Modèles physiopathologiques et développement des médicaments

Modèles physiopathologiques et développement des médicaments Pierre-Olivier Girodet Pharmacologie

Mise sur le marché d un nouveau produit Recherche Développement Mise sur le marché Processus en plusieurs étapes pour évaluer (entre autre) l innocuité et l efficacité d un nouveau produit chez l animal (développement pré-clinique) chez l homme (développement clinique)

Développement du médicament Études in vitro Études pré-cliniques Essais cliniques (Phases 0, I, II, III) AMM Études post-amm (Phases IV) 0 2 4 10 ans

Développement clinique Etude innocuité et efficacité produit chez l homme Phase I Exposition unique à faible dose chez un petit nombre de sujet Phases I, II, II, IV Exposition croissante en terme dose, durée, taille de population

Développement clinique Phase I Volontaire sain Efficacité, effets indésirables, pharmacocinétique Vérification / animal Phase II Nombre limité patients, court terme Dose et posologie (dose-ranging) Sécurité d emploi à court terme Phase III Nombre plus grand de patient Rapport efficacité / sécurité à court et long terme Études comparatives

Mise sur le marché Enregistrement médicament (dossier AMM, Afssaps) Dossier pharmaceutique Dossier pharmacologique et toxicologique Dossier clinique Dossier de synthèse Phase IV (après mise sur marché) Nouvelles indications et profil de tolérance

Modèles physiopathologiques et développement des médicaments I. Études de pharmacologie pré-clinique 1. Screening pharmacologique 2. Études de pharmacodynamie 3. Études de pharmacocinétique II. Études de toxicologie 1. Toxicité générale - aiguë - chronique 2. Études de cancérogénèse 3. Toxicité génétique 4. Toxicologie de la reproduction

But des études de pharmacologie Détermination du profil pharmacologique général Choisir le produit le plus intéressant

1. Screening pharmacologique Principes généraux 30 à 50 tests 3 à 4 doses Modèles animaux Études sur animaux «entiers» Récepteurs, cellules, tissus, organes isolés Ne peuvent reproduire phénomènes complexes se produisant dans organisme entier : Pharmacocinétique, pharmacodynamie

Animaux non modifiés Douleur Dépression Anxiété Alcoolisme (rat Long-Evans) Choc post-traumatique (rat Long-Evans) Neuroleptiques Asthme

Neuroleptiques : Catalepsie chez souris

Modèle murin asthme Sensibilisation Ovalbumine, allergène (D. Pter) Durée Courte : 4 semaines Longue : 10 semaines Injections IP, intra-nasale, inhalée (nébulisations) Rythme administration variable

Modèle murin asthme chronique Ovalbumine 100 µg I.P. Ovalbumine 500 µg intra-nasal J0 J14 J27-29 J47 J61 J73-75

Modèle murin asthme HRB Non spécifique, spécifique Pléthysmographie (Penh) Inflammation LBA Numération, formule % polynucléaires éosinophiles FACS Sang, poumon, moëlle osseuse Remodelage bronchique Histochimie, immunohistochimie

Pléthysmographie (animal conscient et non-restreint)

Dispositif de mesure de la résistance et de la compliance pulmonaire par pléthysmographie

Mesure de la réponse bronchopulmonaire après administration par aérosol de doses croissantes d acétylcholine

Modèles spontanés Souches spontanément porteuses de défauts génétiques SHR (rats spontanément hypertendus) Poulets athéromateux Souris obèses

Animaux expérimentaux Modifications chirurgicales ou chimiques Néphrectomie Sténoses Diabète : streptozotocine Destruction cellules pancréatiques productrices d insuline

Animaux génétiquement modifiés Souris «nude» Immunodéficientes Souris k.o (knock-out) Suppression d un gène ou inactivation Gène p53 : Cancers Souris transgéniques Cancers Alzheimer Athérosclerose (souris Apo-E)

