Procaryotes RÉGULATION DE L EXPRESSION GÉNÉTIQUE 1. L opéron lactose
STRUCTURE DU LACTOSE liaison β-galactosidique β-galactosidase galactose lactose glucose
CROISSANCE BACTÉRIENNE EN PRÉSENCE DE GLUCOSE ET DE LACTOSE log D.O. Croissance bactérienne Diauxie [bactéries] [ONP] T (h) [glucose] [lactose] Concentration en sucres T (h)
INDUCTION ENZYMATIQUE L'utilisation du lactose conditionne la présence de la!-galactosidase, enzyme nécessaire à sa dégradation. Il y a induction de l'enzyme. Deux hypothèses sont à faire pour cette induction le lactose active la!-galactosidase, déjà présente dans le milieu sous forme inactive.! induction biochimique le lactose permet la synthèse de la!- galactosidase de novo.! induction génétique
QUELLE EST LA NATURE DE L'INDUCTION? Expérience A : culture de bactéries en milieu : + glucose + méthionine 35 S pendant 1 heure à 37 C transfert de ces bactéries en milieu : + lactose pendant 1 heure à 37 C! la!-galactosidase synthétisée n'est pas marquée. Expérience B : culture de bactéries en milieu : + glucose pendant 1 heure à 37 C transfert de ces bactéries en milieu : + lactose + méthionine 35 S pendant 1 heure à 37 C! la!-galactosidase synthétisée est marquée. Conclusion : le lactose régule la synthèse de novo de l'enzyme et non une régulation allostérique qui affecterait la conformation d'une enzyme déjà présente.
RÉGULATION DE LA TRANSCRIPTION OU DE LA TRADUCTION? Expérience A : culture de bactéries en milieu : + lactose + méthionine 35 S + rifampicine (inhibiteur de la transcription) pendant 1 heure à 37 C! la!-galactosidase n'est pas synthétisée. Expérience B : culture de bactéries en milieu : +lactose + méthionine 35 S + puromycine (inhibiteur de la traduction) pendant 1 heure à 37 C! la!-galactosidase n'est pas synthétisée. Conclusion : le lactose régule la synthèse de novo de l'enzyme au niveau transcriptionnel : l'arn messager transcrit est ensuite traduit en β-galactosidase.
RÉGULATION DE LA TRANSCRIPTION OU DE LA TRADUCTION? Expérience A : culture de bactéries en milieu : + lactose + méthionine 35 S + rifampicine (inhibiteur de la transcription) pendant 1 heure à 37 C! la!-galactosidase n'est pas synthétisée. Expérience B : culture de bactéries en milieu : +lactose + méthionine 35 S + puromycine (inhibiteur de la traduction) pendant 1 heure à 37 C! la!-galactosidase n'est pas synthétisée. Conclusion : le lactose régule la synthèse de novo de l'enzyme au niveau transcriptionnel : l'arn messager transcrit est ensuite traduit en β-galactosidase.
L'ALLOLACTOSE EST L'INDUCTEUR La β-galactoside transacétylase, enzyme de masse moléculaire 60 kda transformant le lactose β,1-4 en allolactose β,1-6 par transglycosylation lactose β,1-4 allactose β,1-6
DIPLOIDES PARTIELS chromosome bactérien laci - lacz + O + O + lacz + laci + facteur F' lacy + laca +
L'OPERON LACTOSE D'ESCHERICHIA COLI L'opéron lactose d'escherichia coli (6 237 pdb) comporte les éléments suivants : 3 gènes structuraux : lacz, lacy et laca. des éléments régulateurs, promoteur P et opérateur O, agissant en cis. 1 gène régulateur, laci, possédant son promoteur.
REGULATION DE L'OPERON LACTOSE JACOB ET MONOD 1961
LES MUTATIONS DU RÉPRESSEUR i - i - Le répresseur muté ne peut plus se fixer sur l'opérateur fonctionnel. La bactérie est [lac c ] O + i S i s Le répresseur muté ne peut plus interagir avec l'inducteur et changer sa conformation (superrépresseur). La bactérie est [lac - ] O +
LES MUTATIONS DE L OPÉRATEUR i + O C Le répresseur fonctionnel ne peut plus se fixer sur l'opérateur muté. La bactérie est [lac c ].
