Simplexa CMV Quantitation Standards

Simplexa CMV Quantitation Standards REF MOL2210 Rév. B Les standards de dosage Simplexa CMV sont destinés à établir une courbe de référence avec le test Simplexa CMV sur l'integrated Cycler de 3M. Pour diagnostic in vitro APPLICATION Les standards de dosage Simplexa CMV de Focus Diagnostics sont destinés à établir une courbe de référence avec le test Simplexa CMV sur l'integrated Cycler de 3M. CONTEXTE Le test utilisant les standards de dosage Simplexa CMV ont été adaptés au standard CMV de l OMS 1. La charge virale indiquée par le test Simplexa CMV en copies/ml est égale au standard CMV de l OMS en UI/mL. MATÉRIELS FOURNIS La trousse de standards de dosage Simplexa TM CMV de Focus Diagnostics contient suffisamment de produits pour deux réactions. Composant du kit Standard 1 (QS-1) (Standards de dosage 1) Standard 2 (QS-2) (Standards de dosage 2) Standard 3 (QS-3) (Standards de dosage 3) Standard 4 (QS-4) (Standards de dosage 4) Standard 5 (QS-5) (Standards de dosage 5) Description du kit de standards de dosage (Quantification Standard : QS) REF Focus Diagnostics Standards ( REF # MOL2210) Nombre de tubes par kit Réactions par flacon Volume (µl) pour un flacon MOL2211 MOL2212 MOL2213 MOL2214 MOL2215 MATÉRIELS NÉCESSAIRES MAIS NON FOURNIS Description du composant 1. Simplexa CMV ( REF MOL2200) 2. Integrated Cycler de 3M avec le logiciel Integrated Cycler Studio version 4.1 ou plus récente 3. Universal Discs (Disques universels) utilisables sur l'integrated Cycler de 3M 4. Universal Disc Cover Tape 5. a Roche MagNA TM Pure LC System et consommables associés. 6. a Roche MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit (Roche, num. cat. 3038505001) 7. b Appareil biomérieux NucliSENS easymag avec consommables et réactifs associés 8. b Pipette multicanaux Biohit/bioMérieux 9. b Plaque de micropuits ELISA 10. Micropipette(s) monocanal, multicanaux et/ou à répétition ayant une plage de précision de 1 à 10 µl, 10 à 100 µl et 100 à 1 000 µl 11. Congélateur (dégivrage manuel) à -10 C à -30 C (pour stockage des composants congelés du kit) 12. Réfrigérateur à 2-8 C (pour composants du kit et normes de référence décongelés) 13. Enceinte de sécurité (hotte à flux laminaire) pour les extractions

Standards Page 2 14. Microcentrifugeuse 15. Vortex 16. Embouts antiaérosols, stériles, jetables, sans ARNase/ADNase de micropipetteur. 17. Tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml en polypropylène et portoirs (des tubes sans ARNase/ADNase sont recommandés mais non exigés). 18. Gants à usage unique, non poudrés. 19. Eau sans nucléase (utilisée au cours de l'extraction et comme Contrôle sans matrice [NTC]) 20. Portoirs de glacière pour tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml a À utiliser avec la méthode d'extraction Roche MagNA Pure LC b À utiliser avec la méthode d'extraction biomérieux easymag. DURÉE DE CONSERVATION ET MANIPULATION 1. Conserver les standards de référence à une température comprise entre -10 et -30 C (ne pas utiliser de congélateur sans givre). 2. Après une première utilisation, conserver les standards de référence décongelés à une température comprise entre 2 C et 8 C pendant un maximum de cinq (5) jours. 3. N'utilisez pas les standards de référence au-delà de leur date de péremption. MISES EN GARDE ET PRÉCAUTIONS 1. Pour diagnostic in vitro. 