CHAPITRE 7 : LE COMPETUR D HEMATOLOGIE Objectifs pédagogiques : - Décrire les principes de fonctionnement des automates d hématologie - Décrire les principales parties d un compteur d hématologie - Décrire les bonnes pratiques d utilisation d un automate d hématologie - Décrire les procédures d entretien courant des compteurs d hématologie
I- Généralités Les compteurs d hématologie ou automates d hématologie sont des appareils plus ou moins complexes utilisés pour la réalisation de l hémogramme hémogramme. L hémogramme est l'étude cytologique quantitative et qualitative du sang circulant. Il comprend : - la détermination ti des nombres absolus de globules l rouges, de globules l blancs et des plaquettes ; -Le dosage de l hémoglobine ob ; - la mesure de l hématocrite ; - le calcul des constantes érythrocytaires : VGM, TCMH et CCMH ; - l établissement pour les globules les blancs de la formule leucocytaire donnant les pourcentages des différents types de leucocytes : polynucléaires neutrophiles, polynucléaires, éosinophiles, basophiles, lymphocytes. Il faut noter que la plupart des automates calcule l'hématocrite à partir de la numération des globules rouges et du volume globulaire moyen.
II Principes de comptage et de mesure des compteurs d hématologie Il existe essentiellement deux principes de comptage utilisés par les automates d'hématologie utilisés par les lb laboratoires. II 1 La variation d impédance Appelé encore, principe i Coulter du nom de son inventeur: Elle est la méthode de référence. L'appareil utilise les variations d une résistance électrique afin de déterminer la taille des cellules sanguines. Les cellules en passant à travers une ouverture déplacent un volume égal de fluide conducteur. De plus un courant électrique est appliqué au niveau de cette ouverture. Chaque passage d'une cellule à travers l'ouverture provoque alorsune augmentationde la résistance électrique. Cette augmentationest est traduite en impulsions électriques dont la hauteur est directement proportionnelle au volume cellulaire. La détermination de la taille de la cellule est donc basée sur le déplacement du liquide et on obtient par conséquent la mesure du volume cellulaire (c'est à dire le VGM) directement. Le nombre de globulesrouges est déterminé parle total d impulsions enregistrées. Le taux d hématocrite est alors déduit selon la formule : Ht = GRxVGM/10.
PRINCIPE DE MESURE PAR LA VARIATION D IMPEDANCE Légende 1 : Electrode Positive 2 : Electrode Négative 3 : Capillaire de mesure 4 : Globule 5 : Flux aspirant 6 : Sang entier dilué BGB BGR
PRINCIPE DE MESURE PAR LA VARIATION D IMPEDANCE La valeur de l impulsion U est proportionnelle au volume cellulaire Electrode interne I= constante Vide régulé U= R I et R = l / s Bac de comptage Electrode externe 1 impulsion U = 1 particule Saphir percé d un microorifice U Flux de diluant conducteur Micro orifice, surface s Diamètre 4mm Impulsion Temps
II-2: La mesure optique Elle associe la cytométrie en flux et la diffraction lumineuse. La source de lumière peut être un laser ou une lampe au tungstène La cytométrie en flux consiste globalement à faire défiler une à une des cellules devant un faisceau laser. Plus précisément, on utilise d'abord un système d'hydrofocalisation qui va permettre de canaliser les cellules et de les faire passer en file indienne. Lors de leur passage à travers le laser, elles émettent t des signaux lumineux qui sont analysés par l'ordinateur associé au cytomètre. Ces signaux peuvent être de plusieurs natures comme par exemple une diffraction de la lumière par la cellule qui est alors liée à sa taille ou un signal de fluorescence émis spontanément par la cellule ou parce qu'elle a été marquée par un antigène, une coloration...