2. Études de pharmacodynamie Modèle animal Chien, rat, souris Attention au choix PK différente selon espèce Métabolites actifs ou action différente Morphine sur rats Courbe de réponse quantile, binaire Dose/réponse DE 50 : Dose entraînant 50% de l'effet maximum

Réponse quantile : Tout ou rien Relation dose-effet Dose faible Réaction des animaux les + sensibles Dose forte Réaction de tous les animaux

3. Études de pharmacocinétique Détermination paramètres ADME Modèle animal Rat, souris, chien Choix important Pk différente Enzyme métabolisme différents Vitesse absorption différente. Variabilité selon espèce et souche (rat)

Administration Absorption & distribution Elimination Syst. porte Foie Métabolites Rein Urine Bile Per os ou rectal Intestin Fèces Percutané Peau Intraveineux Intramusculaire Muscle Plasma Gl. mammaire Lait Intrarachidien LCR SNC Placenta Inhalation Poumon Foetus Air expiré

Buts des études de toxicologie Caractériser le profil toxique du produit Effets sur croissance, état général, ECG Organes cibles, fonctions physiologiques (reproduction ). Relation des effets à la dose et à l exposition Dose max tolérée Potentiel de progression ou de réversibilité des effets (après cessation traitement) Risque altérations génétiques et processus cancérogène

Buts des études de toxicologie Estimer dose d entrée chez l homme Déterminer effets indésirables potentiels et effets indésirables à surveiller chez l homme Répondre aux exigences réglementaires

1. Étude de toxicité générale Toxicité aiguë Dose unique Modèle animal 2 espèces (rat,souris, chien, primates) 2 sexes 2 voies d administration dont une utilisée en thérapeutique Observation 14 jours au moins (toxicité retardée) Comportement, symptomatologie Circonstances de la mort Détermination DL 50

Ex. de méthodes : Test de Trevan Courbe semi-log : Nombre de morts en fonction dose 30 animaux / sexe / dose

Méthode up-and-down 48 h après dose Vivant administration dose + élevée (facteur 1 à 3 entre les doses) Mort dose inférieure à un autre animal Femelles, rat, 3 à 9 animaux Détermination DL 50 Classe Qualification DL 50 1 Extrêmement toxique < 1 mg/kg 2 Très toxique 1 50 mg/kg 3 Modérément toxique 50 500 mg/kg 4 Faiblement toxique 0,5 5 g/kg 5 Pratiquement non toxique 5 15 g/kg 6 Relativement inoffensif > 15 g/kg

1. Étude de toxicité générale Toxicité chronique Doses répétées Déterminer toxicité du produit administré quotidiennement 4 semaines, 3 mois, 6 mois, 12 mois Voie d administration donnée Étudier réversibilité ou progression des effets liés au produit après l arrêt du traitement Toxicocinétique : Étude du sort d'une substance toxique dans l organisme

1. Étude de toxicité générale Toxicité chronique Doses répétées Déterminer dose sans effet observé : «NOEL» No Observed Effect Level Dose la plus élevée qui, au cours d'une étude de toxicité, ne produit aucun effet observable Supporter les exigences réglementaires pour entrée en clinique (phase I) puis supporter études cliniques à dose répétée (phases II et III)

Modèle animal 2 espèces de mammifères 1 rongeur et 1 non rongeur (rat et chien) Les + proches possible de l homme aux plans pharmacocinétique et métabolique Groupes 1 témoin + 3 doses Effectifs minimums Rongeur : 10 / groupes / sexe Non-rongeur : 4 / groupes / sexe Conditions d hébergement contrôlées Température, alimentation

Paramètres Mortalité Observations cliniques Poids corporel et consommation alimentaire Ophtalmologie, ECG Biologie Hématologie, coagulation, biochimie sanguine, examens urinaires Toxicocinétique Anatomopathologie Autopsies, poids organes, histopathologie animaux morts spontanément, euthanasiés fin étude, groupes témoins et forte dose