2. Tous les produits d'origine doivent être considérés comme potentiellement infectieux. Les matériaux sources d'où provient ce produit ont été testés à la recherche de l'antigène de surface de l'hépatite B, des anticorps anti-hépatite C et anti- VIH-1/2 (SIDA) avec des méthodes homologuées par la FDA et sont apparus négatifs. Cependant, comme aucune méthode de test connue ne peut offrir une garantie à 100 % que des produits dérivés du sang humain ne transmettront pas ces agents infectieux (ou d autres), tous les contrôles, échantillons de sérum et équipements rentrant en contact avec ces échantillons doivent être considérés comme potentiellement infectieux et décontaminés ou éliminés en utilisant les précautions concernant les risques biologiques. Les CDC et les National Institutes of Health préconisent que les agents potentiellement pathogènes soient manipulés au niveau de biosécurité 2. 2,3 3. Portez un équipement individuel de protection comme (mais non limité à) des gants et une blouse de laboratoire lors de la manipulation des réactifs du kit. Lavez-vous soigneusement les mains quand vous avez fini le test. 4. Ne pas pipeter à la bouche. 5. Ne pas fumer, boire, manger, manipuler des lentilles de contact ou se maquiller dans les zones où des réactifs de kits et/ou des échantillons d'origine sont utilisés. 6. Éliminez les standards de référence non utilisées conformément à la réglementation locale, de l'état et fédérale. 7. La contamination des échantillons de patients ou des réactifs peut aboutir à des résultats erronés. Utilisez des techniques respectant les règles d'asepsie. 8. Pipetez et manipulez les standards avec prudence pour éviter de mélanger les standards de référence de puits contigus. 9. Utilisez des techniques de pipetage correctes et conservez le même schéma de pipetage tout au long de la procédure pour garantir l'obtention de valeurs optimales et reproductibles. 10. Ne substituez pas ou ne mélangez pas des standards de référence de différents lots de kits ou avec des produits d'autres fabricants. 11. N'intervertissez pas les bouchons des tubes. Cela pourrait provoquer une contamination et compromettre les résultats des tests. 12. Ne réutilisez pas des Disques universels qui ont été déjà exposés aux échantillons de patients ou à des réactifs. 13. Éliminez le disque utilisé sans détacher ou enlever l'adhésif qui le recouvre. 14. Si le matériau d emballage semble être déchiré ou endommagé, ne pas utiliser et contacter Focus Diagnostics. Les coordonnées de contact sont indiquées à la dernière page de ce document. MODE D'EMPLOI A ZONE D'EXTRACTION DES STANDARDS DE DOSAGE Travaillez dans une zone dédiée à l'extraction. La préparation des standards de dosage pour l'extraction doit être effectuée dans une enceinte de sécurité. Extraction selon la méthode Roche MagNA Pure LC 1. Procédez à l'extraction des standards de dosage à l aide du kit d'isolement d acide nucléique total Roche MagNA Pure Total Nucleic Acid et de l'appareil d'extraction automatisé Roche MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor. Reportez-vous au mode d emploi du fabricant pour l'extraction de l'acide nucléique au moyen de ce kit. 2. Dans le menu déroulant «Protocole» (Protocole) du système MagNA Pure LC System, sélectionnez dans la liste «Total NA», puis «Total NA Variable_elution_volume.blk». Cela chargera les réglages appropriés pour le test. 3. Le protocole de l échantillon doit être : «Total NA Variable_elution_volume». 4. Le volume de l échantillon doit être réglé à 200 µl et le volume d élution doit être réglé à 50 µl. 5. Le volume de dilution doit être réglé à zéro pour tous les échantillons. 6. Assurez-vous que le protocole post élution est réglé sur «None» (aucun).

