PRINCIPALES ETAPES DE L'HEMATOPOIESE MEDULLAIRE (lignées, maturation, voies de domiciliation tissulaire) Partie II

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1 Le 23/09/13 SOGHOMONIAN Astrid, L2 Tissu sanguin et système immunitaire Pr Baccini 22 pages PRINCIPALES ETAPES DE L'HEMATOPOIESE MEDULLAIRE (lignées, maturation, voies de domiciliation tissulaire) Partie II Plan A. Définition B. Les différents compartiments I. Les cellules souches II. Les progéniteurs III. Les précurseurs IV. Les cellules matures C. Mécanismes moléculaires de la différenciation hématopoïétique I. Rôle des facteurs de transcription II. Rôle des facteurs de croissance III. Récepteurs des facteurs de croissance IV. Rôle du micro-environnement A. Définition L hématopoïèse représente l ensemble des événements concourant à la fabrication et au remplacement continu et régulé des cellules sanguines (production quotidienne de à cellules matures par jour). Les cellules sanguines sont des cellules différenciées avec des marqueurs de lignée, sans pouvoir mitotique et avec une durée de vie courte. La production des cellules sanguines est permanente et très importante au niveau de la moelle osseuse (exclusivement) du fait de l'absence de pouvoir mitotique chez ces cellules. (La production est exprimée en giga/jour) (Le prof a dit de bien connaître les durées de vie) 1/22

2 B. Les différents compartiments Les cellules sanguines (hématies, polynucléaires, lymphocytes, monocytes et plaquettes) dérivent toutes d une même cellule indifférenciée : la cellule souche multipotente ou cellule souche primitive. La cellule souche est capable de fournir tous les éléments figurés du sang. Cette cellule, sous l influence de différents facteurs, devient un progéniteur. Le progéniteur est une cellule indifférenciée engagée dans une voie de différenciation et ayant un haut pouvoir mitotique. Les progéniteurs perdent peu à peu leur pouvoir mitotique et deviennent spécifiques d une seule lignée : ce sont des précurseurs morphologiquement identifiables (au myélogramme). Les précurseurs se divisent puis acquièrent les marqueurs spécifiques de lignée : ce sont les cellules matures qui passent dans le sang. Les cellules matures exercent leur fonction au niveau sanguin. Ce sont, d'ailleurs, les seules situées dans le compartiment sanguin, les autres cellule étant toutes dans la moelle osseuse. 2/22

3 I. Les cellules souches Les cellules souches (CSH) ont des capacités de : Autorenouvellement ce qui permet de maintenir le pool de CSH et ainsi d'assurer tout au long de la vie, l'hématopoïèse sans aucune limite. Cette multiplication se fait sans aucune différenciation ; c'est un autorenouvellement pur. Différenciation et multipotence Sous l'influence de facteurs de croissance sécrétés par les composants du stroma suite à des stimuli (ces stimuli sont en relation avec les événements qui se produisent dans l'organisme.ex : une hémorragie) la cellule souche se divise et s'engage dans une voie de différenciation et puis vers une lignée. En fonction du stimuli extérieur, la CSH est capable de donner tous les lignages myéloïdes et lymphoïdes possibles : c'est la multipotence. Par exemple : si elle est stimulée par l'epo (érythropoïétine) elle s'engage vers la voie de différanciation érythroblastique. Expérience de Tille et Mc Culloh (1961) (mise en évidence des cellules souches) : La souris est d'abord irradiée létalement. On lui injecte ensuite de la moelle osseuse et 8 jours après sa rate est prélevée. Au niveau de la rate, sont visibles macroscopiquement, des points blancs (bleus sur le schéma) : ce sont des nodules. Chaque nodule est composé des colonies de cellules, parfois mixtes (1 ou maximum 2 lignées) et strictement identiques. Ces colonies reflètent l'injection de cellule souche dans la moelle irradiée, 8 jours auparavant. Une cellule souche sous l'effet d'un grand nombre de facteurs de croissance a donné soit des colonies d'érythroblastes soit de granuleux... Ces colonies sont monoclonales et toutes identiques. Elle sont parfois mixtes car les progéniteurs peuvent être engagés dans 2 voies de différenciation. Chez l'homme : -Une pathologie a permis de mettre en évidence l'aspect monoclonal. C'est la leucémie myéloïde chronique (LMC) qui est caractérisée par une anomalie cytogénétique du chromosome Phi (translocation). Cette anomalie est retrouvée chez les patients malades dans toutes les cellules hématopoïétiques mais pas dans les non hématopoïétiques. Ce qui montre bien que cette maladie touche la cellule souche et que celle-ci est capable de 3/22

