Analyses moléculaires dans les cancers du sein Anne Vincent-Salomon Département de Pathologie et INSERM U830 Institut CURIE PARIS, France anne.salomon@curie.net
Echantillons de tumeur à l état frais FIXATION CONGELATION Analyse morphologique Analyse morphologique Immunohistochimie (protéine) FISH (ADN) Analyse moléculaire (ADN, ARN, microarn) Facteurs pronostiques Facteurs prédictifs Cibles thérapeutiques
1. Préparation du matériel pour analyse moléculaire Tumoral : Congélation rapide < 30 minutes après ischémie post-opératoire et / ou la biopsie Zone représentative de la tumeur (pas de nécrose, pas de trace de biopsie) Normal pour ADN de référence : Tissu normal péritumoral Sang périphérique Recueil des consentements des patientes
Processus pour la préparation des ARN et ADN à partir des échantillons tumoraux cryopréservés Fragment tumoral congelé Validation de la Richesse en cellules tumorales Cryopreservation d une partie de l échantillon congelé Coupe histologique congelée Analyse microscopique - Type histologique Cellules tumorales 80% + Stroma fibroblastique 20% -Evaluation : -% cellules tumorales -% cellules inflammatoires -% du stroma et sa nature -% tissu normal
Processus pour la préparation des ARN et ADN à partir des échantillons tumoraux cryopréservés Fragment tumoral congelé Cryopreservation d une partie de l échantillon congelé Coupe histologique congelée Validation de la Richesse en cellules tumorales Macrodissection - Pour enrichissement en cellules tumorales avant l extraction des ADN et ARN Cellules tumorales 95%
Processus pour la préparation des ARN et ADN à partir des échantillons tumoraux cryopréservés Fragment tumoral congelé Cryopreservation d une partie de l échantillon congelé Coupe histologique congelée Validation de la Richesse en cellules tumorales Cellules tumorales 95% ARN Cellules tumorales 95% ADN
2. Annotation des échantillons tumoraux (bases de données de qualité) Description du type histologique : exemple des cancers du sein Carcinomes infiltrants du sein Tubuleux Médullaire Lobulaire Canalaire
Age Taille tumorale Grade (index mitotique) Emboles Vasculaires Nature du stroma (lymphoïde ) Statut ganglionnaire RO, RP, ERBB2 2. Annotation des échantillons tumoraux (bases de données de qualité) Caractéristiques anatomo-cliniques associées aux échantillons Suivi clinique : modalités thérapeutiques, évolution clinique
3. Transfert des résultats issus des analyses moléculaires vers la pratique clinique Techniques moléculaires : Réservées à des centres spécialisés Matériel cryopréservé (difficile à mettre en place dans un système de médecine privée) Transfert en pratique clinique : nécessite une méthode Fiable +++ Reproductible Peu couteuse Largement diffusée
3. Transfert des résultats issus des analyses moléculaires vers la pratique clinique L immunohistochimie En hématopathologie : Lymphome T anaplasique ALK positif, activé par translocation t(2;5). Perte d expression de la protéine INI1 dans les tumeurs rhabdoïdes avec mutation somatique du gène INI1. Carcinomes colo-rectaux perte de l expression des protéines MLH1, MSH2 et MHS6 Carcinomes lobulaires infiltrants du sein : mutation du gène de la E-cadhérine L hybridation in situ en fluorescence ou chromogénique Amplifications : ERBB2 Translocations des carcinomes sécrétants juvéniles et adénoides kystiques.