Standards Page 3 7. Assurez-vous que les standards de dosage sont dans le bon emplacement de la cartouche d'échantillons. 8. Passez chaque standard de dosage au Vortex pendant 2 à 4 secondes et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond des tubes. 9. Pipetez 200 µl de chaque standard de dosage et du contrôle sans matrice dans l emplacement correspondant de la cartouche d échantillons. 10. Vérifiez visuellement le niveau des standards de dosage et du contrôle sans matrice dans la cartouche d'échantillons afin de s'assurer que les standards ont été ajoutés. 11. Passez 2 fois au Vortex à pulsations l ADN de contrôle d extraction et d amplification (contrôle interne : IC) et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond du tube. 12. Pour chaque ensemble de standards de dosage, dispensez à l aide d une pipette 100 µl de l IC dans un tube conique contenant 6 ml de tampon de lyse. Mélangez brièvement au vortex. Ajoutez le plateau adéquat à l'appareil d'extraction MagNA Pure. 13. Transférez la cartouche d'échantillons dans l'extracteur MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid et commencez la procédure d'extraction. 14. Lorsque l'extraction de l'acide nucléique est terminée, la cartouche contenant les standards de dosage extraits peut être retirée de l'appareil MagNA Pure et scellée. Conservez l'adn à une température de 2 à 8 C avant utilisation. Une conservation prolongée des standards de dosage extraits à cette température n'est pas recommandée. Gardez les échantillons d'adn extrait sur un bloc réfrigérant pendant le chargement du disque. Extraction par la méthode d'extraction biomérieux NucliSENS easymag 1. Reportez-vous au Manuel de l'utilisateur NucliSENS easymag pour le fonctionnement de l'appareil et du logiciel. 2. Choisissez la matrice générique dans le logiciel NucliSENS easymag avec le paramétrage suivant : Default Request (Demande par Generic 2.0.1 (or equivalent) (ou équivalent) défaut) : Run Name Prefix (Préfixe du (as appropriate) (selon les besoins) nom de la série) : Sample ID prefix (Préfixe ID (as appropriate) (selon les besoins) d échantillon) : Sample Type (Type Primary (Primaire) d échantillon) : Workflow Defaults (Paramètres On-board lysis Incubation (Incubation de lyse dans l instrument) par défaut du flux de travail) : On-board Silica Incubation (Incubation de silice dans l instrument) Reagent Tracking (Traçabilité réactif) : Sample Addition Guidance Off (Traçabilité échantillons désactivée) Lysis, Silica, Internal Control reagent tracking disabled (Traçabilité des réactifs de lyse, silice et contrôle interne désactivée) 3. Saisissez les renseignements pour chaque échantillon dans l'écran de Demande d extraction comme ci-dessous. ID échantillon : (Enter sample name) (Saisir le nom de l'échantillon) Demande : Generic 2.0.1 (or equivalent) (ou équivalent) Volume (ml) : 0,200 Éluat (µl) : 50 Type : Primary (Primaire) Priorité : Normal Matrice : Other (Autre) 4. Créez la série d'extraction dans le logiciel NucliSENS easymag conformément au manuel de l'utilisateur. 5. Passer chaque standard de dosage au Vortex pendant 2 à 4 secondes et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond des tubes. 6. Pipetez 200 µl de standard de dosage et de contrôle sans matrice dans le(s) puits d échantillon(s). 7. Passez 2 fois au Vortex à pulsations le contrôle interne et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond du tube. 8. Pipetez 5 µl d IC vers chaque standard de dosage et tous les puits de contrôles. Changez d'embout entre les standards. 9. Chargez le(s) puits d'échantillons, les nouveaux matériels jetables d'aspiration et réactifs dans l'appareil easymag conformément aux instructions du manuel de l'utilisateur. 10. Démarrez la lyse intégrée et incubez les échantillons lysés pendant 10 minutes avant d ajouter le mélange de silice magnétique. 11. Au cours de la période d'incubation de la lyse, préparez le mélange de silice magnétique. Mélangez la silice et diluez dans de l eau sans nucléase en ajoutant 1 partie de silice magnétique à 3 parties d eau sans nucléase (par exemple, 270 µl de silice magnétique + 810 µl d eau sans nucléase). Préparez à peine 135 µl de mélange de silice magnétique par échantillon. 12. Pour transférer le mélange de silice dans les plaques de puits ELISA, mélangez la silice magnétique et utilisez 1 pointe ainsi que le mode de fonctionnement P2 de la pipette Biohit. Appuyez sur Start (Démarrer) pour aspirer 1 050 µl du mélange de silice magnétique et appuyez de nouveau sur Start (Démarrer) pour renvoyer le premier tirage dans le tube

