ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE LYON Année 2007 - Thèse n UTILISATION DES ANTIOXYDANTS EN HEPATOLOGIE CHEZ LES CARNIVORES DOMESTIQUES THESE Présentée à l UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie) et soutenue publiquement le 2 octobre 2007 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire par Marion CHABAUD Née le 24 juillet 1982 à Cavaillon (84)
ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE LYON Année 2007 - Thèse n UTILISATION DES ANTIOXYDANTS EN HEPATOLOGIE CHEZ LES CARNIVORES DOMESTIQUES THESE Présentée à l UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie) et soutenue publiquement le 2 octobre 2007 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire par Marion CHABAUD Née le 24 juillet 1982 à Cavaillon (84)
Serment de Bourgelat «Je promets et je jure devant le Conseil de l Ordre Vétérinaire de conformer ma conduite professionnelle aux règles prescrites par le codes de déontologie et d en observer en toute circonstances les principes de correction et de droiture. Je fais le serment d avoir à tout moment et en tout lieu le souci constant de la dignité et de l honneur de la profession vétérinaire.» Claude Bourgelat (1977) - Page 1 -
REMERCIEMENTS A Monsieur le Professeur Chayvialle, De la Faculté de Médecine de Lyon, Qui m a fait l honneur d accepter la présidence de mon jury de thèse, Hommages respectueux. A Monsieur le Professeur Cadoré, De l Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon, Qui m a fait l honneur d encadrer ce travail. En témoignage de ma reconnaissance pour sa disponibilité et sa gentillesse, Sincères remerciements. A Monsieur le Professeur Grancher, De l Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon, Qui m a fait l honneur de juger ce travail et de faire partie de mon jury de thèse, En témoignage de ma profonde reconnaissance. A Madame le Docteur Hugonnard, Qui a été l initiatrice de ce projet et m a beaucoup aidée dans ce travail, Pour ses nombreux enseignements, ses conseils, sa patience et sa gentillesse, Que ce travail reste un agréable souvenir, Sincères remerciements. - Page 3 -
A mes parents, Pour l amour, les conseils, le soutien que vous m avez apportés, et la confiance dont vous m avez toujours témoignée. Merci d être à mes côtés et de m avoir donné les moyens de réaliser mes projets. Avec tout mon amour. A François, mon jumeau ; A Pauline, ma soeur, Pour toutes nos disputes d enfance qui nous ont fait mûrir, Pour toute notre complicité qui a grandi avec les années, Que nos moments ensemble ne se fassent pas rares, Je vous aime. A mes grand parents, mamé Suzanne, et papi Raymond, Pour toute votre affection depuis l enfance, Pour tous ces moments précieux à vos côtés, Avec tout mon amour. A Marie-Reine, ma marraine, Pour tous ces séjours inoubliables au Grau du Roi, Pour ta gentillesse, ta générosité et ton sourire, Avec toute mon affection. A Lucie, ma cousine, mon amie, Pour notre grande complicité qui dure depuis si longtemps, Et pour tous les bons moments passés ensemble. Et, à toute ma famille. Pour papé Maurice, mamé Mado et mami Layo, Je pense à vous souvent, vous me manquez tant. A Augustin et Arthur, mes filleuls, Pour vos jolis sourires, et ces moments privilégiés avec vous, Je vous souhaite bon courage dans les premiers pas de votre vie. A la famille Weber, Merci pour votre accueil et votre gentillesse. Une pensée pour Tara. - Page 5 -
A Joachim, Pour ton amour, ton aide et ton soutien si précieux, Tu me donnes le sourire, tu me rends heureuse, Les moments à tes côtés sont toujours aussi précieux, Pour tout ce qui reste à venir et à construire. Je me languis «Tout ce que tu as dans la tête idem». A Toufri, «maman jolie», Pour toute notre complicité, notre amitié fusionnelle qui font de toi ma protégée, ma meilleure amie, A Jean, Prenez soin de vous et de votre petite famille. A Milly, ma nounou, Pour tes câlins, tes ronrons, et tes interminables conversations - Page 7 -
A Perrine, ma co-interne, ma co-docteur, Depuis 2 ans que l on se connaît, notre amitié et notre complicité ne font que grandir et s enrichir en souvenirs et en émotions, c est que du bonheur, Pour nos bêtises et nos délires de «blondes», on se ressemble bien! A Julien, on s amuse bien tous les quatre! A Marie-Flore, mon rayon de soleil, Parce que depuis si longtemps, tu as toujours su être là pour moi, m écouter et me conseiller, Pour nos années de collocation, nos délires et nos apéros aux Tacos, Merci pour tout. A Doudou, mon cavalier de revue, Pour tous nos moments inoubliables durant deux ans de clinique, Pour toutes ces soirées endiablées et ces teq-paf où tu m as bien fait rire, Merci pour cette amitié, qu elle ne s arrête jamais A Nouye, A Aymeric, Pour votre joie de vivre qui me donne le sourire, C est toujours un plaisir d être en votre compagnie, Que ces moments ne se fassent pas rares A Mathilde et Popol s, J ai été heureuse de mieux vous connaître, et j espère qu on gardera contact. Les repas entre filles, c est quand vous voulez. A Miko, Pour notre amitié, et pour cette année qui, j espère, va de nouveau nous rapprocher. A Mélanie, pour tout ce que l on a partagé. A Emilie, pour notre collocation exceptionnelle et nos apéros interminables. A Huguette, ma p tite Pockie, Pour ta gentillesse, tes gratins dauphinois en boîte, mais surtout ton amour pour Miillllyyy, qui ont fait de notre collocation une année inoubliable. A Guillaume, mon père de clinique, pour tous ces moments où l on voulait «viser la lune». A Splinter, un fils de clinique exceptionnel. Au groupe 13, groupe balèze, pour toutes nos soirées mémorables. A tous les internes, pour cette année qui s annonce riche en émotions!!! A Elise et Eric, Pour toutes ces soirées de «blindtest» mémorables surtout celle à la bougie! Heureuse de vous connaître. A tous ceux qui ont fait, qui font, qui feront partie de ma vie et que je n oublie pas - Page 9 -
