E.T.S.L Classe Prépa BTS TP 9 Spectrophotométrie utilisant un spectrophotomètre Genesys Vis Objectifs : - Utiliser un spectrophotomètre monofaisceau Genesys trvaillant exclusivement dans le visible, afin de déterminer la concentration d'une solution colorée. I) Le spectrophotomètre monofaisceau : I-1) Description de l appareil : Le spectrophotomètre est un appareil permettant de mesurer l absorbance (ou la transmittance) d une solution colorée en fonction de la longueur d onde de la radiation qui la traverse. L organisation générale de ce type d appareil est donnée par le schéma fonctionnel représenté cidessous : La source de lumière est polychromatique. Un faisceau de cette lumière visible est envoyé vers un monochromateur qui va la disperser pour «isoler» une radiation de longueur d onde donnée. Celle-ci est réglable de 350 à 800 nm Le faisceau traverse ensuite une cuve contenant la solution colorée avant d atteindre la photocellule. Cette dernière va permettre de mesurer le flux transmis à travers la solution en le transformant en signal électrique. Ce dernier est amplifié et à l affichage apparaît soit l absorbance, soit la transmittance de la solution. 54
I-2) Utilisation des appareils monofaisceau : L application principale d un appareil monofaisceau est la détermination de la concentration d une substance en solution. L opérateur commence par chercher la longueur d onde de travail en consultant la documentation ou en traçant la courbe d absorption spectrale A = f(λ) de la substance en solution. Pour tracer cette courbe, il faut mesurer l absorbance d une solution de concentration constante à différentes longueurs d onde en prenant soin de refaire le zéro d absorbance sur le blanc pour chacune d elles. La courbe obtenue, identique à un facteur constant près à la courbe ε = f(λ), permet de connaître la longueur d onde du maximum d absorption, qui est la longueur d onde à retenir. Ayant préparé une gamme de solutions étalonnées, l opérateur trace ensuite la courbe d étalonnage A = f(c), à la longueur d onde choisie. De cette courbe qui est une droite si la loi de Beer-Lambert est vérifiée, il déduit la concentration de la solution. I-3) Applications de la spectrophotométrie d absorption : La spectrophotométrie d absorption est une méthode générale permettant le dosage de nombreuses substances. Dans le spectre visible, son champ d application s étend, au-delà des substances naturellement colorées, à celles qu il est possible de transformer en composés stables colorés par addition de réactifs appropriés. Ainsi trouve-t-on, pour la plupart des éléments chimiques courants, des ions ou des composés relevant de cette méthode de dosage. L absorptiométrie intéresse plusieurs secteurs d activités : - Les industries chimiques (dosages des métaux et métalloïdes), - La biologie (dosage de l acide urique, du cholestérol, du glucose, de l hémoglobine, des protides, des lipides, du phosphore, etc...), - L hydrologie en analyse des eaux (dosage de l ammoniaque, des fluorures, des phosphates, des sulfates, de l oxygène dissous, etc...), - La pharmacologie (nombreuses méthodes pour alcaloïdes, antibiotiques, vitamines, etc...). II) Expérimentation : Matériel : - Un spectrophotomètre Genesys Vis. - Deux burettes de 25 ml. - Six béchers en plastique de 150 ml. - Une solution mère et une solution inconnue. - Un jeu de macrocuves plastiques. - Un thermomètre. 55
II-1 - Préparation des solutions Rincer les deux burettes à l'eau distillée. Rincer une des deux burettes avec un peu de la solution mère de concentration C 0. Noter la nature de la solution mère ainsi sa concentration : C 0 = Remplir une burette d'eau et l'autre de solution mère. Ajuster au zéro les deux burettes. Relever la température T = Compléter le tableau de façon à ce que le volume total de chaque solution soit de 10 ml. Vous donnerez le détail des calculs effectués pour un exemple de solution. Solution n Csolution (%) V solution mère V eau (ml) B 0 1 20 2 40 3 60 4 80 5 100 Réaliser les solutions et les mettre dans 6 cuves spectrophotométriques (à remplir sous l index). II-2 Spectre d absorbance d une solution pour différentes longueurs d onde Placer les cuves contenant les solutions B à 5 dans le spectrophotomètre : faire