Standards Page 4 de mélange de la silice. Appuyez sur Start (Démarrer) pour distribuer 125 µl du mélange de silice magnétique dans les 8 puits individuels de la plaque ELISA. Répétez selon le besoin pour des plaques ELISA supplémentaires. 13. Après les 10 minutes d incubation de la lyse, utilisez 8 pointes (par plaque ELISA) et le mode de fonctionnement P3 de la pipette Biohit pour transférer 100 µl du mélange de silice magnétique vers chaque standard de dosage et contrôle sans matrice dans le puits d échantillon. Placez les pointes dans les puits des plaques ELISA et appuyez sur Start (Démarrer) pour mélanger et aspirer le mélange de silice magnétique. 14. Transférez le mélange de silice magnétique dans le puits d'échantillon approprié et placez les pointes de pipette dans les échantillons, en dessous du niveau liquide. Appuyez sur Start (Démarrer) pour aspirer, distribuer et mélanger (x3) la silice magnétique et les échantillons. Assurez-vous que les pointes de pipette restent en dessous du niveau liquide afin d'assurer un mélange correct. 15. Répétez les étapes 13 et 14 pour des puits d'échantillons supplémentaires. 16. Après avoir ajouté le mélange de silice magnétique dans tous les échantillons, commencez la série d'extraction. 17. Lorsque la série est terminée, retirez le(s) puits d'échantillon(s) de l'appareil. Si les standards de dosages et les contrôles sans matrice ne sont pas destinés à une utilisation immédiate, transférez-les dans des tubes individuels pour limiter au minimum le risque de voir retomber la silice magnétique dans l'échantillon. Conservez l ADN à une température de 2 à 8 C avant utilisation. Une conservation prolongée des échantillons extraits à cette température n'est pas recommandée. Gardez les échantillons d'adn extrait sur un bloc réfrigérant pendant le chargement du disque. B. CONFIGURATION DE L'APPAREIL DE PCR TEMPS-RÉEL 1. Reportez-vous au Manuel de l'utilisateur de l'integrated Cycler pour plus de détails sur la façon de configurer le logiciel Integrated Cycler Studio pour ajouter une définition de tests, établir une courbe de référence des standards (Série de calibration) et analyser les séries de tests sur l'integrated Cycler. Remarque : Seuls les standards de dosage et le contrôle sans matrice peuvent être chargés sur une série de tests de calibration. Les échantillons de patient et les contrôles positifs pourront être testés après qu'une série de calibration valide aura été effectuée. Exemple de disposition du disque 1 2 3 A QS-1 QS-3 QS-5 B QS-1 QS-3 QS-5 C QS-1 QS-3 QS-5 D QS-1 QS-3 QS-5 E QS-2 QS-4 NTC F QS-2 QS-4 G QS-2 QS-4 H QS-2 QS-4 4 5 6 7 8 9 10 11 12 C. ZONE DE PRÉPARATION DU RÉACTIF Zone dédiée à la préparation du mélange réactif du test Simplexa TM CMV. 1. Décongelez le mélange d amorces et le mélange maître à température ambiante (entre environ 18 C et 25 C). Chaque flacon de composant du kit contient suffisamment de réactifs pour 50 réactions. Avant chaque utilisation, mélangez doucement les composants du kit (mélange d amorces et mélange maître) par inversion (6 à 8 fois) et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond du tube. 2. Préparez le volume requis du mélange réactif dans un tube de microcentrifugeuse en polypropylène de taille appropriée par pipetage du volume de chaque composant comme indiqué dans le tableau ci-dessous. Volumes de mélange réactif Réactif Mélange réactif Mélange réactif Volume / 1 réaction Volume / 24 réactions Simplexa Master Mix 4,0 µl 96 µl Simplexa CMV Primer Mix 1,0 µl 24 µl Volume total 5,0 µl 120 µl 3. Mélangez doucement le mélange réactif par inversion ou par pipetage (8 à 10 fois). 4. Centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond du tube. 5. Poursuivez le paramétrage de la PCR. 6. Utilisez le mélange réactif dans l'heure qui suit sa préparation. Conservez le mélange réactif à une température de 2 à 8 C si le paramétrage de la PCR ne doit pas être réalisé immédiatement après la préparation du mélange réactif.

