MISE AU POINT D UNE TECHNIQUE DE QUANTIFICATION DES POPULATIONS BACTERIENNES ET ARCHAEA DE L ECOSYSTEME CAECAL DU LAPIN PAR PCR EN TEMPS REEL

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1 E C O L E N A T I O N A L E VETERINAIRE T O U L O U S E Master 2 Recherche «Elaboration de la Qualité et Sécurité Alimentaire» Directrice de stage : Mme Sylvie COMBES Mémoire bibliographique MISE AU POINT D UNE TECHNIQUE DE QUANTIFICATION DES POPULATIONS BACTERIENNES ET ARCHAEA DE L ECOSYSTEME CAECAL DU LAPIN PAR PCR EN TEMPS REEL TRAN Ngoc Uyen Lieu du stage : UMR 1289 INRA ENSAT - ENVT TANDEM (Tissus Animaux Nutrition Digestion Ecosystème Métabolisme) 2008

2 Table des matières Page Résumé 1 Introduction 2 1. Principe de la PCR 3 2. PCR en temps réel Principe de la PCR en temps réel Principes mathématiques de la PCR en temps réel Les stratégies de quantification Quantification relative Quantification absolue par étalonnage avec un standard 9 3. Les différentes techniques de PCR en temps réel Agents se liant à l ADN double brin (Lightcycler assay) Hydrolyse de sondes (Taqman assay) Balises moléculaires Amorces scorpion Avantages de la PCR en temps réel Application de la qpcr en écologie microbienne Application de la qpcr à la quantification des archaea et des bactéries 15 Conclusion 17 Références bibliographiques 18 Annexe 1 : Balises moléculaires et amorces scorpion 21 Annexe 2 : Exemple de protocole 22 Annexe 3 : Tableau récapitulatif des différents systèmes de PCR utilisés pour quantifier les bactéries et les archaea dans différents écosystèmes 24

3 Table des illustrations Figures : Page Figure 1 : Schéma de la méthode PCR 5 Figure 2 : Evolution de la quantité d amplicons en fonction du nombre de cycles de PCR présentée en échelle linéaire 6 Figure 3 : Courbe standard en PCR en temps réel 7 Figure 4 : Modèle graphique de la PCR en temps réel 8 Figure 5 : Agents se liant à l ADN double brin (Lightcycler assay) 10 Figure 6 : Courbe de dissociation 11 Figure 7 : Hydrolyse de sondes (Taqman assay) 12 Figure 8 : Balises moléculaires et amorces scorpion 21

4 Résumé Longtemps, l étude des écosystèmes bactériens s est limitée à la fraction cultivable des micro-organismes qui permettait uniquement d avoir un suivi qualitatif, voire semi-quantitatif des populations cultivables présentes. De nouveaux outils permettent aujourd hui de franchir de manière efficace l étape de quantification nécessaire sans nécessité de culture: il s agit de la technique de PCR (Polymérase Chain Réaction) en temps réel. Cette technologie, rapide d exécution, est basée sur la détection et la quantification d un reporter fluorescent dont l émission est directement proportionnelle à la quantité d amplicons générés pendant la réaction de PCR. La lecture de la fluorescence par spectrométrie est immédiate et ne demande aucune manipulation des échantillons au cours de la réaction PCR. Il existe deux principes majeurs pour la détection quantitative des produits d amplification : la première méthode met en jeu les agents se liant à l ADN double brin et la seconde des sondes fluorescentes. Par ailleurs, deux types de quantifications sont réalisables en PCR quantitative. La quantification absolue, exprimée en nombres de copies consiste à mesurer la quantité de copies cible par rapport à des étalons dont le nombre de copies est connue. L autre méthode appelée quantification relative consiste à mettre en relation le nombre de copie de la cible mesurée par PCR quantitative avec le nombre de copie d un autre gène utilisé comme calibrateur. L objectif du stage est de mettre au point une technique de quantification des populations bactériennes et archaea de l écosystème caecal du lapin par PCR en temps réel. Dans ce mémoire bibliographique, les principes, les stratégies de quantifications et les différentes technologies de détection des amplicons sont exposés. Enfin, les avantages et les applications de la qpcr en écologie microbiennes à la détection des bactéries et des archaea sont décrites

