Bactériologie L3. CAPTURE DE PHAGES 2. INTRODUCTION 2.1. Contexte théorique 1. OBJECTIFS - Isoler des phages d E. coli de l environnement. - Effectuer un dénombrement par dilutions en série. - Utiliser une technique de filtration avec filtres millipores. - Les bactériophages (ou phages ) sont des virus s attaquant aux bactéries. - Sept des premiers phages étudiés infectaient la bactérie E. coli, une bactérie qui vit dans l intestin des mammifères. Ils ont été nommés type 1 (T1), type 2 (T2), etc., dans l ordre de leur découverte. - Dès 1952, on a découvert que l ADN constituait le matériel génétique du phage T2. - Les phages sont reproduits par les bactéries selon deux mécanismes principaux : [1; p.446-7] o Cycle lytique : multiplication immédiate du virus et éclatement de la cellule hôte. Ex : phages T d E. coli. o Cycle lysogénique : intégration de l ADN viral au chromosome bactérien sous forme de pro-phage pour un certain temps avant la multiplication virale. Ex : phages λ d E. coli. - Les phages dépendent d hôtes spécifiques pour leur survie et on les trouve dans le même environnement. - Les bactériophages font l objet de recherches intensives : o Ils sont faciles à cultiver en labo sur des cultures bactériennes et permettent de mieux comprendre les mécanismes d infection virale. E. coli ADN E. coli Phages o Certaines compagnies se spécialisent dans l isolation de phages pour constituer les plus grandes banques de phages possible et découvrir de nouveaux médicaments. o Les phages pourraient possiblement être utilisés en complément aux antibiotiques. o Les phages sont utilisés en biotechnologie comme vecteurs pour introduire des gènes. Sarrau Contamination Asepsie Brûleur Rappel Port du sarrau obligatoire. Sécurité au laboratoire s : éviter de se contaminer ou de contaminer des objets ou le labo. En cas de doute, nettoyer soigneusement. Nettoyer le plan de travail et les mains avant et après le labo. Surveiller les becs de gaz. Ajuster le brûleur avec soin. Attacher les cheveux. Comme toujours, il est interdit de manger ou de boire au labo. Page 1 sur 5
2.2. Principe de la méthode employée (Voir la schématisation du protocole) - Amplification. Des phages de bactéries intestinales sont isolés d un échantillon d eau d égout qu on incube avec une culture bactérienne connue pour amplifier leur nombre. - Purification. On élimine d abord par centrifugation les divers débris, les bactéries et leurs fragments. On obtient ensuite une solution de phages plus pure en filtrant avec un filtre muni de pores très fins (0,20 à 0,45µ) qui bloquent le passage des plus petites bactéries, mais non des phages. - Dilutions. Le filtrat est dilué en série avec de la saline pour obtenir plusieurs concentrations différentes. - Culture. Les dilutions du filtrat sont ensemencées sur gélose en présence de bactéries. Après incubation, si le virus est présent, on devrait observer sur les géloses des zones claires appelées plages de lyse, correspondant à des endroits où le virus s est multiplié et a inhibé la croissance bactérienne. - Dénombrement. Le nombre de plages observées sert à évaluer la concentration de phages dans le filtrat. 3. MANIPULATIONS PARTIE 1 : Amplification On peut préparer un kit par table. 1. De manière aseptique, transférer un échantillon d eau d égout dans un erlenmeyer et y ajouter une culture en bouillon d E. coli et du bouillon nutritif concentré 10X dans les proportions suivantes : Eau d égout : milieu de culture 10X : culture bactérienne (45:5:5) 2. Incuber à 37 o C pendant 24 heures. Conserver au réfrigérateur. PARTIE 2 : Isolation Préparation (par équipe): Placer un bécher avec un fond d eau (2 cm) et 6 tubes de gélose LB «molle» sur une plaque chauffante et porter à ébullition pour faire fondre la gélose; puis les maintenir autour de 55 o C. Élimination des résidus par centrifugation (un kit par table) : 3. Avec une pipette stérile, prélever 10 ml de la solution de phages (préparée à la partie 1) et transférer dans un tube stérile à centrifugation avec bouchon. Identifier. 4. Équilibrer dans la centrifugeuse avec un tube d eau ou le tube d une autre équipe. 