonça cette hypothèse, la cold insoluble globulin n étant pas reconnue par des anticorps dirigés spécifiquement contre le fibrinogène (Mosseson et al., 1970). Identifiée lors de nouveaux processus physiologiques, la cold insoluble globulin reçut alors d autres dénominations relatives aux différentes fonctions supposées de la molécule, comme opsonic α2-surface binding glycoprotein (Glycoprotéine opsonique α2 de liaison à la surface cellulaire) (Lanser et al., 1980). Cold insoluble globulin Opsonic α2 surface binding protein Major fibroblast glycoprotein Surface fibroblast antigen Cell surface protein Collagen cell attachment protein Table I: Différentes dénominations de la fibronectine En 1973, une nouvelle protéine présente sur la membrane cytoplasmique de fibroblastes a été identifiée (Hynes, 1973). Dénommée major fibroblast glycoprotein (protéine majeure du fibroblaste) ou surface fibroblast antigen (antigène de surface des fibroblastes) (Ruoslahti et Vaheri, 1975), elle fût observée à la surface d autres types cellulaires et nommée alors cell surface protein (protéine de surface cellulaire) (Alexander et al., 1979). Cette protéine fut ensuite isolée sous forme fibrillaire dans la matrice extracellulaire et dénommée fibronectine,

17 du latin fibro et nectere, littéralement la fibre qui relie (Stenman et Vaheri, 1978). La protéine étant capable de faire adhérer les cellules sur le collagène de type I, elle fut dénommée ccap (collagen Cell Attachment Protein / protéine d adhésion cellulaire au collagène) (Kleinman et al., 1978). La fibronectine peut représenter une part importante des protéines de la matrice extracellulaire. Dans le cartilage de la trachée, la fibronectine correspond à plus de 20% de la masse sèche du tissu (Stechschulte et al., 1997). A partir de 1975, la comparaison de la cold insoluble globulin et de la fibronectine a révélé des caractéristiques d affinité identiques pour les mêmes ligands (Ruoslahti et Vaheri, 1975 ; Vuento et al., 1977) et des propriétés physico-chimiques identiques ou très similaires (Alexander et al., 1979). Même si quelques légères différences de séquence restent affirmées (Yamada et Kennedy, 1979), la cold insoluble globulin, qui n est que l isoforme soluble de la fibronectine retrouvée dans le plasma sanguin, porte depuis le nom de fibronectine plasmatique. D autres formes solubles ont été ensuite identifiées chez différentes espèces animales dans l urine (Katayama et al., 1993), les glaires cervicales (Greenhagen et al., 1996), le liquide amniotique, le liquide céphalorachidien (Ruoslahti et al., 1981), le plasma séminal (Pinke et al., 1997), la salive (Pearlstein et al., 1980), le vitré oculaire (Ménasche et al., 1997) et le lait (Reisinger et Welsch, 1992). Enfin, des formes homologues à la fibronectine ont été retrouvées chez les végétaux (Zhu et al., 1993). 2.1.2 La molécule de fibronectine 2.1.2.1 Expression Le gène codant pour la fibronectine est systématiquement localisé avec les gènes de l isocitrate déshydrogènase I et de la γ-cristalline, formant un groupe syntènique. Identifiées chez la souris, le bœuf et le rat, ces régions sont semblables en cytologie et illustrent la conservation cytogènique de ce groupe de gènes dans l évolution. Chez l homme, le gène codant pour la fibronectine est retrouvé dans les régions chromosomiques 2p14p16, 2q34q36 et 11q12.1q13.5. Si toutes les copies du gène sont exprimées dans les cellules germinales, seules celles portées par le chromosome 2 sont exprimées dans les cellules somatiques (Jhanwar et al., 1986). Le gène est constitué d une succession de séquences répétitives analogues codant pour trois domaines (dénommés domaines de type I, de type II ou de type III) probablement issus d un minigène ancestral. De tels domaines sont retrouvés sur d autres protéines de la matrice extracellulaire, du plasma, de la membrane plasmique ou du cytosol.

18 Chaque domaine de type I ou de type II est codé par un exon, et chaque domaine de type III par deux exons (sauf III 9 ) (Boyd et al., 1993). Stimulation par le sérum? Transcription? G10 CRE CCAAT SP1 AP2 SP1 TATA? AMPc G10bp E1a CREB ATF-2 cjun AMPc NF-1 Tax CP-1 Rb E1a? Activation facteur Activation transcription Inhibition transcription 25 bp Figure 1 : Régulation de l expression du gène codant pour la fibronectine AMPc : Adenosyl MonoPhosphate cyclique ; cjun : proto-oncogène humain jun ; Tax : agent issu de HTLV-1 ; E1a : agent issu de l'adenovirus E1a ; Rb : protéine suppressive de tumeur issu du retinoblastome ; Facteur de transcription : CREB : élément de réponse à l'ampc ; ATF-2 : Activating transcription factor 2 ; C/EBP : protéines inductrices liant la séquence CCAAT ; G10bp : protéine liant les séquences G10 ; Cibles de transcription : CRE : élément de réponse à l'ampc ; G10 : séquence riche en guanidine. D après Kornblihtt et al., 1996 La synthèse de la fibronectine est stimulée par l EGF, le TGFβ, l IFNγ, les corticoïdes et les hormones thyroïdiennes et inhibée par les oestrogènes, le TNFα et l IL-1 (Murata et al., 1990 ; Stamm et al., 1992 ; Vollmer et al. 1995). La transcription du gène codant pour la fibronectine est sous la régulation du SRE (serum response element / élément de réponse au sérum) et de l AMPc (Kornblihtt et al., 1996 ; cf. Figure 1) et libère un ARN messager précurseur codant pour 2386 acides aminés. De nombreux types cellulaires expriment puis sécrètent la fibronectine afin de s assurer un support matriciel. L isoforme plasmatique de la