5 Introduction Les lapins sont des animaux sensibles aux infections digestives et la pathologie digestive est la cause principale de pertes économiques dans les élevages cunicoles, tant par la mortalité induite que par les pertes indirectes (retards de croissance, frais de traitement, etc.). Chez le lapin, la microflore caecale est un élément clé de la physiologie digestive. Elle assure un rôle central dans la digestion de la partie fibreuse de la ration. Aussi, la diversité (richesse, et abondance relative des espèces) et la stabilité de l écosystème jouent vraisemblablement un rôle déterminant dans l apparition des troubles digestifs [12]. Les populations bactériennes et archaea dans leur écosystème caecal sont très importantes en nombre et en diversité. Les méthodes culturales de microbiologie ne permettent d obtenir qu une vue biaisée de la diversité de l écosystème digestif. Récemment, les techniques de biologie moléculaire basées sur l amplification spécifique d une séquence d ADN se sont développées. En écologie microbienne, les méthodes les plus souvent utilisées pour l analyse quantitative sont l hybridation dot-blot, l hybridation fluorescente in situ (FISH), le Southern blot, et la PCR en temps réel. Ces méthodes permettent d obtenir des informations sur la proportion de chaque population microbienne au sein de l écosystème. En regard de ces techniques, la PCR en temps réel apporte une plus grande fiabilité, reproductibilité et permet des analyses à grande échelle étant donné que le processus complet est automatisé [6]. Dans le but de mettre au point une technique de quantification des populations bactériennes et archaea de l écosystème caecal du lapin par PCR en temps réel, cette synthèse présente une description des principes, des avantages de la PCR en temps réel, des stratégies de quantification et des différentes technologies de détection des amplicons

6 1. Principe de la PCR Depuis la découverte de la Polymérase Chain Réaction par Kary Mullis en 1986 et qui lui valu le prix Nobel de chimie en 1993, les techniques de PCR sont rapidement apparues comme des outils indispensables en biologie moléculaire. La technique de Polymérase Chain Réaction (PCR) est un moyen rapide, peu coûteux et simple pour copier des fragments d ADN spécifiques à partir de quantités minimes d un matériel ADN source. C est un procédé d amplification moléculaire qui mime le processus naturel de synthèse de l ADN. La PCR permet d amplifier des séquences dont la taille est inférieure à 6 kilobases [4]. Elle est réalisée dans un mélange réactionnel qui comprend l extrait d ADN (ADN matriciel), la Taq polymérase, les amorces et les quatre désoxyribonucléosides triphosphates (dntp) en excès dans une solution tampon. Les tubes contenant le mélange réactionnel sont soumis à des cycles de température réitérés plusieurs dizaines de fois dans le bloc chauffant d un thermocycleur. L appareil permet la programmation de la durée et de la succession des cycles de paliers de température. Chaque cycle comprend trois périodes de quelques dizaines de secondes (Figure 1). - La dénaturation : 94 C La première période s effectue à une température de 94 C, dite température de dénaturation. À cette température, l ADN matriciel, qui sert de matrice au cours de la réplication, est dénaturé : les liaisons hydrogène ne peuvent pas se maintenir à une température supérieure à 80 C et les ADN double-brin se dénaturent en ADN simple-brin (ADN monocaténaires). - L hybridation : C La deuxième période s effectue à une température généralement comprise entre 40 et 70 C, dite température d hybridation des amorces. La diminution de la température permet aux liaisons hydrogène de se reformer et donc aux brins complémentaires de s hybrider. La formule de calcul de Tm (température de fusion) permettant l'hybridation: 4 C X (G+C) + 2 C x (A+T) (amorces de 14 à 24 bases). La température d'hybridation des amorces doit être inférieure d environ 5 C à la Tm calculée