TABLE DES MATIERES INTRODUCTION 13 I. Les radicaux libres et le stress oxydatif cellulaire 15 I.1. Les radicaux libres 15 I.1.1. Définition et caractéristiques des radicaux libres 15 I.1.1.1. Définition 15 I.1.1.2. Caractéristiques des radicaux libres 15 I.1.2. Nature et mécanismes de production des radicaux libres 17 I.1.2.1. Les radicaux primaires 17 I.1.2.1.1. L anion superoxyde (O 2 - ) 17 I.1.2.1.2. Le radical hydroxyle ( OH) 18 I.1.2.2. Les espèces réactives de l oxygène 19 I.1.2.2.1. Le peroxyde d hydrogène (H 2 O 2 ) 19 I.1.2.2.2. L oxygène singulet ( 1 O 2 ) 20 I.1.2.3. Les autres radicaux libres 20 I.1.2.3.1. Les radicaux libres de l oxygène 20 I.1.2.3.2. Les radicaux libres de l azote 21 I.1.3. Intérêt de la présence des radicaux libres pour l organisme 22 I.1.3.1. Rôle dans l homéostasie cellulaire 22 I.1.3.2. Rôle dans la communication cellulaire 22 I.1.3.3. Autres rôles 22 I.2. Notion de stress oxydatif cellulaire 24 I.2.1. Définition et origines du stress oxydatif 24 I.2.1.1. Définition 24 I.2.1.2. Origine de la rupture d équilibre 24 I.2.1.2.1. Déplétion en molécules antioxydantes 24 I.2.1.2.2. Excès de production de radicaux libres 24 I.2.2. Les lésions cellulaires associées aux radicaux libres 25 I.2.2.1. La peroxydation des lipides membranaires 25 I.2.2.2. La dénaturation des protéines 28 I.2.2.3. L altération de l ADN 29 I.3. Défenses physiologiques contre le stress oxydatif cellulaire 30 I.3.1. Systèmes antioxydants enzymatiques 31 I.3.1.1. Enzymes responsables de la dismutation de l ion superoxyde : les superoxydes dismutases _ 31 I.3.1.2. Enzymes agissant sur les peroxydes 31 I.3.1.2.1. La catalase 31 I.3.1.2.2. Les glutathion peroxydases (GPx) 32 I.3.1.3. Interrelations des enzymes antioxydantes dans la régulation du stress oxydatif cellulaire _34 I.3.2. Systèmes antioxydants non enzymatiques : exemple du glutathion 34 I.3.2.1. La capture d espèces radicalaires 35 I.3.2.2. Participation à l activité d enzymes antioxydantes 36 II. Intérêt potentiel des antioxydants en hépatologie 39 II.1. Les antioxydants : une famille hétérogène 39 II.1.1. Index thérapeutique 39 II.1.1.1. La vitamine E 39 II.1.1.2. La vitamine C 41 II.1.1.3. La N-acétylcystéine (NAC) 44 II.1.1.4. La S-adénosylméthionine (SAMe) 45 II.1.1.5. La silymarine (extrait du chardon-marie, Silybum marianum) 48 II.1.1.6. La colchicine 50 II.1.1.7. Le zinc 51 II.1.1.8. L acide ursodésoxycholique 54 - Page 11 -
II.1.1.9. Le sélénium 55 II.1.2. Réflexions autour de l index thérapeutique 58 II.2. De la pathogénie et de la physiopathologie des affections hépatiques à l utilisation des antioxydants en hépatologie 60 II.2.1. Affections hépatiques et stress oxydatif cellulaire 60 II.2.1.1. Le stress oxydatif cellulaire dans les affections hépatiques 61 II.2.1.1.1. Mécanisme du stress oxydatif 61 II.2.1.1.2. Evaluation du stress oxydatif 63 II.2.1.1.3. Stress oxydatif et affection hépatique : exemple de la lipidose du chat 64 II.2.1.2. Indications générales des antioxydants en hépatologie : notions pharmacologiques 65 II.2.2. Indications spécifiques en hépatologie des antioxydants dotés de propriétés particulières : notions pharmacologiques 69 II.2.2.1. Indication spécifique des antioxydants dans les affections hépatiques associées à une cholestase 69 II.2.2.1.1. Mécanismes physiologiques de la formation de la bile 69 II.2.2.1.2. Physiopathologie de la cholestase et des hépatites cholestatiques 70 II.2.2.1.3. Molécules antioxydantes ayant des propriétés cholérétiques 71 II.2.2.2. Indication spécifique des antioxydants dans les hépatites chroniques idiopathiques 72 II.2.2.2.1. Pathogénie 73 II.2.2.2.1.1. Hépatite chronique et inflammation 73 II.2.2.2.1.2. Hépatite chronique et fibrose 74 II.2.2.2.2. Utilisation raisonnée des antioxydants lors d hépatite chronique 77 II.2.2.2.2.1. Molécules anti-oxydantes ayant des propriétés anti-inflammatoires et immunomodulatrices 77 II.2.2.2.2.2. Molécules anti-oxydantes ayant des propriétés anti-fibrosantes 78 II.2.2.3. Indication spécifique des antioxydants dans les hépatites par surcharge en cuivre 78 II.2.2.3.1. Pathogénie 78 II.2.2.3.2. Molécules antioxydantes ayant des propriétés anti-cuprirétiques 81 III. Applications cliniques des antioxydants en hépatologie vétérinaire 83 III.1. Applications cliniques sur l utilisation des antioxydants dans la lutte contre le stress oxydatif 83 III.1.1. Données cliniques sur l utilisation de la SAMe 83 III.1.1.1. Etudes chez des sujets sains 83 III.1.1.2. Etudes chez des sujets malades 84 III.1.2. Données cliniques sur l utilisation des autres antioxydants 86 III.2. Données cliniques sur l utilisation des antioxydants lors d hépatotoxicoses : exemple de l intoxication au paracétamol 88 III.2.1. Biotransformation du paracétamol dans l organisme 88 III.2.2. Pathogénie de l intoxication au paracétamol 89 III.2.3. Evidence clinique et pharmacologique de l intérêt des antioxydants 90 III.2.3.1. La N-acétylcystéine (NAC) 91 III.2.3.2. La S-adénosylméthionine (SAMe) 93 III.3. Applications cliniques des antioxydants à propriétés particulières dans les affections hépatiques 95 III.3.1. Application dans les affections hépatiques associées à une cholestase 95 III.3.2. Application dans les hépatites chroniques idiopathiques 96 III.3.3. Applications dans les hépatites associées à une surcharge en cuivre 99 III.4. Bilan des différentes applications cliniques 100 CONCLUSION 105 TABLE DES ILLUSTRATIONS 107 BIBLIOGRAPHIE 109 - Page 12 -
INTRODUCTION La toxicité de l oxygène, gaz omniprésent et indispensable pour l organisme, est liée à la formation en excès de formes libres de l oxygène, appelées radicaux libres. Si la notion de radicaux libres est connue des chimistes depuis les années 30, ce n est que depuis les années 1990, avec l avènement du concept de stress oxydatif, que les données sur la réactivité des radicaux libres et leurs actions délétères sur les systèmes biologiques connaissent une véritable explosion scientifique. Un consensus existe aujourd hui concernant l implication des radicaux libres dans la pathogénie et la physiopathologie d affections variées. Des molécules dites anti-oxydantes interviennent selon différents modes d action afin de limiter la production des radicaux libres. Elles constituent donc un mécanisme de défense pour l organisme. Certains antioxydants existent de façon endogène dans l organisme, d autres sont assimilables par voie exogène, qu ils soient naturels ou de synthèse. L intérêt des antioxydants dans le traitement de certaines hépatopathies est un domaine d études récent qui retient l attention de nombreux chercheurs en médecine humaine mais aussi vétérinaire. Depuis quelques années, les publications concernant l intérêt potentiel des antioxydants en médecine humaine dans la prévention et le