Résumé de thèse Anne-Laure Pham-Hung d Alexandry d Orengiani Introduction Les Coronavirus (CoV) sont largement répandus chez les mammifères domestiques, sauvages, chez différentes espèces d oiseaux et sont la source d importantes pertes économiques, notamment dans les élevages de porcs et de volailles. Chez les animaux de compagnie, les Coronavirus sont les agents étiologiques de maladies mortelles, comme la péritonite infectieuse féline et les infections dues au Coronavirus pantropique canin. Ils sont devenus, avec l émergence du SARS-CoV en 2002, d importants pathogènes humains. Avec l émergence du MERS-CoV en 2012 dans la péninsule arabique, six différents Coronavirus sont désormais décrits chez les êtres humains, le SARS-CoV et le MERS-CoV étant les plus mortels, avec 10% et 40% de taux de mortalité, respectivement. De plus, ces deux virus sont le résultat de transmissions inter-espèces. Le SARS-CoV provient de l adaptation d un Coronavirus de chauve-souris et le MERS-CoV a été transmis à l homme par le contact de dromadaires, eux-mêmes probablement contaminés par un Coronavirus de chauve-souris. Les virions des Coronavirus sont enveloppés et forment des structures sphériques. Le génome viral est constitué d un unique brin d ARN positif. Dans le monde viral, c est le plus grand génome à ARN connu à ce jour avec une taille comprise entre 27 et 31 kilobases. L organisation génétique reste très similaire parmi les différents genres des Coronavirus. Il contient à l extrémité 5 du génome, 2 larges cadres de lecture, nommés respectivement ORF1a et ORF1b, qui occupent les deux tiers du génome et codent pour différentes protéines nécessaires à la réplication. En aval de l ORF1b, se trouvent les gènes codant pour les protéines structurales dans l ordre suivant : (HE)-S-E-M-N. En plus, le génome comprend plusieurs protéines non structurales dont les rôles ne sont pas encore bien déterminés à ce 1
jour. Ces protéines semblent avoir un rôle à jouer dans le tropisme cellulaire ou la virulence, car in vivo, la délétion de ces gènes atténue la virulence ou permet un changement de tropisme du virus. La glycoprotéine S constitue les spicules à la surface de la particule et est responsable de l entrée du virus dans la cellule par son attachement aux récepteurs cellulaires. Chiens et chats représentent les espèces les plus communes d animaux domestiques en Europe et présentent une forte prévalence aux infections à Coronavirus. Ces deux espèces cohabitent souvent ensemble, ce qui peut favoriser une transmission inter-espèces. Les Coronavirus canins (CCoV) et félins (FCoV) sont chacun divisés en différents génotypes, eux-mêmes étant le résultat de transmissions entre ces deux espèces, comme c est le cas pour FCoV-II et CCoV-IIb. Il semblerait que les chats soient plus sensibles aux infections à Coronavirus non-félins. En effet, l aminopeptidase N (APN) féline possède cette propriété unique de servir de récepteur à CCoV-II, TGEV, ainsi que HCoV-229E, qui sont des Coronavirus canins, porcins et humains, respectivement. De plus, CCoV-I possède un gène S présentant plus de 80% d homologie avec le gène S de FCoV-I, rendant l infection des chats par CCoV-I probable. C est pour cela qu une étude phylogénétique menée sur des chats naturellement infectées a été conduite, ayant pour but d étudier la diversité des souches CoV chez ces animaux en présence ou non de chiens. Première étude Quatre-vingt-huit échantillons de chats sains et onze de chats souffrant de péritonites infectieuses félines ont été prélevés chez des particuliers. Ces échantillons proviennent de régions ou de pays différents, telles que la région parisienne, la Basse-Normandie, mais aussi la Roumanie. Les renseignements sur la présence de chiens dans le foyer au moment de l échantillonnage a permis de récolter dans la mesure du possible des échantillons canins, afin de comparer les souches éventuelles de CoV présentes chez ces deux espèces. Parmi les 99 2