7 La taille des amorces est généralement comprise entre 10 et 30 nucléotides afin de garantir une hybridation suffisamment spécifique sur les séquences d intérêt de l ADN matriciel. Plus les amorces sont riches en cytosines et guanines, plus leur température d hybridation peut être élevée et donc plus la spécificité de l hybridation est grande. - L élongation : 72 C La troisième période s effectue à une température de 72 C, dite température d élongation. À 72 C, la Taq polymérase se lie aux ADN monocaténaires amorcés et catalyse la réplication en utilisant les dntp présents dans le mélange réactionnel. Les régions de l ADN matriciel en aval des amorces sont ainsi sélectivement synthétisées. Figure 1 : Schéma de la méthode PCR [5] Il s agit d une réaction en trois étapes :(i) La dénaturation de l ADN double brin en ADN simple brin par la chaleur. (ii) L hybridation ou l hybridation des amorces par diminution de la température sous leur température d hybridation. (iii) L élongation des amorces par une ADN polymérase thermostable

8 Les conditions réactionnelles : Les volumes de milieu réactionnel varient entre 25 et 100 µl [4]. Il existe une multitude de formules de milieux réactionnels. Il est toutefois possible de définir une formule standard qui convient à la plupart des réactions de polymérisation en chaîne. Concentrée 10 fois, sa formule est à peu près la suivante : 100 mm Tris-HCl, ph 9,0 ; 15 mm MgCl 2, 500 mm KCl. Il est possible de rajouter des détergents (Tween 20, Triton X-100 ) ou du glycérol afin d augmenter les conditions de stringence qui rendent plus difficile et donc plus sélective l hybridation des amorces. Les dntp (desoxyribonucléotides) fournissent à la fois l énergie et les nucléotides nécessaires à la synthèse de l ADN lors de la polymérisation en chaîne. Ils sont incorporés au milieu réactionnel en excès, soit environ 200 µm final. Selon le volume réactionnel choisi, la concentration en amorce peut varier entre 20 et 100 pmol par échantillon [4]. La quantité d ADN matriciel dans le milieu réactionnel pour initier la réaction d amplification peut se réduire à une copie unique. La quantité maximale ne peut en aucun cas excéder 2 µg. En général, les quantités utilisées se situent dans une gamme comprise entre 10 et 500 ng d ADN matriciel. La quantité de Taq polymérase par échantillon est généralement comprise entre 1 et 3 unités. Le choix de la durée des cycles de température et du nombre de cycles dépend de la taille de la séquence d intérêt ainsi que de la taille et de la complémentarité des amorces. Pour la dénaturation et l hybridation des amorces, 30 secondes suffisent généralement. Pour l élongation, une minute est suffisante pour synthétiser des fragments PCR jusqu à 2 kb (kb = kilobase = 1000 pb). Quand des fragments d ADN plus longs sont amplifiés, le temps est augmenté d une minute pour 1000 pb. Le nombre de cycles est inversement proportionnel à l abondance en ADN matriciel. Il faut compter 20 à 40 cycles pour synthétiser une quantité analysable d ADN (environ 0,1 microgramme)