traitement des lésions hépatiques d origine toxique (notamment celles associées à l'alcoolisme) se multiplient. Une molécule en particulier, la S-adénosylméthionine suscite un vif intérêt : elle a déjà fait l objet de plus de 400 publications référencées dans PubMed en médecine humaine et vétérinaire. Classée chez l homme comme supplément nutritionnel ou médicament suivant les pays, elle est commercialisée en France depuis 2004 comme supplément nutritionnel vétérinaire sous l appellation commerciale ZENTONIL. Les objectifs de ce travail sont de faire un bilan sur les études réalisées chez les carnivores domestiques en ce qui concerne l utilisation des antioxydants en hépatologie, en nous limitant aux espèces canine et féline. Nous nous interrogerons sur l intérêt d un traitement antioxydant dans les affections hépatiques du chien et du chat, sur un plan conceptuel mais aussi à la lumière des études cliniques dont nous disposons. Après avoir expliqué comment les radicaux libres sont à l origine du stress oxydatif cellulaire, nous présenterons l intérêt potentiel des antioxydants dans les affections hépatiques, pour enfin indiquer les données cliniques dont nous disposons sur leur utilisation en hépatologie vétérinaire. - Page 13 -
I. Les radicaux libres et le stress oxydatif cellulaire Depuis quelques années, le monde des sciences biologiques et médicales s intéresse beaucoup au concept de «stress oxydatif», en référence à une situation où la cellule ne contrôle plus la présence excessive de radicaux oxygénés toxiques. Mais qu est-ce qu un radical libre? Comment se produit un stress oxydatif cellulaire, et quelles en sont les conséquences? Comment la cellule lutte-t-elle contre ce stress? Dans cette partie, nous allons répondre à toutes ces questions. I.1. Les radicaux libres I.1.1. Définition et caractéristiques des radicaux libres I.1.1.1. Définition La cellule, et plus généralement l organisme, ne peuvent se dispenser d oxygène qui est un gaz indispensable à la vie et omniprésent. Les mitochondries utilisent 85% de l O2 présent dans l organisme pour la production d énergie. Cependant 3 à 5% de cet oxygène utilisé lors de l activité métabolique normale est inévitablement à l origine de radicaux libres, hautement toxiques (Pastre 2005). Par définition, les radicaux libres sont des espèces chimiques qui possèdent, sur leur orbitale la plus externe, au moins un électron non apparié, résultant soit d un gain soit de la perte d un électron (Twedt 2001-a). Par exemple, par gain d un électron, la molécule d O2 devient l anion superoxyde : O 2 + 1e - O 2 - I.1.1.2. Caractéristiques des radicaux libres Les radicaux libres dérivés de l oxygène sont des radicaux issus d une réduction incomplète de l oxygène (Guilford et al. 1996). Ils sont générés au cours du métabolisme normal de l oxygène dans l organisme et sont produits de manière continue en très faible quantité. - Page 15 -
La molécule d oxygène a une structure biradicalaire, car elle possède deux électrons non appariés. Pour des raisons de restriction de spins, la molécule est inerte vis à vis de la plupart des molécules organiques qui sont des «singulets» (tous les électrons sont uniformément appariés). Malgré sa nature biradicalaire, l oxygène est donc stable et peu réactif (Clausse 2001, Bonnefis 2005, site Internet de l université de Liège b). O O Figure 1 : Caractère biradicalaire de l oxygène (Site Internet de l université de Liège b) Par contre, le champ magnétique créé par la rotation de l électron célibataire du radical libre n'est pas compensé par la rotation en sens inverse d'un électron apparié. Les radicaux libres sont appelés des «doublets» (un seul électron non apparié) (Favier 2004). H O Figure 2 : Electron non apparié du radical hydroxyle (Favier 2004) Cette propriété confère une réactivité très élevée aux radicaux libres. Leur durée de vie ne dépasse pas quelques microfractions de secondes : ils auront toujours tendance à combler leur orbitale déficitaire pour devenir plus stable en captant un électron à une autre molécule qui devient à son tour radicalaire ; ils vont donc se réduire en oxydant d autres molécules. Les radicaux libres sont donc à l origine d une réaction en chaîne : chaque radical libre instable peut réagir avec d autres molécules, de différentes manières, en entraînant des actions délétères sur les molécules en question. Il engendre ainsi la formation d un nouveau radical, source d une réaction en chaîne auto-accélérée en l absence de substances antioxydantes. OH R H D D H H 2 O R D H X H X Z H X H Z... Figure 3 : Exemple de réaction en chaîne (Site Internet de l Université de Liège a) - Page 16 -
La réaction en chaîne peut s arrêter par recombinaison de deux radicaux libres : X + X X X Les radicaux libres sont toxiques au plus haut degré pour l intégrité cellulaire, mais ils sont utiles à l organisme à dose raisonnable : ils interviennent dans la signalisation et l homéostasie cellulaire ( I.1.3.). Leur caractère toxique est contrecarré par un ensemble de systèmes de désactivation cellulaires : enzymes antioxydantes et les antioxydants non enzymatiques, Les radicaux libres font partie de systèmes ubiquitaires. Leurs cibles sont nombreuses dans l organisme, c est pourquoi ils sont impliqués dans de très nombreuses affections (Delattre et al. 2005, Favier 1997, Favier et al. 1997, Grandjean 2005). I.1.2. Nature et mécanismes de production des radicaux libres Parmi toutes les espèces radicalaires susceptibles de se former dans les cellules, il convient de distinguer un ensemble restreint de composés radicalaires qui jouent un rôle particulier en physiologie, appelés radicaux primaires. Il s agit de l anion superoxyde (O2 - ) et du radical hydroxyle (OH ) qui dérivent de l O2. D autres espèces dérivées de l O2, dites espèces réactives de l oxygène, n ont pas une structure radicalaire mais sont aussi réactives car elles peuvent être des précurseurs de radicaux, et donc initier ou propager des dommages oxydatifs. Il s agit de l oxygène singulet ( 1 O2) et du peroxyde d hydrogène (H2O2) (Delattre et al. 2005, Favier 1997, Favier 2003). I.1.2.1. Les radicaux primaires I.1.2.1.1. L anion superoxyde (O 2 - ) Au sein de la chaîne mitochondriale se produit la réduction complète de l oxygène, par le transfert de quatre protons et de quatre électrons, conduisant à la formation d eau : O 2 + 4 e - + 4 H + 2 H 2 O Cette réaction ne peut s effectuer qu en plusieurs étapes successives : c est au niveau du complexe IV de la chaîne mitochondriale que la molécule d oxygène se - Page 17 -