4 donner tous les lignages hématopoïétiques. -Il existe aussi une enzyme : la G6PD, présente dans le globule rouge. Chez les femmes hétérozygotes pour la G6PD, atteintes de certaines pathologies hématologiques, on ne retrouve qu'un seul type de G6PD dans leurs cellules malades. -On a mis en place des tests de clonogénicité. Les cellules souches sont donc : peu nombreuses (représentent à 0,01 à 0,1% de la moelle osseuse) invisibles (pas visibles sur le myélogramme) totipotentes, c'est-à-dire qu'elles sont capables de donner tous les lignages hématopoïétiques présentes essentiellement dans la moelle (avec toujours une très faible quantité dans le sang) possèdent divers marqueurs: CD34 est utilisé couramment en clinique leur congélation est possible à -196 (avec de l'azote liquide), tout en maintenant leurs caractéristiques après décongélation. Elles sont bloquées en phase Go Tests permettant de les mettre en évidence (tests de clonogénicité): On dispose au fond d'une boîte de culture des cellules stromales médullaires, cellules adhérentes permettant aux cellules hématopoïétiques de se développer dans une vraie moelle. Pendant 30 jours, on cultive ces cellules en présence de facteurs hématopoïétiques et d'une moelle de patient. Au bout de 30 jours, on repique ces cellules dans un milieu semi-gélosé avec des facteurs de croissance. Au bout de 15 jours, on retrouve dans la boîte des nodules représentés exclusivement par des cellules érythroïdes ou granuloïdes ou monocytaires. (Si le facteur de croissance est l'epo on retrouvera uniquement des érythroblastes dans les nodules.) 4/22

5 Les cellules souches sont difficiles à mettre en évidence, on ne dispose que de ces tests de clonogénicité ou du CD34 (en clinique). II. Les progéniteurs Ils correspondent au compartiment d'amplification. Les progéniteurs ont un haut pouvoir mitotique et sont déjà engagés dans une voie de différenciation : le retour est donc impossible, la cellule est déjà programmée vers 1 ou 2 lignages maximum : soit érythroblastique ; soit mégacaryocytaire ; soit granulo-monocytaire ; soit eosinophile ; soit basophile. Leur autorenouvellement est quasiment nul, tandis que leur index prolifératif est très élevé (pour augmenter le pool cellulaire). Mise en évidence : Cultures de progéniteurs 5/22

6 Sans facteurs de croissance et de micro-environnement médullaire, on n'obtient rien car les progéniteurs comme les cellules souches ne répondent qu'à des facteurs de croissance. Les progéniteurs sont donc : des cellules engagées dans la différenciation vers une ou deux lignées cellulaires des cellules avec une faible représentation médullaire (un peu plus quand même que la CSH) les progéniteurs peu différenciés ont une circulation temporaire sanguine cultivables in vitro en milieux semi-solides et donnant des colonies CFU, leur multiplication se fait sous l' influence des facteurs de croissance non différenciables morphologiquement entre eux (cellule indifférenciée, sans grain, basophile) 6/22

7 Ils ne peuvent donner qu'un seul type de lignée : lignée érythroïde : BFU-E (burst forming unit- erythroid), CFU-E donnera les hématies lignée granulo-monocytaire : CFU-GM puis les 2 lignées se dissocient donnant : CFU-G Poly neutrophiles CFU-M Monocytes lignée mégacaryocytaire : BFU-MK, CFU-MK plaquettes Les progéniteurs acquièrent des marqueurs membranaires CD spécifiques de lignée les CFU-GEMMk acquièrent le CD34 puis CD33, CD38, HLA-DR CFU-GM : CD34, CD33, CD38, HLA-DR, CD13 CFU-E : CD36 7/22