9 En fonction du principe présenté en figure 1, on peut, en théorie, s attendre, à partir du troisième cycle de la PCR, à observer un doublement de la quantité d amplicons (fragment d ADN borné par les des amorces choisies) à chaque cycle. Nombre de copies d amplicons = 2 n, n = le nombre de cycles d amplification, 2 n correspond à la formation de deux amplicons à partir d un amplicon à chaque cycle. En réalité, la quantité d amplicon obtenue à chaque cycle, n augmente de manière exponentiellement que pendant un certain nombre de cycles, ensuite, l amplification s amortie (phase «linéaire» de la figure 2) en raison de la présence d un réactif qui commence à être limitant au sein du mélange réactionnel. Cet amortissement de l amplification se termine par un plateau au cours duquel l amplification n a plus lieu en raison de l absence complète de l un des réactifs [22]. La réaction devient ensuite imprédictible et il est alors impossible de pouvoir comparer plusieurs échantillons entre eux sans un biais quantitatif plus ou moins significatif. Figure 2 : Evolution de la quantité d amplicons en fonction du nombre de cycles de PCR présentée en échelle linéaire [22] - 6 -

10 2. PCR en temps réel La PCR en temps réel (ou qpcr pour quantitative PCR) a connu un essor considérable au cours de ces dernières années, sans doute en partie en raison de sa simplicité de mise en œuvre, de son automatisation pour des applications d analyses à grande échelle et de la publicité importante qui a été faite sur sa précision et sa sensibilité [22] Principe de la PCR en temps réel La PCR en temps réel combine l amplification avec la détection et la quantification d un signal fluorescent. La réaction d'amplification de la séquence ADN cible suit les mêmes étapes qu'en PCR classique (dénaturation, hybridation, extension). L augmentation du signal fluorescent est directement proportionnelle à la quantité d amplicons générés durant la réaction de PCR. En observant la quantité de fluorescence émise à chaque cycle, il devient possible de suivre la réaction PCR durant sa phase exponentielle (figure 2). La première augmentation significative de la quantité d amplicons est en corrélation directe avec la quantité initiale de la matrice cible (template) [8] Principes mathématiques de la PCR en temps réel La PCR est une réaction en chaîne dans laquelle les produits servent de matrice pour la réaction suivante suivant une amplification théoriquement quadratique: N = N0 X 2n, où N0 est le nombre initial de molécules, n le nombre de cycle et N le nombre de molécules amplifiées. Cette amplification théorique dépend dans la réalité d une efficacité d amplication E, ou proportion moyenne de molécules produites à chaque cycle. (E = 2 idéalement et E = 1 si aucune molécule n est produite). Expérimentalement, E varie entre 1,78 et 1,97. N = N0 X En Soit sous forme logarithmique : LogN = logn0 + n loge A partir d une courbe expérimentale du nombre de molécules amplifiées N en fonction du nombre de cycle, il est possible d en déduire la valeur de N0 c'est-à-dire le nombre initial de molécules. La formule donnant l'efficacité de la PCR en temps - 7 -

11 réel [14] peut être calculé lors de l établissement d une gamme étalon : E% = (10 (- 1/pente) 1) x 100% (Figure 3) Figure 3 : Exemple de courbe standard en PCR en temps réel [14] La pente de la droite de régression lie les logarithmes des quantités d'adn (en abscisses) aux valeurs correspondantes de Ct (en ordonnées). - Cycle seuil (Threshold cycle) : Les valeurs de fluorescence sont enregistrées au cours de chaque cycle et représentent la quantité d amplicons produits en un point précis dans la réaction. Plus il y a de matrices à amplifier au départ de la réaction PCR, moins élevé sera le nombre de cycle requis pour atteindre un point où le signal d émission de fluorescence sera statistiquement et significativement plus élevé que le bruit de fond. Ce point est défini comme étant le cycle seuil (Ct) et apparaîtra toujours au cours de la phase exponentielle d amplification (Figure 4). Par conséquent, la quantification n est pas affectée par l épuisement d un des réactifs comme lors de la phase plateau ce qui explique pourquoi le système en temps réel est si reproductible. La valeur du Ct peut être traduite en un résultat quantitatif en la comparant avec les valeurs du Ct générées avec des matrices de quantification connues Les stratégies de quantification La quantification des acides nucléiques peut se faire soit de façon relative par rapport à un gène de référence interne à - 8 -