DIPLOIDE PARTIEL I - O + Z + // I + O + Z + facteur F' chromosome bactérien l'allèle I + est dominant sur l'allèle I - ces bactéries sont de phénotype [lac + inductible].
DIPLOIDE PARTIEL I s O + Z + // I + O + Z + chromosome bactérien facteur F' l'allèle I s est dominant sur l'allèle I + ces bactéries sont de phénotype [lac - non-inductible].
DIPLOIDE PARTIEL I + O c Z + // I + O + Z + l'allèle O c est dominant sur l'allèle O + ces bactéries sont de phénotype [lac + constitutif].
EMPREINTE DE L OPÉRATEUR SUR L'ADN se ns d e mi gr at io n 3' G G A T C A 5'
INITIATION DE LA TRANSCRIPTION boîte -35 boîte -10 1 er nucléotide transcrit ADN 5' 3' brin non transcrit T T G A C A A A C T G T T A T A A T A T A T T A N 3' 5' brin transcrit -35-10 +1 sens de transcription ~ 40 nucléotides ~ 20 nucléotides ~ 60 nucléotides L'ARN polymérase recouvre 60 nucléotides environ sur l'adn
INITIATION DE LA TRANSCRIPTION Promoteur (ADN couvert par l'arn polymérase) ARN messager Séquences non consensus du promoteur Moitiés symétriques de l'opérateur Opérateur (ADN couvert par le répresseur) Le promoteur faible occupe la position 48 à +12 L'opérateur occupe la position 5 à +21 Ces deux séquences se recouvrent donc partiellement.
GLUCOSE ET TAUX INTRACELLULAIRE D'AMPc
PROTÉINE CAP, AMPc ET TRANSCRIPTION DE L OPÉRON LAC La protéine CAP est un dimère de sous-unités identiques (22,5 kda chacune) : chaque sous-unité possède un site de liaison à l'adn et un site de liaison pour l'ampc. Le dimère seul ne peut se lier à l'adn, mais dès qu'une molécule d'ampc est fixée sur l'une des sous-unités, le changement conformationnel résultant permet la fixation du dimère CAP sur l'adn.
REGION CONTRÔLANT DE L'OPERON LACTOSE Fin du gène du répresseur Site CAP Promoteur ARN messager Début du gène β-gal Séquences consensus du site CAP Sites de mutations empêchant la protéine CAP de se fixer à l'adn Séquences non consensus du promoteur Moitiés symétriques de l'opérateur Opérateur Le site CAP occupe la position 72 à -49 Le promoteur faible occupe la position 48 à +12 L'opérateur occupe la position 5 à +21
CAP-AMPc ACTIVE L'OPERON LACTOSE CAP AMPc Les séquences en -10 et -35 étant différentes des séquences consensus des promoteurs forts, la protéine CAP intervient en incurvant l ADN pour augmenter le niveau de fixation de l'arn polymérase sur ce promoteur.
LE GLUCOSE RÉPRIME L OPÉRON LACTOSE (si absence de lactose ) Le glucose en abaissant le taux intracellulaire d AMPC inactive la protéine CAP et réprime la transcription de l opéron lactose en absence ou présence de lactose.
ACTIVATION TOTALE DE L OPÉRON LACTOSE : PRÉSENCE DE LACTOSE ET ABSENCE DE GLUCOSE
QU EST-CE QU UN OPÉRON? Un opéron est une unité régulée d'expression des gènes dans laquelle on trouve un ensemble de gènes structuraux, sous le contrôle d'un système régulateur unique (ATTENTION ). Les gènes structuraux sont transcrits à partir d'une région "opérateur-promoteur" commune, sous la f orme d'un ARN messager unique, appelé ARNm polycistronique, qui sera traduit en protéines différentes. Cet opéron est contrôlé par une protéine de régulation (répresseur ou activateur) codée par un gène de régulation spécifique.
CONTRÔLE NÉGATIF Répresseur CONTRÔLE POSITIF Activateur
Lactose Répression catabolique Tryptophane Rhamnose
RÉGULATION DE L EXPRESSION GÉNÉTIQUE 2. Régulation de la synthèse de tryptophane
L OPÉRON TRYPTOPHANE β-galactosidase galactose lactose glucose
en absence de trp en présence de trp CONTRÔLE NÉGATIF DE L OPÉRON TRYPTOPHANE répresseur inactif répresseur actif L'opéron tryptophane est sous un contrôle négatif par un répresseur, dimère de sous-unités (PM 12 kda), synthétisé sous forme inactive. L'inducteur est le tryptophane. Changements conformationnels du répresseur
L ATTÉNUATION L'atténuation est une terminaison prématurée de la transcription. L'atténuation est provoquée par un terminateur facultatif qui est situé au début de l'unité de transcription de l'opéron et que l'on appelle atténuateur.