8 En résumé : III. Les précurseurs Les précurseurs sont incapables de s'autorenouveller (l'autorenouvellement est nul, sauf dans un contexte pathologique) et ont un index prolifératif très limité. Ces précurseurs sont donc : déjà engagés dans la différenciation vers une lignée cellulaire identifiables morphologiquement des cellules qui ont perdu leur capacité d auto-renouvellement Selon les lignées, il y a 3 à 5 mitoses entre chaque stade précurseur, de telle sorte qu un précurseur immature conduit à 8 à 32 cellules matures. Il se déroule des modifications morphologiques communes de maturation des précurseurs: diminution de la taille cellulaire (sauf lignée mégacaryocytaire) diminution N/C (rapport nucléo-cytoplasmique) disparition des nucléoles (car la cellule est mature et donc la chromatine sera de moins en moins fine) condensation de la chromatine Il existe des modifications spécifiques de chaque lignée au cours de la différenciation -Pour les granuleux, il y a une lobulation du noyau et l'apparition de granulations spécifiques. -Pour les érythroblastes, il y a une expulsion du noyau. - Particularité : les plaquettes proviennent de la fragmentation du cytoplasme du mégacaryocyte. Les mégacaryocytes se caractérisent par des endomitoses (et non des mitoses), c'est-à-dire que chez le précurseur mégacaryocytaire il va y avoir un doublement de l'adn, sans division cellulaire, à chaque stade de maturation, aboutissant à des cellules de grande taille à 4N, 8N, 16N, 32N ou 64N chromosomes, avec un noyau polylobé. Ainsi la cellule augmente le volume de son cytoplasme afin de produire un maximum de plaquettes. 8/22

9 Les lignées : 9/22

10 IV. Les cellules matures Les cellules matures sont les cellules circulantes sanguines. Ce sont les polynucléaires, c'est-à-dire qu'elles ont un noyau avec plusieurs lobes (et non pas plusieurs noyaux). Elles comprennent : les monocytes, les basophiles, les eosinophiles... C. Mécanismes moléculaires de la différenciation hématopoïétique La différenciation hématopoïétique se fait sous diverses influences qui sont toutes orchestrées par le microenvironnement. Celui-ci permet la sécrétion de facteurs de croissance qui vont stimuler les CSH et les progéniteurs, entraîner la synthèse ou le recrutement de facteurs de transcription au sein de la cellule et la programmation de la cellule vers un lignage myéloïde. I. Rôle des facteurs de transcription Les facteurs de transcription jouent un rôle majeur dans la différenciation cellulaire. Ils ont été identifiés par technique de souris knock-out : par l'inactivation d un gène qui a permis de montrer leur implication. Ils agissent sur l activité de gènes régulateurs nécessaires au développement des lignées hématopoïétiques : ils vont donc interagir avec le promoteur des gènes spécifiques de telle ou telle lignée. Exemples : La lignée érythroblastique : elle est totalement dépendante des familles de protéines nucléaires : GATA qui reconnaissent le site de liaison GAT des régions régulatrices des gènes de l érythropoïèse. Quand le facteur de transcription GATA est stimulé, il est envoyé au noyau et se loge sur ces régions régulatrices et entraîne ainsi la transcription des gènes de l'érythropoïèse. Il y aussi TAL-1, c-myb, Rbtn2 La lignée myéloïde : up-régulation de Pu-1, diminution de GATA 1 et 2 La lignée lymphoide: ikaros 10/22

11 Si la cellule souche est soumise à une stimulation par Ikaros, elle se dirige vers le lignage lymphoïde et si il y a ensuite une stimulation par PAX5, elle s'oriente vers la lignée de lymphocytes B. Idem avec les autres facteurs : II. Rôle des facteurs de croissance Les facteurs de croissance sont des glycoprotéines solubles agissant comme des ''hormones hématopoïétiques'', à très faibles doses. Ils sont indispensables à la survie, à la prolifération et à la différenciation des progéniteurs. Ils inhibent l apoptose et stimulent la prolifération et la différenciation cellulaire. Les facteurs de croissance sont produits essentiellement par le stroma médullaire, les lymphocytes T ou les monocytes. Exceptions : l'epo ou érythropoïétine est synthétisée, essentiellement, par le rein et un peu par le foie. La TPO ou thrombopoïétine est synthétisée, essentiellement, par le foie et peu par le rein. Les facteurs de croissance sont synthétisés de novo après stimulation de la cellule productrice. Il n'y a pas de stockage, excepté la fixation de certains facteurs sur la matrice du micro-environnement médullaire. Lorsqu'il y a un stress dans l'organisme, par exemple une hémorragie, la cellule productrice d'epo (cellule rénale) est stimulée, l'epo est synthétisée de novo et l'epo va se fixer sur des récepteurs spécifiques. Donc, pour tous les facteurs de croissance il y a fixation spécifique sur des récepteurs. 11/22