12 l échantillon, soit de façon absolue après établissement d une gamme étalon de la cible. Figure 4 : Modèle graphique de la PCR en temps réel [8] L intensité de la fluorescence à chaque cycle est proportionnelle à la concentration d amplicons, le cycle seuil (Ct) représente le nombre de cycles requis où le signal d émission de fluorescence est statistiquement et significativement plus élevé que la ligne de base Quantification relative Un gène de référence présent dans l échantillon est quantifié en même temps que le gène étudié, la concentration de ce dernier étant ensuite normalisé par rapport à celle connue du gène de référence. Les gènes les plus souvent utilisés comme références sont des gènes dits «de ménage» dont l expression doit être constante tels que l ARN16S bactérien, rpob (codant la sous-unité ß de l ARN polymérase), gapdh (codant la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase), gst (codant la glutathion-s-transférase) ou le gène codant l actine des eucaryotes Quantification absolue par étalonnage avec un standard Les cinétiques sont mesurées pour différentes concentrations de la séquence gène cible. La courbe d étalonnage permet de déduire la concentration à partir d une mesure du Ct

13 3. Les différentes techniques de PCR en temps réel Plusieurs techniques existent : elles utilisent soit des molécules se liant à l'adn, soit des sondes moléculaires spécifiques de la cible amplifiée. Ces deux types de détection présentent une sensibilité équivalente, mais il existe une différence au niveau de la spécificité Agents se liant à l ADN double brin (Lightcycler assay) Le SYBR Green est l agent le plus fréquemment utilisé. C est une molécule intercalante de l ADN double brin qui agit comme le BET (Bromure d'ethidium). Il est économique, facile à utiliser et possède plus de sensibilité que le BET sans inhiber la réaction d amplification. Cette molécule émet une intense fluorescence lorsqu elle est liée à l ADN double brin et aucune fluorescence sous sa forme libre en solution (Figure 5). Figure 5 : Agents se liant à l ADN double brin (Lightcycler assay) [8]. (a) Durant la dénaturation, le SYBR Green I libre exhibe peu de fluorescence. (b) À la température d appariement, quelques molécules se lient au double brin d ADN naissant résultant en une émission de fluorescence lors de l excitation. (c) Durant la phase de polymérisation, de plus en plus de molécules se lient au brin naissant et l accroissement de la fluorescence peut-être suivi en temps réel

14 A chaque cycle de PCR, lors de l élongation, la molécule de SYBR Green se fixe à l ADN double brin et fluoresce. Au cours des cycles, la fluorescence émise augmente proportionnellement au nombre de copies (Figure 5). Elle est donc directement liée à la quantité initiale et au nombre de cycle de PCR. Le SYBR Green est très stable, seulement 6% de son activité est perdue au bout de 30 cycles de PCR [17]. Le SYBR Green présente l avantage d être applicable à tout couple d amorces et de fournir un signal fort, d autant plus que la taille des amplicons est importante. Il présente néanmoins le désavantage de n être pas spécifique de l amplicon d intérêt. Si la PCR n a pas été correctement mise au point, il est possible que les amorces forment des dimères, ou bien qu un amplicon non spécifique soit amplifié en raison d une faible spécificité des amorces de PCR. Dans ce cas, le signal enregistré ne sera plus proportionnel à la quantité d amplicons spécifiques produits et les résultats s avèreront ininterprétables. Pour vérifier que le bon gène a bien été amplifié, on étudie la courbe de fusion (Figure 6). En effet, chaque produit d ADN double brin synthétisé a une température de fusion spécifique, définie comme la température à laquelle la moitié de l ADN est sous forme de double brin, l autre moitié sous forme de simple brin. Figure 6 : Courbe de dissociation [17] La courbe de fusion est obtenue en traçant la dérivée première de la fluorescence en fonction de la température et la température de fusion d un double brin correspond à un pic sur cette courbe