Choix des doses Au moins 3 niveaux de doses Dose forte doit produire une toxicité (n induisant pas de mortalité ni de souffrance), effet pharmaco important Dose faible doit être dose sans effet NOEL 1/10 DL50 Dose intermédiaire doit permettre d établir relation entre dose et réponse Groupe témoin : seulement le véhicule

Voie et fréquence Voie d administration présumée chez l homme à défaut la plus pertinente Fréquence choisie selon fréquence administration et exposition chez l homme En général 1 fois par jour (cf. PK de l animal) Occasionnellement b.i.d, t.i.d, perfusion continue

Durée La durée des études de toxicité chez l animal doit être supérieure ou égale à la durée de l essai clinique Dépend indication thérapeutique du produit échelle de l essai clinique chez l homme (phases I, II, II, IV)

Durée des études en fonction de la durée envisagée du traitement chez l homme Durée du traitement chez l homme Durée des études 1 ou plusieurs administrations en 1 seul jour 2 semaines Administration réitérée jusqu à 7 jours 4 semaines Administration réitérée jusqu à 30 jours Administration réitérée au-delà de 30 jours (consécutifs ou non en une année) 3 mois 6 mois (rongeur) 9 mois (chien)

2. Études de cancérogenèse Mise en évidence potentiel cancérogène d une substance chimique chez l animal exposé à cette substance pendant majeure partie de sa vie Études requises Substances administrées chez l homme de manière continue ou fractionnée pendant au moins 6 mois Structure chimique suggérant un potentiel cancérogène Substance Similitude biologique avec un cancérogène connu Tendance à s accumuler (produit ou métabolite) Résultats équivoques ou positifs dans les tests de mutagenèse

Modalités / législation Études préalable ADME 2 espèces sélectionnées sur critères métaboliques et sensibilité à 1 ou plusieurs cancérogènes Durée d étude Rat : 24 à 30 mois Souris : 18 à 24 mois Forte dose 100 fois dose thérapeutique humaine (fondée sur la toxicité)

Modèle animal Classiquement rat et souris (hamster) Souris P 53 (plus sensible, diminue durée d étude) Choix repose sur Résultats des études de toxicité à dose répétée Métabolisme chez l homme Paramètres pharmacocinétiques du produit Souches Présence données historiques Similitudes métaboliques avec l homme Faible incidence des tumeurs spontanées Génétiquement stable Longévité adaptée à la durée de l étude Sensibles à un ou plusieurs cancérogènes

Effectifs Étude principale 2 groupes témoins + 3 groupes traités 50 à 65 animaux / sexe / groupe Étude satellite de biodisponibilité 5 animaux / sexe / groupe en plus Soit au minimum 500 animaux par étude!

Paramètres Poids corporel Hebdo ou mensuel Consommation alimentaire Observations cliniques (2 fois par jour) Palpation des masses Hématologie Autopsies

Doses 3 niveaux de dose (minimum) Forte dose Dose max tolérée (DMT) = dose toxique non létale et n interférant pas avec l homéostasie de l animal en général Faible dose 2 à 3 fois la dose pharmacologiquement active (si possible) Dose intermédiaire Moyenne géométrique, permettant d établir une relation dose-réponse

Voie d administration Celle utilisée chez l homme Le plus souvent par voie orale Parfois : voies respiratoire, sous-cutanée

Durée Pendant espérance de vie naturelle de l espèce Souris 18 mois au min 24 mois idéalement Rat 24 mois au min 30 mois max Durée conditionnée par la survie des témoins et de la faible dose au moins 50 % des animaux (ou 25 animaux /sexe) en fin d étude

3. Toxicité génétique Conséquences Cellules germinales Anomalies de la descendance transmissibles (toxicologie de la reproduction) Cellules somatiques Modifications permanentes, prolifération cellulaire, tumeurs (processus cancérogène) Peuvent être atteints Gènes Réparation ou mutation génique Chromosomes Cassures, échanges Mutation chromosomique : Potentiel clastogène