12 Les facteurs de croissance sont de trois types : Les facteurs de croissance agissant sur les temps précoces de l hématopoïèse Ils agissent de façon synergique. CFU-S et CFU-GEMM : FLT3L, SCF, les cytokines de la famille de l IL6 (IL6, LIF, IL11, oncostatinem, cardiotrophine-1), IL12, IL1 et IL4 (facteurs synergiques) Les CSF non spécifiques de lignée, comme le GM-CSF et l IL3 agissent sur plusieurs lignées, y compris sur les temps précoces de l hématopoïèse. 5 facteurs ont une activité restreinte à un lignage hématopoïétique et agissent avant tout tardivement (mais aussi précocement) au cours de la différenciation : G-CSF, MCSF, EPO, TPO et IL5. La TPO et le G-CSF agissent aussi sur les temps précoces et l IL6 et le SCF sur des temps tardifs (respectivement de la mégacaryocytopoïèse et de la lignée mastocytaire) Une partie des facteurs de croissance assure une régulation positive : ils ont une action sur la survie, la prolifération, la différenciation des progéniteurs ils ont une action pleïotrophique, redondante, séquentielle, synergique ils permettent l'induction de cascades d'activation intra-cellulaire qui vont permettre le recrutement de facteurs de transcription et donc la stimulation de telle ou telle lignée. Leur mode d'action est : Direct : IL3, GM-CSF sur les cellules peu différenciées, IL7 sur les progéniteurs lymphoïdes Indirect : IL1 stimule la production de GM-CSF, G-CSF, IL6 Paracrine : action sur une cellule cible proche de la cellule productrice Endocrine : action sur une cellule éloignée : EPO, TPO (hormones) Interaction avec un récepteur spécifique 12/22

13 Action séquentielle : Les facteurs ''précoces '' (famille de l'il6, le SCF, le FLT3-L..) préparent les cellules à recevoir un deuxième signal de prolifération apporté par l IL3 ou le GM-CSF permettant le maintien de la prolifération et permettant aux cellules de recevoir le message de facteurs de croissance plus spécifiques (G-CSF, M-CSF, EPO, TPO, IL5). 13/22

14 EXEMPLES : Erythropoïétine (EPO) C'est un facteur régulateur principal de l érythropoïèse. Son gène est situé sur le chromosome 7. C'est une glycoprotéine fortement glycosylée dont les taux plasmatique varient entre mui/ml. Lieux de production: -90% par le rein : cellules de l'interstitium intertubulaire et cellules endothéliales des capillaires péritubulaires -10% par foie : hépatocytes L'EPO stimule la production de globules rouges, elle augmente l'apport d'o2 aux cellules rénale, il y a donc à ce moment-là une diminution de l'epo, d'où une diminution de production des globules rouges : 14/22

15 L'EPO a une action sur la survie, prolifération, inhibition de l apoptose. Elle agit par liaison à un récepteur spécifique : EPO-R Son récepteur se trouve sur les BFU-E matures et il y en a en nombre maximal sur CFU-E. Il y a une parfaite corrélation entre le taux d Hb et le taux d EPO : -Hb : 12g/dl EPO : 20 U/l -Hb : 7 g/dl EPO : 200 U/I Thrombopoïétine : TPO C'est le ligand de Mpl. C'est le facteur humoral régulant la mégacaryocytopoïèse. Son gène est situé sur le chromosome 3. Elle est sécrétée par le foie (90%) et par le rein (10%) C'est une protéine : elle possède 2 domaines domaine N terminal : porte activité biologique, homologie avec l EPO domaine C terminal : sans homologie avec des protéines connues Elle agit sur les temps précoces et tardifs de la mégacaryocytopoïèse. L'autre partie des facteurs de croissance assurent une régulation négative : Ces facteurs bloquent la prolifération par inhibition de la transition G1/S au niveau du cycle cellulaire. On peut citer : les interférons (IFN) le TGF β qui inhibe l entrée en cycle des CS et des progéniteurs précoces le TNF α : synthétisé par les monocytes et les lymphocytes T ; il inhibe l entrée en cycle des CSH pluripotentes MIP1 α : synthétisé par les macrophages, inhibe la mise en cycle des CFU-S et inhibe les progéniteurs immatures Peptides hémorégulateurs : AcSDKP et le pentapeptide peedck III. Récepteurs des facteurs de croissance A un CSF correspond un récepteur. Ces récepteurs sont en nombre faible: 1000/cellule Une cellule présente plusieurs types de récepteurs. Il en existe 2 familles : les récepteurs avec activité tyrosine kinase C-Kit (R SCF) C-fms (R M-CSF) FLT3 Deux sous-unités identiques s homodimérisent ; il y a la phosphorylation de tyrosines situées sur la partie intracellulaire du récepteur et sur des seconds messagers. la superfamille des Hématopoïétines IL2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 15 EPO, TPO, G-CSF, GM-CSF nécessité d une deuxième protéine pour la transduction du signal (avec phosphorylation de cette protéine) 15/22