19 fibronectine est sécrétée par les hépatocytes (Tamkun et Hynes, 1983), les cellules endothéliales et les macrophages (Hynes et Yamada, 1982). 2.1.2.2 Variabilité Le gène de la fibronectine est un modèle reconnu de l épissage alternatif (Kornblihtt et al., 1996). L'ARN messager codant pour la fibronectine peut être épissé en quatre points, nommés Extra-Domaine de type III A (EDA), Extra-Domaine de type III B (EDB), région de variabilité (V) qui contient le IIIcs (Type III connecting segment / segment de connection des domaines de type III) et région d adhésion cellulaire (C) situés respectivement après les modules III 11, III 7, III 14 et III 15 (cf. Figure 2). Les régions épissées codent le plus souvent pour les domaines de la fibronectine qui sont reconnues par ses récepteurs cellulaires. Les processus d épissage permettent donc de moduler l adhérence cellulaire sur la fibronectine. EDB EDA V C N S S C III 14 - I 11 III 7 - III 8 III 11 - III 12 III 14 - III 15 -I 10 -I 11 III 7 -EDB-III 8 III 11 -EDA-III 12 III 14 - V 64 - III 15 -I 10 -I 11 Type I Type II III 14 - V 89 - III 15 -I 10 -I 11 III 14 - V 95 - III 15 -I 10 -I 11 Type III Domaine épissé III 14 - V - III 15 -I 10 -I 11 Figure 2 : Représentation des formes épissées de la fibronectine D après Hynes, 1993.

20 Les isoformes qui ont le plus de séquences épissées (EDA-,EDB-,V-,C- et EDA-,EDB-,V-,C+), donc les formes les plus courtes, sont celles qui constituent les isoformes plasmatiques de la protéine (Boyd et al., 1993). Toutefois, une faible proportion de fibronectine retrouvée dans le plasma sanguin est constituée des isoformes cellulaires de la glycoprotéine (2.4 mg/l soit moins de 0.85% de la fibronectine présente dans la circulation générale) (Ylatupa et al., 1993). L expression des isoformes de fibronectine contenant les séquences EDA et EDB est accrue lors des processus de développement, de migration cellulaire (et donc de l embryogenèse), de cicatrisation, des processus tumorigènes, et des atteintes aiguës des tissus et des cellules endothéliales (Myers, 1993). 2.1.2.3 Description morphologique La fibronectine, observée par microscopie électronique à transmission et rotation, apparaît sous la forme d'un collier de perle flexible de 2 à 3 nm de diamètre et de 130 nm de long (Erickson et Carrell, 1983 ; cf. Figure 3). La structure générale de ce filament est en forme de 'V' (Alexander et al., 1978 ; Colonna et al., 1978 ; Engel et al., 1981). Figure 3 : Observation de la fibronectine Image Principale : miscroscopie sous immunofluoresence révélant la matrice de fibronectine entourant une monocouche de fibroblast. Encart : molécules de fibronectine sous forme étendue en solution dans un tampon très ionique observée par microscopie électronique à transmission et rotation.

21 2.1.2.4 Structure de la protéine La protéine est composée de deux chaînes polypeptidiques de 220 à 250 kda chacune, qui se lient l une à l autre selon un arrangement anti-parallèle lors de la maturation postsécrétionnelle in situ par deux ponts disulfures près de l extrémité carboxy-terminale des simples chaînes (McKeown-Longo et Mosher, 1984). N S S C Type I Type II Type III Domaine épissé Figure 4 : Représentation des domaines composant le monomère de fibronectine Les deux S indique la position des résidus cystéine permettant de créer les deux ponts dissulfure reliant, selon un arrangement anti-parallèle, les deux chaînes qui forment la molécule de fibronectine. Les structures des différentes régions de la fibronectine dépendent des domaines qui les composent (cf. Figure 4) : Les domaines de type I et de type II, qui comportent respectivement 45 et 60 résidus aminés, possèdent de nombreux ponts disulfures stabilisant des structures en feuillets β donnant respectivement aux domaines une configuration en doigt de gant et en kringle (Litvinovich et al., 1991 ; cf. Figure 5). L étude physico-chimique de l extrémité amino-terminale de la fibronectine montre que les domaines de type II sont structurés à 80% de feuillets β et à 20% de β-tours (Brumfeld et Werber, 1993 ; Pickford et al., 1997).