fixe jusqu à être totalement réduite en eau. Cependant, au niveau des complexes I, II et/ou III, il y a une fuite d électrons célibataires amenant à la réduction partielle de l oxygène. C est ainsi qu en acceptant un électron supplémentaire, la molécule d oxygène se transforme en anion superoxyde (O2 - ). O 2 + 1 e - Oxydase O 2 - Cette réaction est catalysée par de nombreuses enzymes oxydases présentes en concentration élevée dans les hépatocytes (xanthine oxydase) et les phagocytes (NADPH oxydase). Parmi les radicaux libres dérivés de l oxygène, l anion superoxyde est celui qui a la réactivité la plus faible vis à vis des substrats bio-organiques. Ainsi, il ne réagit ni avec les acides nucléiques et leurs constituants (bases et sucre-phosphates), ni avec les protéines et leurs acides aminés, ni avec les lipides et les acides gras polyinsaturés qui les constituent (Delattre et al. 2005, Frei 1994). Par contre, l anion superoxyde a une toxicité indirecte en étant le précurseur d autres radicaux libres, tel que le radical hydroxyle ( OH), le peroxyde d hydrogène (H2O2), ou le peroxynitrite (ONOO - ) qui ont des effets délétères. I.1.2.1.2. Le radical hydroxyle ( OH) En présence de métaux de transition tels que le fer ou le cuivre, l anion superoxyde et le peroxyde d hydrogène peuvent interagir pour produire le radical hydroxyle, selon la réaction d Haber-Weiss, catalysée par le fer : H 2 O 2 + O 2 - OH + O 2 + HO - Cette réaction est la résultante de deux réactions : La première est la réduction des ions Fe 3+ ou Cu 2+ par l anion superoxyde (O2 - ) : Fe 3+ + O 2 - Fe 2+ + O 2 La seconde est la réaction des ions métaux réduits (Fe 2+ ou Cu + ) avec le peroxyde d hydrogène (H2O2) pour former le radical hydroxyle (HO ). Cette seconde réaction est appelée «la réaction de FENTON» : H 2 O 2 + Fe 2+ OH + Fe 3+ + HO - - Page 18 -
Le radical hydroxyle est le plus réactif et le plus agressif de tous les radicaux libres. Il est peu sélectif et va pouvoir interagir avec de nombreuses molécules, en générant des actions délétères sur la molécule atteinte ; mais également en engendrant la formation d un nouveau radical, source d une réaction en chaîne autoaccélérée en l absence de substances antiradicalaires. Il en résulte, de cette extrême réactivité, que le radical hydroxyle est une espèce qui diffuse très peu et, par conséquent, qui réagit quasiment sur le lieu de sa production (ou à quelques dizaines de nanomètres de distance) : en effet, dès qu un radical hydroxyle rencontre un substrat, il réagit dès la première collision sans qu un apport énergétique soit nécessaire à la réaction. Cette grande réactivité lui confère également une très faible durée de vie qui ne dépasse pas quelques microsecondes (10-6 secondes) (Beby 1991, Delattre et al. 2005, Frei 1994, Miller et al. 1993). Il réagit selon trois modes d action (Gardes-Albert et al. 2003) : soit en arrachant un électron : HO + Fe 2+ Fe 3+ + HO - soit en arrachant un atome d hydrogène (d un substrat organique RH) : HO + RH R + H 2 O R = radical centré sur le carbone. soit en s additionnant sur les doubles liaisons : HO + C C C C(OH) I.1.2.2. Les espèces réactives de l oxygène I.1.2.2.1. Le peroxyde d hydrogène (H 2 O 2 ) L enzyme superoxyde dismutase catalyse la dismutation de l anion superoxyde en peroxyde d hydrogène : 2 O 2 - Superoxyde dismutase H 2 O 2 + O 2 - Page 19 -
La réduction divalente de l oxygène par des enzymes oxydases telles que la monoamine oxydase ou la diamine oxydase peut aussi former du peroxyde d hydrogène : O 2 + 2 e - Oxydases O 2 - (+ 2 H + H 2 O 2 ) Le peroxyde d hydrogène, en présence de l ion chlorure, et de certaines peroxydases, telle que la myéloperoxydase neutrophile, intervient dans la production de l acide hypochlorique (HOCl) : H 2 O 2 + Cl - Myéloperoxydase HOCl + HO - Bilan de la réduction de l oxygène et de la formation des radicaux libres: + e O - 2 O 2 - + e - (+2H + ) + e H 2 O - + e 2 OH (+ OH) - (+H + ) H 2 O Figure 4 : Etapes successives de la réduction de l oxygène in vivo (Gardes-Albert et al. 2003) I.1.2.2.2. L oxygène singulet ( 1 O 2 ) Il est formé lors du processus d activation photodynamique de l oxygène faisant intervenir des pigments activés : l énergie d excitation est transférée et il y a formation de l oxygène singulet. Ainsi, il peut être produit dans les tissus exposés à la lumière, tels que la peau et l œil. Lumière UV O 1 2 O 2 L oxygène singulet représente la forme activée de l oxygène. C est une forme très énergétique de grande réactivité qui peut oxyder de nombreuses molécules organiques (Bonnefis 2005, Clausse 2001, Frei 1994). I.1.2.3. I.1.2.3.1. Les autres radicaux libres Les radicaux libres de l oxygène Les radicaux peroxyles (RO2 ) sont formés par fixation de l oxygène sur les radicaux centrés sur le carbone (R ) : R + O 2 RO 2 - Page 20 -
Les hydroperoxydes (ROOH) proviennent de l oxydation d un substrat RH : RO 2 + RH ROOH + R Les radicaux alkoxyles (RO ) sont issus de la décomposition des hydroperoxydes (ROOH) par des cations métalliques : ROOH + Fe 2+ RO + HO - + Fe 3+ Ces molécules sont produites de manière accrue lors de dégradations oxydatives au niveau des macromolécules biologiques telles que les acides nucléiques, les protéines et les lipides (Delattre et al. 2005) ( I.2.2.). I.1.2.3.2. Les radicaux libres de l azote Le monoxyde d azote (NO ) est un radical primaire dérivé de l azote. Il est synthétisé à partir de la L-arginine et de l oxygène par la NO-synthase activée par le calcium. H 2 N HN NH NO synthétase + NADPH + O 2 H 2 N HN O + NO H 2 N HO O H 2 N HO O L-arginine L-citrulline Figure 5 : Synthèse du radical monoxyde d azote (Site Internet de l université de Liège c) Le monoxyde d azote est caractérisé par une grande capacité à diffuser à travers les membranes cellulaires et une réactivité limitée. Il interagit avec l ion superoxyde (O2 - ) pour former l anion peroxynitrite (ONOO - ) : NO + O 2 - ONOO - Cet anion est une espèce activée de l oxygène ayant une très grande réactivité et qui peut donc oxyder de nombreuses molécules (protéines, lipides et acides nucléiques). Il diffuse largement à travers les membranes et sa toxicité peut - Page 21 -