chats, seulement 19 vivaient en présence de chiens et seulement trois échantillons canins ont pu être récoltés. La présence de Coronavirus a été détectée par RT-PCR en utilisant des amorces ciblant le côté 3 du génome, qui partage une grande identité de séquence nucléotidique avec FCoV, CCoV et TGEV. Tous les chats infectés étaient positifs, ainsi que quinze chats sains. Parmi les trois échantillons canins, un seul s est révélé positif. Les caractérisations phylogénétiques ont été réalisées sur les analyses de séquence des gènes S et N. Cette amplification a été réalisée à l aide d amorces consensus de différentes souches FCoV et CCoV. Sur les vingt-six échantillons analysés, vingt ont été assignés au génotype FCoV-I. Les six échantillons restant contiennent un gène N assimilé à CCoV-I, alors que le gène S est assigné au génotype FCoV- I. Afin de caractériser ces souches, une amplification du gène accessoire ORF3 a été réalisée. Ce gène code pour la protéine accessoire gp3, est unique au génotype CCoV-I et a été amplifié dans cinq cas sur six. L analyse de ces séquences d ORF3 a permis d identifier deux délétions identiques. La première, retrouvée systématiquement, induit un codon stop et est située entre les nucléotides 461 et 490. La seconde, elle, maintient le cadre de lecture, et se situe entre les nucléotides 261 et 288. En revanche, cette délétion n est pas systématique. Ces délétions retrouvées n affecte ni le peptide signal, ni le site de glycosylation d ORF3. La protéine gp3 retrouvée dans ces souches félines est donc composée de 149 ou de 158 acides aminés au lieu des 207 acides aminés de CCoV-I. L étude du génome viral complet serait nécessaire afin de déterminer si ces souches félines atypiques résultent ou non d une double recombinaison entre souches canines CCoV-I et FCoV et permettraient ainsi l identification des sites putatifs de recombinaison. Ces phénomènes sont fréquents chez les Coronavirus, de par la longueur de leur génome, mais aussi par leur système de transcription discontinu. Un des faits marquant de ces souches atypiques est la présence de délétions identiques dans la protéine accessoire gp3. En effet, lors 3
de phénomènes de changement d espèces ou de changement de tropisme cellulaire par les Coronavirus, plusieurs études récentes ont pu observer des délétions dans les protéines accessoires, en plus de mutations dans la protéine S. Seconde étude Les propriétés et les fonctions de la protéine gp3 sont encore inconnues à ce jour. Etant donné que des formes tronquées, nommées gp3-δ1 et gp3-δ2 ont pu être mises en évidence dans un cadre de transmissions inter-espèces, l impact de ces délétions durant l infection par les souches atypiques a été recherché dans une seconde étude. Ces trois protéines, malgré les délétions, conservent toutes un peptide signal potentiellement clivable et un site putatif de N- glycosylation. Les analyses in silico (réalisées à l aide du logiciel PSORT) donnent une prédiction de sécrétion pour les trois protéines dans le milieu extracellulaire avec une probabilité de 44%, ou bien une localisation dans le réticulum endoplasmique (RE), avec une probabilité plus faible de 22%. A travers un système de traduction in vitro, la protéine gp3 a été auparavant caractérisée comme une glycoprotéine de 28 kda, possédant un peptide signal clivable. En revanche, sa fonction reste non élucidée. Ici, afin de conserver le contexte hôtespécifique de l étude, les protéines gp3, gp3-δ1 et gp3-δ2 été exprimées et analysées dans des lignées cellulaires canines et félines, sélectionnées pour leur sensibilité à une infection au CoV. En l absence d anticorps spécifiques à gp3, les protéines ont été exprimées via des vecteurs d expression, avec une étiquette 3xFlag à l extrémité C-terminale. Les trois séquences clonées ont été choisies pour leur très grande identité de séquence entre elles (72,52% entre ORF3 et ORF3-Δ1 et 94,30% entre ORF3-Δ1 et ORF3-Δ2), sans les délétions. Ce choix a été motivé pour permettre d évaluer les différences entre les trois protéines exprimées et non les éventuelles substitutions d acides aminés. Les trois protéines gp3 possèdent les mêmes propriétés biochimiques dans des lignées canines ou félines et sont localisées dans le réticulum endoplasmique, en absence de signal spécifique 4
de rétention, quelle que soit la lignée cellulaire utilisée. Toutes s oligomérisent par des ponts disulfures en dimères ou en formes multimériques plus importantes, comme c est le cas pour gp3-δ1. Cette oligomérisation, pourrait être due aux quatre résidus cystéine présents aux positions 25, 71, 124 et 149 et communs aux trois protéines. De plus, elles sont toutes N- glycosylées avec un sucre complexe de type polymannose, en accord avec leur localisation dans le RE des cellules. Sans aucun signal spécifique de rétention pour le RE et sans domaine transmembranaire, les protéines gp3 auraient pu être retenues par un non clivage du peptide signal. C est pour répondre à cette question que des mutants des trois protéines ont été construits, contenant soit un site de clivage muté du peptide signal, soit une