Test de mutation génique In vitro Test d Ames (bactéries) Salmonella Typhimurium mutant His- Souches porteuses mutation gène synthèse histidine Souches incapables de pousser dans milieu sans histidine En présence agents mutagènes : Mutation His- réversible en mutation His+ Souches capables de pousser dans milieu sans histidine Tests sur eucaryotes In vivo Levures, cultures cellulaires CHO Évaluation de l expression de gènes

Test d altération chromosomique In vitro Caryotype sur cultures cellulaires In vivo Test du micronucleus Administration cytochalasine B à un rongeur Prélèvement moëlle osseuse Coloration érythrocytes polychromatophiles Nombre de micronoyaux mise en évidence mutation pouvant conduire au processus de mutagenèse (Test du dominant létal chez la souris)

Test d altération-réparation de l ADN UDS test Rat traité 5 j par le produit Prélèvement foie Incubation hépatocytes avec thymidine tritiée pour marquage de l ADN Comparaison à un témoin mise en évidence synthèse d ADN non programmée Remarque Tests in vitro ne prennent pas en compte les métabolites Évaluation génotoxique toxicité des métabolites

4. Toxicologie de la reproduction Fertilité Embryotoxicité Périnatalité Descendance

5. Toxicologie de la reproduction gamétogénèse implantation conception M F A organogénèse parturition B C D E F Maturité sexuelle Fertilité et développement embryonnaire précoce Développement embryo-foetal Développement pré et post-natal M F A B Études Fertilité F F C C D E Études Tératogénèse Développement pré et post-natal observation

Modèle animal Selon l étude Étude de fertilité 1 rongeur (rat) Étude de tératologie 2 espèces (rat et lapin) Étude de développement pré et post-natal 1 rongeur (rat) Organogenèse Mise bât Rongeur J6 à J17 J 21 Lapin J6 à J 18 J 28-30

Doses et effectif Dose Entraînant le min de toxicité (études préliminaires) Artéfacts Neuroleptique à forte dose : rat dort, pas accouplement (non dû à problème de fertilité) Nombre 20 animaux gestants (donc + au départ) Groupe témoin Dose forte : min de toxicité Dose faible : aucun effet Dose intermédiaire

Étude de tératologie 20 à 26 femelles / groupe Traitement pendant C (organogenèse) Césarienne (mange le malformé) Paramètres Examens viscéraux, squelettiques, externes fœtus/femelle fœtus/groupe fœtus/étude Rat (25) 16 400 1600 Lapin (20) 7 140 560

Étude de fertilité 20 à 26 parents / groupe Traitement mâle et femelle (ensemble ou séparé) pendant gamétogenèse Rat : 10 sem avant (mâle) et 15 jours avant (femelle) Accouplement et période pré-implantatoire Paramètres Nombre de corps jaunes Sites d implantation Pesée organes sexuels, analyse sperme fœtus/groupe fœtus/étude Femelle (25) 400 1600 Mâle 400 1600

Étude pré et post-natale 20 à 26 femelles / groupe Traitement C D E : évaluation de F2 Reproduction F1 : on garde 1 mâle et 1 femelle F2 : Césarienne Paramètres Examens physique (poids ), fonctions réflexes (ouverture des yeux ) comportement (activité motrice, apprentissage ) Étude du passage dans lait en cas d étude PK Rat F1 (25 femelles) 16 fœtus/groupe 4 petits/sexe/portée 200 petits/groupe 800 petits / étude F1 reproduction 25 couples /groupe 100 / étude Rat F2 16 fœtus/groupe 4 petits/sexe/portée 400 petits/groupe 1600 / étude

Réglementation Pour la mise en place des essais cliniques chez le volontaire sain (phase I) Europe : 2 études de tératogénicité demandées Japon : étude fertilité femelle Pour dossier d enregistrement 3 types d études sont nécessaires