s exprimer à distance du site de synthèse (Clausse 2001, Delattre et al. 2005, Favier 2003). Une autre activité du peroxynitrite in vivo, qui est cependant mineure, implique la formation de radicaux hydroxyles (HO ) qui peut initier toute une chaîne de réactions radicalaires comme la peroxydation lipidique. ONOO - + H + HO + NO 2 I.1.3. Intérêt de la présence des radicaux libres pour l organisme Le paradoxe des radicaux libres de l oxygène ou de l azote est qu ils constituent des molécules extrêmement toxiques mais néanmoins indispensables à la vie. Ils remplissent en effet de très nombreuses fonctions utiles (Favier 2003, Grandjean 2005, Pastre 2005). I.1.3.1. Rôle dans l homéostasie cellulaire Les radicaux libres interviennent dans l activité bactéricide des cellules phagocytaires (macrophages, polynucléaires). Après sa phagocytose par un macrophage, une bactérie se retrouve dans une vésicule appelée phagosome. Celui-ci va fusionner avec un lysosome pour donner un phagolysosome. Une succession de réactions brutales et intenses, appelées «explosion respiratoire» se déclenche alors et génère des oxydants bactéricides : H2O2, O2 -, OH, NO, avec en plus dans le polynucléaire, HOCl et 1 O2. Ce mélange réactionnel détruit par oxydation l ensemble des composants bactériens. I.1.3.2. Rôle dans la communication cellulaire Les radicaux libres interviennent également comme des médiateurs intra- ou extracellulaires. Ils permettent d induire la réponse cellulaire à de nombreux stimuli thermiques, physiques (rayons ultraviolets), chimiques (xénobiotiques), permettant l expression de gènes de défense. I.1.3.3. Autres rôles Les radicaux peuvent aussi servir de relais physiologiques entre différentes cellules, dans la stimulation de certains récepteurs membranaires et régulent de nombreuses fonctions comme la vasodilatation et la prolifération cellulaire. Lors d agressions cellulaires majeures, ils sont émis comme signaux de mort cellulaire, ou inducteurs d apoptose, lorsque les capacités de réparation cellulaire sont dépassées. - Page 22 -
Les radicaux libres pourraient même être les premiers responsables de l activation des kinases en cas d agressions cellulaires variées (exposition à une irradiation, des cytokines inflammatoires, des carcinogènes chimiques,...). La figure ci-dessous résume les différents mécanismes de formation des radicaux libres et des espèces réactives de l oxygène. Figure 6 : Origine des différents radicaux libres oxygénés et espèces réactives de l oxygène impliqués en biologie (Favier 2003) Malgré leurs nombreuses fonctions cellulaires, les radicaux libres constituent des espèces hautement toxiques pour l organisme, et responsables du stress oxydatif cellulaire. - Page 23 -
I.2. Notion de stress oxydatif cellulaire I.2.1. Définition et origines du stress oxydatif I.2.1.1. Définition Dans les conditions physiologiques, l équilibre entre la production de radicaux libres et les défenses antioxydantes de la cellule est fragile. Lors d un déficit en substances antioxydantes ou de production excessive de radicaux libres, l équilibre est rompu engendrant un stress oxydatif. Par définition, le stress oxydatif est l état dans lequel les réactions prooxydantes dépassent les capacités anti-oxydantes d un tissu ou d un organisme. Il résulte d un déséquilibre du ratio «antioxydants/pro-oxydants» (Favier 1997, Favier 2003, Grandjean 2001, Grandjean 2005). I.2.1.2. Origine de la rupture d équilibre I.2.1.2.1. Déplétion en molécules antioxydantes Cette déplétion se rencontre lors de carence nutritionnelle relative ou absolue (vitamines, oligoéléments), de vieillissement cellulaire et organique, I.2.1.2.2. Excès de production de radicaux libres Cet excès peut être observé dans quatre cas : lors de modification de l apport en oxygène à l organisme ou à la cellule : hypoxie d altitude, hyper-oxygénation lors de la respiration artificielle, ischémie/reperfusion tissulaire, hypo-oxygénation cérébrale ; lors de la présence de substances ou phénomènes pro-oxydants (pesticides, fumées, radiations, métaux lourds, ) ; lors d activation excessive des systèmes de production «naturelle» des radicaux libres : affections spécifiques (maladies cardio-vasculaires, cataracte), syndromes inflammatoires chroniques, prolifération tumorales ; lors d anomalies génétiques responsables d un mauvais codage d une protéine : o soit enzymatique antioxydante (comme la superoxyde dismutase) ; - Page 24 -
o soit synthétisant un antioxydant (comme la gamma-glutamyl synthétase à l origine du glutathion) ; o soit régénérant un antioxydant ; Ou lors d anomalies d un promoteur de ces mêmes gènes que la mutation rendra incapable de réagir à un excès de radicaux libres. Généralement, le stress oxydant sera la résultante de plusieurs de ces facteurs et se produira dans un tissu et un type cellulaire bien précis, objet de la défaillance (Favier 2003, Grandjean 2001, Grandjean 2005). I.2.2. Les lésions cellulaires associées aux radicaux libres La toxicité cellulaire des radicaux libres se manifeste par la survenue progressive de processus lésionnels sur différents éléments constitutifs de la cellule pouvant conduire à la mort de celle-ci. Les radicaux libres sont également responsables de lésions secondaires dues au caractère cytotoxique et mutagène des produits libérés, notamment lors de la peroxydation des lipides membranaires (Favier 1997). I.2.2.1. La peroxydation des lipides membranaires Les lipides, et notamment les acides gras polyinsaturés des phospholipides membranaires (membranes cytoplasmiques et des organites intracellulaires), sont la cible privilégiée de l attaque par les radicaux libres, surtout par le radical hydroxyle (HO ) (Grandjean 2001, Favier 2003). Cette attaque est appelée peroxydation lipidique. Son mécanisme comprend trois étapes : L initiation : des radicaux se forment sous l influence de divers facteurs : lumière, chaleur, présence de métaux ou d autres radicaux comme le radical hydroxyle (HO ). Le radical hydroxyle est capable d arracher un hydrogène à l un des atomes de carbone situés entre deux doubles liaisons du lipide, pour former une molécule d eau (Murray et al. 2002): RH + HO R + H 2 O (1) Cette réaction supprime le radical hydroxyle mais entraîne la formation d un radical centré sur le carbone (R ). - Page 25 -