15 En augmentant progressivement la température dans les tubes de PCR, les amplicons sont progressivement dénaturés à un faible niveau jusqu à de que la température s approche de la température de fusion (Tm) de l amplicon (Figure 6). A ce moment, la dénaturation des amplicons s accélère pour atteindre 50% d amplicons dénaturés lorsque le Tm est atteint. La dénaturation complète des amplicons est ensuite atteinte lorsque la température continue d augmenter. La dénaturation de l amplicon provoque la libération du SYBR Green et s accompagne donc d une diminution de la fluorescence qui peut être enregistrée. La présence de dimères d amorces ou d amplicons aspécifiques dont le Tm est suffisamment différent du Tm de l amplicon d intérêt peut être détectée grâce à cette courbe de dissociation via la présence de pics surnuméraires lors de la représentation de la dérivée négative de la fluorescence [22] Hydrolyse de sondes (Taqman assay) La méthode de détection à partir de la sonde est basée sur l activité exonucléasique 5-3 de la Taq polymérase. La sonde spécifique est marquée deux fois : un fluorochrome quencher situé en 3 et un fluorochrome reporter en 5. La sonde Taqman est sélectionnée de manière à ce que sa température de fusion (Tm) soit au moins de 10 C supérieure à celle des amorces de PCR. Au cours de la deuxième étape d un cycle de PCR (hybridation des amorces), la sonde Taqman va se fixer de manière spécifique sur sa séquence complémentaire. Cette fixation sera complète et précèdera toujours la fixation des amorces en raison du Tm plus élevé de la sonde Taqman et du fait que l étape précédente de PCR était à une température supérieure (94 C) [22]. Au cours de la polymérisation, la Taq polymérase dégrade la sonde située sur son chemin et libère le reporter du quencher (Figure 7). Cette méthode est très précise car la fluorescence associée au fluorochrome reporter ainsi mesurée est proportionnelle à la quantité de produit généré [5]. La méthode de TaqMan à l avantage d être spécifique de l ADN amplifié comparé au SYBER Green qui peut se lie aussi aux

16 produits non spécifiques de la PCR. Les sondes Taqman sont cependant plus chères et se dégradent plus vite, en particulier lorsqu elles sont exposées à la lumière. Il en résulte une moins bonne répétabilité des PCRs dans le temps par un effet de dégradation des sondes. Les sondes Taqman sont également moins sensibles que le SYBR Green car seul un fluorophore émet un signal à chaque synthèse de deux nouveaux brins d ADN [22]. Figure 7 : Hydrolyse de sondes (Taqman assay) [8] (a) Durant l étape de dénaturation, la sonde est libre en solution. (b) À la température d appariement, la sonde et les amorces s hybrident à leurs séquences cibles respectives et la proximité des fluorochromes permet l inhibition de la fluorescence. La polymérisation débute. (c) La polymérase déplace et hydrolyse la sonde. Le fluorochrome émetteur est libéré de l environnement du suppresseur permettant ainsi l émission de la fluorescence Balises moléculaires Une balise moléculaire est une sonde d hybridation d ADN en forme d épingle à cheveux. En dessous de la température d hybridation la molécule se trouve en position fermée, le quencher se trouve proche du reporter et aucune fluorescence n est détectée. Si la balise moléculaire s associe au produit de PCR ou est détruit, le quencher est éloigné du reporter et