5. Centrifuger à 2500 rpm pendant 10 minutes. Filtration des phages (un kit par table) : 6. Préparer un appareil à filtration stérile utilisant (démo en classe) Un système de pompe à vide. Une pince stérilisée (flambée à l alcool) pour manipuler le filtre. Un filtre «millipore» de 0,20 à 0,45µ. 7. Une fois la centrifugation terminée, vérifier la présence d un culot et verser le surnageant dans la partie supérieure de l appareil à filtration. Filtrer sous vide en ayant pris soin de dévisser légèrement le couvercle supérieur pour faciliter l écoulement du liquide à travers le filtre. Dilution du filtrat de phages (par équipe) : Effectuer une dilution en série du filtrat allant de 10-2 à 10-7. 8. Identifier 6 tubes stériles selon les dilutions visées (10-2, 10-3... 10-7 ) 9. Pipeter 9,9 ml de saline dans le 1 er tube (10-2 ). 10. Pipeter de saline dans chacun des autres tubes (10-3... 10-7 ) Page 2 sur 5
11. Ajouter 100 µl le filtrat au 1er tube (10-2). Rincer l embout dans le tube. 12. Boucher le tube et agiter au Vortex. 13. Transférer 1000µl du 1er au 2e tube de la série; rincer l embout dans le 2e tube. 14. Boucher. Agiter au Vortex. 15. Répéter ces 2 dernières étapes en complétant la dilution en série jusqu au dernier tube. Ensemencement sur géloses des bactéries et des dilutions de phages (par équipe) : 16. Identifier 6 géloses nutritives en vase de Pétri selon les dilutions effectuées (10-2, 10-3... 10-7 ) Les 3 étapes suivantes devraient être effectuées rapidement, après avoir retiré du bain chauffant un seul tube de gélose molle à la fois. Si on les retire trop vite, les géloses refroidiront et se solidifieront trop tôt.. Retirer un tube de gélose molle du bain chauffant et y ajouter aseptiquement 0,1 ml de culture bactérienne (pipette stérile de 1,0ml). Sans attendre : 18. Ajouter 25µl de la solution la plus diluée de phages (10-7 ); agiter par rotation. Sans attendre : 19. Verser toute la gélose molle sur la gélose en vase de Pétri correspondante tout en la dispersant immédiatement sur toute la surface. Répéter les 3 dernières étapes pour chacune des autres dilutions (à partir de la solution la plus diluée) 20. Bien laisser durcir les géloses avant de porter à incuber à 37oC pendant 24 heures. Page 3 sur 5
4. RÉSULTATS NOMS : 4.1. Plages de lyse Noter le nombre de plages de lyse obtenues sur les géloses ensemencées. Tableau 1. Nb de plages de lyse selon les dilutions du filtrat 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 4.2. Concentration de phages dans le filtrat. Calculer la concentration de phages dans le filtrat d égout (nb/ml), en tenant compte que le nombre de plages de lyse a été obtenu à partir d un volume de 25µl d une des dilutions du tableau 1. 5. QUESTIONS. 5.1. Compte tenu du filtre utilisé dans cette expérience, le filtrat de phages obtenu aurait-il pu contenir A) Un coque bactérien provenant de l eau d égout? B) Une spore bactérienne provenant de l eau d égout? C) Une molécule d ADN ou une protéine libre dans l eau d égout? 5.2. Si on voulait réaliser un protocole pour évaluer la concentration de phages dans un échantillon d eau d égout, quelle partie de notre expérimentation devrait être éliminée? 5.3. Les plages de lyse obtenues sont-elles toutes causées nécessairement par un seul type de phage? 5.4. Pendant l amplification des phages, quel organisme s est reproduit le plus rapidement? Les phages présents de l eau d égout ou les bactéries ajoutées? Répondre en comparant leur cycle de multiplication et en assumant un cycle «lytique» pour les phages. 6. MÉDIAGRAPHIE 1. Reece, J.B. et coll. (2012). Campbell Biologie. 4e éd., ERPI, 1458 p. Page 4 sur 5
Hiver 2014 SCHÉMATISATION DU PROTOCOLE 1 = Étape du texte de lab PARTIE 1 1 PARTIE 2 centrifugeuse Filtration 2 10 ml surnageant Égout :milieu :E.coli (45 :5 :5) Incubation 24hres X 37oC 3 4 7 Tube à centrifugation 2500 rpm X 10 min 5 filtrat 11 Filtrat 100 µl 15 1000µl 15 15 15 15 1000µl 1000µl 1000µl 1000µl 9 Saline 9,9 ml 10-2 10 Saline 10 Saline 10 Saline 10 Saline 10 Saline 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 25µl 18 25µl 18 18 18 18 18 25µl 25µl 25µl 25µl Gélose molle 3ml 19 19 19 19 19 19 Gélose dure 25 ml 20 Incubation 24 hres X 37 o C Page 5 sur 5