La propagation : le radical centré sur le carbone (R ) va subir un réarrangement pour former, par délocalisation de la double liaison, un radical diène conjugué, oxydé en radical peroxyle (ROO ) : R + O 2 ROO (2) Cette réaction forme rapidement une réaction en chaîne, car le radical peroxyle est suffisamment réactif pour attaquer les autres acides gras polyinsaturés en arrachant un hydrogène et former un hydroperoxyde lipidique (ROOH) ainsi qu un nouveau radical centré sur le carbone (R ) : ROO + RH ROOH + R (3) Cette étape de propagation peut se reproduire jusqu à épuisement de l acide gras et/ou de l oxygène. Dans ces conditions, une réaction en chaîne s installe, propagée par les radicaux R et ROO. Ainsi, un tel processus amplifie notablement le phénomène de peroxydation lipidique (Clausse 2001, Delattre et al. 2005, Hill s 2001). La terminaison : elle correspond à diverses réactions de couplage entre deux radicaux hydroxyles formant des produits non radicalaires et terminant la chaîne de réactions : 2 ROO ROO + R Produits non radicalaires (4) Ainsi, un radical hydroxyle peut aboutir à la conversion de plusieurs acides gras polyinsaturés en hydroperoxydes lipidiques (ROOH). Ceux-ci s accumulent et entraînent une modification de la souplesse des membranes, et donc une modification du fonctionnement de nombreux transporteurs, récepteurs et de la transduction de signaux. Dans le foie, cette modification entraîne un changement dans la structure et le métabolisme de l hépatocyte. Si les lésions sont trop importantes, les hydroperoxydes lipidiques peuvent conduire à la mort de la cellule (Frei 1994, Pastre 2005, Twedt 2001- a). Comme alternative de la réaction (3), le radical peroxyle (ROO ), après évolution en un peroxyde cyclique et coupure de la molécule, peut libérer différents aldéhydes hautement cytotoxiques et mutagènes, tels que le malonaldialdéhyde et le 4-hydroxynonenal. Ces derniers peuvent réagir avec l ADN ou des protéines et - Page 26 -
provoquent des lésions structurales et fonctionnelles (Clausse 2001, Favier 2003, Frei 1994). La figure ci-dessus montre la réaction en chaîne de la peroxydation lipidique avec la formation de produits terminaux. COOH Arachidonate (RH) HO COOH Radical arachidonique (R ) COOH Radical diène conjugué O 2 REACTION EN CHAINE RADICALAIRE OO COOH Radical peroxyle (ROO ) COOH Arachidonate O-O COOH OOH COOH Endoperoxyde Hydroperoxyde (ROOH) H 3 C-CH 3 O O éthane Malonaldialdéhyde HO OH CH 2 CH 2 O HO H 3 C CH2 CH3 isoprostanes pentane OH Hydroxynonenal PRODUITS TERMINAUX Figure 7 : Mécanisme en chaîne de la peroxydation des acides gras polyinsaturés et nature des produits terminaux formés (Favier 2003) - Page 27 -
I.2.2.2. La dénaturation des protéines L attaque des protéines par le radical hydroxyle (HO ) ou par l oxygène singulet ( 1 O2) peut générer des produits finaux très variés. Par contre, le peroxyde d hydrogène (H2O2) et l anion superoxyde (O2 ) ne semblent oxyder que des protéines présentant des groupements sulfhydryles (-SH) facilement oxydables et accessibles. Les acides aminés les plus sensibles au stress oxydant sont le tryptophane, la tyrosine, la phénylalanine, la méthionine et la cystéine. Les dommages infligés aux protéines peuvent venir non seulement d une attaque directe par les radicaux libres, mais aussi par des produits issus de la peroxydation lipidique comme le malonaldialdéhyde et le 4-hydroxynonénal. Les protéines peuvent alors subir soit des réticulations par formation notamment de ponts bi-tyrosine, soit des coupures en cas d agression forte, soit des modifications de certains acides aminés en cas d agressions modérées. Lorsque qu un radical d acide aminé est formé dans une protéine, les électrons peuvent migrer sur d autres résidus aminés. Ainsi, le site final oxydé au sein de la protéine n est pas forcément le site initial d oxydation. Des enzymes, mais aussi des récepteurs cellulaires et des protéines de transport, peuvent être la cible de ces phénomènes oxydatifs et perdre leurs propriétés biologiques. Elles deviennent alors beaucoup plus sensibles à l action des protéases. Les protéines oxydées se révèlent très hydrophobes, soit par suppression de groupements amines ionisables, soit par extériorisation de zones hydrophobes centrales. Elles vont alors former des amas anormaux dans et autour des cellules. Associés aux aldéhydes produits lors de la peroxydation lipidique, ces amas forment des dépôts de lipofuschines caractéristiques du vieillissement cellulaire. Aussi, des altérations peuvent concerner les protéines impliquées dans le maintien de gradients ioniques entre les cellules et les fluides extracellulaires. C est le cas des pompes à calcium ou à potassium. Ces protéines sont essentielles dans la genèse du signal électrique des cellules musculaires et nerveuses. On comprend donc aisément les conséquences de leur dénaturation oxydative au sein de l organisme (Clausse 2001, Favier 2003, Frei 1994, Grandjean 2005). Les radicaux libres hépatiques oxydent les protéines soufrées tel que le glutathion (GSH) avec épuisement du système enzyme péroxydase-glutathion ( I.3.). - Page 28 -
I.2.2.3. L altération de l ADN Les bases qui composent la molécule d ADN, et particulièrement la guanine, sont très sensibles à l oxydation (Cadet et al. 2002, Cadet et al. 2003). Cinq classes principales de dommages oxydatifs induits par le radical hydroxyle (HO ) sur l ADN peuvent être identifiées (Favier 2003, Grandjean 2005) : l oxydation des bases puriques et pyrimidiques (particulièrement la guanine), engendrant un grand nombre de bases modifiées ; l attaque de la liaison entre la base et le désoxyribose qui crée un site abasique non fonctionnel (= partie de l ADN dépourvue d une base purique ou pyrimidique et ayant perdu l information génétique par rupture de la liaison entre une base et le désoxyribose) ; la création d adduits de dérivés de la peroxydation lipidique, tel que le malonaldialdéhyde-guanine ; l attaque radicalaire des protéines, qui sont très nombreuses à entrer en contact avec l ADN pour le protéger ou pour le lire (histones, enzymes et facteurs de la réplication ou de la transcription), entraîne la genèse de pontages ADN-protéines ou des adduits sur des bases de type lysinoguanine ; des cassures de brins, par destruction du désoxyribose, qui créent une coupure de chaîne simple brin. Figure 8 : Lésions de l ADN formées par attaque radicalaire (Favier 2003) - Page 29 -