STRUCTURE DE L ATTÉNUATEUR Terminaison codon "start" codons trp Séquence codante du peptide leader codon stop Antiterminaison codon "start" de l'arnm trpe L'atténuateur de l'opéron tryptophane est une séquence nucléotidique ARN de 162 bases, située à l'extrémité 5' de l'arnm polycistronique. Cette séquence est donc synthétisée à p artir du promoteur de l'opéron trp avant la séquence codante du gène trpe. Elle comprend une séquence codante, comprise entre les nucléotides 27 à 68 (codon d'initiation AUG à codon stop UGA) permettant la synthèse d'un peptide de 14 acides aminés de longueur : dont deux codons tryptophane (en positions 10 et 11, c'est-à-dire quasiment à la fin de la séquence codante).
L ARNm LEADER TRP 5 ' peptide leader séquence 1 séquence 2 séquence 3 140 162 séquence 4 séquence de pause séquence trpe 4 séquences nucléotidiques (notées 1, 2, 3 et 4) sont des séquences palindromiques qui peu vent conduire à l a formation de structures ARN "en épingles à cheveux"
CERTAINES STRUCTURES EN ÉPINGLES À CHEVEUX SONT DES TERMINATEURS Terminateur rho-indépendant : Structures en "épingle à cheveux" Terminateur rho-dépendant : Epingle 2/3 : antiterminateur Epingle 3/4 : terminateur
PRÉREQUIS DE L ATTÉNUATION L'atténuation repose sur le fait que transcription et traduction sont simultanées chez les bactéries. Dans tous les cas, la transcription de l'arnm tryptophane démarre. L'ARNm trytophane en cours de synthèse est traduit. C'est la position du ribosome en cours de traduction qui va déterminer la suite des évènements : - atténuation et arrêt de la transcription - poursuite de la transcription Le ribosome pourra avoir deux positions sur l'arnm et selon ces positions, il pourra y avoir formation de deux types de structures en épingle à cheveux différentes : - position A : formation d'une boucle 2/3 boucle d'antiterminaison - position B : formation d'une boucle 3/4 boucle de terminaison C'est la vitesse de traduction du peptide leader qui déterminera la position du ribosome sur l'arnm tryptophane.
PRINCIPE DE L ATTÉNUATION ARN polymérase En absence de TRP: -freinage par absence d ARNt-TRP -épingle à cheveux 2/3 -il y a synthèse de l ARNm En présence de [trp] moyenne: - pas de freinage -épingle à cheveux 3/4 -terminaison de la transcription ARN polymérase terminateur rho-indépendant
RÉGULATION DE LA SYNTHÈSE DU TRP 3 Niveaux de régulation : - Rétroinhibition de la voie de synthèse - Répression de l opéron par un répresseur fixant le tryptophane comme corépresseur - Atténuation : transcription abortive de l opéron Question : Dans quelles conditions de concentration de tryptophane interviennent ces différents processus?
RÉGULATION DE L EXPRESSION GÉNÉTIQUE 3. Autres mécanismes de régulation de L expression génétique
L'ARN POLYMERASE BACTERIENNE β' α β Échange de sous unité σ α 3' 5' σ brin transcrit ~ 60 nucléotides intérieur du complexe 3' 5' brin transcrit sites d'interaction avec l'adn site catalytique L'ARN polymérase bactérienne ou holoenzyme (500 kda)! 2 ""'#: sous-unité! (x2) : interactions avec les protéines régulatrices sous-unité " : formation des liaisons phosphodiesters sous-unité "' : liaison au brin d'adn matrice sous-unité # : reconnaissance du promoteur
NIVEAUX DE CONTRÔLES DES GÈNES Chez les bactéries, le contrôle des gènes s'exerce essentiellement à 3 niveaux : l'initiation de la transcription la terminaison de la transcription la stabilité des ARN messagers Dans quelques cas il existe une régulation de la traduction des ARNm (Chez les eucaryotes, il existe des niveaux supplémentaires affectant la maturation des ARN messagers et la traduction en protéines).