17 la fluorescence peut être mesurée (Annexe 1). Ce type de sonde augmente grandement la spécificité de l hybridation [8]. La spécificité de cette technologie est telle qu elle permet de détecter les différences de séquences au nucléotide près, ce qui peut être parfois difficile à réaliser avec les technologies de sondes linéaires. Elle constitue donc une technologie efficace pour la détection et le criblage à grande échelle des SNPs (single nucleotide polymorphisms) [5]. La principale difficulté de ces sondes réside dans le design crucial de la boucle. Cette sonde ADN n émet de la fluorescence qu en présence de nombreuses copies amplifiées de l ADN cible qui vont provoquer la déformation de sa structure Amorces scorpion Les amorces scorpion représentent une variante de la technologie des balises moléculaires. Les fluorochromes et la sonde (partie balise moléculaire) sont intégrés à même l amplicon de façon irréversible durant l amplification par PCR (Annexe 1). Le design d une amorce/sonde scorpion est pratiquement similaire à celui des balises moléculaires. La région amorce du scorpion permet d intégrer la balise moléculaire dans le nouvel amplicon pendant la réaction de PCR. La boucle de l épingle à cheveux est dessinée dans le but de permettre l hybridation de la sonde à sa séquence complémentaire cible située sur l amplicon. Cette hybridation force l épingle à cheveux à changer de conformation permettant ainsi l émission de fluorescence. La technologie amorce/sonde scorpion est généralement plus efficace que les technologies Taqman et balises moléculaires, particulièrement dans un programme de PCR possédant des cycles très courts [8]. 4. Avantages de la PCR en temps réel La PCR traditionnelle est seulement semi quantitative, elle ne peut pas être considérée comme une analyse quantitative et ses résultats sont habituellement exprimés en termes de positivité / négativité. Une évaluation semi-quantitative est possible sur la base de l'aspect de positivité (faible/forte) de bande électrophorétique, mais cette approche est fortement subjective et la sensibilité est très basse. La PCR en temps

18 réel est une variante de la PCR standard. La méthode s'appelle «la PCR en temps réel» car l'adn amplifié peut être détecté au cours du procédé PCR, en temps réel, plutôt qu'à la fin du procédé. Cela permet une mesure plus fiable et plus précise de l'acide nucléique. La réaction PCR en temps réel se déroule automatiquement sans intervention de l'opérateur, permettant d'accroître la productivité et de réduire la possibilité d'erreur humaine pour donner des résultats fiables et reproductibles. 5. Application de la qpcr en écologie microbienne La communauté microbienne est définie par un groupe de microorganismes occupant un même écosystème ayant des activités et des fonctions éventuellement différentes les uns des autres. Les techniques de microbiologie classique conduisent à une vision partielle des communautés microbiennes d un écosystème en favorisant la vision «cultivable» du monde microbien par opposition à la vision «totale» donnée par les outils moléculaires. La PCR quantitative a déjà été utilisé dans l analyse quantitative de la communauté bactérienne du tractus intestinal [24]. Cette technique permet d obtenir des informations sur la proportion de chaque population microbienne au sein de l écosystème intestinal. En outre, elle permet également de suivre l expression de gènes cibles présent en faible quantité dans l écosystème. Cette technique est aussi utilisée pour mettre en évidence de mutations ponctuelles (homo/hétérozygotie, résistance aux antibiotiques dans des gènes) à l aide de sondes Taqman très spécifiques ou l interprétation des courbes de fusion, par exemple. 6. Application de la qpcr à la quantification d archaea et des bactéries totales Le système intestinal et la microflore qui y siège constituent un écosystème très complexe qui joue un rôle très important en santé animale à de nombreux niveaux. L efficacité, la stabilité et la pérennité du fonctionnement de ce système dépend de la diversité microbienne présente. La PCR en temps

19 réel permet de faire des analyses quantitatives afin d approfondir les connaissances sur la diversité archaea et bactérienne du tractus digestif et ainsi identifier de nouveaux isolats. Le principe de quantification des bactéries et des archaea est basé sur l utilisation du gène codant pour l ARN16S. En effet, ce gène présente l avantage d être ubiquitaire, contient à la fois des zones très conservées au cours de l évolution et variables. Il est en outre présent en quantité importante. Un exemple de protocole de détection de l ADN 16S total bactérien et archaea mis au point par Suzuki et al (2000) et Takai et Horikoshi (2000) respectivement, est présenté en annexe. Un tableau récapitulatif des amorces et des sondes utilisées dans différents écosystèmes est également présenté en annexe. L ensemble de ces données servira à l établissement d un protocole de qpcr lors de la partie pratique de ce stage