Selon les études, le support de l information génétique reçoit 10 000 à 100 000 impacts par jour en provenance des radicaux libres de l oxygène, générateurs de lésions du matériel nucléaire immédiatement réparées par les enzymes intranucléaires (excision de bases, excision de nucléotides, couplées ou non à la transcription ; le système de réparation des mésappariements et la réparation par recombinaison). Malheureusement, ce mécanisme peut se dérégler, et dans ce cas, les lésions non réparées vont perturber les mécanismes de réplication de l ADN et entraîner : soit des erreurs de lecture et de synthèse par des ADN polymérases translésionnelles infidèles aboutissant à une mutation ponctuelle dans le génome ; soit une impossibilité de copie de l ADN qui aboutira à la mise en route du suicide programmé des cellules par un mécanisme appelé apoptose ; soit cette modification de l ADN induit des mutations par transversions GC (Guanine/Cytosine) vers TA (Thymine/Adénine) souvent observées spontanément dans les cellules cancéreuses. Ces anomalies de fonctionnement des gènes sont responsables, selon la dose de radicaux libres, d une fibrose, d une inhibition de la prolifération cellulaire, d une apoptose ou d une nécrose (Favier 1997, Favier 2003). Le rôle des nombreux métaux fixés à l ADN, qui est un polyanion (Fe, Mg, Zn, Cu, Ni, Cd, ), est crucial pour amplifier ou orienter le profil de ces lésions : en effet, ils sont capables de renforcer les effets néfastes déjà observés par la formation du radical hydroxyle. Les mutations d ADN peuvent avoir lieu au niveau nucléaire mais aussi au niveau mitochondrial. L ADN mitochondrial semble encore plus sensible que l ADN nucléaire car il ne possède pas de transcriptase réverse et n est pas complexé avec des histones. Il peut donc subir des mutations suite aux attaques des radicaux libres (Favier 2003, Grandjean 2005). I.3. Défenses physiologiques contre le stress oxydatif cellulaire L organisme dispose de nombreuses substances endogènes capables soit de maintenir les espèces réactives de l oxygène à des concentrations quasi-stationnaires (c est le cas des antioxydants enzymatiques), soit de piéger ces espèces (antioxydants non enzymatiques) (Delattre et al. 2005). - Page 30 -
I.3.1. Systèmes antioxydants enzymatiques I.3.1.1. Enzymes responsables de la dismutation de l ion superoxyde : les superoxydes dismutases Les superoxydes dismutases (SOD) sont des métalloenzymes qui catalysent la dismutation de l ion superoxyde (O2 - ) en molécule de peroxyde d hydrogène et d oxygène (Delattre et al. 2005). 2 O 2 - + 2 H + H 2 O 2 + O 2 Le mécanisme réactionnel est catalysé par un métal situé au cœur de l enzyme dont la nature permettra de distinguer trois isoenzymes (Center 2004, Delattre et al. 2005, Favier 2003) : la superoxyde dismutase à manganèse (MnSOD) située dans la mitochondrie, plus particulièrement dans la membrane interne ; la superoxyde dismutase à cuivre-zinc (Cu,ZnSOD) intracellulaire dans le cytosol ; la superoxyde dismutase à cuivre-zinc (Cu,ZnSOD) extracellulaire située dans la matrice extracellulaire des tissus et à un degré moindre dans les liquides extracellulaires (plasma, lymphe). Les SOD ont une activité importante au niveau du foie. I.3.1.2. Enzymes agissant sur les peroxydes Les principales enzymes capables de détruire le peroxyde d hydrogène sont les catalases à cofacteur fer et les glutathion peroxydases à cofacteur sélénium (Favier 2003). I.3.1.2.1. La catalase La catalase est une enzyme héminique à cofacteur fer, localisée dans les peroxysomes, en particulier dans les hépatocytes et les érythrocytes (Clausse 2001, Favier 2003). La réaction catalysée par cette enzyme est une dismutation du peroxyde d hydrogène en eau et en oxygène moléculaire (Delattre et al. 2005) : - Page 31 -
catalase 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 Elle n élimine pas la totalité du peroxyde d hydrogène, mais son rôle est très important, surtout en présence d ions ferreux, en permettant d éliminer l excès de peroxyde d hydrogène afin que la réaction de FENTON ne puisse pas s amplifier (Favier et al.1997). Son affinité pour le peroxyde d hydrogène reste cependant inférieure à celle de la glutathion peroxydase (Clausse 2001). I.3.1.2.2. Les glutathion peroxydases (GPx) Ces enzymes sont capables de détoxifier le peroxyde d hydrogène, le deuxième substrat étant le glutathion réduit (GSH) sur lequel elles transfèrent l oxygène, le transformant en glutathion oxydé (GSSG): H 2 O 2 + 2 GSH GSSG + H 2 O Le glutathion est régénéré par la glutathion-réductase (GSSG réductase), en présence d un cofacteur, le NADPH (Beby 1991). GSSG + NADPH GSSG-réductase 2 GSH + NADP Les glutathion peroxydases ne sont pas spécifiques du peroxyde d hydrogène, les hydroperoxydes (ROOH) des phospholipides des membranes cellulaires sont également des substrats possibles. ROOH + 2 GSH GPx GSSG + ROH + H 2 O L activité détoxifiante des glutathion peroxydases face aux hydroperoxydes (ROOH) nécessite l intervention d une autre enzyme, la phospholipase A2. Cette dernière libère les peroxydes d acides gras des membranes cellulaires en hydrolysant les fonctions esters des phospholipides membranaires. Les peroxydes libérés dans le cytosol sont alors transformés par les glutathion peroxydases tandis que la chaîne d acides gras manquante est resynthétisée (Clausse 2001). Les glutathion peroxydases sont inhibées par les ions superoxydes (Delattre et al. 2005). On distingue 5 isoenzymes de la glutathion peroxydase, dont la plus abondante est la glutathion peroxydase 1, cytoplasmique (90%) et mitochondriale (10%). Elle est exprimée dans la plupart des cellules, particulièrement abondante dans les érythrocytes, les reins et le foie. - Page 32 -