Carcinome lobulaire infiltrant du sein : mutation de la E-cadhérine Gene: chr16 en q22.1, gène supresseur de tumeur Protéine: transmembranaire, adhérence inter-cellulaire E-cadherin p120 ctn catenin -catenin or plakoglobin -catenin Schéma adapté de van Roy F-actin
Carcinome lobulaire infiltrant du sein : mutation de la E-cadhérine Gene: chr16 en q22.1, gène supresseur de tumeur Protéine: transmembranaire, adhérence inter-cellulaire E-cadherin * p120 ctn catenin -catenin or plakoglobin -catenin Schéma adapté de van Roy F-actin
Mutation Perte d expression de la E-cadherine dans la majorité des carcinomes lobulaires infiltrants Contrôle positif interne : Glandes normales résiduelles intra-tumorales
Intérêt d identifier les carcinomes lobulaires en pratique clinique Tumeurs lobulaires à faible prolifération 1. Faible réponse à la chimiothérapie néoadjuvante 2. Identification de nouvelles cibles thérapeutiques FGFR1 gène driver de l amplicon du chromosome 8p12 cible d une thérapie ciblée anti FGFR1 (Reis-Filho et al Clin Can Res 2006)
ERBB2/ Neu/HER2 Gène: oncogène, situé sur le chromosome 17q12 Protéine = récepteur tyrosine-kinase trans-membranaire ACTIVATION de HER 2 dans les cancers du sein par amplification du gène
> 30% de cellules marquées avec intensité forte marquage membranaire complet
Pas d amplification Pas de surexpression Amplification forte >15 copies Surexpression forte 3+ Amplification faible 6-10 copies Surexpression faible 2+
IHC critères d interprêtation Voir les contrôles, si non conformes, le test doit être répété Ne pas interprêter le cas si marquage évident des glandes normales Score 3+ : >30% de cellules tumorales infiltrantes avec marquage membranaire complet et intense Ne pas tenir compte des marquages incomplets et pâles N interprêter que les cellules carcinomateuses infiltrantes 18
Bien identifier les cas équivoques C est à dire ceux à analyser par FISH/CISH CAS 2+ (5 à 15% des cas): Marquage complet soit non uniforme soit faible avec un marquage evident circonférentiel membranaire dans au moins 10% des cellules Cas hétérogènes (exceptionnels :1 cas tous les 3 à 6 mois) ( equivocal, à re-tester par une autre technique) marquage complet et intense de <30% des cellules carcinomateuses infiltrantes
Tumeurs HER2 (3+) Canalaires <1cm 9% < 2 cm 10 à 15% > 2 cm 20 à 25% grade I ~ 0% grade II 11% grade III 27% Lobulaires < 5% Tubuleux 0% Médullaires et basal-like 0% Cancers inflammatoires Cancers de la femme jeune 30% 20
Cas 2+ : 15% des cas FISH pour compléter l analyse 15-30% sont amplifiés (amplification de faible niveau)
5 à 15% 70 à 80% 15% Wolff et al JCO 2007
Principe de l Hybridation in situ en fluorescence Sur coupes tissulaires Sonde spécifique anti HER2 Cible : séquence chromosomique de HER2 Coupe tissulaire fixée de carcinome mammaire
Sondes HER-2 et centromère 17 HER-2 2 copies Amplifié >20 copies centromère 17
HER-2 faible amplification - surreprésentation HER-2 cen 17
FISH Résultats HER-2:. 1-4 copies: pas d'amplification. > 6 copies: amplification HER2/cen 17:. HER2/cen 17 < 2.2: pas d'amplification. HER2/cen 17 > 2.2 : amplification
Trastuzumab (Herceptin ) Mécanismes d action Burstein NEJM 20 Octobre 2005
Classification moléculaire des carcinomes infiltrants de type canalaire Récepteurs Oestrogènes - Récepteurs Oestrogènes + Basal-like ERBB2 Luminal A, B, C Pronostic défavorable Sorlie et al, PNAS 2001
Fréquence des types moléculaires définis par immunohistochimie Luminal A 44%; Luminal B 24%; Luminal HER2 6,5%; BLC 9,8%; TN non BCL 8,5% Luminal A= RO + et /ou RP +, Ki67 <14% ou grade I / II (index mitotique bas) Luminal B = RO + et /ou RP +, Ki-67 > 14% ou grade II (index mitotique fort) ou III luminal/her2 = RO + et/ou RP + et HER2 + HER2 = RO- /HER2+ Basal-like = RO 0% et RP 0% et HER2 0 et EGFR + et /ou CK5/6 + Triple-negative (TN): = tumors that did not express EGFR or CK5/6 were considered = TN non basal Kennecke et al JCO 2010
Immunophénotype des carcinomes infiltrants de type basal-like 10-15% des carcinomes mammaires infiltrants 85% des carcinomes BRCA1 Grade III et phénotype RO-RP- ERBB2- pas de thérapeutique ciblée Mauvais pronostic : 55 à 70% de survie à 10 ans RO- RP- ERBB2-100 % KRT5/6+ 62% EGFR 57% KIT+ 29 % Critères définis par Nielsen et al, Clin Can Res 2004 Spécificité de 100% et sensibilité de 78%
Identification des carcinomes basal-like en pratique clinique Contours arrondis Peu différencié, Nécrose Grade III / Mitoses Stroma lymphoïde Stroma myofibroblastique Atypies
Spectre morphologique des carcinomes triples négatifs 15-18% des carcinomes mammaires Secrétants juvéniles Triples négatifs Adénoïdes kystiques t(12;15) (ETV6; NTRK3) t(6;9) (q22-23; p23-24) (MYB ;NFIB) Basal-like Sporadique ou BRCA1 Médullaires Métaplasiques
Conclusions : Pathologie moléculaire dans les cancers du sein 1. Collection et préparation du matériel tumoral de qualité enrichissement en cellules tumorales 2. Annotations clinico-pathologiques détaillées corrélations moléculaires / phénotypiques identification fiable de nouvelles cibles thérapeutiques 3. Transfert en pratique clinique des avancées de la recherche pour : diffusion au plus grand nombre de patientes adaptation des schémas thérapeutiques aux sous-types tumoraux