délétion du peptide signal. Pour gp3-1 et gp3-2, les mutants contenant un peptide signal non clivable ont une migration plus lente que les formes sauvages, indiquant ainsi un clivage du peptide signal. Pour gp3, la forme sauvage a un poids moléculaire supérieur à la forme sans clivage du peptide signal. D après les études précédentes sur gp3, le peptide signal sauvage induirait une migration aberrante avec un poids moléculaire inférieur à la protéine sans peptide signal. En accord avec ces résultats, un clivage du peptide signal de gp3 en a été conclu. De manière surprenante, cette migration aberrante n a pas été observée pour les protéines gp3-1 et gp3-2, alors que celles-ci contiennent un peptide signal identique. Il est donc probable que la partie C-terminale de gp3 influence la migration de la protéine contenant un peptide signal non clivable. En revanche, les délétions influencent l expression des protéines dans les différentes cellules testées. Toutes les protéines sont visibles dans des cellules canines, mais seule gp3-δ1 conserve une expression détectable en cellules félines. Des analyses effectuées avec des inhibiteurs du protéasome n ont pas permis d améliorer l expression de gp3 et gp3-δ2, menant à la conclusion que leur faible expression en cellules félines n est pas due à un processus de dégradation. Les facteurs de traduction des cellules félines pourraient ainsi 5
influencer les différences d expression observées. Par la suite, l étude de ces protéines dans un contexte viral a été menée. Etant donné que le CCoV de type I ne se réplique pas dans des cellules de laboratoire, le seul moyen de pouvoir étudier ces protéines dans un contexte viral a été d infecter des cellules exprimant les différentes gp3s, avec une souche de Coronavirus canine ne comprenant pas le gène ORF3. Les résultats ont pu démontrer une absence d influence d expression de ces protéines sur la production virale. Le mécanisme par lequel les formes délétées gp3-δ1 et gp3-δ2 confèrent un avantage sélectif aux souches atypiques félines reste encore inconnu à ce jour. L expression optimale de la protéine gp3 en lignée canine et sa présence uniquement dans les souches de Coronavirus canins, pourrait suggérer l importance biologique de cette protéine dans un environnement cellulaire canin. Si la fonction des protéines étudiées corrèlent avec leur expression, alors, il se pourrait que seul gp3-δ1 confère un avantage sélectif dans les lignées cellulaires félines. En l absence de souches de CCoV-I cultivables et de FCoV atypiques, la caractérisation des protéines a été réalisée au travers de transfection transitoire de plasmides d expression. De plus amples études dans un contexte viral seraient nécessaires afin de déterminer le rôle de ces protéines. Etant donné qu il n existe à ce jour aucune souche de CCoV-I cultivable en laboratoire, la construction d un clone infectieux de CCoV, avec et sans les gènes ORF3, pourrait permettre d évaluer les avantages apportés par l expression des protéines gp3. Conclusion générale Les différents génotypes de Coronavirus canins (CCoV-I/II) et félins (FCoV-I/II) sont phylogénétiquement proches, suggérant des transmissions inter-espèces entre chiens et chats. Lors d analyses de séquences menées sur des chats infectés, des souches félines atypiques ont pu être mises en évidence, contenant un gène S de type FCoV-I, un gène N de type CCoV-I, ainsi que la présence du gène ORF3, spécifique à CCoV-I. Dans ces souches, le gène ORF3 est présent avec une ou deux délétions toujours identiques, conduisant à la synthèse de 6
protéines tronquées gp3-δ1 et gp3-δ2. Les délétions de protéines accessoires étant déjà impliquées dans les transmissions inter-espèces, une étude de caractérisation de la protéine gp3 et de ses différentes formes a été menée. Les trois protéines s oligomérisent de manière covalente et sont retenues dans le réticulum endoplasmique, en absence de signal spécifique de rétention. Les délétions influencent le niveau d expression des protéines en cellules félines, où seule l expression de gp3-δ1 est visible, alors qu elles conservent toutes une expression optimale en cellules canines. De plus amples analyses dans un contexte infectieux permettraient de compléter l étude sur l impact de ces protéines lors de l infection d une nouvelle espèce hôte. Dans un contexte d émergence de nouveaux Coronavirus, la compréhension des mécanismes moléculaires de changement d hôte est cruciale et les Coronavirus félins et canins peuvent représenter un modèle d étude utile. 7