PRINCIPE DE MESURE PAR METHODE OPTIQUE Diluant Diluant Cellule photoélectrique SOURCE Diluant Echantillon Diluant
Hydrofocalisation Flux FOCALISATION de gainage HYDRODYNAMIQUE Flux échantillon Flux Flux de de gainage gainage Flux échantillon
Diffraction lumineuse Intensité de la lumière diffractée peut être corrélée à des caractéristiques morphologiques cellulaires: Intensité de la lumière diffractée par la cellule, recueillie dans l'axe de la lumière incidente, dite "diffraction aux petits angles" (2 à 6 ), (FALS Forward Angle Light Scatter, ou FSC Forward Scatter Channel), est en relation proportionnelle avec la taille cellulaire, la forme cellulaire, et l indice de réfraction cellulaire Intensité de la lumière diffractée par la cellule, recueillie de 8 à 90 de l'axe de la lumière incidente, "diffraction aux grands angles", (RALS Right Angle Light Scatter, ou SSC Side Scatter Channel), estrelation proportionnelleavec l'hétérogénéité du contenu cellulaire, présence/absence et taille de granulation cytoplasmique, forme et taille du noyau, rapport N/C, densité chromatinienne du noyau, ce Paramètre est appelé «Granularité» Détection aux petits angles : Taille Détection aux grands angles: «Granularité»
II 3: Mesure de l hémoglobine L hémoglobine est dosée par méthode spectrophotométrique (525 à 550 nm) après la lyse des hématies. Echantillon Diluant + lyse LED Optique Cellule de mesure Photodétecteur
II-4: Principe de mesure de l hématocrite La hauteur de l impulsion limpulsion engendrée par le passage d une cellule dans le micro orifice est directement proportionnelle au volume de la cellule analysée. L hématocrite est mesurée en fonction de l intégration numérique du volume globulaire moyen (VGM). Total volume V T Centrifuge V T HCT (%) = V / V T x100 V
III PRESENTATION DE COMPTEURS D HEMATOLOGIE ET DE QUELQUES PARTIES IMPORTANTES Figure 1 SYSMEX XP 300 Figure 2 SYSMEX XT
Figure 3 : Modèle de bacs de comptage de GR et GB
a. Présenter verticalement le tube d échantillon et actionner en même temps l aspiration Figure 4 : Aspiration automatique de l échantillon
b. Attendre la rentrée de l aiguille d aspiration et retirer verticalement le tube d échantillon Figure 5 : Retrait du tube d échantillon de l aiguille d aspiration
Figure 6 : Modèles de systèmes d aspiration 6-a- Assemblage de seringues sans cartouche de protection 6-b- Assemblage de seringues avec cartouche de protection à soufflets 6- c- Pompes péristaltiques
Figure 7: Modes de présentation des réactifs du compteur d hématologie 7-a : Un compartiment de l appareil peut contenir une solution de lyse et de nettoyage. Le diluant étant a l extérieur 7 b : Un pack ou carton de réactifs 7-b : Un pack ou carton de réactifs peut contenir le diluant, la lyse et la solution de nettoyage
IV Les bonnes pratiques d utilisation des compteurs d hématologie Utiliser toujours un onduleur avec prise de terre pour l alimenter Permettre une bonne circulation d air autour de l appareil (50cmdumur) Allumer l appareil et attendre environ 10 minutes avant son emploi Vérifier qu il n y a pas de bulles d air dans les tuyauteries de réactifs Vérifier toujours les fuites de réactifs dans le circuit hydraulique Vérifier toujours les fuites d air ou de vide dans le circuit Eviter les allumages et extinctions intempestives Eviter la pollution des réactifs par la poussière Ne pas tirer sur le bec d aspiration après aspiration Mélangez soigneusement l échantillon avant emploi Passer de temps à autre le sang de contrôle Observer toujours la procédure d arrêt de l appareil
V Procédures d entretien d un compteur d hématologie Se conformer toujours aux recommandations du fabricant 5 1 Entretien journalier Nettoyer régulièrement le corps de l appareil Nettoyer l appareil avant et après l analyse avec de l eau distillée Nettoyer l appareil avec la solution de nettoyage préconisée Essuyer toute trace de sang 5 2 Entretien hebdomadaire Effectuer un rinçage avec une solution détergente ou fongicide Nettoyage yg et rinçage çg des bacs de mesure 5 3 Entretien semestriel Remplacer les cordons des pompes de l appareil 5 4 Entretien annuel Remplacer les tuyauteries hydrauliques Remplacer les cordons despompes Remplacer les joints des seringues
VI- PRATIQUE : Présentation Pé ti d un automate t d hématologie Instructions avant et après utilisation quotidienne Instructions ti hebdomadaires d Instructions mensuelles Instructions ti tous les six mois Changement de réactifs Remplacement de tuyaux Nettoyage général