attention au positionnement des cuves, l'index situé sur chaque cuve, doit être face au faisceau. Choisir comme longueur d'onde : λ = 350 nm (Cf notice d utilisation en p. 58). Faire le blanc pour la solution n B (eau seule). Cette opération permet de compenser l éventuelle absorption de lumière par le solvant et la cuve. Mesurer ensuite, l'absorbance A de la solution 1 en appuyant sur la touche adéquate (Cf notice d utilisation p.58). Répéter les mêmes opérations en faisant varier la longueur d'onde tous les 50 nm jusqu'à λ = 800 nm limite de l'infrarouge et en choisissant des pas de 10 nm autour du ou des pics d'absorbance. Tracer sur une feuille de papier millimétré, le spectre d'absorbance de la solution 1 en fonction de la longueur d'onde A = f(λ). Pour quelle longueur d onde! max a-t-on le maximum d absorbance? 56
II-3 Courbe d étalonnage Choisissez comme valeur de longueur d onde! max. Faire d abord le blanc puis mesurer l absorbance des solutions 1 à 5. Oter les cuves contenant les solutions 1 à 5 et les remplacer par la cuve contenant la solution inconnue. Réaliser la mesure à λ max. Tracez sur une nouvelle feuille de papier millimétré, la courbe d'étalonnage de l'absorbance de la solution colorée en fonction de sa concentration A = f(c) pour une valeur de longueur d'onde correspondante à un maximum d absorbance! max. II-4 Exploitation Rappel : La loi de Beer-Lambert Pour des solutions peu concentrées, non fluorescentes et ne contenant ni suspension, ni précipité, l absorbance A est donnée par la relation : A =! (! ) x b x C! (! ) est le coefficient d absorption molaire. C est une grandeur caractéristique de la solution et elle dépend de la longueur d onde de la radiation lumineuse traversant la solution. (exprimé en mol -1.m 2 ). b est l épaisseur de solution traversée (exprimé en m) C est la concentration de la solution (en mol.m -3 ) Analyse : Pourquoi choisit-on de réaliser les mesures d absorbance à la longueur d onde! max? D après la courbe d étalonnage obtenue, la loi de Beer-lambert est-elle vérifiée pour la solution étudiée dans ce TP? Si tel est le cas, expliquer pourquoi. Déterminer, à l aide de la courbe d étalonnage, le coefficient d'absorption molaire ε pour la longueur d'onde optimale d'absorbance de la solution étudiée (sur le pic d'absorbance) en prenant comme longueur de cuve b = 1 cm (vous n omettrez pas de donner une unité correcte pour le coefficient d absorption molaire). Reporter sur la courbe A = f(c) correspondant à cette longueur d'onde l'absorbance de la solution inconnue. En déduire la concentration molaire volumique de cette solution. 57
ANNEXE Notice d UTILISATION du SPECTROPHOTOMÈTRE GENESYS Vis MISE EN ROUTE : Mettre l interrupteur situé à l arrière de l appareil (O/I) sur la position I. Attendre que l appareil se mette en condition, il effectue automatiquement un certain nombre de réglages et tests : - Apparition du logo ; - Initialisation ; - Calibrage de la roue de filtrage ; - Recherche de l ordre zéro ; - Recherche du pic énergétique ; - Calibrage du réseau. Placer dans le compartiment à 6 cuves, la cuve contenant le blanc et la ou les cuve(s) contenant la ou les solution(s) étudiée(s) en respectant l indication B pour le blanc et les autres positions pour les solutions étudiées. CHOIX DE LA LONGUEUR D ONDE λ : Appuyer sur la touche verte située sous la mention «Fixer nm» apparente sur l écran. Entrer au clavier, la valeur de la longueur d onde désirée, l appareil se cale automatiquement à cette longueur d onde (de 325 nm à 1100 nm), valider en tapant sur la touche «entrer». RÉGLAGE DU ZÉRO D ABSORBANCE : Appuyer sur la touche B du bloc de touches (B, 1, 2, 3, 4, 5) représentant le portoir de cuves. Attendre que la cuve contenant le blanc se mette en place. Appuyer sur la touche verte située sous la mention «mesurer un blanc» apparente sur l écran, l appareil s ajuste automatiquement pour afficher une absorbance nulle. MESURE DE L ABSORBANCE D UNE SOLUTION : Appuyer sur la touche du bloc de touches (B, 1, 2, 3, 4, 5) représentant le portoir de cuves, cette touche correspondant à la cuve contenant la solution dont on veut mesurer l absorbance. Attendre que la cuve se mette en place, sur l écran s affiche l absorbance de la solution. 58