C est la glutathion peroxydase 4 qui peut directement réduire, sous l action préalable d une phospholipase A2, les hydroperoxydes des phospholipides. Ainsi, elle joue un rôle fondamental dans la protection des membranes cellulaires contre les effets délétères de la peroxydation lipidique. Elle est localisée à deux endroits dans la cellule : dans la mitochondrie et dans le cytoplasme. La glutathion peroxydase 4 humaine peut également réduire les hydroperoxydes de la thymine de l ADN. Le schéma ci-dessous récapitule la formation des différents radicaux libres de l oxygène, leurs actions délétères, ainsi que le mode d action des différents systèmes de défense cellulaires. O 2 Oxygène Superoxyde dismutase CuZn O 2 - Anion superoxyde Superoxyde dismutase Mn Glutathion peroxydase Se Catalase Fe H 2 O 2 Peroxyde d hydrogène Fe Cu HO Radical hydroxyle H2O ADN oxydés Lipides oxydés Protéines oxydées Figure 9 : Mode d action des principaux systèmes enzymatiques antioxydants et de leurs cofacteurs métalliques (Favier 2003) - Page 33 -
I.3.1.3. Interrelations des enzymes antioxydantes dans la régulation du stress oxydatif cellulaire L activité de la superoxyde dismutase (SOD) qui dismute l ion superoxyde (O2 - ) conduit à la formation de peroxyde d hydrogène (H2O2) qui est lui-même un composé oxydant. Une bonne protection ne peut donc être obtenue par les superoxydes dismutases seules. La catalase et/ou les glutathion peroxydases devront alors compléter son action pour obtenir un effet protecteur optimal contre les radicaux libres (Favier 2003, Favier et al. 1997). Exemple de l action complémentaire entre la SOD qui catalyse la réaction (1) et la catalase qui catalyse la réaction (2), pour obtenir des substances non radicalaires : 2 O - 2 + 2 H + SOD H 2 O 2 + O 2 (1) catalase 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 (2) 4 O 2 - + 4 H + 3 O 2 + 2 H 2 O (3) La mitochondrie contient à la fois Cu,ZnSOD située dans l espace intermembranaire, et la MnSOD située à la fois dans la matrice et la membrane interne. Il existe une coopération entre les superoxydes dismutases selon la localisation cellulaire : tout ion superoxyde entrant dans l espace inter-membranaire de la mitochondrie sera immédiatement dismuté par la Cu,ZnSOD. En revanche, les ions superoxydes formés dans la matrice seront dismutés par la MnSOD (Delattre et al. 2005). I.3.2. Systèmes antioxydants non enzymatiques : exemple du glutathion Le glutathion est un tripeptide (glutamine-cystéine-glycine) impliqué dans la prévention de l oxydation des groupements thiols grâce à son pouvoir réducteur. Il est le principal antioxydant intracellulaire où il est présent essentiellement sous forme réduite (GSH). Il est impliqué notamment dans la détoxification hépatique (Cottiglieri 2002). Il joue un rôle majeur dans la protection des lipides, des protéines et des acides nucléiques contre l oxydation. - Page 34 -
Gly Gly Gly Cys Cys S S Cys Glu Glu Glu Glutathion réduit (GSH) Glutathion oxydé (GSSG) Il a une fonction protectrice qui est particulièrement importante dans le foie qui est l organe le plus concentré en glutathion : les hépatocytes ont la capacité de convertir la méthionine en cystéine pour la production de glutathion dans la voie de la transsulfuration (Figure 18, Figure 31), et d exporter le glutathion dans la bile et le plasma. Ainsi, il y a un constant renouvellement de celui-ci dans l organisme, le foie occupant une position centrale dans ce flux dynamique. La concentration hépatocellulaire en glutathion reflète l équilibre entre sa synthèse, son utilisation et son exportation (Center 2004, Davidson 2002, Favier et al. 1997). En tant qu antioxydant, le glutathion peut intervenir dans deux types de mécanismes : la capture d espèces radicalaires et la participation à l activité d enzymes antioxydantes. I.3.2.1. La capture d espèces radicalaires Le glutathion est capable, in vitro, de réagir avec les radicaux hydroxyles ( OH), alkoxyles (RO ), peroxyles (ROO ), les radicaux centrés sur le carbone (R ), mais aussi l acide hypochlorite (HOCl), le peroxynitrite (ONOO -), et l oxygène singulet (1O2). GSH + R GS + RH GSH + OH GS + H 2 O GSH + RO 2 GS + ROOH Le glutathion peut également réagir avec les ions Fe 3+ et Cu 2+ et ainsi limiter leur participation à la génération de radicaux libres par la réaction de FENTON ( I.1.2.1.2.). - Page 35 -
GSH + Fe 3+ GS + Fe 2+ + H + GSH + Cu 2+ GS + Cu + + H + Si le glutathion est effectivement doté d un potentiel réducteur et donc se comporte comme un antioxydant, ses dérivés radicalaires (radicaux thiyles GS ) sont des oxydants capables d initier à leur tour de nouvelles attaques moléculaires. I.3.2.2. Participation à l activité d enzymes antioxydantes Le glutathion participe à l activité des glutathion peroxydases en couplant la réduction de l hydroperoxyde avec l oxydation d un substrat réducteur : ROOH + 2 GSH GPx GSSG + ROH + H 2 O La régénération de la fonction thiol GSH à partir de la forme oxydée GSSG se fait grâce à la glutathion réductase qui nécessite un apport de NADPH, H+ par la voie des pentoses phosphates. GSSG + NADPH GSSG-réductase 2 GSH + NADP Le glutathion est également impliqué dans le maintien de l acide ascorbique et de l α-tocophérol sous formes réduites (Favier et al. 1997). La diminution du glutathion hépatique peut indirectement entraîner des effets toxiques dans les hépatocytes en augmentant le stress oxydatif. Cette diminution est commune dans les affections hépatiques sévères, augmentant le risque de dommage oxydant (Watson 2002). - Page 36 -
Au terme de cette première partie, nous retiendrons que les radicaux libres sont des molécules qui ont tendance à soustraire des électrons aux molécules organiques voisines, afin de maintenir leur équilibre électronique. C est cette réaction moléculaire qui entraîne un stress oxydatif endommageant les lipides, les protéines et les acides nucléiques des hépatocytes. Depuis quelques années, les chercheurs démontrent que le stress oxydatif est impliqué dans de nombreuses affections. Les composés désignés sous le terme d antioxydants constituent la principale défense à l encontre du stress oxydatif, et leur fonction est de protéger les composés membranaires et cytosoliques des lésions provoquées par les radicaux libres (Harper 2000). Nous venons de voir qu il existe dans les cellules et, à fortiori, dans l hépatocyte des systèmes de défenses enzymatiques et non-enzymatiques pour éviter la surproduction de radicaux libres, tels que la superoxyde dismutase, la catalase, les glutathion peroxydases et le glutathion réduit. En plus de ces défenses endogènes, il existe une grande variété d antioxydants, naturels ou de synthèse, pouvant être administrés et permettant la lutte contre le stress oxydatif. Quel est leur intérêt en hépatologie? - Page 37 -