20 Conclusion La méthode PCR en temps réel combine l amplification PCR et la détection de la fluorescence. Il s agit d une détection sensible et spécifique, une quantification facile et précise. En particulier, aucune manipulation post PCR par «détection à l intérieur d un tube» n est nécessaire. Le principe de la quantification repose sur le fait que le nombre de copies de la séquence est directement lié à la quantité initiale, au nombre de cycle et au rendement de la PCR. Deux méthodes permettent de détecter les amplicons lors de la PCR en temps réel. Le marquage non spécifique utilise comme fluorochrome le SybrGreen qui se lie spécifiquement à l ADN bicaténaire. L avantage de cette méthode est son faible coût. Le désavantage de ce processus est son manque de spécificité dû au fait que le fluorochrome se liera indifféremment aux produits de PCR spécifiques et non spécifiques. Une autre méthode est d utiliser une détection spécifique du produit de PCR recherché. Ce type de sonde augmente grandement la spécificité de l hybridation. Cette technique est de plus en plus populaire dans différents domaines de recherche, notamment dans l analyse quantitative du microbiote intestinal car elle permet d obtenir des informations sur la proportion de chaque population microbienne afin d approfondir les connaissances sur la diversité microbienne du tractus digestif. En conclusion, la PCR en temps réel nous semble très performante pour la quantification des populations bactériennes et archaea de l écosystème caecal du lapin

21 Références bibliographiques 1. ANNICK R.: Développement de méthodes moléculaires pour l identification et le dénombrement de souches de Vibrio Cholerae et de Vibrio Parahaemolyticus dans l environnement hydrique et les produits de la mer. Thèse, 2006, BENNEGADI N., GERARD F., LILIANE M., THIERRY G., DOMINIQUE L.: Effects of age and dietary fibre level on caecal microbial communities of conventional and specific pathogen-free rabbits. Microbial Ecology in Health and Disease, 2003, BIO-RAD LABORATORIES: Real-Time PCR Applications Guide, 2006, BLANCHARD A.: Cours atelier PCR. Ecole chercheur INRA-ENSAR «Théorie et pratique de quatre méthodes de génétique moléculaire», Rennes 1994, CHINA B., GHAFIR Y., DAUBE G.: Estimation quantitative et qualitative par amplification génétique des bactéries présentes dans les denrées alimentaires. Ann. Méd. Vét., 2002, 147, CINQUIN, CECILE F.: Développement et validation d'un nouveau modèle de fermentation colique in vitro avec cellules immobilisées. Thèse, 2005, DEWREE R., LICOIS D., COUDERT P., LASSENCE C., VINDEVOGEL H., MARLIER D.: L'Entéropathie Epizootique du Lapin (EEL) : un bilan provisoire des résultats après 20 mois de recherches. 10èmes Journées de la Recherche Cunicole, 2003, ELYSE P.: La PCR en temps réel: principes et applications. Biology and Biotechnology, 2002, EUROGENTEC: Your One-Stop-Shop Real-Time PCR Supplier. Liege Science Park, 2004, FIRMESSE O., SYLVIE R., LUIS G., GERARD C. and FURET J.: Consumption of Camembert cheese stimulates commensal enterococci in healthy human intestinal microbiota. FEMS Microbiol Lett, 2007, FURET J., PASCAL Q., PATRICK T.: Molecular quantification of lactic acid bacteria in fermented milk products using realtime quantitative PCR, 2004, GIDENNE T., CARABAÑO R., BADIOLA I., GARCIA J., LICOIS D.: The caecal ecosystem of the domestic rabbit: impact of nutrition and of some feeding factors implications for the