16 Superfamille des hématopoïétines : Ce sont des glycoprotéines transmembranaires. Elles sont formées de plusieurs chaînes : une spécifique : assure la liaison avec le ligand. Elle présente une haute affinité et une dimérisation. une ou plusieurs communes (entre les groupes) : assurent la transduction du signal Elle se divise en 3 groupes : les récepteurs de l IL3, IL5 et GM-CSF avec deux chaînes : une commune de transduction du signal (chaîne β) et une chaîne assurant la spécificité du récepteur (chaîne α) La transduction du signal entraîne l activation d une protéine Jak (acquisition activité tyrosine kinase) les récepteurs de la famille de l IL6 (IL6, LIF, OSM, IL11) avec trois chaînes conduisant au même type d activation intracellulaire les récepteurs de l EPO et du G-CSF avec une seule chaîne s homodimérisant et activant des protéines Jak La transduction du signal se déroule via : -L'association à des tyrosines kinases cytoplasmiques: JAK (Janus kinase) JAK1, JAK2, JAK3, TYK2 -les STAT : Signal transducer and activators of transcription Stat 1 à 6 C'est une famille de facteurs de transcription. Ce sont des protéines latentes dans le cytoplasme. Elles sont activées par la phosphorylation des tyrosines (JAK). Elles sont transloquées dans le noyau et activent la transcription. 16/22

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18 IV. Rôle du micro-environnement Le micro-environnement médullaire : Les cellules du stroma médullaire (les fibroblastes, les cellules endothéliales, les macrophages, les cellules épithéliales et les adipocytes) sécrètent des matrices extracellulaires (collagène, fibronectine, laminine, protéoglycanes) et des facteurs de croissance indispensables à l hématopoïèse. 18/22

19 L ensemble du microenvironnement est indispensable à toutes les étapes de l hématopoïèse : survie, autorenouvellement, détermination, prolifération et différenciation. Le contact des cellules hématopoïétiques avec les cellules médullaires adhérentes non hématopoïétiques et avec la matrice qu elles produisent est indispensable à l hématopoïèse (on parle de niche hématopoïétique). Les composants de la matrice extra-cellulaire (collagène I et III, protéoglycannes, fibronectine, hémonectine, thrombospondine) assurent le contact cellulaire et la fixation des facteurs de croissance. 19/22

20 Mécanismes d'action du micro-environnement médullaire : il assure la sécrétion locale de facteurs de croissance. Ceux-ci sont stockés au niveau de la matrice extra-cellulaire. On parle de niche hématopoïétique. Exemple du couple SDF1/CXCR4 : SDF1 est un facteur d'adhésion et CXCR4 est le récepteur de SDF1. Ce couple a un rôle majeur dans le homing tissulaire. Dans les cellules de souris Knock Out pour CXCR4 (récepteur essentiel pour le homing), la moelle est vidée de sa substance. La chimiokine attractive est le SDF1 (stroma derived factor-1). Les CSH vont tendre vers leur maturation, maturation qui n'est possible que dans la moelle. SDF1 maintient les facteurs de croissance dans la moelle donc les cellules hématopoïétiques peuvent assurer leur maturation. L'AMD3100 bloque la fixation de SDF1 (CXCL12) à son récepteur ce qui permet la migration des CSH dans le sang. La localisation des CSH dans la moelle osseuse (homing) nécessite une attraction des CSH par la chimiokine SDF1 produite par les cellules stromales. Les molécules d adhésion comme VLA4 permettent l adhésion des CSH aux cellules stromales. Les anticorps anti-vla4 vont entraîner la circulation des CSH vers le sang périphérique. Homing Mobilisation 20/22

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