Standards Page 5 D. ZONE D'AMPLIFICATION PAR PCR EN TEMPS RÉEL Effectuez cette étape dans une zone dédiée à la préparation du Disque universel à 96 puits pour le test Simplexa CMV. Reportez-vous au modèle de disposition du disque, à la section B, tout en effectuant la préparation suivante : 1. Ajoutez 5,0 µl du mélange réactif à chacun des puits. 2. Ajoutez 5,0 µl du standard de dosage extrait dans le puits «QS» approprié. 3. Ajoutez 5,0 µl du contrôle sans matrice extrait dans le puits «NTC». 4. Recouvrez le disque avec l'adhésif de couverture pour disque universel. 5. Ouvrez le couvercle de l'integrated Cycler. 6. Placez le disque universel scellé sur la platine. 7. Fermez délicatement le couvercle. 8. Cliquez sur Run (Exécuter). 9. Cliquez sur Start (Démarrer). E. ANALYSE DE LA COURBE DE RÉFÉRENCE DES STANDARDS (SÉRIE DE CALIBRATION) LIMITES 1. L Integrated Cycler Studio déterminera automatiquement si une série de calibration est valide. a. Si elle est valide, la série de calibration sera automatiquement enregistrée pour être utilisée. b. Si elle n'est pas valide, la série de calibration sera éliminée et nouvelle série de calibration doit être effectuée avant qu'il soit possible de tester des échantillons de patients. 1. À utiliser avec le kit Simplexa CMV. 2. Les techniciens doivent être formés et avoir l'habitude des procédures de tests et de l'interprétation des résultats avant d'effectuer le test. 3. L'Integrated Cycler Studio conserve la dernière série de tests valide de calibration pour quantifier les échantillons inconnus de patients. Les standards de dosage et les échantillons de patients doivent être extraits en utilisant la même méthodologie d'extraction, faute de quoi vos résultats pourraient être erronés. RÉFÉRENCES 1. Fryer JF. Heath AB, Anderson R, Minor PD and the collaborative study group. Collaborative study to evaluate the proposed 1st WHO International Standard for human cytomegalovirus (HCMV) for nucleic acid amplification (NAT)-based assays. WHO ECBS Report 2010; WHO/BS/10.2138. 2. NCCLS H18-A2. Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guideline. 2nd Ed. (1999). 3. CDC-NIH Manual. (1999) Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 4th ed. And National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Protection of Laboratory Workers from Instruments, Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue (NCCLS M29-A). Cette notice est disponible en anglais, français, allemand, italien espagnol et portugais du Brésil à l'adresse www.focusdx.com et dans d'autres langues auprès de votre distributeur local. REPRÉSENTANT AUTORISÉ mdi Europa GmbH, Langenhagener Str. 71 30855, Langenhagen-Hannover, Allemagne RENSEIGNEMENTS POUR LES COMMANDES Téléphone : (800) 838-4548 (États-Unis uniquement) Fax : (562) 240-6510 (562) 240-6500 (International) PI.MOL2210.OUS.FR Rév. B Date de rédaction : 21 octobre 2011 ASSISTANCE TECHNIQUE Téléphone : (800) 838-4548 (États-Unis uniquement) Fax : (562) 240-6526 Consultez notre site internet à l'adresse www.focusdx.com (562) 240-6500 (International) Cypress, Californie 90630 États-Unis